الكتاب يود أن يشكر لانجينو ديفيد لسخاء توفير مساحة الحوض؛ إريك ستون، جون مور جيم وتشين تانغ للمساعدة في صيانة الزرد والكواشف، وروبرتسون أن واليوت Hagedorn من مختبر ليونارد زون لشراء سلالة الزرد المستخدمة هنا. كما أنها يود أن يشكر هورتادو أوكتافيو لتقديم المشورة بشأن التقنيات فوتوليثوغرفيك. مولت FE زمالات من مستشفى شرينير للأطفال و "الرابطة الأسترالية الأمريكية". تم تمويل هذا العمل من المعاهد الوطنية للصحة منح GM92804.

وأقر microinjection يرقات "ماساشوستس العام مستشفى اللجنة الفرعية" المعنية "أبحاث رعاية الحيوان" تحت بروتوكول 2011N000127.
1. تصنيع الجهاز
ملاحظة: جميع بمساعدة الكمبيوتر (CAD) ملفات الرسم المستخدمة لتصميم الأقنعة التصويرية الموصوفة هنا (الشكل 1) متوفرة للتحميل. انظر "الجدول للمواد" للروابط.
<ol><li>اختﻻق يفر العفن الرئيسي في غرفة نظيفة 1,000 فئة باستخدام التقنيات القياسية فوتوليثوغرفيك7. للمصفوفات المجهرية وقنوات، نمط مقاوم الضوء السلبية على أساس الإيبوكسي التتابع في 3 طبقات باستخدام أقنعة منفصلة 3، وفقا لإرشادات الشركة المصنعة: 100 ميكرومتر للميزات الضحلة و 200 ميكرومتر ميزات متوسطة 400 ميكرون ل ميزات العميق. لجهاز التصوير، طبقات النمط الثاني باستخدام 400 ميكرون للميزات الضحلة و 600 ميكرون للميزات العميق.</li>
	<li>الشريط يفر المكتملة إلى قاعدة 15 سم طبق بيتري الصب (الشكل 2).</li>
</ol>2-إعداد المصفوفات السطحية ميكروستروكتوريد-PDMS
<ol><li>لجعل الأجهزة صالحة للاستعمال، ويلقي بولي دايمثيل سيلوكسان (PDMS)، باستخدام رقاقة رئيسية كالعفن. الجمع بين 50 جرام مونومر PDMS مع 5 غ بادئ ومزيج دقيق في بلاستيك وزنها الطبق مع شوكة بلاستيكية.</li>
	<li>صب الخليط بعناية أكثر من العفن.</li>
	<li>ديغا في مجفف فراغ في إينهج 16-25 (54-85 كيلو باسكال) ح 1.</li>
	<li>لعلاج PDMS، خبز عند 65 درجة مئوية على الأقل 3 ح. ينبغي علاج PDMS إلى مادة صلبة ثابتة ولكنها مرنة.</li>
	<li>قص بعناية حول الجهاز على رقاقة رئيسية باستخدام مشرط، مع التأكد من الحفاظ على الاتصال بين طرف دون مشرط والسطح ويفر. استخدام الملقط، قشر النسخة المتماثلة PDMS بعيداً عن ويفر، ونقل إلى سم 10 نظيفة طبق بيتري، ميزة الجانب الأعلى (الشكل 3).</li>
	<li>التعامل مع الجهاز بالبلازما الأكسجين باستخدام فرن بلازما مقابل 35 ثانية للحد من هيدروفوبيسيتي.</li>
	<li>تغطية مع الزرد الجنين المتوسطة (E3) الذي يحتوي على 168 مغ/لتر من إيثيل 3-أمينوبينواتي ميثانيسولفوناتي (مرض التصلب العصبي المتعدد-222، الرقم الهيدروجيني 7.5). إزالة أي فقاعات من أعمق من الميزات التي تتدفق المياه عبر سطح الجهاز باستخدام ماصة نقل.</li>
</ol>3-إعداد المصفوفات السطحية ميكروستروكتوريد-[اغروس]
<ol><li>جعل العفن PDMS سلبية، أول علاج جهاز PDMS مع الأكسجين في البلازما.</li>
	<li>
علاج الجهاز PDMS مع 1ح، 1ح، 2ح،ح2-بيرفلوروكتيلتريثوكسيسيلاني (بفدتس) سيلاني البخار لإنشاء سطح خامل8. باختصار:
	<ol>
<li>ضع PDMS أن تكون ميزة-الجانب-متابعة المعالجة في فراغ غرفة داخل غطاء دخان.</li>
		<li>بجوار PDMS، ضع طبق الزجاج أو الألومنيوم مفتوحة صغيرة، وعناية "الماصة؛" 200 ميليلتر من بفدتس (silane 98 ٪) في الطبق. تنبيه: silane بفدتس هو درجة عالية من التقلب، وعنف ويتفاعل مع الماء، القابلة للاشتعال، ويسبب أضرارا بالغة في العين والجلد على الاتصال. قراءة العظمية بالتفصيل قبل الاستخدام.</li>
		<li>إغلاق الدائرة فراغ وتطبيق فراغ لمدة 15-30 دقيقة، أو حتى يتبخر silane بفدتس تماما.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ضع الجهاز في طبق بتري واستخدامه كقالب ل PDMS الطازجة، إعداد كما هو موضح في الخطوة 2، 2، 1-3.</li>
	<li>خبز عند 65 درجة مئوية على الأقل 3 ح، ثم قشر الطبقة بأكملها من PDMS جديدة من جهاز المعالجة ووضع في طبق بتري طازجة. وهذا يمكن ثم استخدامها كالعفن سلبية يلقي [اغروس].</li>
	<li>إعداد [اغروس]، غلى حل 2% لانخفاض مجمد درجة الحرارة [اغروس] في E3 في فرن ميكروويف حتى يذوب تماما [اغروس].</li>
	<li>صب [اغروس] الساخنة على القالب PDMS السلبية وإزالة أي فقاعات في [اغروس] تغطي الجهاز قبل [اغروس] الساخن يتدفق أكثر الميزات مع ماصة نقل.</li>
	<li>حالما تتم إزالة فقاعات، الثلاجة عند درجة 4 مئوية لتعيين [اغروس].</li>
	<li>إزالة الكتلة [اغروس] من العفن PDMS السلبية بتشويه PDMS من تحت من جهة، ونقل الكتلة [اغروس] إلى طبق بتري الجديدة، والرطب مع E3 التي تحتوي على مرض التصلب العصبي المتعدد-222.</li>
</ol>4-إعداد PDMS أجهزة تصوير
<ol><li>لجعل الأجهزة قابلة للاستخدام، يلقي PDMS، استخدام رقاقة رئيسية كقالب. الجمع بين 50 جرام مونومر PDMS مع 5 غ من البادئ (نفس المستخدمة في الخطوة 2، 1) ومزيج دقيق في بلاستيك وزنها الطبق مع شوكة بلاستيكية.</li>
	<li>صب الخليط بعناية أكثر من العفن.</li>
	<li>ديغا في مجفف فراغ في إينهج 16-25 (54-85 كيلو باسكال) ح 1.</li>
	<li>لعلاج PDMS، خبز عند 65 درجة مئوية على الأقل 3 ح. ينبغي علاج PDMS إلى مادة صلبة ثابتة ولكنها مرنة.</li>
	<li>قطع الأجهزة من يفر الرئيسي ولكمه على منافذ باستخدام لكمه 1.5 مم.</li>
	<li>علاج الأجهزة وزجاج 6-جيدا-قاع لوحة جيدا مع الأكسجين في البلازما ل 35 s، كما هو موضح في الخطوة 2، 6.</li>
	<li>السندات واحد الجهاز ميزة الجانب-لأسفل لكل ساترة زجاج لوحة 6-جيدا بوضعه في هوتبلت 85 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. ملاحظة: لتأكيد الترابط الناجح، تطبيق الضغط الثابت إلى جانب واحد من الجهاز المرتهن باستخدام الملقط. ينبغي أن يظل الجهاز المرفقة إلى ساترة زجاجية.</li>
</ol>5-الزرد الثقافة
<ol><li>الثقافة الزرد الأجنة إلى 2 إدارة الشرطة الاتحادية باستخدام التقنيات القياسية3.</li>
	<li>مزيج الأجنة ديتشوريوناتي استخدام الملقط أو 1 مغ/مل مبطلات (انظر الجدول المواد)3 على الأقل 30-60 دقيقة قبل تحميلها على الجهاز، للسماح لهم بتصويب.</li>
	<li>تخدير الأجنة استخدام الحل (168 مغ/لتر) مرض التصلب العصبي المتعدد-222 (درجة الحموضة 7.5) بإضافة 1 مل 25 X الأسهم إلى E3 في طبق بتري بهم.</li>
</ol>6-توجه الزرد على سطح ميكروستروكتوريد-صفائف ديفت
<ol><li>إعداد كتلة PDMS من الخطوة 2.7 (الشكل 3A) في طبق بتري به أن كان مغطى بطبقة رقيقة (1-2 مم) من E3، مما يتيح سهولة التلاعب بالأجنة.</li>
	<li>نقل العدد المطلوب من الأجنة (عادة 10-20 كل الظروف) على سطح كتلة PDMS استخدام ماصة نقل.</li>
	<li>باستخدام أداة ميكرومانيبوليشن (حلقة الشعر أو ما شابه ذلك)، دفع الأجنة في ديفوتس ميكروستروكتوريد (الشكل 3A). استخدام ديفوتس مناسبة خاصة لتوجهات الظهرية والبطني. ملاحظة: ديفوتس مع أشد تناسب (الظهري والبطني)، حاول الأجنة لتحديد المواقع على سطح الكتلة بالتوازي مع ديفت، والمتداول ثم منها إلى موضع استخدام حلقة شعر. دفعهم أعمق في ديفوت ستساعد على إبقائها مستقرة.</li>
</ol>7-توجه الزرد على سطح ميكروستروكتوريد-قنوات ميكروستروكتوريد
<ol><li>رسم E3 قبالة كتلة PDMS منقوشة مع قنوات ميكروستروكتوريد (الشكل 3B) باستخدام ماصة نقل حتى مستوى E3 يسقط تحت حافة الكتلة، ولكن لا تزال موجودة في الخزان والقنوات وفي طبقة رقيقة على PDMS.</li>
	<li>نقل الأجنة 10 من الخطوة 5.3 إلى الخزان باستخدام ماصة نقل، مع الحرص على عدم تجاوز الحواف.</li>
	<li>استخدام حلقة شعر، التعامل مع كل جنين إلى القمع عند مدخل القناة الملائمة وتوجيه رأس الجنين اتجاه القناة والجنين بالاتجاه المناسب لأنه يدخل القناة.</li>
	<li>حرك كل الجنين إلى أسفل القناة باستخدام حلقة شعر حتى تصل إلى ميكروفيتوريس توجه في جدران القناة التي تساعد على الاحتفاظ به في مكان. يوصي باستخدام القنوات ميكروستروكتوريد خاصة للاتجاه الأفقي. ملاحظة: للحد من انزلاق أثناء microinjection الجنين، حاول ضبط مقدار التوتر السطحي بالرسم E3 من الخزان.</li>
</ol>8-microinjection الزرد
<ol><li>
إعداد إبرة microinjection.
	<ol>
<li>جعل الإبر ميكروكابيلاري البورسليكات الزجاج باستخدام ساحبة ميكروبيبيتي كما هو موضح سابقا4. ينبغي مدبب الإبر الناتجة إلى نقطة نهاية واحدة، تفتق طولها حوالي 10 مم.</li>
		<li>إعداد الحل بالحقن، في هذه الحالة 100 نانومتر chemoattractant (N-فورميلميثيونيني-لوسيل-فينيلالاناين (فملب) أو Leukotriene B4 (LTB4)) و 100 نانومتر من 70 كاتشين والرودامين ديكستران الراسم في برنامج تلفزيوني.</li>
		<li>تحميل 5 ميليلتر من الحل في إبرة ماصة مدبب ناعما استخدام تلميح (انظر الجدول المواد).</li>
		<li>جبل الإبرة في ميكرومانيبولاتور التي شنت على الوقوف مغناطيسية ومتصلا ميكروينجيكتور بيكوبومب.</li>
	</ol>
</li>
	<li>كسر غيض الإبرة بزاوية 45 درجة معسر طرف مدبب مع الملقط.</li>
	<li>ضبط حجم بلعه حقن 1 nL بضبط الوقت الحقن على وحدة تحكم بيكوبومب.</li>
	<li>قم بضبط زاوية إبرة microinjection. عموما بإبرة زاوية 45 ° على وحدة تحكم ميكرومانيبوليشن نقطة انطلاق جيدة، مع الإبرة موازية لطول الجنين. يمكن استخدام زاوية انحدارا لتقليل الحركة الجانبية للجنين أثناء microinjection.</li>
	<li>السيطرة على طبق بيتري مع اليد اليسرى وميكرومانيبولاتور إبرة مع الحق، جلب الإبرة أقرب قدر الإمكان إلى الموقع المقصود من microinjection، في هذه الحالة حويصلة عتيق. ملاحظة: يمكن تحديد حويصلة عتيق هيئة مستطيل الخلفي للعين التي تحتوي على أصغر متميزة الظلام مستطيل هيكلين (أوتوليثس).</li>
	<li>باستخدام وحدة تحكم ميكرومانيبوليشن، اختراق الأنسجة المستهدفة (في هذه الحالة حويصلة عتيق) يكون طرف الإبرة داخل حويصلة، وحقن وحدة التخزين مسبقاً باستخدام رمز التبديل بيكوبومب سيرا على الأقدام. ملاحظة: إذا كان النسيج يقاوم الاختراق، حاول بلطف التنصت على مقبض تحكم ميكرومانيبوليشن.</li>
	<li>للإفراج عن الأجنة، تدفق E3 على السطح من أعلى إلى أسفل باستخدام ماصة نقل، أو بواسطة يحوم الطبق مثل أن يتم الإفراج عن الأجنة في E3 المحيطة بها.</li>
	<li>نقل الأجنة إلى طبق انتعاش من E3 دون استخدام ماصة نقل مرض التصلب العصبي المتعدد-222.</li>
</ol>9-فحص أجنة PDMS جهاز التصوير باستخدام
<ol><li>رئيس الجهاز من الخطوة 4.7 تتدفق E3 (+ مرض التصلب العصبي المتعدد-222) عن طريق المنفذ. هذا يمكن أن يتم استخدام ماصة ميليلتر 1,000 أو ماصة نقل تلميح ضيق.</li>
	<li>سد البئر مع E3 + مرض التصلب العصبي المتعدد-222 حتى يتم تغطية الجهاز.</li>
	<li>تسليم 4 حقن الأجنة من الخطوة 8.7 في كل جيدا باستخدام ماصة نقل. يمكن أن تكون الأجنة قبل أنيسثيتيزيد إذا رغبت بحضانة في E3 + مرض التصلب العصبي المتعدد-222 لمدة 1-2 دقيقة قبل تحميل (الخطوة 5، 3).</li>
	<li>باستخدام أداة ميكرومانيبوليشن (حلقة الشعر أو ما شابه ذلك)، وتوجيه الأجنة عند مداخل القنوات التصوير في الاتجاه المطلوب (الذيل الأول أو رئيس--أولاً، اعتماداً على الجهاز المستخدم)، ودفعهم جزئيا إلى الجهاز (الشكل 4 أ). هذا سوف يساعد في رسم لهم في الجهاز بالتساوي.</li>
	<li>رسم E3 من خلال الجهاز من المنفذ باستخدام 1,000 ميليلتر ماصة أو ماصة نقل حتى يتم رسمها الأجنة في القنوات في التوجه الصحيح للتصوير (الشكل 4 باء). ملاحظة: كن حذراً حتى لا تمتص الأجنة في الماضي هذه النقطة الملائمة، وهذا سوف يضر الأجنة وتغيير اتجاهها.</li>
	<li>نقل لوحة جيدا بالمجهر للتصوير (الشكل 4).</li>
	<li>
صورة باستخدام مجهر فلوري مقلوب.
	<ol>
<li>ضبط التكبير عن طريق اختيار العدسة المناسبة. 10 X عادة تكبير مفيدة للتصوير الزرد هجرة العَدلات.</li>
		<li>ضبط كثافة مصدر الضوء ووقت التعرض لكل قناة حيث يكون كل إشارة واضحة، ولكن غير المشبعة.</li>
		<li>التقاط صور لكل قناة. هنا، يمكننا استخدام البروتينات الفلورية الخضراء (بروتينات فلورية خضراء، السابقين: م 470/22،: 525/50)، "تكساس الأحمر" (تكسريد، السابقين: 585/29، م: 628/32) وأحال القنوات. ويمكن الجمع بين الصور الأقنية خلال مرحلة ما بعد المعالجة (الشكل 4 باء--أنا).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+human+disease:+zebrafish+swim+into+view.">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nat Rev Genet. 8 (5), 353-367 (2007).</li><li>Dang, M., Fogley, R., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+Novel+Cancer+Therapies+Using+Chemical+Genetics+and+Zebrafish.">Identifying Novel Cancer Therapies Using Chemical Genetics and Zebrafish.</a> Adv Exp Med Biol. 916, 103-124 (2016).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).</li><li>Benard, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+zebrafish+embryos+with+intracellular+bacterial+pathogens.">Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens.</a> J Vis Exp. (61), (2012).</li><li>Ellett, F., Irimia, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microstructured+Surface+Arrays+for+Injection+of+Zebrafish+Larvae.">Microstructured Surface Arrays for Injection of Zebrafish Larvae.</a> Zebrafish. 14 (2), 140-145 (2017).</li><li>Bischel, L. L., Mader, B. R., Green, J. M., Huttenlocher, A., Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+Entrapment+By+Restriction+Array+(ZEBRA)+device:+a+low-cost,+agarose-free+zebrafish+mounting+technique+for+automated+imaging.">Zebrafish Entrapment By Restriction Array (ZEBRA) device: a low-cost, agarose-free zebrafish mounting technique for automated imaging.</a> Lab Chip. 13 (9), 1732-1736 (2013).</li><li>Brower, K., White, A. K., Fordyce, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-step+Variable+Height+Photolithography+for+Valved+Multilayer+Microfluidic+Devices.">Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices.</a> J Vis Exp. (119), (2017).</li><li>Shao, G., Wu, J., Cai, Z., Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+elastomeric+high-aspect-ratio+microstructures+using+polydimethylsiloxane+(PDMS)+double+casting+technique.">Fabrication of elastomeric high-aspect-ratio microstructures using polydimethylsiloxane (PDMS) double casting technique.</a> Sens Actuators A Phys. 178, 230-236 (2012).</li><li>Bhuiyan, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acinetobacter+baumannii+phenylacetic+acid+metabolism+influences+infection+outcome+through+a+direct+effect+on+neutrophil+chemotaxis.">Acinetobacter baumannii phenylacetic acid metabolism influences infection outcome through a direct effect on neutrophil chemotaxis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (34), 9599-9604 (2016).</li><li>Henry, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PhagoSight:+an+open-source+MATLAB&#174;+package+for+the+analysis+of+fluorescent+neutrophil+and+macrophage+migration+in+a+zebrafish+model.">PhagoSight: an open-source MATLAB&#174; package for the analysis of fluorescent neutrophil and macrophage migration in a zebrafish model.</a> PloS one. 8 (8), e72636 (2013).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dynam. 203 (3), 253-310 (1995).</li><li>Hemmil&#228;, S., Cauich-Rodr&#237;guez, J. V., Kreutzer, J., Kallio, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+simple,+and+cost-effective+treatments+to+achieve+long-term+hydrophilic+PDMS+surfaces.">Rapid, simple, and cost-effective treatments to achieve long-term hydrophilic PDMS surfaces.</a> Applied Surface Science. 258 (24), 9864-9875 (2012).</li><li>Masselink, W., Wong, J. C., Liu, B., Fu, J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-cost+silicone+imaging+casts+for+zebrafish+embryos+and+larvae.">Low-cost silicone imaging casts for zebrafish embryos and larvae.</a> Zebrafish. 11 (1), 26-31 (2014).</li><li>Yang, F., Gao, C., Wang, P., Zhang, G. J., Chen, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fish-on-a-chip:+microfluidics+for+zebrafish+research.">Fish-on-a-chip: microfluidics for zebrafish research.</a> Lab Chip. 16 (7), 1106-1125 (2016).</li><li>Wielhouwer, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+embryo+development+in+a+microfluidic+flow-through+system.">Zebrafish embryo development in a microfluidic flow-through system.</a> Lab Chip. 11 (10), 1815-1824 (2011).</li><li>Shen, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+student+team+in+a+University+of+Michigan+biomedical+engineering+design+course+constructs+a+microfluidic+bioreactor+for+studies+of+zebrafish+development.">A student team in a University of Michigan biomedical engineering design course constructs a microfluidic bioreactor for studies of zebrafish development.</a> Zebrafish. 6 (2), 201-213 (2009).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+on+a+chip:+a+novel+platform+for+real-time+monitoring+of+drug-induced+developmental+toxicity.">Zebrafish on a chip: a novel platform for real-time monitoring of drug-induced developmental toxicity.</a> PLoS One. 9 (4), e94792 (2014).</li><li>Akagi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Miniaturized+embryo+array+for+automated+trapping,+immobilization+and+microperfusion+of+zebrafish+embryos.">Miniaturized embryo array for automated trapping, immobilization and microperfusion of zebrafish embryos.</a> PLoS One. 7 (5), e36630 (2012).</li><li>Akagi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fish+on+chips:+Microfluidic+living+embryo+array+for+accelerated+in+vivo+angiogenesis+assays.">Fish on chips: Microfluidic living embryo array for accelerated in vivo angiogenesis assays.</a> Sens Actuators B Chem. 189, 11-20 (2013).</li><li>Lin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+mapping+of+brain-wide+activity+in+awake+and+drug-responsive+vertebrates.">High-throughput mapping of brain-wide activity in awake and drug-responsive vertebrates.</a> Lab Chip. 15 (3), 680-689 (2015).</li><li>Noori, A., Selvaganapathy, P. R., Wilson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+in+a+microfluidic+format+using+flexible+and+compliant+channels+and+electroosmotic+dosage+control.">Microinjection in a microfluidic format using flexible and compliant channels and electroosmotic dosage control.</a> Lab Chip. 9 (22), 3202-3211 (2009).</li></ol>

الكتاب يعلن لا تضارب في المصالح.

هنا، يمكننا وصف الاستخدام الأجهزة وضعنا مؤخرا تيسير إدارة الشرطة الاتحادية 2 الزرد microinjection5، وإدخال جهاز بسيط تركيب مجاناً [اغروس] لتصوير مريحة للأجنة. وتبرز هذه الأدوات الأداة المساعدة فوتوليثوغرفيك تقنيات تصنيع الأجهزة مفيدة لتقنيات الزرد.
أننا وجدنا الأجهزة بدل مفيدة بشكل خاص لحقن الخلايا أو الجزيئات المعرضة للتجميع داخل الإبرة microinjection، مثل كونيديا الفطرية أو الخلايا السرطانية البشرية، التي تتطلب استخدام إبرة تحمل أكبر للتسليم. حقن في حويصلة عتيق (الشكل 4) يمثل تحديا خاصا، الأجنة لفة غالباً عند الاتصال مع الإبرة. فإننا نجد أن استخدام القنوات ميكروستروكتوريد التي توجه واستقرار الزرد في جانبية اتجاه تحسن كبير في كل من الإنتاجية والدقة لهذا الأسلوب في أيدينا.
للتصوير السريع من الزرد أفقياً المنحى في نقاط زمنية مختلفة، مثل تقييم لتجنيد العَدلات أو xenograft خبيث، تجنب [اغروس] زيادة الاتساق المتصاعدة بين الأجنة وانخفاض احتمالات الضرر أثناء بعد انتهاء التصوير الإنقاذ. هذه الأجهزة أيضا إظهار الوعد لتصوير انقضاء فترة زمنية ممتدة، وقد استخدمت بنجاح التقاط صور متعددة القنوات، مولتيبلاني مع حركة السمك الأدنى أكثر من 12 ح. نظراً لأنها مقيدة لا بسبب [اغروس]، استطالة النشطة لليرقات خلال هذه الفترة (~ 300 ميكرون من هبف 54-78)11 غير مقيد ويمكن متابعة عادي.
الخطوات الأكثر أهمية في إعداد واستخدام هذه الأدوات شائعة لاستخدام معظم أجهزة موائع جزيئية PDMS على أساس: يجب أن تكون الأجهزة ترطب جيدا وتجنب الفقاعات. لتجنب هذه المشاكل، الرطب الأجهزة في E3 فورا بعد أنها ملفقة، بينما hydrophilicity السطحية التي يمنحها الأوكسجين البلازما المعاملة لا تزال موجودة. أيضا يمكن إعادة المعالجة بالأكسجين البلازما عابر استعادة هيدروفيليسيتي للمسنين PDMS الأجهزة.
الهندسات الدقيقة المستخدمة هنا الاستفادة من دقة عالية من تقنيات فوتوليثوغرفيك، ولكن استخدام حد التصاميم الحالية إلى الزرد أثناء إخصاب بعد انتهاء اليوم الثاني. إعادة تصميم الهندسيات استناداً إلى النظام الأساسي الحالي سيسمح نجاح التوجه 1 إدارة الشرطة الاتحادية وإدارة الشرطة الاتحادية 3 ل microinjection. أن التوجه لليرقات إدارة الشرطة الاتحادية 4 أكثر ازدهارا مع تضخم السباحة قرب يرجح أن تكون أكثر صعوبة، وتتطلب الهندسات دافئ في تركيبة مع ارتفاع حدة التوتر في المياه. أجهزة معقدة دمج تدفق أو فراغ قد يوفر نهج بديل تنطبق على نطاق أوسع من مراحل النمو، ولكن يتطلب أيضا استخدام مضخات وأنابيب، تزايد تكاليف ومخاطر فشل الجهاز.
PDMS مادة فعالة من حيث التكلفة، ومفيدة لاختلاق أجهزة مثل تلك الموضحة هنا، توفير توافق مع الحياة، والشفافية، وإعادة استخدام. عيب واحد من استخدام أجهزة PDMS لالزرد هو هيدروفوبيسيتي، التي يمكن أن تجعل الحفاظ على الطبقات الضحلة من E3 على سطح الجهاز صعبة. يمكنك تجنب هذه المشكلة بصب الأجهزة microinjection في [اغروس]، على الرغم من أن هذا يحد من إعادة استخدام ويزيد من هشاشة الأجهزة. وسيكون بديلاً مفضل تحديد متوافق حيويا في المعاملة السطحية أن الزيادات hydrophilicity PDMS12، أو استخدام الركيزة بلاستيكية مناسبة.
استخدام الأساليب الحالية ل microinjection الزرد في إدارة الشرطة الاتحادية 2 أما التوتر المياه4 أو يلقي قنوات بسيطة في [اغروس] استخدام القوالب التجارية لشل وموقف اليرقات. هذه النهج توفير رقابة محدودة للتوجه ويمكن أن تكون معقدة التجفيف السريع للأجنة. المجهرية تدمج ديفوتس والقنوات المستخدمة هنا تهدف إلى توجيه وشل اليرقات دون الاعتماد كلياً على التوتر المياه، مما يقلل من الخطر للتجفيف. ديفوتس باستخدام قوالب المطبوعة 3D سابقا قد استخدمت للتوجه للأجنة ل أغراض التصوير13، على الرغم من عمق هذه ديفوتس جعلها غير قابلة للوصول ل microinjection.
استخدام نظم موائع جزيئية لتصوير الزرد أصبحت شائعة بشكل متزايد14. وقد وضعت أنظمة متعددة من خلال تدفق للسماح بمراقبة التنمية الزرد على مر الزمن مع القدرة على إدخال المركبات على الطلب15،،من1617. قد صممت أجهزة أكثر تعقيداً للأجنة الصفيف بينما لا يزال داخل هذه المشيمة، التي تنص هندسة كروية بسيطة التي يمكن التلاعب بها بسهولة مع الإنتاجية العالية نسبيا في هذه النظم18،19. ووضعت عدة مجموعات منصات أرايينج والتصوير الزرد مرحلة اليرقات في مختلف التوجهات6،20، يجري الأكثر استعمالا ميكروبومب السلبي مدفوعة "زيبرا" نظام تطوير مختبر بيب6 . خلافا لنظام وحشي، يستخدم الجهاز الذي يصف لنا هنا الشفط، والذي تم إنشاؤه باستخدام ماصة نقل قياسية، رسم اليرقات في القنوات، أثناء تحميل متوازية بدلاً من أن تكون متسلسلة من اليرقات يسمح الإنقاذ يرقات الفردية بعد انتهاء التصوير تطبيق تدفق إيجابي عن طريق نفس المنفذ. وعلاوة على ذلك، يتطلب نهجنا بصمة أصغر، حيث يمكن المستعبدين الأجهزة PDMS إلى أسفل الزجاج التقليدية 6-جيدا لوحات للتصوير.
التصميم التجريبي الحالي يستخدم أجهزة منفصلة ل microinjection والتصوير أساسا حيث أنه يمكن استخدامها مع المعدات التقليدية microinjection ومعيار مقلوب مجاهر. النهج موائع جزيئية للألى microinjection البيض الزرد الفعل توجد21، وفي تركيبة مع "الأسماك-فخ" نوع الأساليب لدرجة عالية من الدقة أرايينج والتوجه لليرقات20، فمن المنتظر أن الأجهزة دمج حقن اليرقات الآلي والتصوير قد أيضا يوم واحد يصبح حقيقة واقعة.

الزرد ظهرت كنموذج قوي للعديد من المجالات، من الدراسات الأساسية البيولوجيا التنموية على نطاق واسع الوراثية والكيميائية شاشات1،2. التلاعبات الجينية الروتينية، مثل ترانسجينيسيس والطفرات كريسبر/Cas9، overexpression الجينات وضربه قاضية تعتمد على microinjection المواد الوراثية في اقحه خلية واحدة، مما أدى إلى وضع بسيطة وسهلة الاستخدام، تجارياً الأدوات المتاحة لتوجيه واستقرار البيض لحقن3. الطرق الأخرى، مثل زرع الأعضاء، والعدوى، غالباً ما تتطلب microinjection في وقت لاحق مرحلة الأجنة واليرقات باستخدام الإبر الشعرية قياس أكبر4. ومع ذلك، استخدام إبر قياس أكبر تحديات كبيرة التقنية، كما أنها أكثر صعوبة لاختراق الأنسجة المستهدفة دون دفع أو المتداول الجنين. في ظل هذه الظروف، قد لا يكون الحصول على التوتر المياه المناسبة المطلوبة لتثبيت الجنين في حين يصعب تفادي التجفيف أثناء الإجراء، والأجنة المنحى المثالي لحقن الأنسجة المستهدفة.
بعد microinjection، يكون من المفيد غالباً الشاشة حقن الأجنة لتحديد تلك التي قد تم حقنه بنجاح، والتقاط الصور للمرة الأولى النقطة. لمواجهة هذه التحديات، قمنا بتطوير مجموعة من الأجهزة ميكروستروكتوريد التي تساعد على استقرار 2 من الأجنة إدارة الشرطة الاتحادية في التوجهات المختلفة سواء microinjection5، وللفرز السريع القائم على الصورة بعد الحقن.
للحصول على قرار الهيكلية الكافية في هذه الأجهزة، ونحن تستخدم تقنيات فوتوليثوغرفيك. يشيع استخدامها في الصناعات الإلكترونية الدقيقة وأكثر مؤخرا باستقراء لتلفيق موائع جزيئية، يمكن تحقيق هذه النهج الهياكل العمودية تتراوح بين 1-1,000 ميكرون، نطاق مناسب تماما للتلاعب بالأجنة الزرد واليرقات. كانت ملفقة كافة الأجهزة باستخدام بولي دايمثيل سيلوكسان (PDMS)، ورخيصة وقوية جسديا وبيولوجيا الخاملة وشفافة.
ميكروستروكتوريد صفائف السطحية (MSAs) تم تنسيقها ككتل PDMS مع سطح العلوي منقوشة، مماثلة لقنوات بسيطة في كتل [اغروس] شائع الاستخدام microinjection البيض. لفحص ما بعد الحقن، يمكن صفت 6 أجهزة تصوير في لوحة 6-جيدا زجاجية قياسية. صممت هذه الأجهزة لتحميل سهل للأجنة، بينما مريح يسمح الإجراء تفريغ إنقاذ الأجنة محددة، تيسير المستندة إلى الصور فحص النهج بطريقة أكثر سهولة من تلك الأجهزة وضعت سابقا مختبر بيب6.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dow Corning Sylgard 184&#160; Polydimethylsiloxane (PDMS)&#160;</td>
			<td>Ellsworth Adhsives</td>
			<td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td>
			<td>For casting the devices. Kit includes PDMS monomer and Initiator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low gelling temperature agarose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9414-10G</td>
			<td>For casting agarose devices</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFDTS silane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>448931-10G</td>
			<td>For casting of negative PDMS molds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine (MS-222)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E10521-10G</td>
			<td>To anesthetize&#160; zebrafish&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine Dextran 70,000 Da</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D1818</td>
			<td>To trace microinjections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leukotriene B4 (LTB4)</td>
			<td>Cayman Chemicals</td>
			<td>20110</td>
			<td>Neutrophil chemoattractant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Formylmethionine-leucyl-phenylalanine (fMLP)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F3506-50MG</td>
			<td>Neutrophil chemoattractant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 cm Petri dish</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>08-757-148</td>
			<td>For Casting from the master wafer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass-bottom 6-well plates</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P06G-0-20-F</td>
			<td>For imaging devices</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass microcapillaries</td>
			<td>World Scientific Instruments</td>
			<td>TW-100-4</td>
			<td>For microinjection needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z350796</td>
			<td>For transferring zebrafish embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader tips</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>E5242956003</td>
			<td>For loading the microinjection needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harris Uni-Core 1.5 mm punch</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>15111-15</td>
			<td>To punch ports in PDMS imaging devices</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No.&#160;11 Scalpel</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10011-00</td>
			<td>For cutting PDMS&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont No. 5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-10</td>
			<td>For dechorionating embryos and breaking microinjection needle tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marzhauser Micromanipulator</td>
			<td>ASI&#160;</td>
			<td>MM33-R</td>
			<td>For manipulating microinjection needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stand</td>
			<td>MSC</td>
			<td>SPI - 87242624</td>
			<td>For mounting micromanipulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MPPI-3 Picopump controller</td>
			<td>ASI</td>
			<td>MPPI-3</td>
			<td>To control microinjection volume and timing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS inverted fluorescent microscope</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>EVOS FL</td>
			<td>To image injected embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ745</td>
			<td>For visualizing microinjecion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoCAD software</td>
			<td>Autodesk</td>
			<td></td>
			<td>Download AutoCAD files from: https://dx-doi-org.remotexs.ntu.edu.sg/10.6084/m9.figshare.4282853 and on the ZFIN community protocols wiki page: https://wiki.zfin.org/display/prot/ZFIN+ Protocol+Wiki &#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microstructured devices for optimized microinjection and imaging of zebrafish larvae

وظهرت الزرد كنموذج قوي من مختلف الأمراض التي تصيب الإنسان وأداة مفيدة لمجموعة متزايدة من الدراسات التجريبية، التي تغطي الأساسية علم الأحياء التنموي من خلال شاشات الجينية والكيميائية على نطاق واسع. ومع ذلك، العديد من التجارب، لا سيما تلك المتعلقة بالعدوى ونماذج إكسينوجرافت، وتعتمد على microinjection وتصوير الأجنة واليرقات، وهي تقنيات الشاقة التي تتطلب مهارة وخبرة. لتحسين الدقة والإنتاجية الحالية microinjection التقنيات، قمنا بتطوير سلسلة من الأجهزة ميكروستروكتوريد لتوجيه واستقرار الأجنة الزرد في 2 يوما بعد الإخصاب (إدارة الشرطة الاتحادية) في اتجاه البطني أو الظهرية الجانبية قبل الإجراء. للمساعدة في تصوير الأجنة، صممنا أيضا جهاز بسيط مع القنوات التي توجه الزرد 4 أفقياً جنبا إلى جنب ضد زلة غطاء زجاج. معا، والأدوات التي نحن الحاضرين هنا تبين فعالية النهج فوتوليثوغرفيك لإنشاء الأجهزة مفيدة لتعظيم الاستفادة تقنيات الزرد.

النهج المذكور هنا يدل على التصميم (الشكل 1) وتصنيع الأجهزة للاستخدام مع 2 إدارة الشرطة الاتحادية الزرد، استخدام تقنيات (الشكل 3) لينة معدني وفوتوليثوغرفيك (الشكل 2). يسمح هذا الأسلوب لاختبار السريع العديد من التكرارات التصميم والتعديلات، والتعديلات والأمثل للأبعاد المجهرية للاستخدام مع الزرد في مراحل أخرى من التنمية، ويمكن توسيع نطاق تطبيقها.
علينا أن نظهر استخدام هذه الأجهزة لتحدي microinjection تقنيات وتصوير مريحة. حويصلة عتيق (الشكل 4، أبيض مخطط تفصيلي متقطع) يوفر موقع المفيد والمميز المناعي ومعزولة لاختبار تجنيد العَدلات في الزرد9. لاختبار قدرة العَدلات الزرد للاستجابة لمعيار تشيمواتراكتانتس، 100 نانومتر فملب و LTB4 تم ميكروينجيكتيد إلى الحويصلات عتيق 2 إدارة الشرطة الاتحادية الزرد الأجنة (4F الشكل، ي)، باستخدام جهاز قناة ميكروستروكتوريد ( الشكل 1) لتثبيت الأجنة في الاتجاه الأفقي. حقن تتبع مع ارتفاع الوزن الجزيئي ديكستران والرودامين، وأداؤها في الأجنة Tg(mpx:EGFP) لتسهيل التصور لتجنيد العَدلات. أونينجيكتيد والأجنة (الشكل 4، ح) أجنة حقن والرودامين وحدها (4E الشكل، وأنا) كانت تستخدم كعناصر سلبية. عقب microinjection، نقلوا إلى جهاز قناة الصور (الشكل 1 أ، ب) الأجنة وتصويرها باستخدام أفوس مجهر فلوري (الشكل 4) في 30 دقيقة وحقن وظيفة ح 5 (الشكل 4-G و الشكل 4 حك، على التوالي). كما هو متوقع، عدد صغير من العَدلات نيون إضافيون لحويصلة عتيق حقنت وهمية في تيميبوينت المبكر (الرقم 4I)، يرجح أن سبب الضرر بوساطة التوظيف. من المثير للاهتمام، والتتبع ديكستران والرودامين لوحظ أن تتراكم في أوتوليثس أثناء التجربة. لكلا تشيمواتراكتانتس (الرقم 4F, J)، تم تعيين العَدلات في أرقام أعلى، وبصفة خاصة ردا على LTB4 (4F الشكل).
وتبين النتائج الممثل هو موضح هنا الاستخدام الناجح لهذا الأسلوب microinjection والتصوير من الزرد. في سياق فحوصات تجنيد العَدلات الزرد، تطبيق هذه الأدوات في تركيبة مع تقنيات التصوير حية تفصيلية و تحليل الهجرة الخلية المتطورة10 قد توفر منبرا مفيداً للتجارب المستقبلية في هذا المجال.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56498/56498fig1.jpg"> رقم 1: مساعدة الحاسوب الرسم (كندي) تصميم الأقنعة التصويرية. (أ-ج) تصميم كندي ميكروستروكتوريد ديفوتس السطحية لتحديد المواقع في جانبية (A) والبطني (ب)، والظهريه (ج) التوجهات. خطوط ملونة مختلفة تمثل تصاميم قناع كندي لميزات مختلفة، مع الأخضر 100 ميكرومتر، الأزرق 200 ميكرومتر، ومرتفعات ميزة 400 ميكرون أحمر. شريط المقياس = 500 ميكرومتر. (د-F) تصميم كندي للقنوات ميكروستروكتوريد لتحديد المواقع في جانبية (د) والبطني (E)، والظهريه (F) التوجهات. خطوط ملونة مختلفة تمثل تصاميم قناع لميزات مختلفة، مع الأخضر 100 ميكرومتر، الأزرق 200 ميكرومتر، ومرتفعات ميزة 400 ميكرون أحمر. مقياس بار: 500 ميكرومتر. (ز--أنا) تصميم CAD للتصوير الأجهزة المصممة لتحميل الرأس-أول (ز) أو الذيل-أول (حاء وطاء). الخطوط الزرقاء تمثل 400 ميكرون الميزات، بينما تمثل الخطوط الحمراء 600 ميكرون الميزات. تبين الأسهم اتجاه اليرقات التي يتم تحميلها. شريط المقياس = 200 ميكرومتر. وقد تم تعديل هذا الرقم من إليت et al. 5 <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56498/56498fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56498/56498fig2.jpg"> رقم 2: رقاقة سيليكون الرئيسي- (أ) القسم العلوي ليفر الرئيسي يظهر الميزات لتوجيه اليرقات الفردية في ديفوتس. (ب) أسفل المقطع ليفر الرئيسي عرض التصميم للقنوات ميكروستروكتوريد. وقد تم تعديل هذا الرقم من إليت et al. 5 <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56498/56498fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56498/56498fig3.jpg"> الشكل 3: أجهزة PDMS ميكروستروكتوريد- (أ) PDMS كتلة المدلى بها من يفر الرئيسي عرض ديفوتس لتوجيه اليرقات الفردية. (ب) PDMS كتلة المدلى بها من يفر الرئيسي عرض القنوات ميكروستروكتوريد. وقد تم تعديل هذا الرقم من إليت et al. 5 <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56498/56498fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56498/56498fig4.jpg"> الشكل 4: نتائج تمثيلية: التصوير تجنيد العَدلات الزرد عقب تسليم microinjection من تشيمواتراكتانتس إلى حويصلة عتيق. (أ-ب) تحميل وتركيب أجنة للتصوير. (أ)-أول الرئيس الجهاز مع الأجنة جاهزة للتحميل، مع منفذ المشار إليه (السهم الأسود). (ب) تحميل الأجنة بعد أنهم انتقلوا إلى موقف (السهم الأصفر). (ج) 6-كذلك الزجاج-أسفل لوحة مع التصوير أجهزة المجهر. يسمح هذا التنسيق التصوير 4 جانبياً الموجهة لاجنة كل بئر (مجموع الأجنة 24)، باستخدام مجهر مقلوب قياسية. (د-ز) العَدلات (اجفب-الأخضر) أونينجيكتيد (د) الجنين وبالتالي حويصلة عتيق microinjection من والرودامين ديكستران (أحمر، وفتح السهم الأبيض) وحدها (E)، 100 نانومتر LTB4 (F)، وشمال البحر الأبيض المتوسط 100 فملب (ز) 30 دقيقة بعد الحقن (mpi). (ح-ك) العَدلات (اجفب-الأخضر) في جنين (ح) أونينجيكتيد و 5 ح عقب حويصلة otic microinjection من والرودامين ديكستران (أحمر، وفتح السهم الأبيض) وحدها (أنا) 100 نانومتر LTB4 (J)، وشمال البحر الأبيض المتوسط 100 فملب (ك) ح 5 وظيفة حقن ( hpi). شريط المقياس = 200 ميكرومتر. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56498/56498fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>

Watch this Scientific Journal Video about Microstructured Devices for Optimized Microinjection and Imaging of Zebrafish Larvae at JoVE.com

Microstructured Devices for Optimized Microinjection and Imaging of Zebrafish Larvae

Microinjection اليرقات والأجنة الزرد أسلوب حاسم ولكنها صعبة المستخدمة في نماذج الزرد كثيرة. نقدم هنا، مجموعة من الأدوات عبارة للمساعدة في تحقيق الاستقرار والتوجه الزرد microinjection والتصوير.

أجهزة ميكروستروكتوريد Microinjection الأمثل وتصوير يرقات الزرد

Zebrafish have emerged as a powerful model of various human diseases and a useful tool for an increasing range of experimental studies, spanning ...

microstructured-devices-for-optimized-microinjection-imaging

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.5K Views.  Massachusetts General Hospital–Harvard Medical School–Shriners Burns Hospital. Microinjection اليرقات والأجنة الزرد أسلوب حاسم ولكنها صعبة المستخدمة في نماذج الزرد كثيرة. نقدم هنا، مجموعة من الأدوات عبارة للمساعدة في تحقيق الاستقرار والتوجه الزرد microinjection والتصوير.

Video: Microstructured Devices for Optimized Microinjection and Imaging of Zebrafish Larvae

Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two layers of skin that enclose undifferentiated mesenchyme, and because the larval tail fin regenerates rapidly within 2-3 days. Using this system, we demonstrate a method for capturing the repair dynamics of the amputated tail fin with time-lapse video brightfield stereomicroscopy. We demonstrate that fin amputation triggers a contraction of the amputation wound and extrusion of cells around the wound margin, leading to their subsequent clearance. Fin regeneration proceeds from proximal to distal direction after a short delay. In addition, developmental growth of the larva can be observed during all stages. The presented method provides an opportunity for observing and analyzing whole tissue-scale behaviors such as fin development and growth in a simple microscope setting, which is easily adaptable to any stereomicroscope with time-lapse capabilities.

We present a protocol for capturing the dynamics of zebrafish larval tail fin regeneration on a whole-tissue scale using brightfield-based stereomicroscopy. This technique enables capturing the regeneration dynamics with single cell resolution. This methodology can be adapted to any stereomicroscope equipped with a CCD camera and time-lapse software.

التقاط إصلاح الأنسجة في الزرد اليرقات مع الوقت الفاصل بين Brightfield Stereomicroscopy

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

تحليل الزرد اليرقات الهيكل العظمي النزاهة العضلات مع ايفانز الأزرق صبغ

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

التصوير الهياكل التحت خلوية في الأجنة الحية اسماك الزرد

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing developmental processes as they happen in the living animal. Cells of interest can be labeled by using a tissue specific promoter to drive the expression of a fluorescent protein (FP) for the generation of transgenic lines. Using fluorescent photoconvertible proteins for this purpose additionally allows to precisely follow defined structures within the expression domain. Illuminating the protein in the region of interest, changes its emission spectrum and highlights a particular cell or cell cluster leaving other transgenic cells in their original color. A major limitation is the lack of known promoters for a large number of tissues in the zebrafish. Conversely, gene- and enhancer trap screens have generated enormous transgenic resources discretely labeling literally all embryonic structures mostly with GFP or to a lesser extend red or yellow FPs. An approach to follow defined structures in such transgenic backgrounds would be to additionally introduce a ubiquitous photoconvertible protein, which could be converted in the cell(s) of interest. However, the photoconvertible proteins available involve a green and/or less frequently a red emission state1 and can therefore often not be used to track cells in the FP-background of existing transgenic lines. To circumvent this problem, we have established the PSmOrange system for the zebrafish2,3. Simple microinjection of synthetic mRNA encoding a nuclear form of this protein labels all cell nuclei with orange/red fluorescence. Upon targeted photoconversion of the protein, it switches its emission spectrum to far red. The quantum efficiency and stability of the protein makes PSmOrange a superb cell-tracking tool for zebrafish and possibly other teleost species.

We established the photoconvertible PSmOrange system as a powerful, straight-forward and cost inexpensive tool for in vivo cell tracking in GFP transgenic backgrounds. This protocol describes its application in the zebrafish model system.

تتبع الخلايا في الزرد-GFP المعدلة وراثيا باستخدام نظام Photoconvertible PSmOrange

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing ...

Microinjection for Transgenesis and Genome Editing in Threespine Sticklebacks

The threespine stickleback fish has emerged as a powerful system to study the genetic basis of a wide variety of morphological, physiological, and behavioral phenotypes. The remarkably diverse phenotypes that have evolved as marine populations adapt to countless freshwater environments, combined with the ability to cross marine and freshwater forms, provide a rare vertebrate system in which genetics can be used to map genomic regions controlling evolved traits. Excellent genomic resources are now available, facilitating molecular genetic dissection of evolved changes. While mapping experiments generate lists of interesting candidate genes, functional genetic manipulations are required to test the roles of these genes. Gene regulation can be studied with transgenic reporter plasmids and BACs integrated into the genome using the Tol2 transposase system. Functions of specific candidate genes and cis-regulatory elements can be assessed by inducing targeted mutations with TALEN and CRISPR/Cas9 genome editing reagents. All methods require introducing nucleic acids into fertilized one-cell stickleback embryos, a task made challenging by the thick chorion of stickleback embryos and the relatively small and thin blastomere. Here, a detailed protocol for microinjection of nucleic acids into stickleback embryos is described for transgenic and genome editing applications to study gene expression and function, as well as techniques to assess the success of transgenesis and recover stable lines.

Transgenic manipulations and genome editing are critical for functionally testing the roles of genes and cis-regulatory elements. Here a detailed microinjection protocol for the generation of genomic modifications (including Tol2-mediated fluorescent reporter transgene constructs, TALENs, and CRISPRs) is presented for the emergent model fish, the threespine stickleback.

Microinjection لTransgenesis والجينوم التحرير في Threespine أبو شوكة

The threespine stickleback fish has emerged as a powerful system to study the genetic basis of a wide variety of morphological, physiological, and ...

A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. In particular, posterior body elongation is an essential process in embryonic development by which multiple tissue deformations act together to direct the formation of a large part of the body axis. In order to observe this process by long-term time-lapse imaging it is necessary to utilize a mounting technique that allows sufficient support to maintain samples in the correct orientation during transfer to the microscope and acquisition. In addition, the mounting must also provide sufficient freedom of movement for the outgrowth of the posterior body region without affecting its normal development. Finally, there must be a certain degree in versatility of the mounting method to allow imaging on diverse imaging set-ups. Here, we present a mounting technique for imaging the development of posterior body elongation in the zebrafish D. rerio. This technique involves mounting embryos such that the head and yolk sac regions are almost entirely included in agarose, while leaving out the posterior body region to elongate and develop normally. We will show how this can be adapted for upright, inverted and vertical light-sheet microscopy set-ups. While this protocol focuses on mounting embryos for imaging for the posterior body, it could easily be adapted for the live imaging of multiple aspects of zebrafish development.

Here, we present a versatile mounting method that allows for the long-term time-lapse imaging of the posterior body development of live zebrafish embryos without perturbing normal development.

تنوعا تصاعد الطريقة على المدى الطويل التصوير التنمية الزرد

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. ...

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. Although many immunohistochemistry protocols have been optimized for mammalian tissue and tissue sections, these protocols often require modification and optimization for non-mammalian model organisms. Zebrafish are increasingly used as a model system in basic, biomedical, and translational research to investigate the molecular, genetic, and cell biological mechanisms of developmental processes. Zebrafish offer many advantages as a model system but also require modified techniques for optimal protein detection. Here, we provide our protocol for whole-mount fluorescence immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae. This protocol additionally describes several different mounting strategies that can be employed and an overview of the advantages and disadvantages each strategy provides. We also describe modifications to this protocol to allow detection of chromogenic substrates in whole mount tissue and fluorescence detection in sectioned larval tissue. This protocol is broadly applicable to the study of many developmental stages and embryonic structures.

Here, we present a protocol for fluorescent antibody-mediated detection of proteins in whole preparations of zebrafish embryos and larvae.

كامل جبل المناعة الكيمياء في الأجنة حمار وحشي واليرقات

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...

In Situ Hybridization in Zebrafish Larvae and Juveniles during Mesonephros Development

The zebrafish forms two kidney structures in its lifetime. The pronephros (embryonic kidney) forms during embryonic development and begins to function at 2 days post fertilization. Consisting of only two nephrons, the pronephros serves as the sole kidney during larval life until more renal function is required due to the increasing body mass. To cope with this higher demand, the mesonephros (adult kidney) begins to form during metamorphosis. The new primary nephrons fuse to the pronephros and form connected lumens. Then, secondary nephrons fuse to primary ones (and so on) to create a branching network in the mesonephros. The vast majority of research is focused on the pronephros due to the ease of using embryos. Thus, there is a need to develop techniques to study older and larger larvae and juvenile fish to better understand mesonephros development. Here, an in situ hybridization protocol for gene expression analysis is optimized for probe penetration, washing of probes and antibodies, and bleaching of pigments to better visualize the mesonephros. The Tg(lhx1a-EGFP) transgenic line is used to label progenitor cells and the distal tubules of nascent nephrons. This protocol fills a gap in mesonephros research. It is a crucial model for understanding how new kidney tissues form and integrate with existing nephrons and provide insights into regenerative therapies.

In Situ Hybridization in Zebrafish Larvae and Juveniles during Mesonephros Development

The zebrafish is an important model for understanding kidney development. Here, an in situ hybridization protocol is optimized to detect gene expression in zebrafish larvae and juveniles during mesonephros development.

في سيتو التهجين في يرقات حمار وحشي والأحداث خلال تطوير Mesonephros

The zebrafish forms two kidney structures in its lifetime. The pronephros (embryonic kidney) forms during embryonic development and begins to function at ...

Using Alizarin Red Staining to Detect Chemically Induced Bone Loss in Zebrafish Larvae

Chemically induced bone loss due to lead (Pb) exposure could trigger an array of adverse impacts on both human and animal skeletal systems. However, the specific effects and mechanisms in zebrafish remain unclear. Alizarin red has a high affinity for calcium ions and can help visualize the bone and illustrate skeletal mineral mass. In this study, we aimed to detect lead acetate (PbAc)-induced bone loss in zebrafish larvae by using alizarin red staining. Zebrafish embryos were treated with a series of PbAc concentrations (0, 5, 10, 20 mg/L) between 2 and 120 h post fertilization. Whole-mount skeletal staining was conducted on larvae at 9 days post fertilization, and the total stained area was quantified using ImageJ software. The results indicated that the mineralized tissues were stained in red, and the stained area decreased significantly in the PbAc-exposure group, with a dose-dependent change in bone mineralization. This paper presents a staining protocol for investigating skeletal changes in PbAc-induced bone defects. The method can also be used in zebrafish larvae for the detection of bone loss induced by other chemicals.

Here, we have used alizarin red staining to show that lead acetate exposure causes a bone mass change in zebrafish larvae. This staining method can be adapted to the investigation of bone loss in zebrafish larvae loss induced by other hazardous toxicants.

استخدام تلطيخ أليزارين الأحمر للكشف عن فقدان العظام المستحث كيميائيا في يرقات الزرد

Chemically induced bone loss due to lead (Pb) exposure could trigger an array of adverse impacts on both human and animal skeletal systems. However, the ...

التعديل الوراثي للعضويات الدماغية الرئيسيات

Targeted Microinjection and Electroporation of Primate Cerebral Organoids for Genetic Modification

The cerebral cortex is the outermost brain structure and is responsible for the processing of sensory input and motor output; it is seen as the seat of higher-order cognitive abilities in mammals, in particular, primates. Studying gene functions in primate brains is challenging due to technical and ethical reasons, but the establishment of the brain organoid technology has enabled the study of brain development in traditional primate models (e.g., rhesus macaque and common marmoset), as well as in previously experimentally inaccessible primate species (e.g., great apes), in an ethically justifiable and less technically demanding system. Moreover, human brain organoids allow the advanced investigation of neurodevelopmental and neurological disorders.
As brain organoids recapitulate many processes of brain development, they also represent a powerful tool to identify differences in, and to functionally compare, the genetic determinants underlying the brain development of various species in an evolutionary context. A great advantage of using organoids is the possibility to introduce genetic modifications, which permits the testing of gene functions. However, the introduction of such modifications is laborious and expensive. This paper describes a fast and cost-efficient approach to genetically modify cell populations within the ventricle-like structures of primate cerebral organoids, a subtype of brain organoids. This method combines a modified protocol for the reliable generation of cerebral organoids from human-, chimpanzee-, rhesus macaque-, and common marmoset-derived induced pluripotent stem cells (iPSCs) with a microinjection and electroporation approach. This provides an effective tool for the study of neurodevelopmental and evolutionary processes that can also be applied for disease modeling.

تسليط الضوء على المؤلف: الحقن المجهري المستهدف والتثقيب الكهربائي للعضويات الدماغية الرئيسية للتعديل الوراثي  

The electroporation of primate cerebral organoids provides a precise and efficient approach to introduce transient genetic modification(s) into different progenitor types and neurons in a model system close to primate (patho)physiological neocortex development. This allows the study of neurodevelopmental and evolutionary processes and can also be applied for disease modeling.

الحقن المجهري المستهدف والتثقيب الكهربائي للعضويات الدماغية الرئيسية للتعديل الوراثي

The cerebral cortex is the outermost brain structure and is responsible for the processing of sensory input and motor output; it is seen as the seat of ...