המחברים רוצה להודות לאנגנאו דוד למתן בנדיבות שטח האקווריום; אריק אבן, ג'ון ג. מור, צ'ין טאנג בשביל לעזור עם דג זברה תחזוקה, ריאגנטים, ו אן רוברטסון, אליוט Hagedorn מהמעבדה של לאונרד Zon עבור ברכישת המתח דג זברה המשמש כאן. הם גם רוצה להודות אוקטביו הורטדו לקבלת ייעוץ על טכניקות photolithographic. FE מומן על ידי מלגות מבית החולים של שריינר לילדים, האגודה האמריקאית אוסטרלי. עבודה זו מומן על ידי NIH הענק GM92804.

Microinjection של הזחלים אושרה על ידי הוועדה חולים כללי מסצ'וסטס-אכפת לי חיה מחקר תחת פרוטוקול 2011N000127.
1. התקן פבריקציה נוספת
הערה: כל בסיוע מחשב (CAD) קבצי ציור המשמש עיצוב מסכות פוטוליתוגרפיה המתוארים כאן (איור 1) זמינים להורדה. ראה טבלה של חומרים עבור קישורים.
<ol><li>לפברק כשהפחד מאסטר עובש בחדר נקי Class 1,000 באמצעות טכניקות photolithographic סטנדרטי7. עבור מערכים מיקרו ו ערוצים, דפוס את photoresist על בסיס אפוקסי שלילי ברצף ב 3 שכבות באמצעות 3 מסכות נפרדים, בהתאם להוראות היצרן: 100 מיקרומטר עבור התכונות רדוד, מיקרומטר 200 עבור התכונות בינונית ו- 400 מיקרומטר עבור התכונות עמוק. עבור התקן הדמיה, דוגמת שתי שכבות באמצעות מיקרומטר 400 עבור התכונות רדוד מיקרומטר 600 עבור התכונות עמוק.</li>
	<li>קלטת כשהפחד שהושלמו לבסיס של 15 ס מ פטרי ליציקת (איור 2).</li>
</ol>2. הכנת מערכי משטח Microstructured - PDMS
<ol><li>כדי להפוך התקנים שמיש, יצוק polydimethylsiloxane (PDMS), באמצעות כשהפחד מאסטר כתבנית. לשלב 50 גרם של מונומר PDMS עם 5 g של היוזם, מערבבים ביסודיות פלסטיק במשקל צלחת עם מזלג מפלסטיק.</li>
	<li>שופכים את התערובת בזהירות מעל העובש.</li>
	<li>דגה, desiccator ואקום ב- 16-25-inHg (54-85 kPa) לשעה.</li>
	<li>. כדי לרפא את PDMS, אופים ב 65 מעלות צלזיוס במשך לפחות 3 שעות. PDMS צריך לרפא למצב מוצק תקיף אך גמיש.</li>
	<li>חותכים בזהירות מסביב למכשיר על כשהפחד הראשי באמצעות אזמל, מקפיד לשמור על קשר בין קצה האזמל השטח וופל. באמצעות מלקחיים, לקלף את העותק המשוכפל של PDMS מחוץ ופלה העברת נקי 10 ס מ פטרי, תכונה בצד (איור 3).</li>
	<li>לטפל המכשיר עם פלזמה חמצן באמצעות תנור פלזמה עבור 35 s כדי להפחית את hydrophobicity.</li>
	<li>מכסים עם דג זברה העובר בינוני (E3) המכיל 168 מ ג/ליטר של אתיל methanesulfonate 3-aminobenoate (MS-222, pH 7.5). הסרה של בועות מתכונות עמוק יותר על-ידי זרימת מים על פני השטח של המכשיר באמצעות פיפטה של העברה.</li>
</ol>3. הכנת מערכי משטח Microstructured - Agarose
<ol><li>כדי להפוך את תבנית PDMS שלילי, קודם לטפל מכשיר PDMS עם חמצן פלזמה.</li>
	<li>
פנקו את המכשיר PDMS עם 1H, 1H, 2H, 2Hכדי ליצור משטח אינרטי8אדי silane - Perfluorooctyltriethoxysilane (PFDTS). בקצרה:
	<ol>
<li>מניחים את PDMS להיות מטופלים תכונה-צד-up בתוך תא ואקום בתוך ברדס fume.</li>
		<li>ליד PDMS, מקום קטן פתוח זכוכית או אלומיניום תבשיל, בזהירות פיפטה 200 µL של PFDTS (98% silane) לתוך קערה. התראה: PFDTS silane הוא הפכפך מאוד, מגיב באלימות עם מים, דליק, גורמת נזקים חמורים העור והעין על קשר. MSDS לקריאה בהרחבה לפני השימוש.</li>
		<li>לסגור את תא ואקום ולהחיל ואקום למשך 15-30 דקות, או עד silane PFDTS הוא התאדו לגמרי.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הכנס את ההתקן צלחת פטרי, להשתמש כתבנית עבור PDMS טריים, המוכנים כפי שמתואר בשלב 2.1-2.3.</li>
	<li>אופים ב- 65 מעלות צלזיוס במשך לפחות 3 שעות, ולאחר מכן לקלף את כל השכבה של טרי PDMS מהמכשיר שטופלו ומניחים בצלחת פטרי טריים. זה יכול לשמש לאחר מכן כתבנית שלילי להטיל agarose.</li>
	<li>כדי להכין agarose, מרתיחים פתרון 2% של נמוך ג'לי טמפרטורה agarose ב E3 במיקרוגל עד התפרקה לחלוטין agarose.</li>
	<li>שופכים את agarose חם כייר שלילי PDMS, להסיר את כל הבועות ב agarose המכסה את המכשיר על-ידי agarose חם זורם מעל תכונות בעלות פיפטה העברה.</li>
	<li>ברגע בועות יוסרו, להכניס למקרר ב 4 ° C כדי להגדיר את agarose.</li>
	<li>להסיר את הבלוק agarose כייר PDMS שליליים על ידי עיוות את PDMS מ מתחת בעבודת יד, להעביר את גוש agarose חדש צלחת פטרי, ו רטוב עם E3 המכיל MS-222.</li>
</ol>4. הכנת PDMS התקני הדמיה
<ol><li>כדי להפוך התקנים שמיש, יצוק PDMS, באמצעות כשהפחד מאסטר כתבנית. לשלב 50 גרם של מונומר PDMS עם 5 g של יוזם (כמו בשימוש בשלב 2.1), לערבב ביסודיות ב פלסטיק במשקל צלחת עם מזלג מפלסטיק.</li>
	<li>שופכים את התערובת בזהירות מעל העובש.</li>
	<li>דגה, desiccator ואקום ב- 16-25-inHg (54-85 kPa) לשעה.</li>
	<li>. כדי לרפא את PDMS, אופים ב 65 מעלות צלזיוס במשך לפחות 3 שעות. PDMS צריך לרפא למצב מוצק תקיף אך גמיש.</li>
	<li>לחתוך את ההתקנים מ כשהפחד מאסטר, אגרוף יציאות באמצעות אגרוף 1.5 מ מ.</li>
	<li>פינוק המכשירים ו 6-ובכן זכוכית-תחתון טוב צלחת עם חמצן פלזמה עבור 35 s, כפי שמתואר בשלב 2.6.</li>
	<li>בונד אחד התקן תכונה לצד השני על כל coverslip זכוכית של צלחת 6-טוב על-ידי הצבתו על פלטה 85 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. הערה: כדי לאשר התקשרות מוצלחת, החל בלחץ חזק לצד אחד של המכשיר בונדד באמצעות מלקחיים. המכשיר צריכים להישאר קשור coverslip זכוכית.</li>
</ol>5. דג זברה תרבות
<ol><li>תרבות עוברי דג זברה כדי dpf 2 באמצעות טכניקות רגיל3.</li>
	<li>Dechorionate עוברי באמצעות מלקחיים או 1 מ"ג/מ"ל, פרוטאז מערבבים (ראה טבלת חומרים)3 לפחות 30-60 דקות לפני טעינה להתקן, כדי לאפשר להם ליישר.</li>
	<li>להרדים עוברי באמצעות פתרון מניות (168 מ ג/ליטר) MS-222 (pH 7.5) על-ידי הוספת 1 מ"ל של 25 X E3 ב שלהם צלחת פטרי.</li>
</ol>6. הכיוון של דג זברה על השטח Microstructured - מערכים דיבוט
<ol><li>להכין את הרחוב PDMS צעד 2.7 (איור 3A) של צלחת פטרי כזה כי הוא מכוסה על ידי שכבה (1-2 מ מ עובי) של E3, שמאפשר מניפולציה קל של העוברים.</li>
	<li>להעביר את המספר הנדרש של עוברי (בדרך כלל 10-20 לכל תנאי) על פני הרחוב PDMS באמצעות פיפטה של העברה.</li>
	<li>בעזרת כלי המיקרומניפולציה (שיער לולאה או דומה), לדחוף את העוברים החורים microstructured (איור 3 א). השימוש וגושים מתאימה בעיקר אוריינטציות הגבי ו הגחון. הערה: לקבלת החורים עם הדוק יותר מתאים (הגבי ו הגחון), נסה מיצוב העוברים על פני הרחוב במקביל דיבוט ולאחר מכן לגלגל אותם בעזרת לולאה שיער. דוחף אותם עמוק יותר לתוך דיבוט יסייע לשמור אותם יציבים.</li>
</ol>7. הכיוון של דג זברה על השטח Microstructured - ערוצי Microstructured
<ol><li>צייר E3 לא ברחוב PDMS בדוגמת לערוצי microstructured (איור 3B) באמצעות פיפטה העברה של עד הרמה של E3 יורד מתחת לקצה הרחוב, אך היא עדיין נוכחים המאגר ואת ערוצי בשכבה דקה על PDMS.</li>
	<li>העברת העוברים 10 מהשלב 5.3 לתוך המאגר באמצעות פיפטה העברה, נזהר שלא תציף את הקצוות.</li>
	<li>באמצעות לולאה שיער, לתמרן כל העובר לאבדון בכניסה של הערוץ המתאים, אוריינט כזה כי ראשו של העובר לכיוון התעלה, העובר יש את הכיוון המתאים המתאוששת הערוץ.</li>
	<li>החלק כל העובר למטה הערוץ באמצעות לולאה שיער עד שהוא מגיע את microfeatures orienting בקירות הערוץ המסייעים לשמור אותו במקום. השימוש ערוצי microstructured מומלצת במיוחד בכיוון לרוחב. הערה: כדי לצמצם את העובר הזזה במהלך microinjection, נסה לכוונן את הכמות של מתח על ידי ציור E3 מן המאגר.</li>
</ol>8. microinjection של דג זברה
<ol><li>
להכין את המחט microinjection.
	<ol>
<li>להפוך מחטים microcapillary זכוכית בורוסיליקט באמצעות של פולר micropipette כמו שתואר לעיל4. . המחטים וכתוצאה מכך צריך צמצום עד לנקודה בקצה אחד, באורך להתחדד של 10 מ מ.</li>
		<li>להכין פתרון כדי להיות מוזרק, ב- chemoattractant ננומטר זה מקרה 100 (N-Formylmethionine-leucyl-פנילאלנין (fMLP) או Leukotriene B4 (LTB4)) ו- 100 ננומטר של 70 kDa Rhodamine לתוספי מעקב ב- PBS.</li>
		<li>לטעון µL 5 של פתרון לתוך המחט בעזרת פיפטה דק מחודדות עצה (ראה טבלת חומרים).</li>
		<li>לטעון את המחט לתוך micromanipulator רכוב על דוכן מגנטי ומחובר microinjector picopump.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לשבור את קצה המחט בזווית של 45 מעלות על-ידי צובט את הטיפ מחודדות עם מלקחיים.</li>
	<li>התאם גודל בולוס הזרקת 1 nL על-ידי התאמת זמן הזרקת בבקר picopump.</li>
	<li>להתאים את הזווית של המחט microinjection. זווית המחט של 45 מעלות על הבקר המיקרומניפולציה בדרך כלל נקודת התחלה טובה, עם מחט מקבילים באורך של העובר. זווית תלולה עשוי לשמש כדי למזער את התנועה לרוחב של העובר במהלך microinjection.</li>
	<li>שליטה על צלחת פטרי עם יד שמאל ועל את המחט micromanipulator בימין, להביא את המחט קרוב ככל האפשר לאתר המיועד של microinjection, במקרה זה שלפוחית otic. הערה: ניתן לזהות את שלפוחית otic כמו האיבר מלבני האחורי לעין המכיל שני קטן יותר ברורים כהה מלבני מבנים (otoliths).</li>
	<li>באמצעות הבקר חוץ-גופית, לחדור את רקמת המטרה (במקרה זה שלפוחית otic) כך קצה המחט נמצא שלפוחית, ולהזריק האחסון מראש באמצעות המתג הרגל picopump. הערה: אם הרקמה יתנגד חדירה, לנסות בעדינות הקשה על הידית בקר המיקרומניפולציה.</li>
	<li>כדי לשחרר את העוברים, זורמים E3 מעל פני השטח מלמעלה למטה באמצעות פיפטה העברה, או על ידי מתערבל המנה כך העוברים משוחררים לתוך E3 שמסביב.</li>
	<li>העברת העוברים תבשיל שחזור של E3 ללא באמצעות פיפטה העברה של MS-222.</li>
</ol>9. הקרנת עוברי באמצעות PDMS את התקן הדמיה
<ol><li>פריים המכשיר משלב 4.7 מאת זורם E3 (+ MS-222) דרך היציאה. ניתן לבצע זאת באמצעות פיפטה 1,000 µL או פיפטה של צרות-קצה העברה.</li>
	<li>למלא את הבאר E3 + MS-222 עד המכשיר מכוסה.</li>
	<li>לספק 4 העוברים מוזרק משלב 8.7 לתוך כל טוב באמצעות פיפטה של העברה. עוברי ניתן מראש anesthetized במידת הצורך על-ידי המקננת ב E3 + MS-222 למשך 1-2 דקות לפני טעינת (שלב 5.3).</li>
	<li>בעזרת כלי המיקרומניפולציה (שיער לולאה או דומה), אוריינט העוברים בכניסות של ערוצי הדמיה בכיוון הרצוי (זנב-הראשון או ראש-הראשון, בהתאם למכשיר בשימוש), לדחוף אותם באופן חלקי המכשיר (איור 4A). זה יעזור למשוך אותם לתוך המכשיר באופן שווה.</li>
	<li>צייר E3 דרך המכשיר מן הנמל באמצעות פיפטה µL 1,000 או פיפטה העברה עד העוברים נמשכים לתוך תעלות לכיוון הנכון הדמיה (איור 4B). הערה: תיזהר שלא לשאוב את העוברים מעבר לנקודה השמנה, זה נזק העוברים ולשנות את חוש ההתמצאות שלהם.</li>
	<li>להעביר היטב-לוחית מיקרוסקופ הדמיה (איור 4C).</li>
	<li>
התמונה באמצעות מיקרוסקופ פלורסנט הפוכה.
	<ol>
<li>התאם הגדלה על-ידי בחירת העדשה המתאימה. 10 X הוא בדרך כלל ההגדלה שימושי הדמיה ההעברה נויטרופילים דג זברה.</li>
		<li>התאם עוצמה מקור האור וזמן חשיפה לכל ערוץ כך כל אות היא ברורה, אבל לא רוויות.</li>
		<li>לכידת תמונות לכל ערוץ. כאן, השתמשנו חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP, לשעבר: 470/22, Em: 525/50), טקסס אדום (TxRed, לשעבר: 585/29, Em: 628/32) ולהעביר ערוצי. ניתן לשלב תמונות רב-ערוצי במהלך עיבוד שלאחר (איור 4B-אני).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+human+disease:+zebrafish+swim+into+view.">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nat Rev Genet. 8 (5), 353-367 (2007).</li><li>Dang, M., Fogley, R., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+Novel+Cancer+Therapies+Using+Chemical+Genetics+and+Zebrafish.">Identifying Novel Cancer Therapies Using Chemical Genetics and Zebrafish.</a> Adv Exp Med Biol. 916, 103-124 (2016).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).</li><li>Benard, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+zebrafish+embryos+with+intracellular+bacterial+pathogens.">Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens.</a> J Vis Exp. (61), (2012).</li><li>Ellett, F., Irimia, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microstructured+Surface+Arrays+for+Injection+of+Zebrafish+Larvae.">Microstructured Surface Arrays for Injection of Zebrafish Larvae.</a> Zebrafish. 14 (2), 140-145 (2017).</li><li>Bischel, L. L., Mader, B. R., Green, J. M., Huttenlocher, A., Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+Entrapment+By+Restriction+Array+(ZEBRA)+device:+a+low-cost,+agarose-free+zebrafish+mounting+technique+for+automated+imaging.">Zebrafish Entrapment By Restriction Array (ZEBRA) device: a low-cost, agarose-free zebrafish mounting technique for automated imaging.</a> Lab Chip. 13 (9), 1732-1736 (2013).</li><li>Brower, K., White, A. K., Fordyce, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-step+Variable+Height+Photolithography+for+Valved+Multilayer+Microfluidic+Devices.">Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices.</a> J Vis Exp. (119), (2017).</li><li>Shao, G., Wu, J., Cai, Z., Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+elastomeric+high-aspect-ratio+microstructures+using+polydimethylsiloxane+(PDMS)+double+casting+technique.">Fabrication of elastomeric high-aspect-ratio microstructures using polydimethylsiloxane (PDMS) double casting technique.</a> Sens Actuators A Phys. 178, 230-236 (2012).</li><li>Bhuiyan, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acinetobacter+baumannii+phenylacetic+acid+metabolism+influences+infection+outcome+through+a+direct+effect+on+neutrophil+chemotaxis.">Acinetobacter baumannii phenylacetic acid metabolism influences infection outcome through a direct effect on neutrophil chemotaxis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (34), 9599-9604 (2016).</li><li>Henry, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PhagoSight:+an+open-source+MATLAB&#174;+package+for+the+analysis+of+fluorescent+neutrophil+and+macrophage+migration+in+a+zebrafish+model.">PhagoSight: an open-source MATLAB&#174; package for the analysis of fluorescent neutrophil and macrophage migration in a zebrafish model.</a> PloS one. 8 (8), e72636 (2013).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dynam. 203 (3), 253-310 (1995).</li><li>Hemmil&#228;, S., Cauich-Rodr&#237;guez, J. V., Kreutzer, J., Kallio, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+simple,+and+cost-effective+treatments+to+achieve+long-term+hydrophilic+PDMS+surfaces.">Rapid, simple, and cost-effective treatments to achieve long-term hydrophilic PDMS surfaces.</a> Applied Surface Science. 258 (24), 9864-9875 (2012).</li><li>Masselink, W., Wong, J. C., Liu, B., Fu, J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-cost+silicone+imaging+casts+for+zebrafish+embryos+and+larvae.">Low-cost silicone imaging casts for zebrafish embryos and larvae.</a> Zebrafish. 11 (1), 26-31 (2014).</li><li>Yang, F., Gao, C., Wang, P., Zhang, G. J., Chen, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fish-on-a-chip:+microfluidics+for+zebrafish+research.">Fish-on-a-chip: microfluidics for zebrafish research.</a> Lab Chip. 16 (7), 1106-1125 (2016).</li><li>Wielhouwer, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+embryo+development+in+a+microfluidic+flow-through+system.">Zebrafish embryo development in a microfluidic flow-through system.</a> Lab Chip. 11 (10), 1815-1824 (2011).</li><li>Shen, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+student+team+in+a+University+of+Michigan+biomedical+engineering+design+course+constructs+a+microfluidic+bioreactor+for+studies+of+zebrafish+development.">A student team in a University of Michigan biomedical engineering design course constructs a microfluidic bioreactor for studies of zebrafish development.</a> Zebrafish. 6 (2), 201-213 (2009).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+on+a+chip:+a+novel+platform+for+real-time+monitoring+of+drug-induced+developmental+toxicity.">Zebrafish on a chip: a novel platform for real-time monitoring of drug-induced developmental toxicity.</a> PLoS One. 9 (4), e94792 (2014).</li><li>Akagi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Miniaturized+embryo+array+for+automated+trapping,+immobilization+and+microperfusion+of+zebrafish+embryos.">Miniaturized embryo array for automated trapping, immobilization and microperfusion of zebrafish embryos.</a> PLoS One. 7 (5), e36630 (2012).</li><li>Akagi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fish+on+chips:+Microfluidic+living+embryo+array+for+accelerated+in+vivo+angiogenesis+assays.">Fish on chips: Microfluidic living embryo array for accelerated in vivo angiogenesis assays.</a> Sens Actuators B Chem. 189, 11-20 (2013).</li><li>Lin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+mapping+of+brain-wide+activity+in+awake+and+drug-responsive+vertebrates.">High-throughput mapping of brain-wide activity in awake and drug-responsive vertebrates.</a> Lab Chip. 15 (3), 680-689 (2015).</li><li>Noori, A., Selvaganapathy, P. R., Wilson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+in+a+microfluidic+format+using+flexible+and+compliant+channels+and+electroosmotic+dosage+control.">Microinjection in a microfluidic format using flexible and compliant channels and electroosmotic dosage control.</a> Lab Chip. 9 (22), 3202-3211 (2009).</li></ol>

המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.

כאן, אנו מתארים את השימוש של ההתקנים שפיתחנו לאחרונה להקל על 2 dpf דג זברה microinjection5, ולהציג את התקן הרכבה פשוטה ללא agarose עבור הדמיה נוח של העוברים. כלים אלה מדגישים את התועלת של טכניקות photolithographic להרכבת התקנים שימושי עבור דג זברה טכניקות.
מצאנו למתקן התקנים שימושי במיוחד עבור הזרקה של תאים או חלקיקים נוטה צבירת בתוך המחט microinjection, כגון conidia פטרייתי או תאים סרטניים אנושיים, אשר דורשים את השימוש מחט שיעמום גדול יותר עבור משלוח. הזרקה לתוך שלפוחית otic (איור 4) מהווה אתגר מסוים, כפי העוברים לעיתים קרובות לגלגל לאחר יצירת קשר עם המחט. מצאנו כי השימוש ערוצים microstructured אוריינט ולייצב את דג זברה ב תנועה צדית התמצאות השתפרה מאוד הן את התפוקה והדיוק של טכניקה זו בידיים שלנו.
עבור הדמיה מהירה של דג זברה רוחבית אוריינטציה בנקודות זמן שונות, כגון הערכה של גיוס נויטרופילים או גרורות xenograft, הימנעות agarose גדל הרכבה עקביות בין עוברי סיכון מופחת של נזק במהלך פוסט-הדמיה הצלה. התקנים אלה גם מבטיחים לדימות לשגות זמן ממושך, שימשו בהצלחה ללכוד תמונות רב-ערוצי, multiplane עם דגים מינימלי תנועה מעל 12 שעות. כי הם אינם מרוסנים על-ידי agarose, התארכות פעיל של הזחלים במהלך זה תקופה (מיקרומטר ~ 300 מ 54-78 hpf)11 היא בלתי מוגבלת, ניתן להמשיך כרגיל.
השלבים הקריטיים ביותר הכנה, שימוש בכלים אלה נפוצים לשימוש של רוב המכשירים microfluidic PDMS מבוסס: התקנים חייב להיות wetted ביסודיות, להימנע בועות. כדי להימנע מבעיות כאלה, רטוב ההתקנים E3 מיד לאחר שהם מיוצרים, ואילו hydrophilicity משטח שהוענקו על ידי טיפול פלזמה החמצן עדיין קיימת. טיפול מחדש עם פלזמה חמצן יכול לשמש גם לשחזור transiently hydrophilicity למכשירים PDMS בגיל העמידה.
גיאומטריות מדויקות המשמש כאן לנצל הרזולוציה הגבוהה של טכניקות photolithographic, אך השימוש הנוכחי של מגבלת עיצובים כדי דג זברה בזמן ההפריה שלאחר יום השני. עיצוב מחדש של גיאומטריות מבוססת על פלטפורמת הנוכחי יאפשר כיוון מוצלחת של 1 dpf ו- 3 dpf עבור microinjection. הכיוון של יותר קליל 4 dpf הזחלים עם שלפוחיות שחייה המנופח סביר להיות מאתגרת יותר, וזקוקים סנוג גיאומטריות בשילוב עם מתח מים גבוהה יותר. המכשירים מורכבים שילוב זרימה או אבק עשוי לספק גישה חלופית החלים על מגוון רחב יותר של שלבים התפתחותיים, אך גם דורשת שימוש של משאבות, צינורות, הגדלת עלות וסיכון של כשל בהתקן.
PDMS הוא חומר חסכונית, שימושי עבור בדיית מכשירים כמו אלה שתוארו כאן, מתן הביו, שקיפות, שימושית. חסרון אחד של שימוש PDMS התקנים עבור דג זברה הוא hydrophobicity, אשר יכול לגרום תחזוקה של שכבות רדוד של E3 על פני השטח של המכשיר מאתגר. בעיה זו יכולה להימנע על ידי יציקת המכשירים microinjection ב agarose, למרות זה מגביל את שימושית ומגביר את השבריריות של התקנים. אלטרנטיבה יהיה זיהוי של טיפול פני שטח מסתיימים זה מגביר את hydrophilicity של PDMS12, או השימוש המצע פלסטיק המתאים.
השיטות הקיימות עבור microinjection של דג זברה-2 dpf להשתמש גם מתח מים4 או ערוצי פשוטה יצוקים agarose באמצעות תבניות מסחריות כדי לשתק ומקם את הזחלים. גישות אלה מספקים שליטה מוגבלת על התמצאות, יכול להיות מסובך ייבוש מהיר של העוברים. מזערים משולבים קדימה רבותיי, ערוצי המשמש כאן נועדו אוריינט, לשתק את הזחלים ללא תלוי לחלוטין המתח המים, ובכך להקטין את הסיכון של ייבוש. בעבר היו בשימוש וגושים עשה שימוש בתבניות מודפס 3D לאוריינטציה של העוברים על מטרות הדמיה13למרות העומק של גושים אלה גרם להם נגיש עבור microinjection.
השימוש במערכות microfluidic עבור דג זברה הדמיה הופך להיות נפוץ יותר ויותר14. פותחו מספר מערכות זרימה דרך כדי לאפשר התבוננות דג זברה פיתוח לאורך זמן עם היכולת להציג חומרים הביקושים15,16,17. המכשירים מורכבים יותר עוצבו כדי מערך עוברי בעוד עדיין בתוך chorion שלהם, אשר מספק של גאומטריה ספירית פשוטה, כי ניתן לטפל בקלות עם תפוקה גבוהה יחסית של מערכות אלה,18,19. מספר קבוצות פיתחו פלטפורמות עבור סידור במערך והדמיה דג זברה הפרפרים והעשים שונים אוריינטציות6,20, היצור הכי ידידותי micropump פסיבי מונע "זברה" מערכת שפותחה על ידי המעבדה ביב6 . בניגוד למערכת זברה, המכשיר זה נתאר כאן משתמש היניקה, שנוצר באמצעות פיפטה של העברה סטנדרטי, למשוך הרימות אל הערוצים, בזמן טעינת מקבילים ולא רציפים של הזחלים מאפשר חילוץ של הזחלים בודדים פוסט-הדמיה מאת החלת תזרים חיובי דרך אותה היציאה. יתר על כן, הגישה שלנו דורש טביעת רגל קטנה יותר, אז יכול להיות מודבקת PDMS התקנים קונבנציונאלי זכוכית-6-ובכן לוחות עבור הדמיה.
הנבחנים הנוכחי מנצל התקנים נפרדים עבור microinjection והדמיה בעיקר כך הם יכולים לשמש עם ציוד הרגיל microinjection תקן הפוך מיקרוסקופים. גישות Microfluidic עבור microinjection אוטומטית של ביצי דג זברה כבר קיים21, בשילוב עם שיטות סוג "מלכודת דגים" סידור במערך ומדויקים והכיוון של הזחלים20, זה הנראה לעין את התקנים שילוב הזרקת זחל אוטומטית הדמיה עלולות גם יום אחד להפוך למציאות.

דג זברה הופיעו כמודל עוצמה עבור שדות רבים, מחקרים של יסוד ביולוגיה התפתחותית כדי בקנה מידה גדול גנטי, כימית מסכי1,2. שינויים גנטיים שגרתיות, כגון ביטוי גנים, נוקאאוט, מוטגנזה מכוונת CRISPR/Cas9 transgenesis לסמוך על microinjection של חומר גנטי לתוך הזיגוטה מתא בודד, אשר הובילה להתפתחות של פשוט, קל לשימוש, מסחרית כלים זמינים עבור המכוונת וייצוב ביצים הזרקת3. גישות אחרות, כגון השתלת זיהום, דורשים לעיתים קרובות microinjection לתוך העוברים בשלב מאוחר יותר, הזחלים באמצעות מד גדול מחטים נימי4. עם זאת, השימוש מחטים מד גדול מציג אתגרים טכניים משמעותיים, כמו זה יותר קשה לחדור את רקמת המטרה בלי לדחוף או מגלגלים את העובר. בתנאים אלה, קבלת מתח מים המתאים הנדרש כדי לייצב את העובר תוך הימנעות ייבוש במהלך ההליך קשה, העוברים לא יכול להיות אידיאלי אוריינטציה להזרקה לתוך רקמת המטרה.
בעקבות microinjection, הוא לעיתים קרובות שימושי למסך עוברי מוזרק סמן הוזרק בהצלחה, וכדי ללכוד תמונות של נקודת הזמן הראשוני. לטפל באתגרים אלה, פיתחנו מגוון של מכשירים microstructured המסייעים לייצב את העוברים dpf 2 הכיוונים השונים הן עבור microinjection5, והן עבור מיון המבוסס על תמונות מהיר שלאחר ההזרקה.
כדי להשיג רזולוציה מבנית מספיק במכשירים האלה, אנחנו מנוצל טכניקות photolithographic. נפוץ תעשיות מיקרו-אלקטרוניים ועוד אקסטרפולציה לאחרונה microfluidic פבריקציה נוספת, גישות אלה ניתן להשיג מבנים אנכיים הנע בין 1-1, 000 מיקרומטר, בקנה מידה המתאימה מניפולציה של דג זברה עוברי וזחלים. כל ההתקנים הללו זוייפו באמצעות polydimethylsiloxane (PDMS), שהינו זול חזקים פיזית, אינרטי מבחינה ביולוגית, שקוף.
מערכים משטח microstructured (שימי) שעוצבו כבלוקים של PDMS עם משטח עליון בדוגמת, מקביל הערוצים פשוט בבלוקים agarose הנפוץ עבור הביצה microinjection. להקרנה שלאחר ההזרקה, 6 התקני הדמיה יכול להיות ערוכים תת 6-ובכן צלחת רגילה. התקנים אלה מיועדים לטעינה קלה של העוברים, בעוד ההליך לפריקת בנוחות מאפשר חילוץ העובר ספציפיים, הקלת מבוססת תמונה הקרנת גישות בצורה יותר ידידותית למשתמש מאשר התקנים אלה שפותחו בעבר על ידי ביב מעבדה6.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dow Corning Sylgard 184&#160; Polydimethylsiloxane (PDMS)&#160;</td>
			<td>Ellsworth Adhsives</td>
			<td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td>
			<td>For casting the devices. Kit includes PDMS monomer and Initiator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low gelling temperature agarose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9414-10G</td>
			<td>For casting agarose devices</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFDTS silane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>448931-10G</td>
			<td>For casting of negative PDMS molds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine (MS-222)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E10521-10G</td>
			<td>To anesthetize&#160; zebrafish&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine Dextran 70,000 Da</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D1818</td>
			<td>To trace microinjections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leukotriene B4 (LTB4)</td>
			<td>Cayman Chemicals</td>
			<td>20110</td>
			<td>Neutrophil chemoattractant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Formylmethionine-leucyl-phenylalanine (fMLP)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F3506-50MG</td>
			<td>Neutrophil chemoattractant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 cm Petri dish</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>08-757-148</td>
			<td>For Casting from the master wafer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass-bottom 6-well plates</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P06G-0-20-F</td>
			<td>For imaging devices</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass microcapillaries</td>
			<td>World Scientific Instruments</td>
			<td>TW-100-4</td>
			<td>For microinjection needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z350796</td>
			<td>For transferring zebrafish embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader tips</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>E5242956003</td>
			<td>For loading the microinjection needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harris Uni-Core 1.5 mm punch</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>15111-15</td>
			<td>To punch ports in PDMS imaging devices</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No.&#160;11 Scalpel</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10011-00</td>
			<td>For cutting PDMS&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont No. 5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-10</td>
			<td>For dechorionating embryos and breaking microinjection needle tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marzhauser Micromanipulator</td>
			<td>ASI&#160;</td>
			<td>MM33-R</td>
			<td>For manipulating microinjection needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stand</td>
			<td>MSC</td>
			<td>SPI - 87242624</td>
			<td>For mounting micromanipulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MPPI-3 Picopump controller</td>
			<td>ASI</td>
			<td>MPPI-3</td>
			<td>To control microinjection volume and timing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS inverted fluorescent microscope</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>EVOS FL</td>
			<td>To image injected embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ745</td>
			<td>For visualizing microinjecion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoCAD software</td>
			<td>Autodesk</td>
			<td></td>
			<td>Download AutoCAD files from: https://dx-doi-org.remotexs.ntu.edu.sg/10.6084/m9.figshare.4282853 and on the ZFIN community protocols wiki page: https://wiki.zfin.org/display/prot/ZFIN+ Protocol+Wiki &#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microstructured devices for optimized microinjection and imaging of zebrafish larvae

דג זברה הופיעו כמודל עוצמה של מחלות אנושיות שונות, כלי שימושי עבור טווח גדל והולך של מחקרים ניסיוניים, פורש יסוד ביולוגיה התפתחותית דרך מסכי גנטי וכימיים בקנה מידה גדול. עם זאת, ניסויים רבים, במיוחד אלה הקשורים לזיהום, מודלים xenograft, לסמוך על microinjection הדמיה של עוברי וזחלים, אשר מפרך טכניקות הדורשות מיומנות ומומחיות. כדי לשפר את הדיוק ואת התפוקה של טכניקות microinjection הנוכחי, פיתחנו סדרה של התקנים microstructured אוריינט ולייצב את העוברים דג זברה-2 ימים שלאחר ההפריה (dpf) בכיוון הגחון, הגבי או לרוחב לפני נוהל. כדי לסייע ההדמיה של העוברים, עיצבנו גם מכשיר פשוט עם ערוצים אוריינט דג זברה 4 רוחבית במקביל נגד החלקה כיסוי זכוכית. יחד, בכלים אותם אנו מציגים כאן להדגים את היעילות של גישות photolithographic כדי ליצור התקנים שימושי עבור אופטימיזציה של טכניקות דג זברה.

הגישה המתוארת כאן מדגים את העיצוב (איור 1) ועל פבריקציה נוספת של התקנים לשימוש עם דג זברה 2 dpf, באמצעות photolithographic (איור 2) וטכניקות רך-ליטוגרפיה (איור 3). שיטה זו מאפשרת בדיקה מהירה של איטראציות עיצוב ושינויים רבים, שינויים ואופטימיזציה של מיקרו מידות לשימוש עם דג זברה אחרים שלבי ההתפתחות רשאי להאריך את היישום שלהם.
נדגים שימוש של התקנים אלה נוחים הדמיה וטכניקות microinjection מאתגר. שלפוחית otic (חלוקה לרמות מקווקוויםבאיור 4D, לבן) מספק אתר שימושי, החיסון-חסוי, מבודד לבדיקת גיוס נויטרופילים דג זברה9. כדי לבדוק את היכולת של דג זברה נויטרופילים להגיב chemoattractants סטנדרטי, 100 ננומטר של fMLP, LTB4 היו microinjected לתוך השלפוחיות המוגלתיות otic dpf 2 דג זברה העובר (איור 4F, J), באמצעות המכשיר ערוץ microstructured ( איור 1 ג'י) כדי לייצב את העוברים בכיוון לרוחב. זריקות היו במעקב עם משקל מולקולרי גבוה לתוספי Rhodamine, הופיעה Tg(mpx:EGFP) עוברי כדי להקל על ויזואליזציה של גיוס נויטרופילים. Uninjected עוברי (איור 4D, H), העוברים הזריק Rhodamine לבד (איור 4E, אני) שימשו פקדים שלילי. בעקבות microinjection, העוברים הועברו לתוך המכשיר ערוץ הדמיה (איור 1 א', ב'), עם תמונה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי EVOS (איור 4C)-30 min ו- 5 שעות שלאחר ההזרקה (איור 4D- G , איור 4 H-K, בהתאמה). כצפוי, מספר קטן של נויטרופילים פלורסנט גויסו שלפוחית otic המוזרק מוק-timepoint מוקדמת (איור 4I), ככל הנראה עקב גיוס בתיווך נזק. מעניין, רכיב המעקב לתוספי Rhodamine נצפתה לצבור otoliths במהלך הניסוי. עבור שני chemoattractants (איור 4F, J), גויסו נויטרופילים במספרים גבוהים, במיוחד בתגובה LTB4 (איור 4F).
התוצאות נציג המוצגת כאן מדגימים את השימוש בשיטה זו עבור microinjection מוצלחת והדימות של דג זברה. בהקשר של מבחני הגיוס נויטרופילים דג זברה, יישום של כלים אלה בשילוב עם טכניקות הדמיה חיים מפורט תא מתוחכמים ההעברה ניתוח10 עשוי לספק פלטפורמה שימושי לניסויים עתידיים בתחום זה.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56498/56498fig1.jpg"> איור 1: ממוחשבים עיצוב (CAD) ציור של מסיכות פוטוליתוגרפיה. (A-C) עיצוב CAD עבור microstructured וגושים השטח לצורך מיקום צדדי (A), הגחוני / (B) ו הגבי אוריינטציות (C). קווים צבעוניים שונים מייצגים CAD מסכת עיצובים עבור תכונות שונות, עם 100 מיקרומטר ירוק, כחול 200 מיקרומטר, ובגובה אדום מיקרומטר 400 תכונה. סרגל קנה מידה = 500 CAD עיצוב מיקרומטר. (D-F) עבור ערוצי microstructured לצורך מיקום צדדי (D), הגחוני / (E) ו הגבי אוריינטציות (F). קווים צבעוניים שונים מייצגים מסכת עיצובים עבור תכונות שונות, עם 100 מיקרומטר ירוק, כחול 200 מיקרומטר, ובגובה אדום מיקרומטר 400 תכונה. סרגל קנה מידה: 500 מיקרומטר. (G-אני) עיצוב CAD הדמיה התקנים שנועדו עבור טעינת הראש-ראשון (G) או זנב-הראשון (ו H). קווים כחולים מייצגים תכונות 400 מיקרומטר, ואילו הקווים האדומים מייצגים תכונות מיקרומטר 600. חיצים מראים את הכיוון שבו הזחלים הם טעונים. סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. דמות זו שונתה מ. Ellett et al. 5 <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56498/56498fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56498/56498fig2.jpg"> איור 2: וופל בסיס סיליקון- (א) בחלק העליון של תכונות מראה וופל מאסטר המכוונת הזחלים בודדים לתוך וגושים. (B) בתחתית מקטע של מאסטר וופל מציג עיצוב עבור ערוצי microstructured. דמות זו שונתה מ. Ellett et al. 5 <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56498/56498fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56498/56498fig3.jpg"> איור 3: התקנים Microstructured PDMS. (א) PDMS בלוק יצוק וופל הראשי מציג וגושים עבור המכוונת הזחלים בודדים. PDMS (B) לחסום יצוק וופל הראשי מציג ערוצי microstructured. דמות זו שונתה מ. Ellett et al. 5 <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56498/56498fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56498/56498fig4.jpg"> איור 4: תוצאות נציג: הדמיה גיוס של נויטרופילים דג זברה בעקבות מסירת microinjection chemoattractants לתוך שלפוחית otic. (A-B) טעינת והרכבה עוברי עבור הדמיה. (א) הראש-הראשון המכשיר עם עוברי מוכן להעלאה, עם יציאת שצוין (שחור החץ). (B) טעון העוברים לאחר הם נמשכו סמיכה (חץ צהוב). (C) צלחת זכוכית 6-ובכן-התחתון עם התקני על מיקרוסקופ הדמיה. תבנית זו מאפשרת הדמיה של 4 רוחבית מונחה העוברים לכל טוב (סה כ 24 עוברי), באמצעות מיקרוסקופ הפוך רגיל. (D-G) נויטרופילים (ירוק-EGFP) uninjected (ד) העובר, הבאים otic שלפוחית microinjection של Rhodamine לתוספי (אדום, פתח ראש חץ לבן) לבד (E), 100 ננומטר LTB4 (F), ו- 100 ננומטר fMLP (G) 30 דקות פוסט הזרקה (mpi). (H-K) נויטרופילים (EGFP-ירוק) של העובר (H) uninjected ו- h 5 בעקבות otic שלפוחית microinjection של Rhodamine לתוספי (אדום, פתח ראש חץ לבן) לבד (אני), 100 ננומטר LTB4 (J), ו- 100 ננומטר fMLP (K) 5 שעות פוסט (הזרקה מדד מחירי הבתים של). סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56498/56498fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Microstructured Devices for Optimized Microinjection and Imaging of Zebrafish Larvae at JoVE.com

Microstructured Devices for Optimized Microinjection and Imaging of Zebrafish Larvae

Microinjection של דג זברה עוברי וזחלים היא טכניקה חיונית ומאתגרת המשמשים דגמים רבים של דג זברה. כאן, אנו מציגים מגוון רחב של כלים microscale כדי לסייע ייצוב והכיוון של דג זברה הן microinjection והן הדמיה.

Microstructured מכשירי Microinjection אופטימיזציה והדימות של הזחלים דג זברה

Zebrafish have emerged as a powerful model of various human diseases and a useful tool for an increasing range of experimental studies, spanning ...

microstructured-devices-for-optimized-microinjection-imaging

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.5K Views.  Massachusetts General Hospital–Harvard Medical School–Shriners Burns Hospital. Microinjection של דג זברה עוברי וזחלים היא טכניקה חיונית ומאתגרת המשמשים דגמים רבים של דג זברה. כאן, אנו מציגים מגוון רחב של כלים microscale כדי לסייע ייצוב והכיוון של דג זברה הן microinjection והן הדמיה.

Video: Microstructured Devices for Optimized Microinjection and Imaging of Zebrafish Larvae

Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two layers of skin that enclose undifferentiated mesenchyme, and because the larval tail fin regenerates rapidly within 2-3 days. Using this system, we demonstrate a method for capturing the repair dynamics of the amputated tail fin with time-lapse video brightfield stereomicroscopy. We demonstrate that fin amputation triggers a contraction of the amputation wound and extrusion of cells around the wound margin, leading to their subsequent clearance. Fin regeneration proceeds from proximal to distal direction after a short delay. In addition, developmental growth of the larva can be observed during all stages. The presented method provides an opportunity for observing and analyzing whole tissue-scale behaviors such as fin development and growth in a simple microscope setting, which is easily adaptable to any stereomicroscope with time-lapse capabilities.

We present a protocol for capturing the dynamics of zebrafish larval tail fin regeneration on a whole-tissue scale using brightfield-based stereomicroscopy. This technique enables capturing the regeneration dynamics with single cell resolution. This methodology can be adapted to any stereomicroscope equipped with a CCD camera and time-lapse software.

לכידת תיקון רקמות דג הזברה זחלים עם הזמן לשגות Brightfield stereomicroscopy

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

ניתוח של יושרה שריר שלד דג הזברה זחלים עם אוונס הכחול צבע

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

הדמית מבני subcellular בעובר דג הזברה החייה

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing developmental processes as they happen in the living animal. Cells of interest can be labeled by using a tissue specific promoter to drive the expression of a fluorescent protein (FP) for the generation of transgenic lines. Using fluorescent photoconvertible proteins for this purpose additionally allows to precisely follow defined structures within the expression domain. Illuminating the protein in the region of interest, changes its emission spectrum and highlights a particular cell or cell cluster leaving other transgenic cells in their original color. A major limitation is the lack of known promoters for a large number of tissues in the zebrafish. Conversely, gene- and enhancer trap screens have generated enormous transgenic resources discretely labeling literally all embryonic structures mostly with GFP or to a lesser extend red or yellow FPs. An approach to follow defined structures in such transgenic backgrounds would be to additionally introduce a ubiquitous photoconvertible protein, which could be converted in the cell(s) of interest. However, the photoconvertible proteins available involve a green and/or less frequently a red emission state1 and can therefore often not be used to track cells in the FP-background of existing transgenic lines. To circumvent this problem, we have established the PSmOrange system for the zebrafish2,3. Simple microinjection of synthetic mRNA encoding a nuclear form of this protein labels all cell nuclei with orange/red fluorescence. Upon targeted photoconversion of the protein, it switches its emission spectrum to far red. The quantum efficiency and stability of the protein makes PSmOrange a superb cell-tracking tool for zebrafish and possibly other teleost species.

We established the photoconvertible PSmOrange system as a powerful, straight-forward and cost inexpensive tool for in vivo cell tracking in GFP transgenic backgrounds. This protocol describes its application in the zebrafish model system.

מעקב תאים דג הזברה GFP מהונדס שימוש במערכת photoconvertible PSmOrange

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing ...

Microinjection for Transgenesis and Genome Editing in Threespine Sticklebacks

The threespine stickleback fish has emerged as a powerful system to study the genetic basis of a wide variety of morphological, physiological, and behavioral phenotypes. The remarkably diverse phenotypes that have evolved as marine populations adapt to countless freshwater environments, combined with the ability to cross marine and freshwater forms, provide a rare vertebrate system in which genetics can be used to map genomic regions controlling evolved traits. Excellent genomic resources are now available, facilitating molecular genetic dissection of evolved changes. While mapping experiments generate lists of interesting candidate genes, functional genetic manipulations are required to test the roles of these genes. Gene regulation can be studied with transgenic reporter plasmids and BACs integrated into the genome using the Tol2 transposase system. Functions of specific candidate genes and cis-regulatory elements can be assessed by inducing targeted mutations with TALEN and CRISPR/Cas9 genome editing reagents. All methods require introducing nucleic acids into fertilized one-cell stickleback embryos, a task made challenging by the thick chorion of stickleback embryos and the relatively small and thin blastomere. Here, a detailed protocol for microinjection of nucleic acids into stickleback embryos is described for transgenic and genome editing applications to study gene expression and function, as well as techniques to assess the success of transgenesis and recover stable lines.

Transgenic manipulations and genome editing are critical for functionally testing the roles of genes and cis-regulatory elements. Here a detailed microinjection protocol for the generation of genomic modifications (including Tol2-mediated fluorescent reporter transgene constructs, TALENs, and CRISPRs) is presented for the emergent model fish, the threespine stickleback.

Microinjection עבור עריכת Transgenesis ו הגנום ב הקוצנים Threespine

The threespine stickleback fish has emerged as a powerful system to study the genetic basis of a wide variety of morphological, physiological, and ...

A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. In particular, posterior body elongation is an essential process in embryonic development by which multiple tissue deformations act together to direct the formation of a large part of the body axis. In order to observe this process by long-term time-lapse imaging it is necessary to utilize a mounting technique that allows sufficient support to maintain samples in the correct orientation during transfer to the microscope and acquisition. In addition, the mounting must also provide sufficient freedom of movement for the outgrowth of the posterior body region without affecting its normal development. Finally, there must be a certain degree in versatility of the mounting method to allow imaging on diverse imaging set-ups. Here, we present a mounting technique for imaging the development of posterior body elongation in the zebrafish D. rerio. This technique involves mounting embryos such that the head and yolk sac regions are almost entirely included in agarose, while leaving out the posterior body region to elongate and develop normally. We will show how this can be adapted for upright, inverted and vertical light-sheet microscopy set-ups. While this protocol focuses on mounting embryos for imaging for the posterior body, it could easily be adapted for the live imaging of multiple aspects of zebrafish development.

Here, we present a versatile mounting method that allows for the long-term time-lapse imaging of the posterior body development of live zebrafish embryos without perturbing normal development.

שיטת הרכבה צדדית עבור Long Term הדמיה של פיתוח דג זברה

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. ...

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. Although many immunohistochemistry protocols have been optimized for mammalian tissue and tissue sections, these protocols often require modification and optimization for non-mammalian model organisms. Zebrafish are increasingly used as a model system in basic, biomedical, and translational research to investigate the molecular, genetic, and cell biological mechanisms of developmental processes. Zebrafish offer many advantages as a model system but also require modified techniques for optimal protein detection. Here, we provide our protocol for whole-mount fluorescence immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae. This protocol additionally describes several different mounting strategies that can be employed and an overview of the advantages and disadvantages each strategy provides. We also describe modifications to this protocol to allow detection of chromogenic substrates in whole mount tissue and fluorescence detection in sectioned larval tissue. This protocol is broadly applicable to the study of many developmental stages and embryonic structures.

Here, we present a protocol for fluorescent antibody-mediated detection of proteins in whole preparations of zebrafish embryos and larvae.

כל הר אימונוהיסטוכימיה בזיבפיש עוברים וזחלים

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...

In Situ Hybridization in Zebrafish Larvae and Juveniles during Mesonephros Development

The zebrafish forms two kidney structures in its lifetime. The pronephros (embryonic kidney) forms during embryonic development and begins to function at 2 days post fertilization. Consisting of only two nephrons, the pronephros serves as the sole kidney during larval life until more renal function is required due to the increasing body mass. To cope with this higher demand, the mesonephros (adult kidney) begins to form during metamorphosis. The new primary nephrons fuse to the pronephros and form connected lumens. Then, secondary nephrons fuse to primary ones (and so on) to create a branching network in the mesonephros. The vast majority of research is focused on the pronephros due to the ease of using embryos. Thus, there is a need to develop techniques to study older and larger larvae and juvenile fish to better understand mesonephros development. Here, an in situ hybridization protocol for gene expression analysis is optimized for probe penetration, washing of probes and antibodies, and bleaching of pigments to better visualize the mesonephros. The Tg(lhx1a-EGFP) transgenic line is used to label progenitor cells and the distal tubules of nascent nephrons. This protocol fills a gap in mesonephros research. It is a crucial model for understanding how new kidney tissues form and integrate with existing nephrons and provide insights into regenerative therapies.

In Situ Hybridization in Zebrafish Larvae and Juveniles during Mesonephros Development

The zebrafish is an important model for understanding kidney development. Here, an in situ hybridization protocol is optimized to detect gene expression in zebrafish larvae and juveniles during mesonephros development.

בסיטו הכלאה בזחלי זברה וצעירים במהלך פיתוח מסונפרוס

The zebrafish forms two kidney structures in its lifetime. The pronephros (embryonic kidney) forms during embryonic development and begins to function at ...

Using Alizarin Red Staining to Detect Chemically Induced Bone Loss in Zebrafish Larvae

Chemically induced bone loss due to lead (Pb) exposure could trigger an array of adverse impacts on both human and animal skeletal systems. However, the specific effects and mechanisms in zebrafish remain unclear. Alizarin red has a high affinity for calcium ions and can help visualize the bone and illustrate skeletal mineral mass. In this study, we aimed to detect lead acetate (PbAc)-induced bone loss in zebrafish larvae by using alizarin red staining. Zebrafish embryos were treated with a series of PbAc concentrations (0, 5, 10, 20 mg/L) between 2 and 120 h post fertilization. Whole-mount skeletal staining was conducted on larvae at 9 days post fertilization, and the total stained area was quantified using ImageJ software. The results indicated that the mineralized tissues were stained in red, and the stained area decreased significantly in the PbAc-exposure group, with a dose-dependent change in bone mineralization. This paper presents a staining protocol for investigating skeletal changes in PbAc-induced bone defects. The method can also be used in zebrafish larvae for the detection of bone loss induced by other chemicals.

Here, we have used alizarin red staining to show that lead acetate exposure causes a bone mass change in zebrafish larvae. This staining method can be adapted to the investigation of bone loss in zebrafish larvae loss induced by other hazardous toxicants.

שימוש בכתמים אדומים של אליזרין לאיתור אובדן עצם הנגרם כימית בזחלי דגי זברה

Chemically induced bone loss due to lead (Pb) exposure could trigger an array of adverse impacts on both human and animal skeletal systems. However, the ...

שינוי גנטי של אורגנואידים מוחיים פרימטים

Targeted Microinjection and Electroporation of Primate Cerebral Organoids for Genetic Modification

The cerebral cortex is the outermost brain structure and is responsible for the processing of sensory input and motor output; it is seen as the seat of higher-order cognitive abilities in mammals, in particular, primates. Studying gene functions in primate brains is challenging due to technical and ethical reasons, but the establishment of the brain organoid technology has enabled the study of brain development in traditional primate models (e.g., rhesus macaque and common marmoset), as well as in previously experimentally inaccessible primate species (e.g., great apes), in an ethically justifiable and less technically demanding system. Moreover, human brain organoids allow the advanced investigation of neurodevelopmental and neurological disorders.
As brain organoids recapitulate many processes of brain development, they also represent a powerful tool to identify differences in, and to functionally compare, the genetic determinants underlying the brain development of various species in an evolutionary context. A great advantage of using organoids is the possibility to introduce genetic modifications, which permits the testing of gene functions. However, the introduction of such modifications is laborious and expensive. This paper describes a fast and cost-efficient approach to genetically modify cell populations within the ventricle-like structures of primate cerebral organoids, a subtype of brain organoids. This method combines a modified protocol for the reliable generation of cerebral organoids from human-, chimpanzee-, rhesus macaque-, and common marmoset-derived induced pluripotent stem cells (iPSCs) with a microinjection and electroporation approach. This provides an effective tool for the study of neurodevelopmental and evolutionary processes that can also be applied for disease modeling.

מחבר זרקור: מיקרו-הזרקה ממוקדת ואלקטרופורציה של אורגנואידים מוחיים פרימטים לשינוי גנטי  

The electroporation of primate cerebral organoids provides a precise and efficient approach to introduce transient genetic modification(s) into different progenitor types and neurons in a model system close to primate (patho)physiological neocortex development. This allows the study of neurodevelopmental and evolutionary processes and can also be applied for disease modeling.

מיקרו-הזרקה ממוקדת ואלקטרופורציה של אורגנואידים מוחיים פרימטים לשינוי גנטי

The cerebral cortex is the outermost brain structure and is responsible for the processing of sensory input and motor output; it is seen as the seat of ...