Die Autoren möchte Kami Harris für besser gekleideteres Design, Ashley McKibbon und Jessica Thomas-Ebbett für Dreharbeiten, John Blakely, Alexandra Foley-Eby, Chris Langley, Julie Lewis, Kelsey McIntyre, Ashley McKibbon, Chris Zinck und Rosie den Hund für das erscheinen in der Video. A. M. K. wurde von der kanadischen Lyme-Borreliose-Forschungsgemeinschaft unterstützt und Projektförderung durch naturwissenschaftlich-technischen Forschung Rat von Kanada (NSERC) zur Verfügung gestellt wurde. M. K. B. W. finanziell Gehalt von New Brunswick Innovation Foundation (NBIF).

1. DNA-Isolierung von Zecken
<ol><li>Erwerben Sie Zecken über Feldauflistung oder passive Überwachung von Tierärzten und Mitgliedern der Öffentlichkeit. Zecken sollten getötet durch Einfrieren, platziert in einem versiegelten Beutel und verschickt bei Raumtemperatur.<ol>
<li>Verwenden ein Formular, informieren Sie sich auf das Datum und die geographische Lage der Begegnung, Tick Anlage Status, Wirtsarten und Zeitgeschichte reisen der Gastgeber.</li>
		<li>Da nested PCR von Natur aus anfällig für Verschmutzung ist, sicherzustellen Sie, dass die Labor-Arbeitsbereich eingerichtet wurde, dass Kreuz-minimieren der Proben. Dies beinhaltet Ausführung verschiedene Elemente des Protokolls in separaten, dedizierten Räumen gut voneinander isoliert, die gründlich gereinigt und sterilisiert werden, und um sicherzustellen, dass alle Instrumente sind frei von Verunreinigungen.</li>
		<li>Fotografieren Sie nach Erhalt der Probekörpers die Zecke zu und bestimmen Sie Arten, Entwicklungsstadium, Geschlecht und Milchstau Status im Vergleich zu einer Identifizierung wichtiger32 .</li>
		<li>Halbieren Sie unter aseptischen Bedingungen die Zecke mit Hilfe einer sterilen Rasierklinge oder einem Skalpell, und legen Sie die zwei Tick-Fragmente in separaten Mikrozentrifugenröhrchen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Um Gesamt-DNA zu extrahieren, verwenden Sie jede Isolierung-Prozedur, die PCR-kompatible Vorlage ergibt; Dieses Protokoll zeigt einen einfachen Chelat-basierten Ansatz.<ol>
<li>Zunächst fügen einem entsprechenden Volumen (oft zwischen 50-200 µL) eine lytische Chelat-Reagenz auf das Tick-Fragment. Die konkrete Höhe richtet sich nach der Probe Größe und Milchstau Status; Leitlinien sollten vom Hersteller bereitgestellt werden. Mit einem Reaktionscup Stößel zu homogenisieren.</li>
		<li>Inkubieren Sie Proben in einem Wasserbad bei 60 ° C für 45 min. und Vortex kurz.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie Proben für 4 min bei 16.276 x g (13.300 u/min) in eine Desktop-Microcentrifuge.</li>
		<li>Übertragen Sie überstand auf eine frische, beschriftete Reaktionscup mit 50 µL Isopropanol, Mix von Inversion und Zentrifugieren Sie erneut wie in (1.2.3).</li>
		<li>Abgießen Sie den Überstand, und spülen Sie das DNA-Pellet mit 50 µL 70 % Ethanol.</li>
		<li>Entfernen Sie überschüssige Ethanol mit einer Pipette und lassen Sie das Pellet 15 min bei Raumtemperatur an der Luft trocknen.</li>
		<li>Aufschwemmen DNA, hinzufügen 50 µL 1 mM Tris pH 7.0 und inkubieren Sie Proben in einem Wasserbad für 1 h bei 60 ° C. Die DNA kann jetzt bei-20 ° C für künftige molekulare Analysen gespeichert werden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. nested PCR-Nachweis von Borrelien OspA und Fettpölsterchen.
Hinweis: Eine Übersicht über allgemeine PCR-Prinzipien und Praktiken wird von Lorenz, 201233bereitgestellt.
<ol><li>Synthetisieren oder Borrelien äußeren und inneren Oligonukleotid-gen-spezifische Primer zu erhalten. Siehe Tabelle 1 für Grundierung Sets, ihre jeweiligen Amplikons Größen und Schmelztemperaturen.</li>
</ol><table border="1"><tbody>
<tr>
<td>Primer-Name</td>
			<td>Gen Ziel</td>
			<td colspan="2">Sequenz (5' - 3')</td>
			<td>Größe der Amplifikate</td>
			<td>Anlasstemperatur</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fettpölsterchen, Fw</td>
			<td>FlaB</td>
			<td colspan="2">gcatcactttcagggtctca</td>
			<td rowspan="2">503 bp</td>
			<td rowspan="2">55° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fettpölsterchen, Rv</td>
			<td>FlaB</td>
			<td colspan="2">tggggaacttgattagcctg</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fettpölsterchen In Fw</td>
			<td>FlaB</td>
			<td colspan="2">ctttaagagttcatgttggag</td>
			<td rowspan="2">447 bp</td>
			<td rowspan="2">58° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fettpölsterchen In Rv</td>
			<td>FlaB</td>
			<td colspan="2">tcattgccattgcagattgt</td>
		</tr>
<tr>
<td>OspA-Out Fw</td>
			<td>OspA</td>
			<td colspan="2">cttgaagttttcaaagaagat</td>
			<td rowspan="2">487 bp</td>
			<td rowspan="2">55° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>OspA-Out Rv</td>
			<td>OspA</td>
			<td colspan="2">caactgctgacccctctaat</td>
		</tr>
<tr>
<td>OspA In Fw</td>
			<td>OspA</td>
			<td colspan="2">acaagagcagacggaaccag</td>
			<td rowspan="2">350 bp</td>
			<td rowspan="2">58° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>OspA In Rv</td>
			<td>OspA</td>
			<td colspan="2">ttggtgccatttgagtcgta</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1: Innere und äußere Primer für nPCR von Borrelia BurgdorferiFlaB und OspA. In der Praxis die FlaB -Primer erkennen B. Burgdorferi s.s. und andere eng im Zusammenhang mit Borrelien Genospecies während OspA Primer nur B. Burgdorferi s.s. erfassen Verstärkung aus beiden Loci deutet darauf hin, B. Burgdorferi. s.s.
<ol start="2"><li>Pre-sterilisieren Sie einen PCR-Schrank mit UV-Licht und 70 % Ethanol. Hinweis: Um mögliche Kontamination der Probe zu minimieren, sollte in diesem Arbeitsbereich werden unterscheidet sich von der Lage der Zecke Dissektion, DNA-Extraktion, und gel-Elektrophorese.<ol>
<li>Verwenden Sie für den ersten PCR-Lauf die äußere Primer in Verbindung mit der Vorlage, die DNA erholt oben in Schritt 1.0, die und richten Sie das Reaktionsgemisch wie in Tabelle 2beschrieben. Parallel führen Sie positive Control läuft bestehend aus verifizierten Borrelien DNA und Negativkontrolle läuft einschließlich keine-Vorlage Reaktionen um Reagenz und Aerosol Kontamination zu erkennen. Fügen Sie DNA am Ende um mögliche Verschmutzung von Reagenzien zu minimieren. Stellen Sie sicher, dass jedes Rohr überhaupt geschlossen ist, mal als Reagenzien werden nicht hinzugefügt und enge Röhren sofort nach Zugabe der DNA und bevor andere Röhren geöffnet werden.</li>
		<li>Programmieren einer Thermocycler folgendermaßen: 95 ° C für 5 min; 40 Zyklen von 95 ° C für 15 s, Ausglühen Temperatur für 30 s, 72 ° C für 45 s; 72 ° C für 5 min; und bei 4 ° c halten</li>
	</ol>
</li>
	<li>Führen Sie die zweite Runde der PCR ähnlich wie die erste Reaktion, außer inneren Primer mit 2 µL der ersten PCR-Produkt (hergestellt in 2.2.2) verwenden. Hinweis: Reaktion Volumen sind wieder in Tabelle 2angegeben. Zur Vermeidung von Kreuzkontamination der Amplifikate indem sichergestellt wird, dass Vorlage DNA zuletzt hinzugefügt wird und dass nur Röhren entspricht einer Probe gleichzeitig geöffnet sind, muss darauf geachtet werden. 
	 
	<table border="1"><tbody>
<tr>
<td>Komponente</td>
				<td>PCR-# 1-Volumes</td>
				<td>PCR # 2 Bände</td>
			</tr>
<tr>
<td>Taq Polymerase Master Mix 2 X</td>
				<td>12,5 ΜL</td>
				<td>12,5 ΜL</td>
			</tr>
<tr>
<td>Nuklease-freies Wasser</td>
				<td>8.5 ΜL</td>
				<td>8.5 ΜL</td>
			</tr>
<tr>
<td>10 µM Forward und Reverse Primer</td>
				<td>1,0 µL äußere Primer</td>
				<td>1,0 µL innere Primer</td>
			</tr>
<tr>
<td>DNA-Vorlage</td>
				<td>2.0 µL, von der Probengewinnung (1.2.7)</td>
				<td>2.0 µL aus Runde 1 der PCR (2.2.2)</td>
			</tr>
</tbody></table>
Tabelle 2: PCR Reaktionsmischungen für erste und zweite Vergrößerungen. 
	 
	<ol>
<li>Programm der Thermocycler wie zuvor, aber passen Sie die Anlasstemperatur um die innere Primer zu berücksichtigen (siehe Tabelle 1).</li>
	</ol>
</li>
</ol>(3) Agarose-Gelelektrophorese und Bildgebung
Hinweis: Grundlegende Anweisungen DNA durch Elektrophorese zu trennen, finden Sie unter Lee Et Al., 201234.
<ol><li>Bereiten Sie eine 1,2 % Agarosegel mit 20 X SB Puffer (0,2 M NaOH, 0,8 M Borsäure pH 8), 1 X verdünnt und abschmecken Sie etwa 5 µL des Fleckes DNA vor dem Gießen, Pre-Färbung des Gels ist.</li>
	<li>Last 10 µL des Produkts von der zweiten (inneren) PCR-Reaktion aus jeder experimentellen und Kontrollprobe, neben einer 100 bp-Leiter (5 µL).<ol>
<li>Für 1 h bei 107 electrophorese V (5V/cm).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Zeigen Sie an und dokumentieren Sie das Gel mit einem Transilluminator und zugehörigen Kamera und Software.</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Über jahrzehntelange Nutzung, PCR-basierten Techniken haben immer wieder bewiesen ihren Wert in den Nachweis von Borrelien von Arthropoden und Säugetieren Proben, ob Borrelien aus ökologischen oder klinischen Herkunft kommen. PCR bietet viele Verbesserungen gegenüber bereits vorhandenen Ansätze zur Überwachung. Vor allem, es ist nicht angewiesen auf die Entwicklung und Leistung der Antikörper Reagenzien und stattdessen um neue Ziele von Interesse zu erkennen, einfach durch Ändern der Grundierung Sequenzen leicht angepasst werden. PCR beherbergt auch die Bewertung der mehrere Loci parallel, entweder eigenständig oder über eine Multiplex-Reaktion. Es kann zu vielfältigen Probe Eingänge, einschließlich frisch und archivierten Zecken22, Tier- oder menschlichen Körperflüssigkeiten und resezierten Gewebes25angewendet werden. PCR liefert auch Amplifikate, die weiter verarbeitet werden können, z. B. durch Beschränkung Enzym Verdauung, Sonde Hybridisierung oder Sequenzierung, erhöhte Einblick in mikrobiellen Identität21.
Als klinische Tool ist PCR standard serologische Diagnostik, konzeptionell vorzuziehen, da es einen direkten Hinweis auf bakterielle Präsenz, anstatt auf Host Immunantwort als sekundäre Maßnahme der Infektion bietet. Lyme-Borreliose ist aber verbunden mit einer relativ bescheidenen mikrobielle Belastung (< 50 Organismen/mL Urin oder Plasma) und vorübergehende Spirochetemia, die falsch-negativ hervorrufen kann Ergebnisse25. Die Empfindlichkeit dieser Technik in der Klinik sehr unterschiedlich je nach Gewebe, Stadium der Infektion und Probe Zustand zwischen 12,5 % und 62 % in vorhandene Untersuchungen von Blut, Liquor cerebrospinalis und biopsiert Gewebe36fallen. Molekulare Empfindlichkeit Einschränkungen sind kein Anliegen wenn PCR im Anschluss an die Bakterienkultur erfolgt, aber Erholung von lebensfähigen Spirochetes von klinischen Proben ebenso anspruchsvoll erwiesen hat. Erst kürzlich wurden Protokolle für höhere Ausbeute35optimiert. Unterdessen kann Darm von einer infizierten Zecke Erwachsene im Durchschnitt überall von 2.000 auf über 50.000 Borrelien37,38,39, Hafen fest im Erfassungsbereich des nPCR ist. Somit eignet sich das Protokoll zur Tick Überwachung Bemühungen.
Trotz vieler Vorteile stellt nPCR bestimmte Herausforderungen, und die Kapazität dieser Technik richtig angeben, dass Zecken Infektion hängt daher strategische Auswahl von Genen und Amplifikate, sorgfältige experimentelle Workflows, die Qualität DNA wiederherstellen von Proben bei gleichzeitiger Minimierung der Kreuz-Exposition von Proben und die Verwendung geeigneter Kontrollen, die Verunreinigungen in der Laborumgebung und Reagenzien melden können. Vor jedem Experiment sollte den Umfang und die Absichten der Untersuchung eindeutig festzulegen, dass darin, geeignete genetische Loci und Regionen ausgewählt werden können. Wenn das Ziel einen unvoreingenommenen Bildschirm für die Lyme-verursachenden Borrelia Burgdorferi s.l. komplexe soll, Primer geschaffen werden, um alle zugehörigen Stämme mit ähnlicher Affinität zu erkennen und Verstärkung Effizienz, ohne die Erfassung unabhängig Organismen25. Neue Primer können entworfen werden und bewertet in Silico mit Software-Tools wie Primer-BLAST40, obwohl sie gegen Standardwerk auch experimentell überprüft werden soll isoliert vor auf Fußgelenkes Proben angewendet wird. Die DNA-Extraktionsverfahren soll intakte mikrobielle Vorlage von ökologischen Mischprobe (Tick Homogenat) zu erholen. Ein optionaler Schritt, bevor Sie fortfahren mit PCR ist es, die Integrität der extrahierten DNA zu bewerten. Darüber hinaus könnten parallele Reaktionen auf ein Zimmermädchen-gen in die Zecke eingerichtet werden. Die letztere Methode kann auch angeben, dass die Anwesenheit von Inhibitoren in das Reaktionsgemisch, Bereitstellung von Selbstvertrauen, dass negative Borrelien Reaktionen aufgrund des Fehlens des Organismus und nicht auf das Vorhandensein von einem hemmenden Verunreinigung.
Die erhöhte Empfindlichkeit der verschachtelten PCR-Ansatz geht auf Kosten der möglichen Kontamination, die falsch-positiven Ergebnisse erwirtschaftet. Exogene Vorlage könnte zu einer Probe während Tick Dissektion und DNA-Recovery oder bei der Einrichtung der äußeren und inneren Amplifikationen eingeführt werden. Es ist daher besonders wichtig, beste Praxis Protokolle für PCR, Vorlage oder Amplifikate zu vermeiden folgen Cross-Kontamination. Dazu gehören die Verwendung von separaten Arbeitsstationen mit unabhängigen Luftströme, Eindämmung in PCR und biologische Sicherheitswerkbänke, gegebenenfalls gründliche chemische und physikalische Reinigung und Sterilisation von Oberflächen und Reagenzien und vorsichtigen Umgang mit DNA 41. Nr. Vorlagensteuerelemente sind auch entscheidend bei der Identifizierung von Kontamination der Lager Reagenzien. Eine besondere Gefährdung des nPCR ist der Amplifikate handling, das tritt auf, wenn die Produkte der ersten Reaktion in der zweiten PCR-Gefäß zu übertragen. Da das Ziel DNA exponentielle Anreicherung im positiven Proben bereits durchgemacht hat, dieser Schritt ist besonders anfällig für Cross-Kontamination und ein Single-Tube nPCR Protokoll wurde entwickelt, um diese Einschränkung zu umgehen. Bei diesem Ansatz werden beide Arten von Grundierungen für ein bestimmtes Gen zusammen ein Reaktionsgefäß hinzugefügt, die abgedichtet für beide Runden des PCR31bleibt. Die äußeren und inneren Grundierung Paare müssen thermodynamisch deutlich, so sein, dass das äußere paar Vorlage auf eine hohe Anlasstemperatur verstärkt, die für die innere Primer unerschwinglich ist. In der zweiten Runde wird die Anlasstemperatur abgesenkt, um das innere paar unterzubringen. Nicht nur ist dies einen potenziell verwirrende Schritt umgehen, es erlaubt auch die Verwendung von zusätzlichen Anti-Kontamination misst31,42. Diese Änderung kann jedoch einige Assay Sensibilität Opfern. Unabhängig von dem Ansatz helfen Erhöhung der Zahl der technischen Wiederholungen durchgeführt unabhängig voneinander auf einer Stichprobe, um vermeidbare Verunreinigung zu identifizieren.
Molekulare Techniken haben weiterhin seit der Einführung des nPCR zu entwickeln, und diese neueren Ansätze bieten ausgewählte Vorteile gegenüber den ursprünglichen Entwürfen, wenn auch an finanziellem Aufwand erhöht. Wie der Name schon sagt, quantitative PCR (qPCR oder Real Time (RT)-PCR) ermöglicht die Aufzählung der Erreger in einer Probe, während konventionelle Techniken qualitativer Natur43. Die Empfindlichkeit der qPCR ähnelt angeblich nPCR38, obwohl es je nach Grundierung Eigenschaften28schwanken kann. Eine Variation der qPCR, das molecular Beacons (MB) anstelle von herkömmlichen TaqMan-Sonden verwendet hat auch Versprechen in den Nachweis von Borrelien in klinischen Proben44,45,46gezeigt. Aufgrund ihrer einzigartigen Sekundärstruktur produzieren molecular Beacons angeblich geringere Hintergrundfluoreszenz und höhere legitime Signale, wodurch höhere Sensitivität47. Prä-klinischen Auswertungen vorschlagen einen möglichen Nachweisgrenze von zwischen einem und zehn Spirochäten44,45. Darüber hinaus wurde die Technik erfolgreich in Multiplex-Reaktionen gleichzeitig erkennen eine Säugetier-Wirt gen44 und andere durch Zecken übertragene Krankheitserreger45, das ist nicht so leicht erreichbar mit nPCR angewendet. Weitere Design-Modifikationen umfassen Tröpfchen digitale PCR (DdPCR)-Technologie, der ohne den Einsatz einer Standardkurve39,48DNA quantifizieren kann. Die untere Nachweisgrenze dieser Technik für Borrelien ist ebenfalls rund zehn Spirochäten/Probe39. Im Vergleich zu nPCR, haben diese Ansätze auch den Vorteil der reduzierten Potenzial für Verschmutzung, da sie nur ein einzelnes Verstärkung Protokoll erfordern.
Das Ziel der Überwachung statt ist, den abwechslungsreichen bakteriellen Inhalt einer Zecke zu profilieren, 16 s rRNA metagenomische Screening eine attraktive Option49. Obwohl dieser Ansatz teurer ist, spezielle DNA-Sequenzer nicht gefunden in allen molekularbiologischen Labors erfordert und anspruchsvollere Bioinformatik-basierte Auslegung erfordert, kann es ein breites Spektrum von Mikroben auf mehr genau erfassen. die Erreger-Last des Vektors zu vertreten.
Während qPCR und seine Derivate Methoden der Wahl für quantitative Anwendungen sind und Metagenomik Bildschirme breite Vorräte von der Zecke Mikrobiom bieten, gezielte Überwachung Bemühungen oft beschäftigen sich mit binären Berichterstattung über das Vorhandensein oder Fehlen von eine oder mehrere Erreger in einem Vektor. Unter solchen Umständen können diese neuere, aufwendigere Ansätze unnötiger Komplexität und finanzielle Belastung in den Prozess einführen. Aus diesen Gründen hat nPCR den Test der Zeit als eine zentrale Technik in Tick Prüfung standgehalten.

Lyme-Borreliose (LD) ist die am weitesten verbreiteten Vektoren übertragene Infektion in der nördlichen Hemisphäre, und die Inzidenz weiter um1zu erhöhen. Diese schwächende Krankheit wird verursacht durch spirocheteal Erreger der Lyme-Borreliose (LB) komplexe (gemeinhin als Borrelia Burgdorferi Sensu Lato oder s.l.), historisch die vorherrschende nordamerikanischen Erreger, B umfasst. Burgdorferi Sensu Stricto (SS), neben B. Afzelii und B. Garinii, die sind in Europa und Asien weit verbreitet, und Arten von neuen klinischen Relevanz2,3. Diese Bakterien sind für den Menschen durch den Biss von infizierten Ixodes Zecken2. übertragen. Obwohl die wichtigsten nordamerikanischen Vektoren I. Scapularis und I. Pacificussind, wurden mehrere Arten innerhalb dieser Gattung zu beherbergen und übertragen das Bakterium4gefunden. Beim Menschen verursachen B. Burgdorferi multisystemischen Symptome, die Auswirkungen auf die Haut, Gelenke, Herz, Nervensystem, endokrinen Drüsen, Magen-Darm-Trakt und inneren Organe5,6,7, 8,9,10. Das Center for Disease Control and Prevention schätzt derzeit mehr als 300.000 neue Fälle pro Jahr in den Vereinigten Staaten11,12. Während die Prognose oft günstig ist, wenn die Krankheit diagnostiziert und in den frühen Stadien behandelt, jedoch haben Studien gezeigt, dass überall zwischen 10 % und 60 % der Patienten, die die empfohlene antibiotische Therapie nach der Therapie Symptome weiterhin erhalten Einstellung, bezeichnet ein Phänomen Post Behandlung Lyme-Borreliose-Syndrom (PTLDS)13,14,15. Darüber hinaus können Verzögerungen in klinische Intervention aus Mangel an Bewusstsein für einen Zeckenstich, unspezifische Präsentation der ursprünglichen Krankheit, und die geringe Sensitivität der traditionellen Serologie-basierte Diagnostik bei Ausbruch der Infektion ergeben. Ausfall, rasch und angemessen zu behandeln kann Symptom Progression, die sich in immer mehr schwächenden Komplikationen16,17manifestieren kann. Lyme-Borreliose Prävention ist daher ein Eckpfeiler des Risiko-Managements. Strategien, um dieser wachsenden Bedrohung zu bekämpfen gehören robuste Überwachungsmaßnahmen um die Prävalenz der Erreger in Zecken anzugeben und geografische Regionen von Interesse zu identifizieren.
Dieser Artikel beschreibt das Dienstprogramm von verschachtelten Polymerase-Kettenreaktion (nPCR) als molekulare Screening-Instrument, um die infizierte Zecken zu identifizieren. Um die Spezifität zu erhöhen, sind zwei Borrelien Gene für parallele Verstärkung benutzt. Flagellin B (FlaB) kodiert ein großen Filament-Protein der Geissel18, und das Gen befindet sich auf der einzigen linearen Chromosom, während das Lipoprotein-Produkt des Outer Surface Protein A (OspA) Tick Mitteldarm vermittelt Kolonialisierung und Plasmid-kodierte19,20. Der Workflow besteht aus Tick Sammlung, DNA-Extraktion und dann eine erste Runde der PCR Borrelienerkennen-spezifische Loci. Anschließende PCR verwendet das Produkt der ersten Reaktion als eine neue Vorlage, um kleinere, interne Verstärkung Fragmente zu generieren. Eine Zecke gilt als positiv für Borrelia Burgdorferi , wenn innere Amplifikate aus beiden Borrelien -Gene durch Agarose-Gelelektrophorese nachgewiesen werden können.
Die nPCR Technik und Fettpölsterchen sowohl die OspA gen Ziele haben für ökologische Überwachung und klinischen Nachweis von Lyme Spirochäten seit den frühen 1990er Jahren21,22,23 weit verbreitet ,24,25. Vor der Entwicklung der molekularen Protokolle wurden Zecken von unterwirft Darminhalt zu beflecken Anti -Borrelia Immunfluoreszenz (IF), mikrobielle Kultur oder eine Kombination davon26bewertet. Diese Ansätze leiden inhärenten Beschränkungen, einschließlich des langsamen Wachstums und anspruchsvolle Art der Borrelien27, Antikörper-Performance-Probleme und das Erfordernis der live Zecken für IF Verarbeitung21. PCR wurde später angenommen, um schnelle, sensitive und spezifische Identifikation von infizierten Vektoren zur Verfügung zu stellen. Es bot deutliche Verbesserungen über die traditionellen Methodik, einschließlich kulturunabhängig direkte Anwendung auf verschiedenen Probenarten wie tot und archivierten Zecken, die sonst nicht geeignet zum Testen von21,22 . Verschachtelte experimentellen Designs weiter verbessert die Spezifität und Sensitivität der klassischen PCR durch den Einsatz von zwei unterschiedliche Sätze von Gen-spezifische Primer in zwei aufeinander folgenden Runden Verstärkung25,28.
Experimentelle Erfolg hängt entscheidend von strategischen gen Auswahl und Amplifikate Design. Um das Vorhandensein von Borrelia Burgdorferigenau abschätzen zu können, sollte Primer die relevanten Erreger erkennen, ohne kreuzreagierende mit Rückfallfieber Spirochäten auch in der Gattung Borrelia . Im Falle von Fettpölsterchenist diese Besonderheit erzielt durch die Ausrichtung auf eine interne Variable Region des Gens, anstatt die relativ erhaltenen flankierenden Sequenzen, die durch verschiedene Bakterien (Abbildung 1)24,29 geteilt werden , 30.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56471/56471fig1.jpg"> Abbildung 1: das Konzept der nPCR, wie abgebildet, mit Borrelien FlaB gen als Ziel. Der 5' und 3' Termini des Gens sind häufig auf Organismen über Borrelia Burgdorferi s.l., rendern diese Regionen ungeeignet für die spezifische Beurteilung der Lyme-verursachenden Erreger. Die weniger konserviert Innenraum Sequenzen als Grundierung Ziele verwenden, werden zwei Runden von PCR ausgeführt, um eine endgültige, interne Amplifikate zu erkennen. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56471/56471fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
In einem Test ihrer diskriminierenden Kapazitäten wurden innen FlaB -Primer mit über 80 verschiedenen Borrelien -Isolate ausgewertet und festgestellt, dass um nur diejenigen, die mit Lyme-Borreliose24verbunden zu ermitteln. Die untere Nachweisgrenze des nPCR wurde dokumentiert auf sechs24 bis zehn31 Bakterien aus Reinkultur, obwohl die Empfindlichkeit durch südliche Beflecken der Amplifikate und Hybridisierung ein möglicher weiter verbessert werden kann oder Chemilumineszenz-Sonde. Kupplung die Techniken reduziert die Nachweisgrenze auf einen einzigen Spirochete31. Durch direkten Vergleich ergab sich konventionelle, unprobed Einzel-Runde PCR, berichten die Präsenz von mindestens 104 Spirochäten31. Es sollte jedoch darauf hingewiesen, dass Assay Empfindlichkeit niedriger sein wird, bei der Arbeit mit komplexen Umwelt- und klinische Proben, durch die überwältigende Präsenz von unabhängigen DNA und mögliche hemmende Stoffe. Diese Herausforderungen können durch den Einsatz von nPCR weitgehend umgangen werden.
Trotz Fortschritten in der molekularen Technologien in den vergangenen Jahrzehnten bleibt nPCR eine Heftklammer Technik in modernen Überwachung Bemühungen. Wenn bei der Konzipierung und Durchführung dieses Protokolls geachtet wird, ist es leistungsfähig, anpassungsfähig und relativ unkompliziert Ansatz, das Vorhandensein von Krankheitserregern im Tick Vektoren zu erfassen.

<table><tbody><tr><td>LabGard Class II, Type A2 biological safety cabinet</td><td>Nuaire</td><td>ES AIR NU-543&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Razor blades</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td>0.22 mm thickness</td></tr><tr><td>Microfuge Tubes (Microtubes 1.5 mL)</td><td>Axygen</td><td>311-08-051</td><td></td></tr><tr><td>AquaGenomic&amp;nbsp;</td><td>MultiTarget Pharmaceuticals</td><td>2030</td><td>DNA extraction reagent</td></tr><tr><td>Microtube Pestle</td><td>Diamed</td><td>DIATEC610-1551</td><td>Designed for 1.5 ml tubes</td></tr><tr><td>Water bath - Isotemp 202</td><td>Fishse Scientific</td><td>15-462-2</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Labnet</td><td>S0100 CAN</td><td></td></tr><tr><td>Spectrafuge 24D Digital Microcentrifuge</td><td>Labnet</td><td>C2400</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>190764</td><td></td></tr><tr><td>BIS-TRIS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B9754</td><td></td></tr><tr><td>Primer Synthesis</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>OLIGO</td><td></td></tr><tr><td>PCR Cabinet</td><td>Misonix</td><td>PCR6-482</td><td></td></tr><tr><td>PCR tube with attached flat caps 0.2mL</td><td>VWR</td><td>20170-012</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq Green Master Mix 2x</td><td>Promega</td><td>M7123</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-free water</td><td>Promega</td><td>M7123</td><td>The water comes with the GTG</td></tr><tr><td>Spectrafuge Mini</td><td>Labnet</td><td>C1301</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Safe DNA Stain 10,000X Concentration</td><td>EDVOTEK</td><td>608</td><td></td></tr><tr><td>Froggarose LE (Molecular Biology Grade Agarose)</td><td>FroggaBio</td><td>A87-500G</td><td></td></tr><tr><td>GD 100 bp DNA Ladder</td><td>FroggaBio</td><td>DM001-R500&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Electrophoresis power pack&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>VWR 105</td><td>EC Apparatus Corporation</td></tr><tr><td>Fluor-S MultiImager&amp;nbsp;</td><td>BioRad</td><td>170-7700 (Serial number 433B0154)</td><td></td></tr><tr><td>Quantity One 1-D Analysis Software (V. 4.5.2)</td><td>BioRad</td><td>1709600</td><td></td></tr></tbody></table>

detecting the lyme disease spirochete, borrelia burgdorferi, in ticks using nested pcr

Lyme-Borreliose ist eine schwere Vektoren übertragene Infektion, die durch die Borrelia Burgdorferi Sensu Lato Familie der Spirochäten, verursacht wird, die durch den Biss von infizierten Ixodes Zecken auf den Menschen übertragen werden. Der primäre ätiologische Agent in Nordamerika ist Borrelia Burgdorferi Sensu Stricto. Als geografische Risikoregionen zu erweitern, ist es ratsam, robuste Überwachungsprogramme zu unterstützen, die können Tick Infektionsraten zu messen, und Ergebnisse, Ärzte, Tierärzte und der Öffentlichkeit zu kommunizieren. Die molekulare Technik der verschachtelten Polymerase-Kettenreaktion (nPCR) ist seit langem verwendet zu diesem Zweck, und es bleibt eine zentrale, billigen und robusten Ansatz in den Nachweis von Borrelien in Zecken und Wildtiere.
Dieser Artikel demonstriert die Anwendung der nPCR ankreuzen, DNA Extrakte zu infizierten Proben zu identifizieren. Zwei unabhängige B. Burgdorferi zielt, Gene codieren Flagellin B (FlaB) und Outer Surface Protein A (OspA), benutzt worden ausführlich mit dieser Technik. Das Protokoll beinhaltet Tick Sammlung, DNA-Extraktion und dann eine erste Runde der PCR, jeweils zwei Borrelienzu erkennen-spezifische Loci. Nachfolgenden Polymerase-Kettenreaktion (PCR) verwendet das Produkt der ersten Reaktion als eine neue Vorlage, um kleinere, interne Verstärkung Fragmente zu generieren. Die verschachtelte Ansatz verbessert die Spezifität und Sensitivität der konventionellen PCR. Eine Zecke gilt als positiv für den Erreger, wenn innere Amplifikate aus beiden Borrelien -Gene durch Agarose-Gelelektrophorese nachgewiesen werden können.

nPCR ist ein eleganter Ansatz zur Erhöhung der Spezifität und Sensitivität der Erregernachweis, insbesondere bei komplexen Umweltproben untersucht werden. Wie in Abbildung 1dargestellt, können zwei Runden von PCR gezielt eine strategisch wichtige Region der Borrelien FlaB Locus (und OspA, nicht im Bild) das Vorhandensein von Borrelia Burgdorferi -Bakterien durch die Generierung von kurzen inneren melden. Amplifikate. Wenn durch Gelelektrophorese gelöst, können die Fettpölsterchen und OspA Reaktionsprodukte aus jedem Tick visuell erzielte und Kontrollen verglichen. In Abbildung 2Unikat-IDs werden am oberen Rand jedes Gel zur Verfügung gestellt, und keine-Vorlage und Aerosol-Steuerelemente sind vertreten ganz links und rechts, bzw., angrenzend an den Leitern.
Robuste Amplikons Bands sind in ausgewählten experimentellen Proben deutlich sichtbar, und sie sind leicht zu unterscheiden von überschüssigen Primer und restliche DNA (Abbildung 2). Basierend auf den experimentellen Design Grundsätzen, eine Zecke positive Borrelien wenn parallel Negativkontrollen zeigen keine Verstärkung und inneren Amplifikate entstehen von Fettpölsterchen und OspA Primern gilt. In diesem Fall Kriterien Proben T907, T604 und T606 Überwachung für die Lyme-Erreger (Abbildung 2). Steckbrief, T923 war nur positiv für OspA, ein Ergebnis, dafür gibt es mehrere mögliche Erklärungen: A) die Zecke Ursprungs war negativ für Borrelien, aber die äußere oder innere OspA -PCR Zubereitung kontaminiert wurde fälschlicherweise mit Schablone DNA (Anmerkung, die systemische Kontamination von Reagenzien über Negativkontrollen ausgeschlossen wurde), B) das ticken getragene Lyme- Borrelien, aber niedrige Vorlage Beträge oder experimentellen Fehler verhindert Verstärkung der FlaB, oder C) ein Organismus anwesend war Das enthielt die konservierte OspA -Sequenz, aber fehlte Flagellin oder hatte nicht genügend Identität gezielt Fettpölsterchen , um die Zündkapseln Tempern und Umgebung. In der Tat, wurden in einer Vielzahl von Organismen, einschließlich Pflanzen und Tiere28 OspA Sequenz Ähnlichkeiten festgestellt. Die Situation umgekehrt, Verstärkung der mehr konserviert Flagellin -gen, aber nicht das OspA -gen, deutet eine Verwandten Borrelien -Arten. In der Praxis ergibt dieses Protokoll mehr OspA Single-Positive Ergebnisse als die FlaB -Primer, was darauf hindeutet, dass Szenario "A" die wenigsten wahrscheinliche Erklärung ist zu tun. Ohne weitere experimentelle Analyse der strittigen Probe ist jedoch nicht möglich, die Quelle des Single-positives Ergebnis zu bestimmen. Erhöhung der Anzahl der technischen Wiederholungen auf zweideutige Proben durchgeführt, kann helfen, um ihre wahre Stellung zu vereinbaren, da Verunreinigungen, die fälschlicherweise zu früheren Reaktionen eingeführt wurden nicht in die archivierte DNA vorhanden wäre. Wenn nachfolgende Reaktionen mit diesen Primer nicht schlüssige Ergebnisse liefern, konnten andere Borrelien -Loci mittels PCR untersucht werden. Amplifikate generiert aus diesen Reaktionen könnte auch sequenziert und unter Isolate zur Identität zuweisen, und schätzen Sie das Ausmaß der Belastung Divergenz verglichen werden. SAPI und Kollegen bieten ein Beispiel für diesen Workflow mit menschlichen klinischen Proben35.
Alle Faktoren berücksichtigt, die beschriebenen Protokoll und Interpretation Kriterien eingeschätzt wurden, bzw. falsche positive und falsche negative Zinsen von 0,17 % und 0,0063 % Ausbeute.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56471/56471fig2.jpg"> Abbildung 2 : Erkennung von Borrelia burgdorferi in einzelnen Zecken durch nPCR von FlaB und OspA. Codes zugewiesen jedem Tick sind am oberen Rand der Gele vertreten und Identitäten werden vertikal ausgerichtet, um den Nachweis von OspA und FlaB in jeder Probe zu melden. Lanes berechtigt B am linken Rand stellen keine Vorlage Bildsteuerung, während ein (rechten Fahrspuren) Aerosol Steuerelemente, Kontamination der Laborumgebung zu erfassen sind. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56471/56471fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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Detecting the Lyme Disease Spirochete, Borrelia Burgdorferi, in Ticks Using Nested PCR

Nested PCR ist eine sensible, spezifische und einfache Technik, die Zecke kann, die DNA extrahiert angewendet werden, um Borrelia Burgdorferi, dem Erreger der Lyme-Borreliose untersuchen. Das erste PCR-Experiment verwendet gen-spezifische Primer, um lange Amplifikate zu generieren, die dann Vorlagen für eine nachfolgende Reaktion unter Verwendung der internen Zündkapseln werden.

Das Lyme Krankheit Spirochete, Borrelia Burgdorferiin Zecken mit verschachtelten PCR zu erkennen

Lyme disease is a serious vector-borne infection that is caused by the Borrelia burgdorferi sensu lato family of spirochetes, which are transmitted to ...

detecting-lyme-disease-spirochete-borrelia-burgdorferi-ticks-using

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Detecting the Lyme Disease Spirochete, Borrelia Burgdorferi, in Ticks Using Nested PCR

17.9K Aufrufe.  Mount Allison University. Nested PCR ist eine sensible, spezifische und einfache Technik, die Zecke kann, die DNA extrahiert angewendet werden, um Borrelia Burgdorferi, dem Erreger der Lyme-Borreliose untersuchen. Das erste PCR-Experiment verwendet gen-spezifische Primer, um lange Amplifikate zu generieren, die dann Vorlagen für eine nachfolgende Reaktion unter Verwendung der internen Zündkapseln werden.

Serie: Detecting the Lyme Disease Spirochete, Borrelia Burgdorferi, in Ticks Using Nested PCR

Methods for Rapid Transfer and Localization of Lyme Disease Pathogens Within the Tick Gut

Lyme disease is caused by infection with the spirochete pathogen Borrelia burgdorferi, which is maintained in nature by a tick-rodent infection cycle 1. A tick-borne murine model 2 has been developed to study Lyme disease in the laboratory. While na&iacute;ve ticks can be infected with B. burgdorferi by feeding them on infected mice, the molting process takes several weeks to months to complete. Therefore, development of more rapid and efficient tick infection techniques, such as a microinjection-based procedure, is an important tool for the study of Lyme disease 3,4. The procedure requires only hours to generate infected ticks and allows control over the delivery of equal quantities of spirochetes in a cohort of ticks. This is particularly important as the generation of B. burgdorferi infected ticks by the natural feeding process using mice fails to ensure 100% infection rate and potentially results in variation of pathogen burden amongst fed ticks. Furthermore, microinjection can be used to infect ticks with B. burgdorferi isolates in cases where an attenuated strain is unable to establish infection in mice and thus can not be naturally acquired by ticks 5. This technique can also be used to deliver a variety of other biological materials into ticks, for example, specific antibodies or double stranded RNA 6. In this article, we will demonstrate the microinjection of nymphal ticks with in vitro-grown B. burgdorferi. We will also describe a method for localization of Lyme disease pathogens in the tick gut using confocal immunofluorescence microscopy.

Lyme disease research studies often require generation of ticks infected with the pathogen Borrelia burgdorferi, a process that typically takes several weeks. Here we demonstrate a microinjection-based tick infection procedure that can be accomplished within hours. We also demonstrate an immunofluorescence method for in situ localization of B. burgdorferi within ticks.

Methoden zur raschen Transfer und die Lokalisierung von Lyme-Borreliose Erreger innerhalb der Tick Gut

Lyme disease is caused by infection with the spirochete pathogen Borrelia burgdorferi, which is maintained in nature by a tick-rodent infection cycle 1.  ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Infectious diseases transmitted by arthropod vectors continue to pose a significant threat to human health worldwide. The pathogens causing these diseases, do not exist in isolation when they colonize the vector; rather, they likely engage in interactions with resident microorganisms in the gut lumen. The vector microbiota has been demonstrated to play an important role in pathogen transmission for several vector-borne diseases. Whether resident bacteria in the gut of the Ixodes scapularis tick, the vector of several human pathogens including Borrelia burgdorferi, influence tick transmission of pathogens is not determined. We require methods for characterizing the composition of the bacteria associated with the tick gut to facilitate a better understanding of potential interspecies interactions in the tick gut. Using whole-mount in situ hybridization to visualize RNA transcripts associated with particular bacterial species allows for the collection of qualitative data regarding the abundance and distribution of the microbiota in intact tissue. This technique can be used to examine changes in the gut microbiota milieu over the course of tick feeding and can also be applied to analyze expression of tick genes. Staining of whole tick guts yield information about the gross spatial distribution of target RNA in the tissue without the need for three-dimensional reconstruction and is less affected by environmental contamination, which often confounds the sequencing-based methods frequently used to study complex microbial communities. Overall, this technique is a valuable tool that can be used to better understand vector-pathogen-microbiota interactions and their role in disease transmission.

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Here, we present a protocol to spatially and temporally assess the presence of viable microbiota in tick guts using a modified whole-mount in situ hybridization approach.

Visualisierung der Mikrobiota in Tick Mut durch ganze-Mount In Situ Hybridisierung

Infectious diseases transmitted by arthropod vectors continue to pose a significant threat to human health worldwide. The pathogens causing these ...

Genetik

Evaluation of a Universal Nested Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction for the Detection of Lyssaviruses

To detect rabies virus and other member species of the genus Lyssavirus within the family Rhabdoviridae, the pan-lyssavirus nested reverse transcription polymerase chain reaction (nested RT-PCR) was developed to detect the conserved region of the nucleoprotein (N) gene of lyssaviruses. The method applies reverse transcription (RT) using viral RNA as template and oligo (dT)15 and random hexamers as primers to synthesize the viral complementary DNA (cDNA). Then, the viral cDNA is used as a template to amplify an 845 bp N gene fragment in first-round PCR using outer primers, followed by second-round nested PCR to amplify the final 371 bp fragment using inner primers. This method can detect different genetic clades of rabies viruses (RABV). The validation, using 9,624 brain specimens from eight domestic animal species in 10 years of clinical rabies diagnoses and surveillance in China, showed that the method has 100% sensitivity and 99.97% specificity in comparison with the direct fluorescent antibody test (FAT), the gold standard method recommended by the World Health Organization (WHO) and the World Organization for Animal Health (OIE). In addition, the method could also specifically amplify the targeted N gene fragment of 15 other approved and two novel lyssavirus species in the 10th Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV) as evaluated by a mimic detection of synthesized N gene plasmids of all lyssaviruses. The method provides a convenient alternative to FAT for rabies diagnosis and has been approved as a National Standard (GB/T36789-2018) of China.

A pan-lyssavirus nested reverse transcription polymerase chain reaction has been developed to detect specifically all known lyssaviruses. Validation using rabies brain samples of different animal species showed that this method has a sensitivity and specificity equivalent to the gold standard fluorescent antibody test and could be used for routine rabies diagnosis.

Bewertung einer universellen, veralteten Transcription Polymerase Chain Reaction zur Erkennung von Lyssaviren

To detect rabies virus and other member species of the genus Lyssavirus within the family Rhabdoviridae, the pan-lyssavirus nested reverse transcription ...

Feeding of Ticks on Animals for Transmission and Xenodiagnosis in Lyme Disease Research

Transmission of the etiologic agent of Lyme disease, Borrelia burgdorferi, occurs by the attachment and blood feeding of Ixodes species ticks on mammalian hosts. In nature, this zoonotic bacterial pathogen may use a variety of reservoir hosts, but the white-footed mouse (Peromyscus leucopus) is the primary reservoir for larval and nymphal ticks in North America. Humans are incidental hosts most frequently infected with B. burgdorferi by the bite of ticks in the nymphal stage. B. burgdorferi adapts to its hosts throughout the enzootic cycle, so the ability to explore the functions of these spirochetes and their effects on mammalian hosts requires the use of tick feeding. In addition, the technique of xenodiagnosis (using the natural vector for detection and recovery of an infectious agent) has been useful in studies of cryptic infection. In order to obtain nymphal ticks that harbor B. burgdorferi, ticks are fed live spirochetes in culture through capillary tubes. Two animal models, mice and nonhuman primates, are most commonly used for Lyme disease studies involving tick feeding. We demonstrate the methods by which these ticks can be fed upon, and recovered from animals for either infection or xenodiagnosis.

Lyme disease is the most commonly-reported vector-borne disease in North America. The causative agent, Borrelia burgdorferi is a spirochete bacterium transmitted by Ixodid ticks. Transmission and detection of infection in animal models is optimized by the use of tick feeding, which we describe here.

Fütterung von Zecken auf Tiere, die zur Übertragung und Xenodiagnosis in Lyme Disease Research

Transmission of the etiologic agent of Lyme disease, Borrelia burgdorferi, occurs by the  attachment and blood feeding of Ixodes species ticks on ...

Cultivation Methods of Spirochetes from Borrelia burgdorferi Sensu Lato Complex and Relapsing Fever Borrelia

The Borrelia consists of three groups of species, those of the Lyme borreliosis (LB) group, also known as B. burgdorferi sensu lato (s.l.) and recently reclassified into Borreliella, the relapsing fever (RF) group Borrelia, and a third reptile-associated group of spirochetes. Culture-based methods remain the gold standard for the laboratory detection of bacterial infections for both research and clinical work, as the culture of pathogens from bodily fluids or tissues directly detects replicating pathogens and provides source material for research. Borrelia and&#160;Borreliella spirochetes&#160;are fastidious and slow growing, and thus are not commonly cultured for clinical purposes; however, culture is necessary for research. This protocol demonstrates the methodology and recipes required to successfully culture LB and RF spirochetes, including all recognized species from B. burgdorferi s.l. complex including&#160;B. afzelii, B. americana, B. andersonii, B. bavariensis, B. bissettii/bissettiae, B. burgdorferi sensu stricto&#160;(s.s.), B. californiensis, B. carolinensis, B. chilensis, B. finlandensis, B. garinii, B. japonica, B. kurtenbachii, B. lanei, B. lusitaniae, B. maritima, B. mayonii, B. spielmanii, B. tanukii, B. turdi, B. sinica, B. valaisiana, B. yangtzensis, and RFspirochetes, B. anserina, B. coriaceae, B. crocidurae, B. duttonii, B. hermsii, B. hispanica, B. persica, B. recurrentis, and B. miyamotoi. The basic medium for growing LB and RF spirochetes is the Barbour-Stoenner-Kelly (BSK-II or BSK-H) medium, which reliably supports the growth of spirochetes in established cultures. To be able to grow newly isolated Borrelia isolates from tick- or host-derived samples where the initial spirochete number is low in the inoculum, modified Kelly-Pettenkofer (MKP) medium is preferred. This medium also supports the growth of B. miyamotoi. The success of the cultivation of RF spirochetes also depends critically on the quality of ingredients.

Cultivation Methods of Spirochetes from Borrelia burgdorferi Sensu Lato Complex and Relapsing Fever Borrelia

In vitro culture is a direct detection method for the presence of living bacteria. This protocol describes methods for the culture of diverse Borrelia spirochetes,&#160;including those of the Borrelia burgdorferi sensu lato complex, relapsing fever Borrelia species, and Borrelia miyamotoi. These species are fastidious and slow growing but can be cultured.

Kultivierungsmethoden von Spirochäten aus Borrelia burgdorferi , Sensu Lato Complex und Rezidivfieber Borrelien

The Borrelia consists of three groups of species, those of the Lyme borreliosis (LB) group, also known as B. burgdorferi sensu lato (s.l.) and recently ...

Phage-Mediated Genetic Manipulation of the Lyme Disease Spirochete Borrelia burgdorferi

Introducing foreign DNA into the spirochete Borrelia burgdorferi has been almost exclusively accomplished by transformation using electroporation. This process has notably lower efficiencies in the Lyme disease spirochete relative to other, better-characterized Gram-negative bacteria. The rate of success of transformation is highly dependent upon having concentrated amounts of high-quality DNA from specific backgrounds and is subject to significant strain-to-strain variability. Alternative means for introducing foreign DNA (i.e., shuttle vectors, fluorescent reporters, and antibiotic-resistance markers) into B. burgdorferi could be an important addition to the armamentarium of useful tools for the genetic manipulation of the Lyme disease spirochete. Bacteriophage have been well-recognized as natural mechanisms for the movement of DNA among bacteria in a process called transduction. In this study, a method has been developed for using the ubiquitous borrelial phage &#966;BB-1 to transduce DNA between B. burgdorferi cells of both the same and different genetic backgrounds. The transduced DNA includes both borrelial DNA and heterologous DNA in the form of small shuttle vectors. This demonstration suggests a potential use of phage-mediated transduction as a complement to electroporation for the genetic manipulation of the Lyme disease spirochete. This report describes methods for the induction and purification of phage &#966;BB-1 from B. burgdorferi, the use of this phage in transduction assays, and the selection and screening of potential transductants.

Phage-Mediated Genetic Manipulation of the Lyme Disease Spirochete Borrelia burgdorferi

The ability of bacteriophage to move DNA between bacterial cells makes them effective tools for the genetic manipulation of their bacterial hosts. Presented here is a methodology for inducing, recovering, and using &#966;BB-1, a bacteriophage of Borrelia burgdorferi, to transduce heterologous DNA between different strains of the Lyme disease spirochete.

Phagenvermittelte genetische Manipulation der Borreliose Spirochete Borrelia burgdorferi

Introducing foreign DNA into the spirochete Borrelia burgdorferi has been almost exclusively accomplished by transformation using electroporation. This ...

Multiplex-Immunoassay für Borrelien-spezifisches IgG und IgM im Serum

Simultaneous Detection of Different Antibody Classes in a Multiplexed Serological Test

To monitor the progression of infectious diseases, it is useful to assess immunoreactivity against various antigenic determinants, and measure different antibody isotypes because they appear at different stages of the host immune response. With Lyme borreliosis, the pathogenic agent can be one of the multiple members of the Borrelia species. Therefore, correct sample classification requires evaluating the immunoreactivity against different antigens of different Borrelia species. Additionally, anti-pathogen IgG and IgM responses can have different elicitation time courses during disease progression. Here we demonstrate the development of a two-reporter multiplex immunoassay that has utility in identifying Borrelia-specific immune response in human serum samples by simultaneously evaluating both IgG and IgM immunoreactivity against different bacterial antigens in the same reaction well. This dual-reporter approach retains the analytical performance of single-reporter methods while conserving time and resources and reducing sample size requirements. This assay allows essentially double the serological information to be generated from a blood sample in half the time.

Autor im Rampenlicht: Erweiterung des Anwendungsbereichs von Multiplex-Immunoassays für die Lyme-Borreliose-Diagnostik und die Erregerforschung 

A three-channel dual-reporter fluorescence flow analysis system was used to develop a bead-based multiplex immunoassay that simultaneously evaluates serum samples for IgG and IgM elicited against multiple antigens of different Borrelia species that cause Lyme borreliosis in Europe and North America.

Gleichzeitiger Nachweis verschiedener Antikörperklassen in einem serologischen Multiplex-Test

To monitor the progression of infectious diseases, it is useful to assess immunoreactivity against various antigenic determinants, and measure different ...

Tick Microbiome Characterization by Next-Generation 16S rRNA Amplicon Sequencing

In recent decades, vector-borne diseases have re-emerged and expanded at alarming rates, causing considerable morbidity and mortality worldwide. Effective and widely available vaccines are lacking for a majority of these diseases, necessitating the development of novel disease mitigation strategies. To this end, a promising avenue of disease control involves targeting the vector microbiome, the community of microbes inhabiting the vector. The vector microbiome plays a pivotal role in pathogen dynamics, and manipulations of the microbiome have led to reduced vector abundance or pathogen transmission for a handful of vector-borne diseases. However, translating these findings into disease control applications requires a thorough understanding of vector microbial ecology, historically limited by insufficient technology in this field. The advent of next-generation sequencing approaches has enabled rapid, highly parallel sequencing of diverse microbial communities. Targeting the highly-conserved 16S rRNA gene has facilitated characterizations of microbes present within vectors under varying ecological and experimental conditions. This technique involves amplification of the 16S rRNA gene, sample barcoding via PCR, loading samples onto a flow cell for sequencing, and bioinformatics approaches to match sequence data with phylogenetic information. Species or genus-level identification for a high number of replicates can typically be achieved through this approach, thus circumventing challenges of low detection, resolution, and output from traditional culturing, microscopy, or histological staining techniques. Therefore, this method is well-suited for characterizing vector microbes under diverse conditions but cannot currently provide information on microbial function, location within the vector, or response to antibiotic treatment. Overall, 16S next-generation sequencing is a powerful technique for better understanding the identity and role of vector microbes in disease dynamics.

Here we present a next-generation sequencing protocol for 16S rRNA sequencing which enables identification and characterization of microbial communities within vectors. This method involves DNA extraction, amplification and barcoding of samples through PCR, sequencing on a flow-cell, and bioinformatics to match sequence data to phylogenetic information.

Tick Microbiome Charakterisierung von Next-Generation-16 s rRNA Amplikons Sequenzierung

In recent decades, vector-borne diseases have re-emerged and expanded at alarming rates, causing considerable morbidity and mortality worldwide. Effective ...

Das Lyme Krankheit Spirochete, Borrelia Burgdorferiin Zecken mit verschachtelten PCR zu erkennen

Zusammenfassung

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Methoden zur raschen Transfer und die Lokalisierung von Lyme-Borreliose Erreger innerhalb der Tick Gut

Visualisierung der Mikrobiota in Tick Mut durch ganze-Mount In Situ Hybridisierung

Bewertung einer universellen, veralteten Transcription Polymerase Chain Reaction zur Erkennung von Lyssaviren

Fütterung von Zecken auf Tiere, die zur Übertragung und Xenodiagnosis in Lyme Disease Research

Kultivierungsmethoden von Spirochäten aus Borrelia burgdorferi , Sensu Lato Complex und Rezidivfieber Borrelien

Phagenvermittelte genetische Manipulation der Borreliose Spirochete Borrelia burgdorferi

Gleichzeitiger Nachweis verschiedener Antikörperklassen in einem serologischen Multiplex-Test

Gleichzeitiger Nachweis verschiedener Antikörperklassen in einem serologischen Multiplex-Test

Gleichzeitiger Nachweis verschiedener Antikörperklassen in einem serologischen Multiplex-Test

Tick Microbiome Charakterisierung von Next-Generation-16 s rRNA Amplikons Sequenzierung