Yazarlar David Langenau cömertçe akvaryum yer verdiğiniz için teşekkür etmek istiyorum; Eric Stone, John C. Moore ve Qin Tang için Zebra balığı bakım ve reaktifler ve Anne Robertson ve Elliott Hagedorn burada kullanılan Zebra balığı zorlanma tedarik için Leonard Zon'ın Laboratuarı'ndan yardım. Onlar da Octavio Hurtado photolithographic teknikleri tavsiyeler için teşekkür etmek istiyorum. FE Shriner'ın hastaneden Arkadaş grupları tarafından çocuk ve Amerikan Avustralya Derneği için finanse edildi. Bu eser NIH tarafından finanse edildi GM92804 verin.

Larva mikroenjeksiyon Protokolü 2011N000127 altında Massachusetts genel hastane alt Komisyonu araştırma hayvan bakım tarafından kabul edildi.
1. cihaz imalat
Not: Burada açıklanan fotolitografi maskeleri tasarlamak için kullanılan tüm bilgisayar destekli çizim (CAD) dosyaları (şekil 1) elde edilebilir için download. Malzemeler tablo bağlantıları için bkz.
<ol><li>Bir sınıf 1.000 temiz oda standart photolithographic teknikleri7kullanarak ana kalıp gofret imal. Mikroyapı diziler ve kanallar için üreticinin yönergelerine göre sıralı olarak 3 ayrı maskeleri kullanarak 3 kat epoksi esaslı negatif fotorezist desen: 100 µm sığ özellikleri için orta özellikler için 200 µm ve 400 µm derin özellikleri. Görüntü aygıtı için sığ ve derin özellikleri için 600 µm 400 µm kullanarak desen iki katmanlı.</li>
	<li>Tamamlanan gofret 15 cm Petri kabına (Şekil 2) döküm için tabanına kaydet.</li>
</ol>2. Microstructured yüzey diziler - PDMS hazırlanması
<ol><li>Kullanılabilir aygıtlar açmak için ana gofret bir kalıp olarak kullanarak polydimethylsiloxane (PDMS), atıldı. 50 g PDMS monomer başlatıcı 5 g ile birleştirin ve plastik bir çatalla yemek ağırlığında bir plastik iyice karıştırın.</li>
	<li>Karışımı dikkatle kalıp dökün.</li>
	<li>Degas, 16-25 inHg (54-85 kPa) 1 h için bir vakum desiccator içinde.</li>
	<li>PDMS iyileştirmek için en az 3 h için 65 ° C'de pişirin. PDMS için sert ama esnek sağlam bir tedavi.</li>
	<li>Dikkatle cihazın bir neşter bisturi ucu ve gofret yüzey arasındaki temas korumak emin olmak istedim, kullanarak ana gofret kesti. Forseps kullanarak, gofret ve temiz bir 10 cm Petri dish, (şekil 3) özelliği tarafa aktarmak uzak PDMS yineleme kabuğu.</li>
	<li>Cihazın 35 için bir plazma fırın kullanarak oksijen plazma ile tedavi hydrophobicity azaltmak için s.</li>
	<li>168 mg/L etil 3-aminobenoate methanesulfonate (MS-222, pH 7.5) içeren Zebra balığı embriyo ile orta (E3) kapsar. Herhangi bir kabarcıklar akan tarafından daha derin özelliklerinden bir transfer pipet kullanarak aygıt yüzey üzerinde su kaldır.</li>
</ol>3. Microstructured yüzey diziler - özel hazırlanması
<ol><li>Bir negatif PDMS kalıp yapmak, oksijen plazma PDMS cihazla tedavi.</li>
	<li>
1H, 1H, 2H, 2H- Perfluorooctyltriethoxysilane (PFDTS) silane buharı8inert bir yüzey oluşturmak için PDMS cihazla tedavi. Kısaca:
	<ol>
<li>Bir duman başlık içinde bir vakum odasında özelliği-yan-up tedavi olmak için PDMS yerleştirin.</li>
		<li>PDMS yanındaki küçük bir açık cam veya alüminyum çanak yerleştirin ve dikkatle PFDTS 200 µL pipet (%98 silane) çanak içine. Dikkat: PFDTS silane son derece kırılgandır, şiddetle su ile reaksiyona girer, yanıcı ve kişinin üzerine şiddetli deri ve göz hasara neden olur. Okuma MSDS ayrıntılı kullanmadan önce.</li>
		<li>Vakum odası kapatır ve vakum 15-30 dakika, ya da PFDTS silane tamamen buharlaşıp kadar uygular.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cihazın bir Petri ve 2.1 2.3 adımda anlatıldığı gibi hazırlanan taze PDMS için bir kalıp olarak kullanın.</li>
	<li>En az 3 h için 65 ° C'de pişirin sonra tedavi aygıttan taze PDMS tüm katmanın soyma ve taze kabında yerleştirin. Bu o zaman olumsuz bir kalıp olarak özel oyuncular için kullanılabilir.</li>
	<li>Özel hazırlamak için özel tamamen eriyene kadar düşük jelleşme sıcaklık özel E3 içinde mikrodalga bir de %2 çözümünün kaynatın.</li>
	<li>Sıcak özel PDMS negatif kalıp dökün ve aygıt üzerinde bir aktarma pipet ile özellikleri tarafından akan sıcak özel kapsayan özel herhangi bir kabarcıklar kaldırmak.</li>
	<li>Kabarcıklar kaldırılır sonra 4 ° C özel ayarlamak için buzdolabında bekletin.</li>
	<li>El ile üzerinden PDMS altında bozulmayı tarafından olumsuz PDMS kalıp özel blok kaldırmak için bir yeni Petri kabına ve MS-222 içeren ıslak E3 ile özel blok aktarmak.</li>
</ol>4. görüntü aygıtları PDMS hazırlanması
<ol><li>Kullanılabilir aygıtlar açmak için PDMS ana gofret bir kalıp olarak kullanarak, atıldı. 50 g PDMS monomer başlatıcı (2.1 adımda kullanılan ile aynı) ve karışımı iyice bir plastik plastik Çatalla yemek ağırlığında 5 g ile birleştirir.</li>
	<li>Karışımı dikkatle kalıp dökün.</li>
	<li>Degas, 16-25 inHg (54-85 kPa) 1 h için bir vakum desiccator içinde.</li>
	<li>PDMS iyileştirmek için en az 3 h için 65 ° C'de pişirin. PDMS için sert ama esnek sağlam bir tedavi.</li>
	<li>Aygıtların Master gofret kesme ve 1.5 mm yumruk kullanarak bağlantı noktaları yumruk.</li>
	<li>Tedavi de aygıtlar ve bir 6-şey cam-alt plaka ile oksijen plazma için 35 s, 2.6. adımda açıklandığı gibi.</li>
	<li>Bir aygıt özelliği yan-aşağı her cam coverslip 6-şey plaka için 10 dk 85 ° C ocağın üzerine yerleştirerek bond. Not: başarılı bağ onaylamak için gümrüklü aygıtı forseps kullanarak bir yana firma basınç uygulayın. Cihazın cam coverslip bağlı kalmalıdır.</li>
</ol>5. Zebra balığı kültür
<ol><li>Kültür Zebra balığı embriyolar için 2 dpf standart teknikleri3kullanarak.</li>
	<li>Dechorionate embriyo forseps veya 1 mg/mL proteaz kullanarak (bkz: malzemeler tablo)3 yükleme üzerine cihaz, onları düzeltmek izin vermek için önce en az 30-60 dakika karıştırın.</li>
	<li>E3 (168 mg/1 mL 25 X ekleyerek M) MS-222 (pH 7.5) hisse senedi çözüm kendi kabında kullanarak embriyo uyuşturan.</li>
</ol>6. yönünü Microstructured yüzeyde - Divot diziler Zebra balığı
<ol><li>Öyle ki bu embriyoların daha kolay manipülasyon sağlar E3 ince (1-2 mm) tabakası ile kaplıdır, Petri kabına 2.7 (şekil 3A) adımda PDMS bloğundan hazırlayın.</li>
	<li>Embriyo (genellikle koşul başına 10-20) gerekli sayıda transfer pipet kullanarak PDMS blok yüzey aktarın.</li>
	<li>Embriyolardan aracını kullanarak (saç döngüsü veya benzer), embriyo microstructured efendim (şekil 3A) itin. Efendim kullanımı dorsal ve ventral yönler için özellikle uygundur. Not: Efendim ile sıkı bir için (dorsal ve ventral) uygun, blok paralel olarak divot yüzeyinde embriyo konumlandırma ve sonra onları bir saç döngüsü kullanarak pozisyona haddeleme deneyin. Divot daha derin iterek onları istikrarlı tutmaya yardımcı olacaktır.</li>
</ol>7. yönünü Microstructured yüzeyde - Zebra balığı Microstructured kanalları
<ol><li>E3 E3 düzeyi sokağın kenarına düşüyor ama rezervuar ve kanalları ve PDMS üzerinde ince bir tabaka hala mevcuttur kadar transfer pipet kullanarak microstructured kanalları (şekil 3B) desenli PDMS bloktan çizin.</li>
	<li>10 embriyo 5.3 adımından kenar taşması değil dikkatli olmak bir transfer pipet kullanarak rezervuar aktarın.</li>
	<li>Saç döngüsü kullanarak, uygun kanalının girişinde huni içine her embriyo işlemek ve embriyo başkanı doğru kanal ve kanal girerken embriyonun uygun yönlendirmeyi vardır öyle ki yönlendirmek.</li>
	<li>Her embriyo yerde tutmak için yardımcı kanal duvarlarında hikayedir microfeatures ulaşıncaya kadar bir saç döngüsü kullanarak kanal aşağı kaydırın. Microstructured kanalları kullanılması özellikle yanal yönlendirme için tavsiye edilir. Not: mikroenjeksiyon sırasında kayma embriyo azaltmak için rezervuar E3 çizerek yüzey gerilimi miktarını ayarlamayı deneyin.</li>
</ol>8. mikroenjeksiyon Zebra balığı
<ol><li>
Mikroenjeksiyon iğne hazırlayın.
	<ol>
<li>Micropipette çektirme yukarıda açıklanan4kullanan borosilikat cam microcapillary iğne yapmak. Elde edilen iğneler yaklaşık 10 mm Konik uzunluğu ile bir ucunda bir noktaya konik.</li>
		<li>Bu durumda 100 nM chemoattractant enjekte edilir çözüm hazırlamak (N-Formylmethionine-leucyl-fenilalanin (fMLP) veya Leukotriene B4 (LTB4)) ve 100 70 kDa rodamine dextran izleyici PBS nM.</li>
		<li>Çözüm 5 µL ince konik bir pipet kullanarak iğne yük ipucu (malzeme tabloya bakın).</li>
		<li>İğne manyetik bir stand üzerine monte ve bir picopump microinjector bağlı bir micromanipulator içine monte.</li>
	</ol>
</li>
	<li>45 ° açıyla iğne ucu konik ucunu Forseps ile pinching tarafından kır.</li>
	<li>Enjeksiyon bolus boyutu 1 ayarlaması nL picopump denetleyicisi enjeksiyon zamanında ayarlayarak.</li>
	<li>Mikroenjeksiyon iğne açısını ayarlayın. Bir iğne 45 °'in Embriyolardan denetleyicisinde genellikle embriyo uzunluğu paralel iğne ile iyi bir başlangıç noktası açısıdır. Bir dik açı embriyo yanal hareketi mikroenjeksiyon sırasında en aza indirmek için kullanılabilir.</li>
	<li>İğneyi yakın Petri kabına sol el ile ve hakkı olan iğne micromanipulator kontrol, mikroenjeksiyon, bu durumda ve vezikül hedef siteye mümkün olduğunca getir. Not: Ve vezikül dikdörtgen organ iki küçük ayrı karanlık dikdörtgen yapı (otoliths) içeren göz posterior olarak tespit edilebilir.</li>
	<li>Embriyolardan denetleyicisi kullanarak, iğne ucu vezikül içinde öyle ki (Bu durumda ve vezikül) hedef doku nüfuz ve picopump ayak pedalı anahtarı kullanarak önceden oluşturulmuş hacim enjekte. Not: doku penetrasyonu direnir, Embriyolardan denetleyicisi topuzu hafifçe dokunarak deneyin.</li>
	<li>Embriyo serbest bırakmak için bir transfer pipet kullanarak yukarıdan aşağıya doğru veya öyle ki embriyo çevreleyen E3 yayımlanan çanak dönen yüzey üzerinde E3 akışı.</li>
	<li>Embriyo transferi pipet kullanarak MS-222 E3 kurtarma yemek için aktarın.</li>
</ol>9. embriyo görüntüleme cihazı PDMS kullanarak tarama
<ol><li>Adım 4.7, akan E3 (+ MS-222) aygıttan bağlantı noktası üzerinden Başbakan. Bu yapılabilir bir 1000 µL pipet ya da dar uçlu transfer pipet kullanarak.</li>
	<li>Cihazın kaplı kadar iyi E3 + MS-222 ile doldurun.</li>
	<li>4 enjekte embriyo transferi pipet de her kullanarak adım 8.7 sunmak. Embriyo (Adım 5.3) yükleme öncesinde 1-2 min için E3 + MS-222 kuluçka tarafından istenirse önceden imzalat olabilir.</li>
	<li>Embriyolardan aracını kullanarak (saç döngüsü veya benzer), embriyoların istenen yönde (kuyruk-ilk veya kafa ilk, kullanılan aygıt bağlı olarak) görüntüleme kanal girişlerinde yönlendirmek ve bunları kısmen cihazın (şekil 4A) içine itin. Bu cihazın içine eşit çizerken yardımcı olacaktır.</li>
	<li>E3 embriyo kanalları (şekil 4B) görüntüleme için doğru yönde içine çizilmiş kadar 1.000 µL pipet veya transfer pipet kullanarak bağlantı noktası aygıtı aracılığıyla çizmek. Not: embriyo yakalama noktası geçmiş değil emmek için dikkatli olun, bu embriyolar zarar ve yönelimleri alter.</li>
	<li>İyi-plaka (şekil 4 c) görüntüleme için mikroskop aktarın.</li>
	<li>
Ters bir floresan mikroskop kullanarak görüntü.
	<ol>
<li>Büyütme uygun lens seçerek ayarlayın. 10 X genellikle Zebra balığı nötrofil geçiş görüntüleme için yararlı bir büyütme'dur.</li>
		<li>NET, ama değil doymuş her sinyal ışık kaynağı yoğunluğu ve pozlama süresi her kanal için ayarlanır.</li>
		<li>Esir alma imge her kanal için. Burada, biz yeşil flüoresan protein kullanılır (GFP, Ex: 470/22, Em: 525/50), Texas kırmızı (TxRed, Ex: 585/29, Em: 628/32) ve kanalları aktarılır. Çok kanallı görüntüler sonrası işleme sırasında kombine edilebilir (şekil 4B-ı).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+human+disease:+zebrafish+swim+into+view.">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nat Rev Genet. 8 (5), 353-367 (2007).</li><li>Dang, M., Fogley, R., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+Novel+Cancer+Therapies+Using+Chemical+Genetics+and+Zebrafish.">Identifying Novel Cancer Therapies Using Chemical Genetics and Zebrafish.</a> Adv Exp Med Biol. 916, 103-124 (2016).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).</li><li>Benard, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+zebrafish+embryos+with+intracellular+bacterial+pathogens.">Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens.</a> J Vis Exp. (61), (2012).</li><li>Ellett, F., Irimia, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microstructured+Surface+Arrays+for+Injection+of+Zebrafish+Larvae.">Microstructured Surface Arrays for Injection of Zebrafish Larvae.</a> Zebrafish. 14 (2), 140-145 (2017).</li><li>Bischel, L. L., Mader, B. R., Green, J. M., Huttenlocher, A., Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+Entrapment+By+Restriction+Array+(ZEBRA)+device:+a+low-cost,+agarose-free+zebrafish+mounting+technique+for+automated+imaging.">Zebrafish Entrapment By Restriction Array (ZEBRA) device: a low-cost, agarose-free zebrafish mounting technique for automated imaging.</a> Lab Chip. 13 (9), 1732-1736 (2013).</li><li>Brower, K., White, A. K., Fordyce, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-step+Variable+Height+Photolithography+for+Valved+Multilayer+Microfluidic+Devices.">Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices.</a> J Vis Exp. (119), (2017).</li><li>Shao, G., Wu, J., Cai, Z., Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+elastomeric+high-aspect-ratio+microstructures+using+polydimethylsiloxane+(PDMS)+double+casting+technique.">Fabrication of elastomeric high-aspect-ratio microstructures using polydimethylsiloxane (PDMS) double casting technique.</a> Sens Actuators A Phys. 178, 230-236 (2012).</li><li>Bhuiyan, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acinetobacter+baumannii+phenylacetic+acid+metabolism+influences+infection+outcome+through+a+direct+effect+on+neutrophil+chemotaxis.">Acinetobacter baumannii phenylacetic acid metabolism influences infection outcome through a direct effect on neutrophil chemotaxis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (34), 9599-9604 (2016).</li><li>Henry, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PhagoSight:+an+open-source+MATLAB&#174;+package+for+the+analysis+of+fluorescent+neutrophil+and+macrophage+migration+in+a+zebrafish+model.">PhagoSight: an open-source MATLAB&#174; package for the analysis of fluorescent neutrophil and macrophage migration in a zebrafish model.</a> PloS one. 8 (8), e72636 (2013).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dynam. 203 (3), 253-310 (1995).</li><li>Hemmil&#228;, S., Cauich-Rodr&#237;guez, J. V., Kreutzer, J., Kallio, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+simple,+and+cost-effective+treatments+to+achieve+long-term+hydrophilic+PDMS+surfaces.">Rapid, simple, and cost-effective treatments to achieve long-term hydrophilic PDMS surfaces.</a> Applied Surface Science. 258 (24), 9864-9875 (2012).</li><li>Masselink, W., Wong, J. C., Liu, B., Fu, J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-cost+silicone+imaging+casts+for+zebrafish+embryos+and+larvae.">Low-cost silicone imaging casts for zebrafish embryos and larvae.</a> Zebrafish. 11 (1), 26-31 (2014).</li><li>Yang, F., Gao, C., Wang, P., Zhang, G. J., Chen, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fish-on-a-chip:+microfluidics+for+zebrafish+research.">Fish-on-a-chip: microfluidics for zebrafish research.</a> Lab Chip. 16 (7), 1106-1125 (2016).</li><li>Wielhouwer, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+embryo+development+in+a+microfluidic+flow-through+system.">Zebrafish embryo development in a microfluidic flow-through system.</a> Lab Chip. 11 (10), 1815-1824 (2011).</li><li>Shen, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+student+team+in+a+University+of+Michigan+biomedical+engineering+design+course+constructs+a+microfluidic+bioreactor+for+studies+of+zebrafish+development.">A student team in a University of Michigan biomedical engineering design course constructs a microfluidic bioreactor for studies of zebrafish development.</a> Zebrafish. 6 (2), 201-213 (2009).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+on+a+chip:+a+novel+platform+for+real-time+monitoring+of+drug-induced+developmental+toxicity.">Zebrafish on a chip: a novel platform for real-time monitoring of drug-induced developmental toxicity.</a> PLoS One. 9 (4), e94792 (2014).</li><li>Akagi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Miniaturized+embryo+array+for+automated+trapping,+immobilization+and+microperfusion+of+zebrafish+embryos.">Miniaturized embryo array for automated trapping, immobilization and microperfusion of zebrafish embryos.</a> PLoS One. 7 (5), e36630 (2012).</li><li>Akagi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fish+on+chips:+Microfluidic+living+embryo+array+for+accelerated+in+vivo+angiogenesis+assays.">Fish on chips: Microfluidic living embryo array for accelerated in vivo angiogenesis assays.</a> Sens Actuators B Chem. 189, 11-20 (2013).</li><li>Lin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+mapping+of+brain-wide+activity+in+awake+and+drug-responsive+vertebrates.">High-throughput mapping of brain-wide activity in awake and drug-responsive vertebrates.</a> Lab Chip. 15 (3), 680-689 (2015).</li><li>Noori, A., Selvaganapathy, P. R., Wilson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+in+a+microfluidic+format+using+flexible+and+compliant+channels+and+electroosmotic+dosage+control.">Microinjection in a microfluidic format using flexible and compliant channels and electroosmotic dosage control.</a> Lab Chip. 9 (22), 3202-3211 (2009).</li></ol>

Yazarlar hiçbir çıkar çatışmaları bildirin.

Burada, nasıl kullanılacağını açıklar biz son zamanlarda 2 dpf Zebra balığı mikroenjeksiyon5kolaylaştırmak ve basit özel ücretsiz montaj aygıt için uygun görüntüleme embriyo tanıtmak için geliştirdiler. Bu araçlar imalat Zebra balığı teknikleri için yararlı aygıt için photolithographic teknikleri yardımcı programı vurgulayın.
MSA aygıtları özellikle yararlı için hücreleri veya parçacıklar enjeksiyon eğilimli toplama mikroenjeksiyon iğne mantar conidia veya teslimi için daha büyük bir iğne kullanımını gerektiren insan kanser hücreleri gibi içinde bulduk. Embriyo sık sık iğne ile temas rulo olarak ve vezikül (şekil 4) içine enjeksiyon belirli bir meydan okuma sunuyor. Biz kullanan şark ve Zebra balığı bir lateral içinde stabilize microstructured kanal bulmak yönlendirme büyük ölçüde geliştirilmiş performans ve bizim ellerde bu tekniğin doğruluk.
Montaj tutarlılık embriyo ve azaltılmış sırasında hasar olasılığı arasında artan özel kaçınarak nötrofil işe alım veya xenograft metastaz, değerlendirilmesi gibi farklı zaman noktalarda yanal odaklı Zebra balığı, hızlı görüntüleme için Kurtarma sonrası görüntüleme. Bu aygıtlar aynı zamanda Genişletilmiş zaman atlamalı görüntüleme için umut verici ve başarıyla en az balık hareketi 12 h ile çok kanallı, multiplane görüntüler yakalamak için kullanılan. Onlar özel tarafından kısıtlı değil çünkü larva aktif uzama sırasında bu dönem (54-78 hpf dan ~ 300 µm)11 sınırlanmamıştır ve normal olarak devam edebilirsiniz.
Hazırlanması ve bu araçların kullanımı en kritik adımlarda en temel PDMS mikrosıvısal cihazların kullanımı yaygındır: aygıt-meli var olmak iyice ıslak ve baloncuklar önlenebilir. Bu tür sorunları önlemek için oksijen plazma tedavi ile doğan yüzey hydrophilicity hala mevcut iken hemen onlar cihazlarında sonra E3 aygıtlardan ıslak. Oksijen plazma ile yeniden tedavi geçici hydrophilicity yaşında PDMS cihazlara geri yüklemek için de kullanılabilir.
Burada kullanılan kesin geometrileri, ikinci gün sonrası döllenme sırasında photolithographic teknikleri, ama mevcut tasarımları limit kullanım yüksek çözünürlüklü Zebra balığı için yararlanın. Re-Tasarım geçerli platformda temel geometrileri 1 dpf ve mikroenjeksiyon için 3 dpf başarılı yönünü sağlayacak. Daha fazla batmaz 4 dpf larvaları ile şişirilmiş yüzmek sidiktorbası yönünü büyük olasılıkla daha zor olacağını ve yüksek su gerilim ile birlikte rahat geometrileri gerektirir. Karmaşık aygıtlar akışı veya vakum entegre alternatif bir yaklaşım çok çeşitli gelişim aşamalarında ilgili sağlayabilir ama aynı zamanda Pompalar ve kablo kanalları, maliyet ve aygıt hatası riski artan kullanımı gerektirir.
PDMS Biyouyumluluk, şeffaflık ve yeniden kullanılabilirliği sağlamak burada açıklananlar gibi cihazlar imalatı için maliyet-etkin ve yararlı bir malzeme var. Zebra balığı için PDMS aygıtları kullanmanın bir dezavantajı E3 sığ tabakalarının cihazın yüzeyi Tarih bakımından zorlu yapabilirsiniz hydrophobicity var. Her ne kadar bu yeniden kullanılabilirliği sınırlar ve cihazların kırılganlık artar mikroenjeksiyon cihazlar özel döküm tarafından bu sorun önlenebilir. Tercih edilen bir alternatif hydrophilicity PDMS12veya uygun bir plastik yüzey kullanımı artar Biyouyumlu yüzey işlem kimliği olur.
Ya su gerginlik4 2 dpf, Zebra balığı mikroenjeksiyon için geçerli yöntemleri kullanabilir ya da basit Kanallar hareketsiz ve larvalar konumlandırmak için ticari kalıpları kullanarak özel döküm. Bu yaklaşımlar yönlendirmesi sınırlı denetim sağlamak ve embriyoların hızlı kurutma tarafından karmaşık. Microstructures efendim entegre ve burada kullanılan kanalları yönlendirmek ve üzerinde böylece kurutma riskini azaltarak tamamen su gerilim bağlı olmadan larvaları hareketsiz için tasarlanmıştır. Her ne kadar bu efendim derinliği onları mikroenjeksiyon için erişilmez duruma 3D yazdırılan kalıplar kullanılarak yapılan efendim daha önce için görüntüleme amacıyla13, embriyo yönünü için kullanılmıştır.
Zebra balığı görüntüleme için mikrosıvısal sistemlerinin kullanımı giderek yaygın14haline geliyor. Birden çok akış sistemleri aracılığıyla zaman içinde Zebra balığı gelişiminin gözlem yeteneği isteğe bağlı15,16,17bileşikler tanıtmak için izin vermek için geliştirilmiştir. Daha karmaşık aygıtlar bu sistemleri18,19nispeten yüksek işlem hacmi ile kolayca manipüle edilebilir basit bir küresel geometri sağlayan hala onların koryon iken içinde dizi embriyolar için tasarlanmıştır. Çeşitli gruplar platformları için diziliyor ve larva sahne Zebra balığı en kullanıcı dostu pasif micropump Beebe lab6 tarafından geliştirilen "ZEBRA" sistemi tahrik olmak çeşitli yönleri6,20, görüntüleme geliştirdik . ZEBRA sistem aksine biz tanımlamak aygıt burada emme, oluşturulan standart transfer pipet kullanarak kullanır, larva yerine sıralı paralel yükleme sırasında kanalları içine larva çizmek için bireysel larva tarafından sonrası Imaging kurtarılması sağlar pozitif akışı aynı bağlantı noktası üzerinden uygulanıyor. Ayrıca, PDMS aygıtları geleneksel cam-alt 6-şey plakaları görüntüleme için bağlı bu yüzden daha küçük bir ayak izi, bizim yaklaşım gerektirir.
Geçerli deneysel tasarım mikroenjeksiyon ve böylece öncelikle onlar geleneksel mikroenjeksiyon ekipman ve standart ile kullanılabilir görüntüleme için ayrı bir aygıt kullanır Inverted Mikroskoplar. Zaten otomatik mikroenjeksiyon Zebra balığı yumurta için mikrosıvısal yaklaşımlar var21ve son derece hassas diziliyor ve larva20yönünü "balık-tuzak" türü yöntemleri ile birlikte, öngörülebilir entegre bu cihazlar Ayrıca otomatik larva enjeksiyon ve görüntüleme bir gün bir gerçeklik olabilir.

Zebra balığı biyolojinin temel gelişimsel büyük ölçekli için genetik çalışmalar birçok alanları için güçlü bir model olarak ortaya çıktı ve1,2kimyasal ekranlarında. Basit, kolay kullanımı, geliştirilmesi için ticari olarak açmıştır tek hücreli zigot içine genetik materyal mikroenjeksiyon gen overexpression, nakavt, CRISPR/Cas9 mutagenesis ve transgenesis gibi rutin genetik manipülasyon itimat Yönlendirme ve yumurta enjeksiyon3için sabitleme için araçlar. Nakli ve enfeksiyon, gibi diğer yaklaşımlar genellikle mikroenjeksiyon sonraki sahne embriyo ve daha büyük ölçüm kapiller iğneler4kullanarak larva gerektirir. Ancak, hedef doku iterek veya embriyo haddeleme olmadan nüfuz daha zor olduğu gibi daha büyük gauge iğne kullanımı önemli teknik sorunlar, sunar. Bu koşullar altında işlem sırasında kurutma kaçınmak zor olsa embriyo stabilize etmek için gereken uygun su gerginlik ve embriyo elde etmek hedef doku içine enjeksiyon için ideal odaklı olabilir.
Mikroenjeksiyon, enjekte embriyo başarıyla enjekte seçin ve başlangıç zaman noktası görüntülerini yakalamak için ekran yararlıdır. Bu sorunları ele almak üzere, çeşitli yönleriyle mikroenjeksiyon5için hem hızlı görüntü tabanlı tarama sonrası enjeksiyon için 2 dpf embriyo dengelemeye yardımcı microstructured cihazları bir dizi geliştirdi.
Bu cihazlar içinde yeterli yapısal kararlılık elde etmek için photolithographic teknikleri kullanılmıştır. Mikroelektronik sanayi ve daha yakın zamanda yaygınlaştırılması mikrosıvısal imalat için yaygın olarak kullanılan, bu yaklaşımlardan 1-1000 µm, Zebra balığı embriyo ve larva manipülasyon için uygun bir ölçek uzanan dikey yapıları elde edebilirsiniz. Tüm aygıtlar kullanarak ucuz, fiziksel olarak sağlam, biyolojik olarak inert ve şeffaf olan polydimethylsiloxane (PDMS), fabrikasyon.
Microstructured yüzey diziler (MSAs) PDMS taşları desenli bir üst yüzeyi olarak biçimlendirilmiş, benzer şekilde özel bloklar halinde basit kanalları daha yaygın olarak kullanılan yumurta mikroenjeksiyon için. Sonrası enjeksiyon tarama için 6 görüntüleme aygıtları bir standart cam popolu 6-şey tabak içinde dizilmiş. Bu cihazlar embriyo kolay yükleme için tasarlanmış, kaldırma yordamı uygun görüntü tabanlı kurtarma kolaylaştırmak belirli embriyo izin verirken bu aygıtları daha daha kullanıcı dostu bir şekilde yaklaşımlar eleme daha önce tarafından geliştirilen Beebe laboratuvar6.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dow Corning Sylgard 184&#160; Polydimethylsiloxane (PDMS)&#160;</td>
			<td>Ellsworth Adhsives</td>
			<td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td>
			<td>For casting the devices. Kit includes PDMS monomer and Initiator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low gelling temperature agarose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9414-10G</td>
			<td>For casting agarose devices</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFDTS silane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>448931-10G</td>
			<td>For casting of negative PDMS molds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine (MS-222)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E10521-10G</td>
			<td>To anesthetize&#160; zebrafish&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine Dextran 70,000 Da</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D1818</td>
			<td>To trace microinjections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leukotriene B4 (LTB4)</td>
			<td>Cayman Chemicals</td>
			<td>20110</td>
			<td>Neutrophil chemoattractant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Formylmethionine-leucyl-phenylalanine (fMLP)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F3506-50MG</td>
			<td>Neutrophil chemoattractant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 cm Petri dish</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>08-757-148</td>
			<td>For Casting from the master wafer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass-bottom 6-well plates</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P06G-0-20-F</td>
			<td>For imaging devices</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass microcapillaries</td>
			<td>World Scientific Instruments</td>
			<td>TW-100-4</td>
			<td>For microinjection needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z350796</td>
			<td>For transferring zebrafish embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader tips</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>E5242956003</td>
			<td>For loading the microinjection needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harris Uni-Core 1.5 mm punch</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>15111-15</td>
			<td>To punch ports in PDMS imaging devices</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No.&#160;11 Scalpel</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10011-00</td>
			<td>For cutting PDMS&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont No. 5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-10</td>
			<td>For dechorionating embryos and breaking microinjection needle tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marzhauser Micromanipulator</td>
			<td>ASI&#160;</td>
			<td>MM33-R</td>
			<td>For manipulating microinjection needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stand</td>
			<td>MSC</td>
			<td>SPI - 87242624</td>
			<td>For mounting micromanipulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MPPI-3 Picopump controller</td>
			<td>ASI</td>
			<td>MPPI-3</td>
			<td>To control microinjection volume and timing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS inverted fluorescent microscope</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>EVOS FL</td>
			<td>To image injected embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ745</td>
			<td>For visualizing microinjecion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoCAD software</td>
			<td>Autodesk</td>
			<td></td>
			<td>Download AutoCAD files from: https://dx-doi-org.remotexs.ntu.edu.sg/10.6084/m9.figshare.4282853 and on the ZFIN community protocols wiki page: https://wiki.zfin.org/display/prot/ZFIN+ Protocol+Wiki &#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microstructured devices for optimized microinjection and imaging of zebrafish larvae

Zebra balığı ortaya çıkmıştır geniş çeşitli insan hastalıkları ve deneysel çalışmalar, artan bir dizi için yararlı bir araç güçlü bir model olarak büyük ölçekli kimyasal ve genetik ekranlar aracılığıyla temel gelişim biyolojisi kapsayan. Ancak, birçok deney, özellikle enfeksiyon ve xenograft modelleri, ilgili mikroenjeksiyon ve görüntüleme embriyo ve beceri ve uzmanlık gerektiren zahmetli tekniklerdir larva güveniyor. Hassas ve geçerli mikroenjeksiyon teknikleri-den geçerek artırmak için biz bir dizi yönlendirmek ve 2 gün sonrası döllenme (dpf), Zebra balığı embriyolar dengelemek için microstructured aygıtları önce menfez, dorsal veya yanal yönde geliştirdi yordam. Embriyo görüntülemede yardım için de paralel bir cam kapak notu karşı yanal olarak 4 Zebra balığı şark kanalları ile basit bir aygıt tasarlanmış. Birlikte, burada mevcut araçları Zebra balığı teknikleri optimizasyonu için yararlı aygıt oluşturmak için photolithographic yaklaşımlar etkinliğini göstermektedir.

Burada açıklanan yaklaşım geliştirme (şekil 1) ve photolithographic (Şekil 2) ve yumuşak tekniğinde (şekil 3) teknikleri kullanarak 2 dpf Zebra balığı ile kullanılacak cihazların üretim gösteriyor. Bu yöntem birçok tasarım yineleme ve değişiklikler hızlı test sağlar ve değişiklikler ve Mikroyapı boyutları diğer gelişim aşamasında Zebra balığı ile kullanılacak duruma getirilmesi onların uygulama uzatabilir.
Biz zorlu mikroenjeksiyon teknikleri ve rahat görüntüleme için bu cihazların kullanımı göstermektedir. Ve vezikül (şekil 4 d, beyaz çizgili anahat) yararlı, bağışıklık ayrıcalıklı ve izole bir site nötrofil işe alım Zebra balığı9' testleri için sağlar. Zebra balığı nötrofil standart chemoattractants, 100 tepki yeteneğini test etmek için fMLP ve LTB4 nM microinjected 2 dpf Zebra balığı embriyo (şekil 4F, J), ve veziküller microstructured kanal aygıtı ( kullanarak Şekil 1G) yanal yönde embriyolar dengelemek için. Enjeksiyonları yüksek molekül ağırlıklı rodamine dextran ile takip ve görselleştirme nötrofil alımı kolaylaştırmak için Tg(mpx:EGFP) embriyo gerçekleştirilen. Embriyo (şekil 4 d, H) ve tek başına (şekil 4E, ben) negatif denetimi olarak kullanılan rodamine enjekte embriyo uninjected. Mikroenjeksiyon, embriyo görüntü kanal aygıtı (şekil 1A, B) transfer edildi ve bir EVOS floresan mikroskop (şekil 4 c) kullanarak 30 dk ve 5 h mesaj enjeksiyon yansıma (şekil 4 d- G ve şekil 4 H-K, sırasıyla). Beklendiği gibi floresan nötrofil az sayıda sahte enjeksiyonlu ve vezikül, erken timepoint (şekil 4I), büyük olasılıkla zarar-aracılı işe alım nedeniyle işe. İlginçtir, rodamine dextran izleyici deneme sırasında otoliths içinde birikmesine gözlendi. Her iki chemoattractants (şekil 4F, J) için nötrofiller özellikle LTB4 karşılık olarak daha yüksek rakamlarla işe (şekil 4F).
Burada gösterilen temsilcisi sonuçlar başarılı kullanımı, bu yöntem için mikroenjeksiyon ve Zebra balığı görüntüleme gösterilmektedir. Zebra balığı nötrofil işe alım deneyleri bağlamında, uygulama bu araçların detaylı canlı görüntüleme teknikleri ve sofistike hücre göç analizi10 ile birlikte bu alanda gelecekteki deneyler için yararlı bir platform sağlar.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56498/56498fig1.jpg"> Şekil 1: bilgisayar destekli çizim (CAD) tasarım fotolitografi maskeler. (A-C) En düşük CAD tasarımı için lateral(a), (B) ventral ve dorsal (C) yönler konumlandırma için microstructured yüzey efendim. Farklı renkli çizgiler CAD maskesi çizmek yeşil 100 µm ile farklı özellikler için temsil, mavi 200 µm ve kırmızı 400 µm özelliği heights. Ölçek çubuğu = 500 µm. (D-F) CAD tasarım lateral (D), ventral (E) ve dorsal (F) yönler konumlandırma için microstructured kanallar için. Farklı renkli çizgiler yeşil 100 µm ile farklı özellikler için maske tasarımlar temsil, mavi 200 µm ve kırmızı 400 µm özelliği heights. Ölçek çubuğu: 500 µm. (G-Ben) için görüntüleme aygıtları yükleme kafa ilk (G) veya kuyruk-ilk (h) için tasarlanmış CAD tasarımı. Kırmızı çizgiler 600 µm özellikleri temsil ederken mavi çizgiler 400 µm özellikleri, temsil eder. Oklar larva yüklü olan yön gösterir. Ölçek çubuğu 200 µm =. Bu rakam Ellett ve ark. değiştirildi 5 <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56498/56498fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56498/56498fig2.jpg"> Şekil 2: Ana silikon gofret. (A)üst bölümünde ana gofret bireysel larva efendim yönlendirme özellikleri gösterir. (B) alt bölümünde ana gofret tasarım microstructured kanallar için gösterilen. Bu rakam Ellett ve ark. değiştirildi 5 <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56498/56498fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56498/56498fig3.jpg"> Şekil 3: Microstructured PDMS aygıtları. (A) PDMS blok gelen ana gofret efendim bireysel larva yönlendirme için gösterilen döküm. (B) PDMS dökme gelen ana gofret microstructured kanalları gösterilen engelleyin. Bu rakam Ellett ve ark. değiştirildi 5 <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56498/56498fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56498/56498fig4.jpg"> Şekil 4: temsilcisi sonuçları: İşe Alım Zebra balığı nötrofil chemoattractants teslimini mikroenjeksiyon ve vezikül takip Imaging. (A-B) Yükleme ve görüntüleme için embriyo montaj. (A) kafa ilk aygıt ile embriyo ile bağlantı noktası belirtilen (siyah oku) yükleme için hazır. Sonra pozisyon (sarı ok) içine çektiği (B) Indirim embriyo. (C) 6-şey cam-alt plaka görüntüleme aygıtları üzerinde mikroskop ile. Bu biçim 4 / yanal Imaging yönelik standart bir ters mikroskop kullanarak embriyo iyi (24 embriyo toplam), başına sağlar. (D-G) Nötrofil (EGFP-yeşil) bir uninjected (D) embriyo ve aşağıdaki ve vezikül mikroenjeksiyon rodamine dextran (kırmızı, açık beyaz ok ucu) Yalnız, (E), 100 nM LTB4 (F) ve 100 nM fMLP (G) 30 dk sonrası enjeksiyon (MPI). (H-K) Nötrofil (EGFP-yeşil) bir uninjected (H) embriyo ve 5 h ve vezikül mikroenjeksiyon rodamine dextran (kırmızı, açık beyaz ok ucu) Yalnız, (ben), 100 takip nM LTB4 (J) ve 100 nM fMLP (K) 5 h mesaj enjeksiyon ( HPI). Ölçek çubuğu 200 µm. = <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56498/56498fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Microstructured Devices for Optimized Microinjection and Imaging of Zebrafish Larvae at JoVE.com

Microstructured Devices for Optimized Microinjection and Imaging of Zebrafish Larvae

Zebra balığı embriyo ve larva mikroenjeksiyon birçok Zebra balığı modellerinde kullanılan çok önemli ama zorlu bir tekniktir. Burada, Zebra balığı mikroenjeksiyon ve görüntüleme için yönünü ve istikrar içinde yardım etmek için microscale araçlar bir dizi mevcut.

Microstructured cihazlar için en iyi duruma getirilmiş mikroenjeksiyon ve Zebra balığı larva görüntüleme

Zebrafish have emerged as a powerful model of various human diseases and a useful tool for an increasing range of experimental studies, spanning ...

microstructured-devices-for-optimized-microinjection-imaging

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.5K Görüntüleme.  Massachusetts General Hospital–Harvard Medical School–Shriners Burns Hospital. Zebra balığı embriyo ve larva mikroenjeksiyon birçok Zebra balığı modellerinde kullanılan çok önemli ama zorlu bir tekniktir. Burada, Zebra balığı mikroenjeksiyon ve görüntüleme için yönünü ve istikrar içinde yardım etmek için microscale araçlar bir dizi mevcut.

Video: Microstructured Devices for Optimized Microinjection and Imaging of Zebrafish Larvae

Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two layers of skin that enclose undifferentiated mesenchyme, and because the larval tail fin regenerates rapidly within 2-3 days. Using this system, we demonstrate a method for capturing the repair dynamics of the amputated tail fin with time-lapse video brightfield stereomicroscopy. We demonstrate that fin amputation triggers a contraction of the amputation wound and extrusion of cells around the wound margin, leading to their subsequent clearance. Fin regeneration proceeds from proximal to distal direction after a short delay. In addition, developmental growth of the larva can be observed during all stages. The presented method provides an opportunity for observing and analyzing whole tissue-scale behaviors such as fin development and growth in a simple microscope setting, which is easily adaptable to any stereomicroscope with time-lapse capabilities.

We present a protocol for capturing the dynamics of zebrafish larval tail fin regeneration on a whole-tissue scale using brightfield-based stereomicroscopy. This technique enables capturing the regeneration dynamics with single cell resolution. This methodology can be adapted to any stereomicroscope equipped with a CCD camera and time-lapse software.

Time-lapse aydınlık stereomikroskobi ile Zebra balığı Larva Doku Onarım yakalama

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

Gelişim Biyolojisi

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

Evans Blue Dye ile Zebra balığı Larva İskelet Kası Bütünlüğü Analizi

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

Yaşayan Zebra balığı Embriyo Hücre alt yapıları görüntüleme

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing developmental processes as they happen in the living animal. Cells of interest can be labeled by using a tissue specific promoter to drive the expression of a fluorescent protein (FP) for the generation of transgenic lines. Using fluorescent photoconvertible proteins for this purpose additionally allows to precisely follow defined structures within the expression domain. Illuminating the protein in the region of interest, changes its emission spectrum and highlights a particular cell or cell cluster leaving other transgenic cells in their original color. A major limitation is the lack of known promoters for a large number of tissues in the zebrafish. Conversely, gene- and enhancer trap screens have generated enormous transgenic resources discretely labeling literally all embryonic structures mostly with GFP or to a lesser extend red or yellow FPs. An approach to follow defined structures in such transgenic backgrounds would be to additionally introduce a ubiquitous photoconvertible protein, which could be converted in the cell(s) of interest. However, the photoconvertible proteins available involve a green and/or less frequently a red emission state1 and can therefore often not be used to track cells in the FP-background of existing transgenic lines. To circumvent this problem, we have established the PSmOrange system for the zebrafish2,3. Simple microinjection of synthetic mRNA encoding a nuclear form of this protein labels all cell nuclei with orange/red fluorescence. Upon targeted photoconversion of the protein, it switches its emission spectrum to far red. The quantum efficiency and stability of the protein makes PSmOrange a superb cell-tracking tool for zebrafish and possibly other teleost species.

We established the photoconvertible PSmOrange system as a powerful, straight-forward and cost inexpensive tool for in vivo cell tracking in GFP transgenic backgrounds. This protocol describes its application in the zebrafish model system.

Photoconvertible PSmOrange Sistemi kullanılarak GFP transgenik zebrafish hücreleri izleme

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing ...

Microinjection for Transgenesis and Genome Editing in Threespine Sticklebacks

The threespine stickleback fish has emerged as a powerful system to study the genetic basis of a wide variety of morphological, physiological, and behavioral phenotypes. The remarkably diverse phenotypes that have evolved as marine populations adapt to countless freshwater environments, combined with the ability to cross marine and freshwater forms, provide a rare vertebrate system in which genetics can be used to map genomic regions controlling evolved traits. Excellent genomic resources are now available, facilitating molecular genetic dissection of evolved changes. While mapping experiments generate lists of interesting candidate genes, functional genetic manipulations are required to test the roles of these genes. Gene regulation can be studied with transgenic reporter plasmids and BACs integrated into the genome using the Tol2 transposase system. Functions of specific candidate genes and cis-regulatory elements can be assessed by inducing targeted mutations with TALEN and CRISPR/Cas9 genome editing reagents. All methods require introducing nucleic acids into fertilized one-cell stickleback embryos, a task made challenging by the thick chorion of stickleback embryos and the relatively small and thin blastomere. Here, a detailed protocol for microinjection of nucleic acids into stickleback embryos is described for transgenic and genome editing applications to study gene expression and function, as well as techniques to assess the success of transgenesis and recover stable lines.

Transgenic manipulations and genome editing are critical for functionally testing the roles of genes and cis-regulatory elements. Here a detailed microinjection protocol for the generation of genomic modifications (including Tol2-mediated fluorescent reporter transgene constructs, TALENs, and CRISPRs) is presented for the emergent model fish, the threespine stickleback.

Threespine Sticklebacks içinde Transgenesis ve Genom Kurgu Mikroenjeksiyon

The threespine stickleback fish has emerged as a powerful system to study the genetic basis of a wide variety of morphological, physiological, and ...

A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. In particular, posterior body elongation is an essential process in embryonic development by which multiple tissue deformations act together to direct the formation of a large part of the body axis. In order to observe this process by long-term time-lapse imaging it is necessary to utilize a mounting technique that allows sufficient support to maintain samples in the correct orientation during transfer to the microscope and acquisition. In addition, the mounting must also provide sufficient freedom of movement for the outgrowth of the posterior body region without affecting its normal development. Finally, there must be a certain degree in versatility of the mounting method to allow imaging on diverse imaging set-ups. Here, we present a mounting technique for imaging the development of posterior body elongation in the zebrafish D. rerio. This technique involves mounting embryos such that the head and yolk sac regions are almost entirely included in agarose, while leaving out the posterior body region to elongate and develop normally. We will show how this can be adapted for upright, inverted and vertical light-sheet microscopy set-ups. While this protocol focuses on mounting embryos for imaging for the posterior body, it could easily be adapted for the live imaging of multiple aspects of zebrafish development.

Here, we present a versatile mounting method that allows for the long-term time-lapse imaging of the posterior body development of live zebrafish embryos without perturbing normal development.

Zebra balığı Kalkınma Uzun Süreli Görüntüleme için A yönlü Montaj Yöntemi

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. ...

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. Although many immunohistochemistry protocols have been optimized for mammalian tissue and tissue sections, these protocols often require modification and optimization for non-mammalian model organisms. Zebrafish are increasingly used as a model system in basic, biomedical, and translational research to investigate the molecular, genetic, and cell biological mechanisms of developmental processes. Zebrafish offer many advantages as a model system but also require modified techniques for optimal protein detection. Here, we provide our protocol for whole-mount fluorescence immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae. This protocol additionally describes several different mounting strategies that can be employed and an overview of the advantages and disadvantages each strategy provides. We also describe modifications to this protocol to allow detection of chromogenic substrates in whole mount tissue and fluorescence detection in sectioned larval tissue. This protocol is broadly applicable to the study of many developmental stages and embryonic structures.

Here, we present a protocol for fluorescent antibody-mediated detection of proteins in whole preparations of zebrafish embryos and larvae.

Zebrabalığı Embriyoları ve Larvalarında Tüm Mount Immunohistochemistry

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...

In Situ Hybridization in Zebrafish Larvae and Juveniles during Mesonephros Development

The zebrafish forms two kidney structures in its lifetime. The pronephros (embryonic kidney) forms during embryonic development and begins to function at 2 days post fertilization. Consisting of only two nephrons, the pronephros serves as the sole kidney during larval life until more renal function is required due to the increasing body mass. To cope with this higher demand, the mesonephros (adult kidney) begins to form during metamorphosis. The new primary nephrons fuse to the pronephros and form connected lumens. Then, secondary nephrons fuse to primary ones (and so on) to create a branching network in the mesonephros. The vast majority of research is focused on the pronephros due to the ease of using embryos. Thus, there is a need to develop techniques to study older and larger larvae and juvenile fish to better understand mesonephros development. Here, an in situ hybridization protocol for gene expression analysis is optimized for probe penetration, washing of probes and antibodies, and bleaching of pigments to better visualize the mesonephros. The Tg(lhx1a-EGFP) transgenic line is used to label progenitor cells and the distal tubules of nascent nephrons. This protocol fills a gap in mesonephros research. It is a crucial model for understanding how new kidney tissues form and integrate with existing nephrons and provide insights into regenerative therapies.

In Situ Hybridization in Zebrafish Larvae and Juveniles during Mesonephros Development

The zebrafish is an important model for understanding kidney development. Here, an in situ hybridization protocol is optimized to detect gene expression in zebrafish larvae and juveniles during mesonephros development.

In Situ Mesonephros Gelişimi Sırasında Zebra Balığı Larvaları ve Yavrularında Melezleme

The zebrafish forms two kidney structures in its lifetime. The pronephros (embryonic kidney) forms during embryonic development and begins to function at ...

Using Alizarin Red Staining to Detect Chemically Induced Bone Loss in Zebrafish Larvae

Chemically induced bone loss due to lead (Pb) exposure could trigger an array of adverse impacts on both human and animal skeletal systems. However, the specific effects and mechanisms in zebrafish remain unclear. Alizarin red has a high affinity for calcium ions and can help visualize the bone and illustrate skeletal mineral mass. In this study, we aimed to detect lead acetate (PbAc)-induced bone loss in zebrafish larvae by using alizarin red staining. Zebrafish embryos were treated with a series of PbAc concentrations (0, 5, 10, 20 mg/L) between 2 and 120 h post fertilization. Whole-mount skeletal staining was conducted on larvae at 9 days post fertilization, and the total stained area was quantified using ImageJ software. The results indicated that the mineralized tissues were stained in red, and the stained area decreased significantly in the PbAc-exposure group, with a dose-dependent change in bone mineralization. This paper presents a staining protocol for investigating skeletal changes in PbAc-induced bone defects. The method can also be used in zebrafish larvae for the detection of bone loss induced by other chemicals.

Here, we have used alizarin red staining to show that lead acetate exposure causes a bone mass change in zebrafish larvae. This staining method can be adapted to the investigation of bone loss in zebrafish larvae loss induced by other hazardous toxicants.

Zebra Balığı Larvalarında Kimyasal Olarak İndüklenen Kemik Kaybını Tespit Etmek için Alizarin Kırmızı Boyama Kullanımı

Chemically induced bone loss due to lead (Pb) exposure could trigger an array of adverse impacts on both human and animal skeletal systems. However, the ...

Primat Serebral Organoidlerinin Genetik Modifikasyonu

Targeted Microinjection and Electroporation of Primate Cerebral Organoids for Genetic Modification

The cerebral cortex is the outermost brain structure and is responsible for the processing of sensory input and motor output; it is seen as the seat of higher-order cognitive abilities in mammals, in particular, primates. Studying gene functions in primate brains is challenging due to technical and ethical reasons, but the establishment of the brain organoid technology has enabled the study of brain development in traditional primate models (e.g., rhesus macaque and common marmoset), as well as in previously experimentally inaccessible primate species (e.g., great apes), in an ethically justifiable and less technically demanding system. Moreover, human brain organoids allow the advanced investigation of neurodevelopmental and neurological disorders.
As brain organoids recapitulate many processes of brain development, they also represent a powerful tool to identify differences in, and to functionally compare, the genetic determinants underlying the brain development of various species in an evolutionary context. A great advantage of using organoids is the possibility to introduce genetic modifications, which permits the testing of gene functions. However, the introduction of such modifications is laborious and expensive. This paper describes a fast and cost-efficient approach to genetically modify cell populations within the ventricle-like structures of primate cerebral organoids, a subtype of brain organoids. This method combines a modified protocol for the reliable generation of cerebral organoids from human-, chimpanzee-, rhesus macaque-, and common marmoset-derived induced pluripotent stem cells (iPSCs) with a microinjection and electroporation approach. This provides an effective tool for the study of neurodevelopmental and evolutionary processes that can also be applied for disease modeling.

Yazar Spotlight: Genetik Modifikasyon için Primat Serebral Organoidlerinin Hedefli Mikroenjeksiyonu ve Elektroporasyonu  

The electroporation of primate cerebral organoids provides a precise and efficient approach to introduce transient genetic modification(s) into different progenitor types and neurons in a model system close to primate (patho)physiological neocortex development. This allows the study of neurodevelopmental and evolutionary processes and can also be applied for disease modeling.

Genetik Modifikasyon için Primat Serebral Organoidlerinin Hedefe Yönelik Mikroenjeksiyonu ve Elektroporasyonu

The cerebral cortex is the outermost brain structure and is responsible for the processing of sensory input and motor output; it is seen as the seat of ...