Name: a versatile mounting method for long term imaging of zebrafish development
Uploaded: 2017-01-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 55 s
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Estelle Hirsinger: Core funding from the Institut Pasteur and Agence Nationale de la Recherche (ANR-10-BLAN-121801 DEVPROCESS). Estelle Hirsinger is from the Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS). Benjamin Steventon was funded by the Agence Nationale de la Recherche (ANR- 10-BLAN-121801 DEVPROCESS), then a Roux fellowship (Institut Pasteur) then an AFM-Te&#769;le&#769;thon fellowship (number 16829). He is now supported by a Wellcome Trust/Royal Society Sir Henry Dale Fellowship.

1. Herstellung von Lösungen und Pulled Glasnadel <ol><li> Machen Sie eine 25x Stammlösung von Tricaine (3-Amino benzoesäureethylester, die auch als Ethyl-3-aminobenzoat) bei 4 mg / ml in 20 mM Tris pH 8,8 und bringen diese Lösung bei pH 7. Aliquot von 4 ml und an einem -20 ° C. HINWEIS: Das Anästhetikum Tricaine wirkt bevorzugt auf neuronalen spannungsgesteuerten Natriumkanäle dadurch blockiert Muskelzuckungen und Bewegung 6. </li><li> Machen Sie eine Arbeitslösung von Tricaine bei einer Endkonzentration von 0,17 mg / ml in E3 Embryo Medium. 7 HINWEIS: Stellen Sie die Tricaine Arbeitslösung unvorbereitet wie der pH-Wert dieser Lösung driftet. </li><li> Man löst den niedrigschmelzender Agarose bis zu einer Endkonzentration von 1,5% in E3 embryo-Medium in einem 50 ml-Röhrchen, indem die Lösung in einer Mikrowelle erhitzt wird. entweder in einem Wasserbad oder Benchtop-Inkubator 45 ° C - Lassen Sie diese Lösung auf 42 ins Gleichgewicht. Wenn die Vorbereitung große Gerichte für vertikaleLichtbogen-Bildgebung (Schritt 4), zusätzlich 25 ml 1% Standard Schmelzen Agarose in E3 Embryo Medium. </li><li> Verwenden Sie Borosilikatglas mit Filament Kapillaren mit Abmessungen von 1,20 mm OD, ID 0,69 mm, Länge 10 mm. </li><li> Wenn Kapillaren von der Art der Heizung Faden Nadel Abzieher beschrieben in der Tabelle von Geräten und Reagenzien gezogen wird , verwenden Sie die folgenden Einstellungen: Wärme 600, Pull 120, Geschwindigkeit 50, Zeit 225, Druck 500. Mit einem Paar scharfe Zange, Pause die Nadel gerade hinter dem Punkt, an dem es biegt sich für orientierende Embryonen eine saubere und scharfe Nadel zu schaffen und überschüssige Agarose zu entfernen. Ein Mikroskalpell kann auch verwendet werden, um überschüssige Agarose zu entfernen. </li></ol> 2. Einbettung von Embryonen für Inverted oder Upright Mikroskopie <ol><li> Heben Sie die Embryonen in E3 Embryo Medium auf die entsprechende Bühne. 7 </li><li> Bei der erforderlichen Stufe dechorionate Embryonen mit einem Paar von scharfen Pinzette unter einem Binokular dissecting Mikroskop. </li><li> Inkubieren Sie die dechorionated Embryonen für mindestens 5 min in der Tricaine Arbeitslösung. </li><li> Sobald die geschmolzene Agarose-Lösung auf 45 ° C abgekühlt ist, verwenden, um eine Glaspasteurpipette den dechorionated Embryo direkt in das 50 ml-Röhrchen mit minimaler Übertragung von E3 Medium zu übertragen. </li><li> Entfernen Embryo zusammen mit etwa 1 ml Medium Montage und fügen Sie ca.. 100 &amp; mgr; l mit einem 10 mm Mikrotiterplatten-Medium zusammen mit dem Embryo mit dem zentralen Kreis einer 35 mm Glasboden-Petrischale Montage. </li><li> Da die Montagemedium setzt, um den Embryo an den Rand des Kreises der Agarose mit dem Schwanz nach außen (Abbildung 1A) gegenüber zu bewegen. Verwenden Sie die Kapillarnadel den Embryo in der gewünschten seitlichen Ausrichtung zu halten, bis das Gel vollständig eingestellt. Um das Bild zu hinteren Körperentwicklung, achten Sie darauf, den Embryo in eine seitliche einer Orientierung wie möglich zu orientieren. Daher halten den Embryo in dieser Stellung durch vorsichtiges adjustments mit der Kapillare Nadel. HINWEIS: Mehrere Embryonen kann an dieser Stelle auf die Montageschale gegeben werden, falls erforderlich. Wenn dies der Fall ist, übertragen, das niedrigschmelzende Agarose in die Schale erste und die Embryonen in der Mitte der Agarose Tropfen hinzu. Drücken Sie dann die Embryonen aus zu den Rändern des Glasring und orientieren in die gewünschte Position. Bis zu sechs Embryonen können auf diese Weise montiert werden, bevor die Agarose verfestigt wird. </li></ol> 3. Entfernen von überschüssiger Agarose Rund um den Hinterleib Hinweis: Dieser Abschnitt beschreibt das Verfahren, mit dem Agarose aus dem Bereich entfernt wird, um den hinteren Körper umgibt. Im Falle von posterior Körperdehnung, ist es wichtig, dass der Schwanz normalerweise wachsen-out kann zu gewährleisten. Durch das Entfernen der Agarose nach der Embryo durch Agarose vollständig aufgenommen wurde, wird der Embryo durch den Kopfbereich und etwa die Hälfte der Dottersack eingeschlossen gelassen. <ol><li> Nachdem die Agarose Tropfen gesetzt hat, überfluten die Petri-dish mit der Tricaine Arbeitslösung. </li><li> Unter einem Sezieren Binokular mit einer Durchlichtbasis, passen Sie die Spiegelposition und der Winkel des einfallenden Lichts, so dass der starke Kontrast für die Schnitte in der Agarose ermöglicht, durch den Betrieb deutlich zu sehen. </li><li> Zur Durchführung geschnitten 1 (Abbildung 1), verwenden Sie die Kapillar - Nadel oder die Mikro-Skalpell die Agarose auf halbem Weg entlang der Dotter zu schneiden, aus einer Position posterior nur zur Formherzfeld in die Position des somite 5 (5. anterioren Somiten). </li><li> Starten Sie den ersten Schnitt neben dem Inneres bilden, wie gezeigt, und die vollständige Weg durch die Agarose auf das Glas. </li><li> Halten Sie die Kapillare oder Mikroskalpell tief in der Agarose und langsam sah nach oben und unten , während beginnen einen langen Schnitt über den Embryo zu machen , wie 1 gezeigt Abbildung. Schneiden Sie so nah an der Embryo wie möglich, ohne den Embryo oder Eigelb Punktierung. </li><li> Als nächstes stellen Schnitte 2 und 3 (Abbildung 1 </strong&gt;) Aus der Position gegenüber dem Embryo beginnt und mit dem Schnitt bis auf das Glas ganzen Weg Bodenschale. Machen Sie 2 geschnitten, so dass sie tangential zu den ersten 5 Somiten ist, so dass eine uneingeschränkte dorsalwärts des hinteren Körpers entfaltet. Machen Sie 3 schneiden in einem Winkel von 90 ° mit dem Eigelb Oberfläche und ausgehend von der Heartfield. HINWEIS: Das Schneiden des Agarose , bis der Rand des Glaskreis hilft bei der Entfernung der Agarose als kompletter Block (Schritt 3.6) (wie in Abbildung 1 gezeigt). Jedoch ist dies nicht notwendig. </li><li> Beginnend an der Kreuzung der Schnitte 1 und 3 machen einen langsamen Diagonalschnitt gegen Ende des Schnitts 2, während sich langsam nach oben, um das Anheben des quadratischen Agarose rund um den hinteren Körper zu entfernen. Anmerkungen: In einigen Fällen wird dies in einem Block freigegeben werden und der Betrieb wird in einem Arbeitsgang abgeschlossen. In anderen Fällen kann es mehrere Versuche, dis-lodge alle Agarose rund um den Embryo nehmen. </li><li> Mit einem Paar scharfe Zange, entfernen Sie das verdrängt bSchlösser von Agarose aus dem Embryo Medium. in diesem Prozess zu unterstützen, die Agarose-Stücke auf die Seite der Schale bewegen und die Wand der Petrischale als Träger verwenden, während die Agarose-Stücke herausheben. </li></ol><img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/55210/55210fig1.jpg" /> Abbildung 1: Diagramme von Montage - Set-ups. (A) Das Diagramm zeigt die Position des montierten Embryo innerhalb der Mitte Glasring einer Petrischale. Auf der rechten Seite ist ein lautes Summen des Embryos mit jedem aufeinanderfolgenden Schnitt durch die mit dottted roten Linien Agarose gezeigt umgibt. (B) Die montierten Embryonen ist in der Seitenansicht diagrammed Anzeige der Leichtigkeit des Zugangs für Kehr- und aufrecht Ziele. (C) Ein ähnliches digram zeigt , wie Embryonen können für vertikale Lichtbogen Abbildungsaufbauten montiert werden. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55210/55210fig1large.jpg" target="_blank">Bitte cl</a>ick hier eine größere Version dieser Figur zu sehen. <ol start="9"><li> Wenn Muskelzucken nicht vollständig an diesem Punkt blockiert wird, fügen Tropfen Tricaine aus der Stammlösung von 4 mg / ml, pH 7. </li></ol> 4. Montage von Embryonen für vertikale Lichtbogen-Mikroskopie Hinweis: Dies ist eine Variante der oben beschriebenen Methode, dass für den Zugriff mehrerer Ziele umrissenen ermöglicht Abbilden von Proben durch vertikal orientierte SPIM. Die Idee hinter dieser Variante wird die Probe geringfügig höher als der Boden der Schale zu heben, um einen einfachen Zugang von zwei Abbildungsziele zu ermöglichen. <ol><li> Vor Montage zu probieren, Mantel eine 100 mm Petrischale aus Kunststoff mit 1% Agarose in E3 Medium bis zu einer Höhe von 5 mm und stehen lassen. </li><li> Geben Sie einen Tropfen von 1 ml mit niedrigem Schmelzpunkt Agarose in die Mitte des Tellers und stehen lassen. </li><li> Einbetten von Embryonen in niedrigschmelzender Agarose, wie in Abschnitt 2. Dieses Mal jedoch, entfernen Sie den Embryo aus dem 50-ml-TubeAgarose mit einem kleineren Tropfen Lösung (0,5 ml) und legen diese kleinen Tropfen auf dem 1 ml in der Mitte der Schale fallen. </li><li> Verwenden Sie die Kapillarnadel den Embryo in der Mitte des kleinen Tropfen zu platzieren und zu pflegen ihre korrekte Ausrichtung bis Gel festgelegt ist. </li><li> Fluten die Schale mit Tricaine Arbeitslösung und entfernen Sie das überschüssige Agarose, wie in Abschnitt 3, jedoch ohne durch das Polster von 1% Standard-Agarose-Schneiden. </li></ol>

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	<li>Graeden, E., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Imaging+of+the+Zebrafish+Embryonic+Brain+by+Confocal+Microscopy.">Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy.</a> J Vis Exp. (26), e1-e2 (2009).</li><li>Delaune, E. A., Fran&#231;ois, P., Shih, N. P., Amacher, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell-Resolution+Imaging+of+the+Impact+of+Notch+Signaling+and+Mitosis+on+Segmentation+Clock+Dynamics.">Single-Cell-Resolution Imaging of the Impact of Notch Signaling and Mitosis on Segmentation Clock Dynamics.</a> Dev Cell. 23 (5), 995-1005 (2012).</li><li>Lawton, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+tissue+fluidity+steers+zebrafish+body+elongation.">Regulated tissue fluidity steers zebrafish body elongation.</a> Development. 140 (3), 573-582 (2013).</li><li>Dray, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-Fibronectin+Interactions+Propel+Vertebrate+Trunk+Elongation+via+Tissue+Mechanics.">Cell-Fibronectin Interactions Propel Vertebrate Trunk Elongation via Tissue Mechanics.</a> Curr Biol. 23 (14), 1335-1341 (2013).</li><li>Steventon, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species+tailoured+contribution+of+volumetric+growth+and+tissue+convergence+to+posterior+body+elongation+in+vertebrates.">Species tailoured contribution of volumetric growth and tissue convergence to posterior body elongation in vertebrates.</a> Development. 143, 1732-1741 (2016).</li><li>Attili, S., Hughes, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anaesthetic+Tricaine+Acts+Preferentially+on+Neural+Voltage-Gated+Sodium+Channels+and+Fails+to+Block+Directly+Evoked+Muscle+Contraction.">Anaesthetic Tricaine Acts Preferentially on Neural Voltage-Gated Sodium Channels and Fails to Block Directly Evoked Muscle Contraction.</a> PLoS ONE. 9 (8), 103751-103756 (2014).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book, 5th Edition; A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2007).</li><li>Schr&#246;ter, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+zebrafish+somitogenesis.">Dynamics of zebrafish somitogenesis.</a> Dev Dyn. 237 (3), 545-553 (2008).</li><li>Megason, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+toto+imaging+of+embryogenesis+with+confocal+time-lapse+microscopy.">In toto imaging of embryogenesis with confocal time-lapse microscopy.</a> Methods Mol Biol (Clifton, N.J.). 546, 317-332 (2009).</li><li>Sugiyama, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illuminating+cell-cycle+progression+in+the+developing+zebrafish+embryo.">Illuminating cell-cycle progression in the developing zebrafish embryo.</a> PNAS. 106 (49), 20812-20817 (2009).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Diese Befestigungstechnik ermöglicht Embryonen noch während der Übertragung an das Mikroskop und über an folgenden hinteren Körperdehnung mehrere Längenskalen dem Ziel eines langfristigen Zeitraffer-Imaging Experimente gehalten werden. Darüber hinaus ist es vielseitig, dass sie für die Bildgebung auf beiden aufrechten und der inversen Mikroskopie Aufbauten erlaubt, und ein Vorschlag gemacht wird, wie dies weiter vertikal ausgerichtet SPIM angepasst werden. Ein entscheidender Schritt in diesem Protokoll ist die sorgfältige Entfernung von überschüssigem Agarose rund um den hinteren Körper, zu ermöglichen, dass die normale Entwicklung dieser Struktur wichtig ist. Es ist wichtig, darauf zu achten, hier nicht in den Embryo zu beschädigen, insbesondere wenn um die Oberseite des Dotters die Agarose zu entfernen. Außerdem muss darauf geachtet werden, wenn der Schnitt Agaroseblock aus der ganzen Embryo zu entfernen, wie es manchmal ist es möglich, den Embryo aus der Form während dieses Prozesses zu verlieren. Aus diesen Gründen ist das eine niedrige Durchsatzverfahren That ist nicht geeignet für die Montage von vielen Genaktivität im Gegensatz gleichzeitig zu bereits veröffentlichten Verfahren unter Verwendung von 3D-Druck Kunststoff-Formen. 8, 9 sind jedoch Embryonen durch diese Befestigungsmethode sehr stabil und können daher mit dem Mikroskop viel einfacher, und behalten ihre 3D - Orientierung im gesamten Körper posterior Dehnung transportiert werden. Ein weiterer wichtiger Schritt ist die Genauigkeit der anfänglichen seitlichen Ausrichtung des Embryos, und auf Vermeidung antero-posterior oder dorso-ventralen Neigung. Entweder Neigung wird die seitliche Sicht des hinteren Körperstreckung entgegen, die am bequemsten Blickwinkel für die weitere Analyse ist. Die anteroposteriore Neigung wird zusätzlich Ergebnis im hinteren Körper wächst nach oben oder unten in Bezug auf die horizontale Ebene, die den Erwerb von höheren Stacks in z bedeuten und damit zeit Verfehlungen mit einer geringeren Zeitauflösung. Diese Methode ist versatile und ist für die Bildgebung der Zellteilung Raten bei der Verwendung der Fucci Leitung 5, 10 sowie mehreren skalaren morphometrische Analysen erlaubt. Allerdings 5 kann die dramatische Gesamtverschiebung des Schwanzknospen während der Verlängerung der hinteren Körperachse, nur eine relativ geringe Vergrßerung Ziele ergibt , verwendet werden , den gesamten Prozess zu erfassen, wie in Abbildung 2 dargestellt. Dies liegt daran , höhere Vergrößerung Ergebnisse in der Region von Interesse das Sichtfeld innerhalb von 3 verlassen - 4 h Erwerb (Video Abbildung 1). Daher besteht ein Weg, um die Abbildung des Schwanzknospe verbessern, ist eine automatische Tracking-Algorithmus zu haben, die die Gesamtbewegung des Schwanzknospe verfolgen und die x, y, z-Position des Mikroskoptisches während der Akquisition einzustellen. Gegeben hier beschrieben, um die erhöhte Stabilität des Embryos in allen axialen Abmessungen mit dem Befestigungsverfahren sollte geeignet sein, umein solcher Ansatz.

Posterioren Körper Dehnung ist ein wesentlicher Prozess bei der Embryonalentwicklung, durch die der Embryo ein großer Teil der Körperachse zu bilden, erstreckt. Es ist ein Beispiel eines komplexen morphogenetic Prozess, bei dem mehrere Zellverhalten koordinativ die Morphogenese auf der Ebene der einzelnen Gewebe zu erzeugen, wirken. Diese unterschiedlichen Gewebedeformationen dann zusammen wirken, um die Dehnung des hinteren Körpers an der gesamten Strukturebene zu erzeugen. Um zu verstehen , wie diese Prozesse werden gesteuert , und während der Entwicklung koordiniert, müssen wir in der Lage sein , diese Verfahren bei mehreren Skalen zu folgen (dh auf der Ebene von Molekülen, Zellen, Zellpopulationen und Gewebe) , und dieses an die Morphogenese der gesamten Struktur direkt zu beziehen . Zebrabärbling-Embryonen sind für die Bildgebung hintere Körperdehnung ideal als ihre optische Transparenz und die geringe Größe ermöglicht die Anwendung der minimal-invasiven Bildgebung Licht nähert sich gut für Live-Bildgebung. 1 Dieses wurde durch eine Reihe neuerer Publikationen belegt worden , die Licht auf hintere Körperentwicklung auf der Ebene von Molekülen vergossen haben, 2 Einzelzellen, 3 und inter Gewebe Verhaltensweisen, 4 sowie auf der Ebene der Zellpopulation und ganze Organ. 5 Advanced Imaging-Techniken wie konfokale Multiphotonenmikroskopie und selektive Ebene Beleuchtung Mikroskopie (SPIM) ermöglichen die langfristige Darstellung von Entwicklungsprozessen mit einer verminderten Wirkung von Licht Toxizität und Photobleaching. Robusten Techniken für die Montage von lebenden Proben benötigt werden drei Ziele zu erreichen: 1) eine ausreichende Unterstützung für das Mikroskop während der Übertragung Proben in der richtigen Ausrichtung zu halten und während der Aufnahme, 2) eine ausreichende Bewegungsfreiheit der Probe für das Auswachsen zu ermöglichen von der hintere Körperbereich ohne seine normale Entwick beeinflussenwicklung und schließlich 3) ein gewisses Maß an Vielseitigkeit des Montageverfahrens Bildgebung auf verschiedenen Imaging-Setups zu ermöglichen. Dieses Protokoll stellt eine Montagetechnik zum Abbilden der Entwicklung der Zebrabärbling D. rerio. Diese Technik beinhaltet Embryonen so dass der Kopf und yolk sac Regionen fast vollständig in Agarose enthalten, während Verlassen der posterior Körperbereich zu verlängern und zu entwickeln, die normalerweise Montage. Als solches ist es auch ein geeignetes Verfahren für die Langzeit-Bildgebung von anderen Regionen des Entwicklungs Körper als die Agarose Bildgebung durch Standardlichtabbildungstechniken ermöglicht. Dieses Protokoll veranschaulicht in einer seitlichen Ausrichtung von Embryonen Befestigungs, obwohl es auch möglich ist, Embryonen in alternativen Orientierungen zu montieren. Es wird weiter zeigen, wie das Verfahren zur aufrechten, umgedreht und vertikale Lichtbogen-Mikroskopie-Setups anzupassen.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;CONSUMABLES&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass-bottomed dishes</td><td>Mattek</td><td>P35-1.5-10-C</td><td>35 mm Petri dish, 10 mm microwell. No. 1.5 cover glass</td></tr><tr><td>Capillaries for injection needles</td><td>&amp;nbsp;Sutter&amp;nbsp;</td><td>BF 120-94-10</td><td>We use orosilicate glass with filament, OD 1.20 mm, ID 0.94 mm, length 10 cm. However, filament needles are not necessary and most injection standard needles should work.</td></tr><tr><td>Micro-scalpel</td><td>Feather</td><td>P-715</td><td>Micro Feather disposable opthalmic scalpel with plastic handle</td></tr><tr><td>Pasteur Pipettes</td><td></td><td></td><td>230 mm long</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;REAGENTS&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Low-melting point agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9414</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;EQUIPMENT&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fine forceps&amp;nbsp;</td><td>FINE SCIENCE TOOLS GMBH&amp;nbsp;</td><td>11252-30&amp;nbsp;</td><td>Dumont #5</td></tr><tr><td>Needle puller&amp;nbsp;</td><td>Sutter&amp;nbsp;</td><td>P97</td><td>Heating-filament needle puller</td></tr><tr><td>Binocular dissecting microscope</td><td>Leica</td><td>S8 Apo</td><td></td></tr></tbody></table>

a versatile mounting method for long term imaging of zebrafish development

Zebrabärbling-Embryonen bieten eine ideale experimentelle System komplexe morphogenetischen Prozesse zu untersuchen aufgrund ihrer leichten Zugänglichkeit und optische Transparenz. Insbesondere ist hintere Körperdehnung ein wesentlicher Prozess in der embryonalen Entwicklung, durch die Verformungen mehrere Gewebe zusammen, um die Bildung eines großen Teils der Körperachse zu lenken handeln. Um diesen Prozess durch langfristige Zeitraffer-Bildgebung zu beobachten, ist es notwendig, eine Montagetechnik zu verwenden, die ausreichende Unterstützung ermöglicht es, Proben in der richtigen Ausrichtung während der Übertragung an das Mikroskop und den Erwerb zu halten. Darüber hinaus muss die Montage bieten auch ausreichende Bewegungsfreiheit für das Auswachsen des hinteren Körperbereich ohne seine normale Entwicklung zu beeinflussen. Schließlich muss ein gewisses Maß an Vielseitigkeit des Montage Methode, um Bildgebung auf verschiedenen Abbildungsaufbauten ermöglichen. Hier präsentieren wir eine Montagetechnik für die Abbildung der Entwicklung des hinteren Körpers Elongation in der Zebrabärbling D. rerio. Diese Technik beinhaltet Embryonen, so dass der Kopf und Dottersack Regionen sind fast vollständig in Agarose enthalten, während das Weglassen der hinteren Körperbereich zu verlängern und zu entwickeln, die normalerweise Montage. Wir werden zeigen , wie sich dies für aufrecht, umgekehrt und vertikale Lichtbogen - Mikroskopie - Set-ups angepasst werden. Während dieses Protokoll Embryonen für die Bildgebung bei der Montage für den hinteren Körper konzentriert, könnte es leicht für die Live-Bildgebung von mehreren Aspekten der Zebrabärblingentwicklung angepasst werden.

Das Protokoll oben skizzierte Details eine vielseitige Technik zur Montage von Genaktivität für die Langzeit Zeitraffer-Bildgebung. Ein Beispiel hierfür ist in 2A und in animierter / Video - 1 gezeigt. Die Embryonen wurden in der 1-Zell-Stadium injiziert mit mRNA, die das Photokonvertierbare fluoreszierendes Protein kikumeGR kodiert. Am 15 Somiten Stadium wurden sie wie oben beschrieben montiert und für 12 h auf einem invertierten konfokalen Mikroskop mit einem 10X-Objektiv abgebildet wird. Die resultierenden konfokalen Stapel wurden maximal wie gezeigt projiziert angezeigt werden. Dieser Film zeigt deutlich, dass der hintere Körper frei während der gesamten Dauer des Films zu verschieben erlaubt und zeigt ähnliche Veränderungen in der Morphologie wie in Embryonen gesehen, die frei über ihre Chorion in normalen Kulturbedingungen erlaubt zu entwickeln. Ein weiteres Beispiel ist in der B ild 2B gezeigtund animierte / Video 2. Hier wurden die Embryos in der 16 Zelle injiziert Stufe mit einer Kombination von mRNAs Histon 2B-mCherry Protein (dh Etiketten , die Kerne) und eGFP: CAAX - Box (das Etiketten - Membranen, Details siehe Referenz 5). Sie wurden dann , wie in 1B schematisch dargestellt mit einem Eintauchen in Wasser 25X Ziel an einer aufrechten Multiphotonen- Mikroskop abgebildet wird . Die Bilder wurden für 3 Stunden von der 10 somite Bühne genommen, um zelluläre Verhalten während Schwanzknospen Bildung sichtbar zu machen. Die Zellen können aktive Vorsprünge und Richtungsbewegungen wie die Schwanzknospe Formen normal zu erzeugen, zu sehen. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/55210/55210fig2.jpg" /> Abbildung 2: Beispiele für Zeitraffer-Imaging von posterior Körper Dehnung bei 10 X Vergrößerung. (A) aufeinanderfolgenden Frameseines repräsentativen Film, den Prozess der axialen Dehnung abdeckt. Embryonen werden in Seitenansicht mit posterior auf der rechten Seite des Bildes angezeigt. (B) aufeinander folgende Rahmen einer höheren Vergrößerung des Films einzelnen Zellverhalten während Schwanzknospen Bildung. Embryonen werden in Seitenansicht mit posterior nach rechts gezeigt. Die gepunkteten Linien umreißen die Bildung Schwanzknospe. Kleine farbige Linien zeigen Spuren von Kernen einzelnen Zellbewegungen zu folgen. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55210/55210fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55210/55210fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Video 1" src="/files/ftp_upload/55210/55210video1.jpg" /> Animierte / Video Abbildung 1: Zeitraffer-Film von posterior Körperdehnung eines KikumeGR mRNA injizierte Zebrabärbling Embryo durch konfokale Mikroskopie. Embryo mit anterior der linken und Poster gezeigtenior nach rechts. Die Bilder wurden in Intervallen von 10 min bei 10-facher Vergrößerung aufgenommen. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55210/Video_Figure_1.mov" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55210/Video_Figure_1.mov" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Video 2" src="/files/ftp_upload/55210/55210video2.jpg" /> Animierte / Video Abbildung 2: Zeitraffer-Film von posterior Körperdehnung eines Nuklear mCherry und Membran-GFP Labelled Zebrafischembryo Abgebildete durch Zwei-Photonen - Mikroskopie. Embryo mit anterioren nach rechts und posterior auf der linken Seite gezeigt. Die Bilder wurden in 2-Minuten-Intervallen bei 25X Vergrößerung. Farbige Linien zeigen Spuren von Zellen für die letzten zehn Zeitschritte für jede Zelle verfolgt. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55210/video_figure_2.mov" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55210/video_figure_2.mov" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

Here, we present a versatile mounting method that allows for the long-term time-lapse imaging of the posterior body development of live zebrafish embryos without perturbing normal development.

Eine vielseitige Montagemethode für Langzeit Imaging von Zebrabärblingentwicklung

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. ...

a-versatile-mounting-method-for-long-term-imaging-zebrafish

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

11.3K Aufrufe.  Institut Pasteur. Here, we present a versatile mounting method that allows for the long-term time-lapse imaging of the posterior body development of live zebrafish embryos without perturbing normal development.

Serie: A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

Imaging subzellulärer Strukturen in der Living Zebrafischembryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM compared to confocal systems are its low phototoxicity, gentle mounting strategies, fast acquisition with high signal to noise ratio and the possibility of imaging samples from various angles (views) for long periods of time. Imaging from multiple views unleashes the full potential of LSFM, but at the same time it can create terabyte-sized datasets. Processing such datasets is the biggest challenge of using LSFM. In this protocol we outline some solutions to this problem. Until recently, LSFM was mostly performed in laboratories that had the expertise to build and operate their own light sheet microscopes. However, in the last three years several commercial implementations of LSFM became available, which are multipurpose and easy to use for any developmental biologist. This article is primarily directed to those researchers, who are not LSFM technology developers, but want to employ LSFM as a tool to answer specific developmental biology questions. 
Here, we use imaging of zebrafish eye development as an example to introduce the reader to LSFM technology and we demonstrate applications of LSFM across multiple spatial and temporal scales. This article describes a complete experimental protocol starting with the mounting of zebrafish embryos for LSFM. We then outline the options for imaging using the commercially available light sheet microscope. Importantly, we also explain a pipeline for subsequent registration and fusion of multiview datasets using an open source solution implemented as a Fiji plugin. While this protocol focuses on imaging the developing zebrafish eye and processing data from a particular imaging setup, most of the insights and troubleshooting suggestions presented here are of general use and the protocol can be adapted to a variety of light sheet microscopy experiments.

Light sheet fluorescence microscopy is an excellent tool for imaging embryonic development. It allows recording of long time-lapse movies of live embryos in near physiological conditions. We demonstrate its application for imaging zebrafish eye development across wide spatio-temporal scales and present a pipeline for fusion and deconvolution of multiview datasets.

Mit Lichtblatt Fluoreszenzmikroskopie Bild Zebrabärbling Augenentwicklung

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo. Here we describe a method to mount zebrafish embryos for long-term imaging and demonstrate how to automate the capture of time-lapse images using a confocal microscope. We also describe a method to create controlled, precise damage to individual branches of peripheral sensory axons in zebrafish using the focused power of a femtosecond laser mounted on a two-photon microscope. The parameters for successful two-photon axotomy must be optimized for each microscope. We will demonstrate two-photon axotomy on both a custom built two-photon microscope and a Zeiss 510 confocal/two-photon to provide two examples.

Zebrafish trigeminal sensory neurons can be visualized in a transgenic line expressing GFP driven by a sensory neuron specific promoter 1. We have adapted this zebrafish trigeminal model to directly observe sensory axon regeneration in living zebrafish embryos. Embryos are anesthetized with tricaine and positioned within a drop of agarose as it solidifies. Immobilized embryos are sealed within an imaging chamber filled with phenylthiourea (PTU) Ringers. We have found that embryos can be continuously imaged in these chambers for 12-48 hours. A single confocal image is then captured to determine the desired site of axotomy. The region of interest is located on the two-photon microscope by imaging the sensory axons under low, non-damaging power. After zooming in on the desired site of axotomy, the power is increased and a single scan of that defined region is sufficient to sever the axon. Multiple location time-lapse imaging is then set up on a confocal microscope to directly observe axonal recovery from injury.

Here we describe a method for mounting zebrafish embryos for long-term imaging, two-photon imaging and tissue-damage techniques, and time-lapse confocal imaging.

Zwei-Photonen-Axotomie und Zeitraffer-konfokale Bildgebung in lebenden Zebrafisch-Embryonen

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Biologie

Dissection and Lateral Mounting of Zebrafish Embryos: Analysis of Spinal Cord Development

The zebrafish spinal cord is an effective investigative model for nervous system research for several reasons. First, genetic, transgenic and gene knockdown approaches can be utilized to examine the molecular mechanisms underlying nervous system development. Second, large clutches of developmentally synchronized embryos provide large experimental sample sizes. Third, the optical clarity of the zebrafish embryo permits researchers to visualize progenitor, glial, and neuronal populations. Although zebrafish embryos are transparent, specimen thickness can impede effective microscopic visualization. One reason for this is the tandem development of the spinal cord and overlying somite tissue. Another reason is the large yolk ball, which is still present during periods of early neurogenesis. In this article, we demonstrate microdissection and removal of the yolk in fixed embryos, which allows microscopic visualization while preserving surrounding somite tissue. We also demonstrate semipermanent mounting of zebrafish embryos. This permits observation of neurodevelopment in the dorso-ventral and anterior-posterior axes, as it preserves the three-dimensionality of the tissue.

Developmental processes such as proliferation, patterning, differentiation, and axon guidance can be readily modeled in the zebrafish spinal cord. In this article, we describe a mounting procedure for zebrafish embryos, which optimizes visualization of these events.

Dissection und seitlicher Anbau von Zebrafisch-Embryonen: Analyse der Rückenmarksentwicklung

The zebrafish spinal cord is an effective investigative model for nervous system research for several reasons. First, genetic, transgenic and gene ...

Neurowissenschaften

A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues or cells. A difficulty with imaging whole embryo development is that zebrafish embryos grow substantially in length. When mounted as regularly done in 0.3-1% low melt agarose, the agarose imposes growth restriction, leading to distortions in the soft embryo body. Yet, to perform confocal time-lapse microscopy, the embryo must be immobilized. This article describes a layered mounting method for zebrafish embryos that restrict the motility of the embryos while allowing for the unrestricted growth. The mounting is performed in layers of agarose at different concentrations. To demonstrate the usability of this method, whole embryo vascular, neuronal and muscle development was imaged in transgenic fish for 55 consecutive hours. This mounting method can be used for easy, low-cost imaging of whole zebrafish embryos using inverted microscopes without requirements of molds or special equipment.

This article describes a method to mount fragile zebrafish embryos for extended time-lapse confocal microscopy. This low-cost method is easy to perform using regular glass-bottom microscopy dishes for imaging on any inverted microscope. The mounting is performed in layers of agarose at different concentrations.

Eine geschichtete Montagemethode für die verlängerte Zeitraffer-Konfokalmikroskopie ganzer Zebrafisch-Embryonen

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues ...

Visualizing the Developing Brain in Living Zebrafish using Brainbow and Time-lapse Confocal Imaging

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in vivo imaging techniques can provide a clear window into these processes in the living organism. For example, dividing cells and their progeny can be followed in real time as the nervous system forms. In recent years, technical advances in multicolor techniques have expanded the types of questions that can be investigated. The multicolor Brainbow approach can be used to not only distinguish among like cells, but also to color-code multiple different clones of related cells that each derive from one progenitor cell. This allows for a multiplex lineage analysis of many different clones and their behaviors simultaneously during development. Here we describe a technique for using time-lapse confocal microscopy to visualize large numbers of multicolor Brainbow-labeled cells over real time within the developing zebrafish nervous system. This is particularly useful for following cellular interactions among like cells, which are difficult to label differentially using traditional promoter-driven colors. Our approach can be used for tracking lineage relationships among multiple different clones simultaneously. The large datasets generated using this technique provide rich information that can be compared quantitatively across genetic or pharmacological manipulations. Ultimately the results generated can help to answer systematic questions about how the nervous system develops.

In vivo imaging is a powerful tool that can be used to investigate the cellular mechanisms underlying nervous system development. Here we describe a technique for using time-lapse confocal microscopy to visualize large numbers of multicolor Brainbow-labeled cells in real time within the developing zebrafish nervous system.

Visualisierung des sich entwickelnden Gehirns bei lebenden Zebrafischen mit Brainbow und Zeitraffer-Konfokalbildnis

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in ...

Long-term Live Imaging Device for Improved Experimental Manipulation of Zebrafish Larvae

The zebrafish larva is an important model organism for both developmental biology and wound healing. Further, the zebrafish larva is a valuable system for live high-resolution microscopic imaging of dynamic biological phenomena in space and time with cellular resolution. However, the traditional method of agarose encapsulation for live imaging can impede larval development and tissue regrowth. Therefore, this manuscript describes the zWEDGI (zebrafish Wounding and Entrapment Device for Growth and Imaging), which was designed and fabricated as a functionally compartmentalized device to orient larvae for high-resolution microscopy while permitting caudal fin transection within the device and subsequent unrestrained tail development and re-growth. This device allows for wounding and long-term imaging while maintaining viability. Given that the zWEDGI mold is 3D printed, the customizability of its geometries make it easily modified for diverse zebrafish imaging applications. Furthermore, the zWEDGI offers numerous benefits, such as access to the larva during experimentation for wounding or for the application of reagents, paralleled orientation of multiple larvae for streamlined imaging, and reusability of the device.

This manuscript describes the zWEDGI (zebrafish Wounding and Entrapment Device for Growth and Imaging), which is a compartmentalized device designed to orient and restrain zebrafish larvae. The design permits tail transection and long-term collection of high-resolution fluorescent microscopy images of wound healing and regeneration.

Langfristige Live Imaging-Gerät für verbesserte experimentelle Manipulation von Zebrafischlarven

The zebrafish larva is an important model organism for both developmental biology and wound healing. Further, the zebrafish larva is a valuable system for ...

Biotechnik

Multilayer Mounting for Long-term Light Sheet Microscopy of Zebrafish

Light sheet microscopy is the ideal imaging technique to study zebrafish embryonic development. Due to minimal photo-toxicity and bleaching, it is particularly suited for long-term time-lapse imaging over many hours up to several days. However, an appropriate sample mounting strategy is needed that offers both confinement and normal development of the sample. Multilayer mounting, a new embedding technique using low-concentration agarose in optically clear tubes, now overcomes this limitation and unleashes the full potential of light sheet microscopy for real-time developmental biology.

The development of zebrafish can be followed over days with light sheet microscopy when embryos are embedded in optically clear polymer tubes with low-concentration agarose.

Multilayer-Halterung für Langzeit-Licht-Mikroskopie Blatt der Zebrafisch

Light sheet microscopy is the ideal imaging technique to study zebrafish embryonic development. Due to minimal photo-toxicity and bleaching, it is ...

4-Dimensional Imaging of Zebrafish Optic Cup Morphogenesis

Visual system function requires the establishment of precise tissue and organ structures. In the vertebrate eye, structural defects are a common cause of visual impairment, yet mechanisms of eye morphogenesis are still poorly understood. The basic organization of the embryonic eye is conserved throughout vertebrates, thus live imaging of zebrafish embryos has become a powerful approach to directly observe eye development at real time under normal and pathological conditions. Dynamic cell processes including movements, morphologies, interactions, division, and death can be visualized in the embryo. We have developed methods for uniform labeling of subcellular structures and timelapse confocal microscopy of early eye development in zebrafish. This protocol outlines the method of generating capped mRNA for injection into the 1-cell zebrafish embryo, mounting embryos at optic vesicle stage (~12 hours post fertilization, hpf), and performing multi-dimensional timelapse imaging of optic cup morphogenesis on a laser scanning confocal microscope, such that multiple datasets are acquired sequentially in the same imaging session. Such an approach yields data that can be used for a variety of purposes, including cell tracking, volume measurements, three-dimensional (3D) rendering, and visualization. Our approaches allow us to pinpoint the cellular and molecular mechanisms driving optic cup development, in both wild type and genetic mutant conditions. These methods can be employed directly by other groups or adapted to visualize many additional aspects of zebrafish eye development.

This protocol describes an approach for in toto labeling and multidimensional imaging of zebrafish early eye development. We describe labeling, embedding, and four dimensional (4D) imaging using laser scanning confocal microscopy, and considerations for optimizing acquisition of datasets for dissecting mechanisms of optic cup morphogenesis.

4-dimensionale Bildgebung der Zebrafisch-Optikbecher-Morphogenese

Visual system function requires the establishment of precise tissue and organ structures. In the vertebrate eye, structural defects are a common cause of ...

Layered Agar Mounting: Preparing Live Zebrafish Embryos for Long-Term Imaging with an Inverted Microscope

Source: Upadhyay S., et.al. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/60321/" target="_blank">A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos</a>. J. Vis. Exp. (2020).
This article describes a method to mount live zebrafish embryos for long term imaging. This method is cost effective and easy to perform using regular glass-bottom microscopy dishes for imaging on Inverted Microscope. The mounting is performed in layers of agarose at different concentrations.

Layered Agar Mounting: Vorbereitung lebender Zebrafischembryonen für die Langzeitbildgebung mit einem inversen Mikroskop

Source: Upadhyay S., et.al. A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (2020).
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