Die Autoren möchten sich Nicole Hasenkampf und Amanda Tardo für technische Unterstützung danken. Wir danken auch Drs. Linden Hu und Adriana Marques für die Empfehlung des LeFlap Aufnahme-Vorrichtung, und Dr. Lise Gern für den Unterricht an der Kapillare Fütterungsmethode. Diese Arbeit wurde vom NIH / NCRR Zuschuss 8 P20 GM103458-09 (MEE) und vom National Center for Research Resources und dem Office of Research Infrastructure Programme (OriP) der National Institutes of Health durch Gewährung P51OD011104/P51RR000164 unterstützt.

Eine experimentelle Umriss Zeckenimpfung und Fütterung bei Tieren für die Lyme-Borreliose Forschung ist in Abbildung 1 dargestellt. 1. Impfen Nymphen Ixodes Zecken mit B. burgdorferi Mit Kapillarrohr-Fütterung Bei der Durchführung von Manipulationen mit Zecken werden weiße Laborkittel mit elastischen Ärmel, Handschuhe und Einweg füllig Mützen getragen. <ol><li> Unser Verfahren ist eine modifizierte Version von dem durch Broadwater et al. 49 gemeldet. Bereiten Kapillaren durch Erhitzen und Ziehen Pasteur Pipetten zu brechen Dünne Verwendung einer Pipette Magnet. Mit einer Pinzette und Binokular, brechen Sie die Tipps zur optimalen Durchmesser (ca. 0,2 mm). Ein Rohr standardisiert auf Mundwerkzeuge der Zecke Größe als der Bemessung. Ein Gesichtsschutz sollte bei der Vorbereitung der Pipetten getragen werden. </li><li> Wachsen B. burgdorferi zwischen 2-8 × 10 7 / ml (mid-log-Phase) in BSK-H-Medium (Sigma) conhaltige 6% Kaninchenserum. </li><li> Verwenden Nymphen Zecken, die bei 23 ° C für 4-6 Wochen nach der Häutung der Larven abgelegt wurden. Ort Zecken auf eine kleine 60 x 15 mm Petrischale mit einem doppelseitigen Klebeband auf der äußeren unteren Oberfläche der Schale. Legen Sie die Zecken ventralen Seite nach oben. </li><li> Tauchen Sie die Kapillare Spitze in der B. burgdorferi Kulturröhrchen nach dem Mischen. Legen Sie die Kapillare über das Hypostom der Zecke Mundteile mit einem Binokular. Verwenden Knetmasse, um den Schlauch zu fixieren, wie in 2A gezeigt. </li><li> Legen Sie die Petrischalen mit aufgeklebten Zecken in einem großen, klaren Kunststoffwanne für einen zusätzlichen Grad des Einschlusses. Nasse Handtücher werden hinzugefügt, um Feuchtigkeit zu versorgen. Zeigen die Zecken in einem 37 ° C warmen Inkubator für 30 Minuten-2 Stunden, bis der Defäkation ist offensichtlich. Dies zeigt, dass die Medien, die Spirochäten wurde durch die Zecke übergeben. </li><li> Seien Sie die Zecken für 2-4 Wochen bei 23 ° C, um die Anpassung an die Umwelt Tick vor der Fütterung zu ermöglichensie auf Tiere. </li></ol> 2. Infizieren Mäuse mit B. burgdorferi von Tick <ol><li> Verdünnen Ketamin Lager 1:10 in sterilem Wasser. Betäuben jeder Maus mit 100 mg / kg Ketamin durch intraperitoneale Injektion mit einer Tuberkulinspritze </li><li> Sobald die Maus vollständig betäubt wird, rasieren Sie die Maus von den Ohren bis zur Mitte zurück mit einem feinen (Remington glatt und seidig) Elektro-Trimmer. </li><li> In einem weißen Pfanne ohne andere Gegenstände in der Nähe, übertragen Sie die Nymphen Zecken (Hafen, dass B. burgdorferi) mit einem angefeuchteten Pinsel auf den haarlosen Bereich der Maus. Alternativ können nicht infizierten Zecken auf Mäuse für Xenodiagnose von Mäusen mit verdächtigen Infektion platziert werden. Die Verwendung eines sauberen, weißen Oberfläche Zecken Platzierung wird sichergestellt, dass alle Zecken ungebunden ist leicht ersichtlich. </li><li> Platzieren Sie die Maus in spezialisierten Käfighaltung (Käfighaltung Allentown, Allentown, PA). Die Käfighaltung besteht aus einem Edelstahl-Grill aus dem Boden des Käfigs erhöht. Ter Käfig oben wurde von unserer hauseigenen Werkstatt modifiziert, um den Flaschenhalter genug, um freie Bewegung der Maus unterhalb erlauben zu erheben. Die Pfanne wird mit etwa ½ Zoll von Wasser zu stoppen alle Zecken, die aus Mäusen (3A) fallen gefüllt. Um die Gefahr der Unterkühlung zu minimieren, wiederverwendbare Wärmekissen, Mikrowelle vor verwenden, werden unter den Käfigen, bis Mäuse aus der Narkose aufwachen komplett. Tiere sind oft Ataxie, als sie aus der Narkose und reiben gegen Lebensmittel-und Wasserschalen zu erholen, so müssen diese entfernt werden. Der Wasserstand ist niedrig genug, um Gliedmaßen von Mäusen aus Untertauchen verhindern. </li><li> Setzen Sie den Käfig in einem Fach, das mit Tangle-Trap-Paste (Contech, Victoria, BC, Kanada) und Band gesäumt wurde, um den Einschluss von Arthropoden zu gewährleisten. Die Mäuse werden einzeln in Käfigen gehalten und kontinuierlich während der Dauer der Anästhesie beobachtet. </li><li> Innerhalb von 2 Stunden, wenn Mäuse sind völlig aus der Narkose erwacht, das Essen Schale und Wasserflasche sind in den Käfig ersetzt. Nach 24 Stunden, das Gehäuse Bereicherung, bestehend aus einem Kunststoff-Hütte und Nylabone ersetzt wird. </li><li> Nach 3, 4 und 5 Tage, prüfen Sie die Maus, Käfig und Käfig Wasser gefüttert Zecken. Der Käfig Wasser wird durch einen weißen Metallwanne gesiebt (zB &quot;Goldwaschen&quot;). Spülen gefüttert Zecken in sauberem Wasser und lagern in Plastikdosen (Abbildung 3B). An den Tagen 3 und 4 ersetzen Wasser im Käfig mit sauberem Wasser. Am Tag 5, überprüfen Sie nicht nur den Käfig, aber die Maus gründlich nach Zecken absuchen. In der Regel von dieser Stelle alle Zecken zugeführt und die Mäuse können regelmäßige Käfighaltung zurückgegeben werden. </li><li> Zeigen alle Abfälle aus den Mäusekäfige, einschließlich Flüssigkeiten, Biohazard Behälter für Autoklavieren und Entsorgung. Halten Sie ein Protokoll von der Anzahl der Zecken auf Mäuse und solche, jederzeit wiederhergestellt platziert. </li></ol> 3. Füttern Ticks auf nicht-menschlichen Primaten für die Infektion mit B. burgdorferi oder Xenodiagnose <ol><li> Bereiten Sie die Zecke Aufnahme-Vorrichtung: Schneiden Sie ein 1 ¾ Zoll Durchmesser Kreis in der 3-Zoll-x3-Zoll-LeFlap (Flap) mit einem sauberen Skalpell und die Mess-Reiseführer. Verwenden Sie den Ausschnitt als Vorlage, um Kreise von identischer Größe in der Biatane Schaum und Duoderm geschnitten. Der Schaum wird zur Klappe über der Oberfläche der Haut erhöhen und verhindern, dass mögliche Zerschlagung der Zecke. Die Duoderm fügt eine weitere Schicht der Polsterung und überlagert die Kanten der Aufnahme-Vorrichtung für zusätzliche Sicherheit durch Zecken Flucht. Ein Diagramm der Aufnahme-Vorrichtung ist in Fig. 4 dargestellt. </li><li> Veterinär Personal wird das Tier mit 5-8 mg / kg Telazol durch intramuskuläre Injektion betäuben. </li><li> Clip das Haar des Tieres mit elektrischen Trimmer (Oster) mit der Größe 40 Messern ausgestattet. Alle Bereiche, die von der Jacke abgedeckt werden, werden abgeschnitten: Rücken, Front, Oberarme. Mit Rasierschaum und Dual-Blade Einwegrasierer, dicht eine Fläche von ca. 25 cm x 20 cm vertikal horizontal rasieren. Wischen Sie mit einem feuchten Papiertüchern und trocken blasen mit geringer Wärme, um die Haut zu trocknen. </li><li> Legen Sie die Klappe auf ter Tierrücken, knapp unterhalb des Schulterblatts, auf jeder Seite der Wirbelsäule. Verwenden Sie eine Markierung, um den Kreis an dieser Stelle verfolgen. Bereiten Sie den Hautbereich, um den Kreis von mit SkinPrep abwischen. Dadurch wird Öl in die Haut, die die Haftung von Klebstoff-und Containment-Geräte beeinträchtigen könnten. So dass etwa 1 cm Umfang der Raum um den Kreis, eine Schicht der Hautkleber (SkinBond) mit einer Breite von ca. 4 cm. </li><li> Entfernen Sie die Schutzfolie von der Biatane Schaum und bringt die Haut in die entsprechende Stelle. Die Tiere werden wieder von Tierärzten mit 5 mg / kg Telazol betäubt. Dichten Sie die Ränder mit Hautkleber und Hypafix Band. Entfernen Sie die Schutzfolie von der Klappe und bringen auf dem Biatane. Zeigen Hypafix Band um die Kanten des LeFlap, dann kleben Sie die Maschen des Klappen und legen Sie die Jacke auf das Tier. Band-und Tangle-Trap-Paste wird auf dem Boden in einem Umkreis um den menschlichen Primaten Käfighaltung für zusätzliche Sicherheit angewendet. </li><li> Um die Auswirkungen zu minimieren chemicALS in Schritt 3.4 auf Pump Fütterung verwendet wird, werden die Zecken hat 24 Stunden nach der Aufnahme-Vorrichtung an Ort und Stelle ist. An diesem Punkt wird die Sicherheit der Vorrichtung inspiziert und auch verstärkt werden, wenn nötig. Typischerweise werden 20 nüchterne Nymphen (4-8 Wochen nach der Häutung der Larven) auf die Haut im Gerät mit einem Pinsel aufgenommen. </li><li> Entfernen Sie die Schutzfolie aus dem Netz der Klappe und verschließen Sie sie fest. Schließlich entfernen Sie die Duoderm Unterstützung, um Kleber freizulegen, und legen Sie oben auf der Aufnahme-Vorrichtung. Fügen Sie ein Stück Hypafix Band über das offene Mesh-Kreis und die Jacke ersetzen. Die fertige Behältervorrichtung ist in Fig. 5A gezeigt. </li><li> Nach 5 Tagen, die Tiere zu betäuben, wie oben und die Jacken entfernt. Entfernen Sie das Band erste Zecke Fütterung durch die Maschen (5B) zu inspizieren. Ziehen Sie vorsichtig die Duoderm weg von der Klappe. </li><li> Ziehen Sie den Netzabschnitt an den Rändern, um Zugang zu den Zecken bereitzustellen. Fed Zecken werden häufig in der Nähe oder im Internet unterder Schaum Kreis (Fig. 5C) und werden entfernt und mit einem Pinsel in reinem Wasser gegeben. Entfernen Sie das Gerät einmal alle sichtbaren gefüttert Zecken gesammelt (5D). </li></ol> Hinweis: Normalerweise können die Rückhaltevorrichtung einfach von der Haut abgezogen werden. Wenn die Haftung ist stark und könnte die Haut schädigen, wird Unisolve Lösungsmittel auf den Bereich für schonende Entfernung aufgetragen. Die Haut wird mit Isopropanol abgewischt und Zecken werden bei 23 ° C gelagert Wenn für die Infektion verwendet wird, kann die Zecken zerkleinert, um die Nummer, die B enthalten bestätigen burgdorferi. Wenn für Xenodiagnose verwendet wird, werden die Zecken für 1-3 Wochen vor der Analyse der Mitteldarminhalt gehalten.

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Um Zecken diesem Hafen B zu erhalten burgdorferi für nachfolgende Untersuchungen kann die Zecken werden: (1) bei infizierten Mäusen im Larvenstadium zugeführt wird, (2) in B. taucht burgdorferi Kulturen entweder an der Larven oder Nymphenstadium 48, (3) mit B. mikroinjizierten burgdorferi-47, oder (4)-Kapillare zugeführt B. burgdorferi-49. Während jedes dieser Verfahren hat den Zweck, zu gewährleisten, dass ein großer ...

Im Jahr 2011, Lyme-Krankheit war die 6. häufigste Landesmeldepflichtige Krankheit in Nordamerika ( <a href="http://www.cdc.gov/lyme/stats/index.html" target="_blank">http://www.cdc.gov/lyme/stats/index.html</a> ). B. burgdorferi ist ein vielseitiges Mikrobe, genetisch und antigene (Übersicht in 1). Seine genetische Konstitution umfasst eine große (&gt; 900 kB) Chromosom und bis zu 21 Plasmide (12 lineare, kreisförmige 9), die mit Plasmid-Gehalt unter unterschiedlichen Isolaten. Viel ist über diese Spirochäten gelernt werden, da mehr als 90% der Plasmid-offenen Leserahmen mit keinem der bekannten bakteriellen Sequenzen sind 2,3. B burgdorferi bietet eine Vielzahl von Antigenen als mögliche Ziele der Wirtsimmunität. Doch eine unbehandelte Infektion oft anhält. Das Zusammenspiel der Spirochäten mit der Zecke Milieu und dem Wirbel Host-Umgebung erfordert Anpassung von B. burgdorferi während des Infektionsprozesses. Mehrere Plasmid-kodiertenGene sind dafür bekannt, unterschiedlich in Reaktion auf Änderungen der Temperatur, des pH, der Zelldichte und sogar Stufe des Lebenszyklus der Zecke 4-8 ausgedrückt. Die Studie von B. burgdorferi Anpassung während seiner Enzootische Zyklus und Wirtsreaktionen nach der Infektion durch den natürlichen Weg beruht auf der Fähigkeit, Zecken auf geeigneten Tiermodellen zu ernähren. Solche Studien sind mit den technischen Herausforderungen der Erzeugung von Zecken, die B. Hafen erfüllt burgdorferi und die Sicherstellung der effizienten Übertragung und / oder Fütterung von Zecken auf dem Modell-Host. Darüber hinaus ist die Rückhaltung und Gewinnung von infizierten Zecken wesentlich. Unter den verwendeten Modelle sind Mäusen und nicht-menschlichen Primaten, von denen jeder dient als wertvolles Werkzeug bei Lyme-Borreliose Forschung. Wie mit dem weiß-footed Maus, die ein natürliches Reservoir für B. Host ist burgdorferi, ist die Labormaus ein sehr anfällig Host, persistierende Infektion unterstützt von B. burgdorferi-9. Folgende Infektion Krankheit anfälligen Mäusen, wie den C3H-Stamm, der Spirochäten zu verbreiten, um mehrere Gewebe, einschließlich der Haut, der Blase, Muskeln, Gelenke und Herz. Entzündliche Reaktionen auf die Infektion erkrankten Herz-und Gelenkgewebe führen. Während die Spirochäten bestehen in diesem Wirt und infektiös bleiben können entzündliche Läsionen intermittierende werden, nicht anders als der Prozess beim Menschen. Das Mausmodell ist damit vorgesehen viel Informationen über B. burgdorferi-induzierten Pathologie, einschließlich Arthritis und Karditis und Host-Immunantworten 10-12. Aus der Perspektive des Erregers sind bestimmte Gene in Säuger Infektion differentiell exprimiert wird, da einige notwendige zur Übertragung von der Zecke Vektor 13-21 haben. Obwohl mehrere Tierarten verwendet worden, um die Lyme-Krankheit 22 studieren, Rhesusaffen am ehesten imitieren die Multi-Organ-Charakter der menschlichen Krankheit 23. Im Gegensatz zu anderenTiermodelle, die Breite von Krankheitserscheinungen wie Erythema migrans, Karditis, Arthritis und Neuropathien des peripheren und zentralen Nervensysteme bei Makaken beobachtet. Bei Mäusen, die Reservoirwirt für B. burgdorferi, variiert Krankheit durch Mausstamm und 24 Jahren, während der frühen und späten verbreitet Manifestationen sind selten 9. Darüber hinaus sind andere Nagetiere, Hasentiere, und Eckzähne alle scheitern zu neurologischen Krankheit von B. zeigen burgdorferi-Infektion 25. Wichtig ist, Makaken zeigen Anzeichen, die charakteristisch für alle drei Phasen der Lyme-Borreliose, nämlich früh lokalisierte, Früh verbreitet, und im Spätstadium Lyme-Borreliose sind 26-28. Erythema migrans (EM) ist gedacht, um in 70-80% der Fälle bei Menschen 29 auf, und ist auch in Rhesusaffen 28,30 ersichtlich. Nach der Infektion verbreiten die Borrelien aus der Impfstelle, mehrere Organe. Spirochäten DNA wurde in Skelett mu erkanntscles, Herz, Blase, periphere Nerven-und Plexus sowie im zentralen Nervensystem (Gehirn-, Hirnstamm und Kleinhirn, Rückenmark und Dura mater) 31. Kreuzen Sie ernähren sich von Mäusen, wurde von uns und anderen Forschungsteams wurden für die Vermehrung von Zecken Kolonien genutzt, im Vorratsbehälter Kompetenz studiert 32-36 und in den Studien von B. burgdorferi Pathogenese 37-40. Diese Technik ist auch für Xenodiagnose und Prüfung von Impfstoffwirksamkeit bei Mäusen 41-44 verwendet. Wir haben eingespeist Ixodes Zecken auf nicht-menschlichen Primaten für die Modellentwicklung 28, eine Studie über die Wirksamkeit des Impfstoffes 45 und für Xenodiagnose in der Beurteilung der Persistenz Post-Antibiotika-Behandlung 46. Zecken diesem Hafen B. burgdorferi kann in einem natürlichen Zyklus, indem Enzootische Larven auf infizierten Mäusen und mit den Nymphen für Studien, wie die Borrelien werden durch die Lebensphasen übertragen beibehalten werden. In diesem BerichtWeisen wir auf, wie man Zecken mit Wildtyp-oder Mutanten-B-Infektion erzeugen burgdorferi, mit Kapillarrohr-Fütterung. Dies kann auch durch Mikroinjektion 47 und 48 durch Eintauchen durchgeführt werden. Der Zweck der Einführung von künstlichen B. burgdorferi in Zecken sein kann, Mutanten-Stämme, deren Übertragbarkeit ist nicht bekannt, zu untersuchen, um eine Gruppe von Zecken mit einer hohen Infektionsrate zu erzeugen und Fehlerpotential zu reduzieren, indem sie eine saubere und sonst nicht infizierten Zecke Kolonie. Darüber hinaus zeigen wir, Tick Fütterung auf Mäuse und nicht-menschlichen Primaten, um Eindämmung und Rückgewinnung von Zecken voll zu gewährleisten. Die Verwendung von Haken Fütterung ist für zukünftige Studien der Immunantwort auf B. burgdorferi-Infektion, mögliche Lyme-Impfstoff Wirksamkeit und Xenodiagnose zum Nachweis von okkulten Infektionen.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Reagent&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>BSK-H</td><td>Sigma</td><td>B-8291</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine HCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tangle Trap coating Paste</td><td>Ladd research</td><td>T-131</td><td></td></tr><tr><td>SkinPrep</td><td>Allegro Medical Supplies</td><td>177364</td><td></td></tr><tr><td>LeFlap, 3&quot; x 3&quot;</td><td>Monarch Labs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hypafix tape</td><td>Allegro Medical Supplies</td><td>191523</td><td></td></tr><tr><td>SkinBond</td><td>Allegro Medical Supplies</td><td>554536</td><td></td></tr><tr><td>UniSolve</td><td>Allegro Medical Supplies</td><td>176640</td><td></td></tr><tr><td>Biatane Foam, adhesive 4&quot;x4&quot;</td><td>Coloplast</td><td>3420</td><td></td></tr><tr><td>DuoDerm CGF Dressing - 4&quot; x 4&quot;, (3/4)&quot; adhesive border </td><td>Convatec</td><td>187971</td><td></td></tr><tr><td>Nonhuman primate jackets with flexible 2&quot; back panels; add drawstrings at top and bottom</td><td>Lomir Biomedical Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;EQUIPMENT &lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Pipet puller</td><td>David Kopf Instruments</td><td>Model 700C</td><td></td></tr><tr><td>Dark field microscope</td><td>Leitz Wetzlar</td><td>Dialux</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting microscope</td><td>Leica</td><td>Zoom 2000</td><td></td></tr><tr><td>Mouse caging</td><td>Allentown caging</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

feeding of ticks on animals for transmission and xenodiagnosis in lyme disease research

Die Übertragung der Erreger der Lyme-Borreliose, Borrelia burgdorferi, tritt durch die Anbringung und Blut Fütterung von Ixodes Zecken auf Säugetierarten Gastgeber. In der Natur kann diese zoonotischen bakteriellen Erreger eine Vielzahl von Reservoirwirten verwenden, aber die weiß-footed Maus (Peromyscus leucopus) ist der wichtigste Reservoir für die Larven-und Nymphen Zecken in Nordamerika. Menschen sind Neben Gastgeber am häufigsten infiziert mit B. burgdorferi durch den Biss von Zecken im Nymphenstadium. B. burgdorferi passt seine Hosts am enzootische Zyklus, also die Fähigkeit, die Funktionen dieser Spirochäten und deren Auswirkungen auf Säugetierwirte erforschen erfordert die Verwendung von Haken Fütterung. Darüber hinaus ist die Technik der Xenodiagnose (unter Verwendung des natürlichen Vektor für Erkennung und Wiederherstellung eines Infektionserregers) hat sich als nützlich in Studien der kryptischen Infektion. Um diese zu erhalten, Nymphen Zecken Hafen B. burgdorferi,Zecken werden live Spirochäten in der Kultur durch Kapillaren zugeführt. Zwei Tiermodelle, Mäusen und nicht-menschlichen Primaten, werden am häufigsten für die Lyme-Borreliose Studien mit Zeckenzeit verwendet. Wir zeigen die Methoden, mit denen diese Zecken können auf zugeführt werden, und von den Tieren entweder für Infektion oder Xenodiagnose erholt.

Nach der Beendigung der kapillaren Zuführung, die Zecken werden typischerweise bei 23 ° C für 2-3 Wochen ruhen, bevor sie an Tieren für die Übertragung zugeführt. Verwendung der kapillaren Zufuhr Technik haben wir festgestellt, dass über 90% des zugeführten Zecken Hafen B. burgdorferi. Der Prozentsatz der positiven Zecken wird durch Waschen bestimmt Zecken in Wasserstoffperoxid und Ethanol, dann locker und in sterilem PBS mit einem Mikrozentrifugenröhrchen förmige Stößel. Die Mitteldarminhalt in die...

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Feeding of Ticks on Animals for Transmission and Xenodiagnosis in Lyme Disease Research

Lyme-Borreliose ist die am häufigsten berichteten Vektor-übertragene Krankheit in Nordamerika. Der Erreger ist Borrelia burgdorferi Spirochäten Bakterium übermittelt durch Schildzecken. Übertragung und Erfassung von Infektionen in Tiermodellen durch die Verwendung von Zecken Fütterung, die wir hier beschreiben optimiert.

Fütterung von Zecken auf Tiere, die zur Übertragung und Xenodiagnosis in Lyme Disease Research

Transmission of the etiologic agent of Lyme disease, Borrelia burgdorferi, occurs by the  attachment and blood feeding of Ixodes species ticks on ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.1K Aufrufe.  Tulane University Health Sciences Center.  Lyme-Borreliose ist die am häufigsten berichteten Vektor-übertragene Krankheit in Nordamerika. Der Erreger ist Borrelia burgdorferi Spirochäten Bakterium übermittelt durch Schildzecken. Übertragung und Erfassung von Infektionen in Tiermodellen durch die Verwendung von Zecken Fütterung, die wir hier beschreiben optimiert. 

Serie: Feeding of Ticks on Animals for Transmission and Xenodiagnosis in Lyme Disease Research

Methods for Rapid Transfer and Localization of Lyme Disease Pathogens Within the Tick Gut

Lyme disease is caused by infection with the spirochete pathogen Borrelia burgdorferi, which is maintained in nature by a tick-rodent infection cycle 1. A tick-borne murine model 2 has been developed to study Lyme disease in the laboratory. While na&iacute;ve ticks can be infected with B. burgdorferi by feeding them on infected mice, the molting process takes several weeks to months to complete. Therefore, development of more rapid and efficient tick infection techniques, such as a microinjection-based procedure, is an important tool for the study of Lyme disease 3,4. The procedure requires only hours to generate infected ticks and allows control over the delivery of equal quantities of spirochetes in a cohort of ticks. This is particularly important as the generation of B. burgdorferi infected ticks by the natural feeding process using mice fails to ensure 100% infection rate and potentially results in variation of pathogen burden amongst fed ticks. Furthermore, microinjection can be used to infect ticks with B. burgdorferi isolates in cases where an attenuated strain is unable to establish infection in mice and thus can not be naturally acquired by ticks 5. This technique can also be used to deliver a variety of other biological materials into ticks, for example, specific antibodies or double stranded RNA 6. In this article, we will demonstrate the microinjection of nymphal ticks with in vitro-grown B. burgdorferi. We will also describe a method for localization of Lyme disease pathogens in the tick gut using confocal immunofluorescence microscopy.

Lyme disease research studies often require generation of ticks infected with the pathogen Borrelia burgdorferi, a process that typically takes several weeks. Here we demonstrate a microinjection-based tick infection procedure that can be accomplished within hours. We also demonstrate an immunofluorescence method for in situ localization of B. burgdorferi within ticks.

Methoden zur raschen Transfer und die Lokalisierung von Lyme-Borreliose Erreger innerhalb der Tick Gut

Lyme disease is caused by infection with the spirochete pathogen Borrelia burgdorferi, which is maintained in nature by a tick-rodent infection cycle 1.  ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Infectious diseases transmitted by arthropod vectors continue to pose a significant threat to human health worldwide. The pathogens causing these diseases, do not exist in isolation when they colonize the vector; rather, they likely engage in interactions with resident microorganisms in the gut lumen. The vector microbiota has been demonstrated to play an important role in pathogen transmission for several vector-borne diseases. Whether resident bacteria in the gut of the Ixodes scapularis tick, the vector of several human pathogens including Borrelia burgdorferi, influence tick transmission of pathogens is not determined. We require methods for characterizing the composition of the bacteria associated with the tick gut to facilitate a better understanding of potential interspecies interactions in the tick gut. Using whole-mount in situ hybridization to visualize RNA transcripts associated with particular bacterial species allows for the collection of qualitative data regarding the abundance and distribution of the microbiota in intact tissue. This technique can be used to examine changes in the gut microbiota milieu over the course of tick feeding and can also be applied to analyze expression of tick genes. Staining of whole tick guts yield information about the gross spatial distribution of target RNA in the tissue without the need for three-dimensional reconstruction and is less affected by environmental contamination, which often confounds the sequencing-based methods frequently used to study complex microbial communities. Overall, this technique is a valuable tool that can be used to better understand vector-pathogen-microbiota interactions and their role in disease transmission.

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Here, we present a protocol to spatially and temporally assess the presence of viable microbiota in tick guts using a modified whole-mount in situ hybridization approach.

Visualisierung der Mikrobiota in Tick Mut durch ganze-Mount In Situ Hybridisierung

Infectious diseases transmitted by arthropod vectors continue to pose a significant threat to human health worldwide. The pathogens causing these ...

Genetik

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne relapsing fever (Borrelia spp.), Rocky Mountain Spotted fever (Rickettsia rickettsii), ehrlichiosis (Ehrlichia chaffeensis and E. equi), anaplasmosis (Anaplasma phagocytophilum), encephalitis (tick-borne encephalitis virus), babesiosis (Babesia spp.), Colorado tick fever (Coltivirus), and tularemia (Francisella tularensis) 1-8. To be properly transmitted into the host these infectious agents differentially regulate gene expression, interact with tick proteins, and migrate through the tick 3,9-13. For example, the Lyme disease agent, Borrelia burgdorferi, adapts through differential gene expression to the feast and famine stages of the tick's enzootic cycle 14,15. Furthermore, as an Ixodes tick consumes a bloodmeal Borrelia replicate and migrate from the midgut into the hemocoel, where they travel to the salivary glands and are transmitted into the host with the expelled saliva 9,16-19.
As a tick feeds the host typically responds with a strong hemostatic and innate immune response 11,13,20-22. Despite these host responses, I. scapularis can feed for several days because tick saliva contains proteins that are immunomodulatory, lytic agents, anticoagulants, and fibrinolysins to aid the tick feeding 3,11,20,21,23. The immunomodulatory activities possessed by tick saliva or salivary gland extract (SGE) facilitate transmission, proliferation, and dissemination of numerous tick-borne pathogens 3,20,24-27. To further understand how tick-borne infectious agents cause disease it is essential to dissect actively feeding ticks and collect tick saliva. This video protocol demonstrates dissection techniques for the collection of hemolymph and the removal of salivary glands from actively feeding I. scapularis nymphs after 48 and 72 hours post mouse placement. We also demonstrate saliva collection from an adult female I. scapularis tick.

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

The collection of infected tick hemolymph, salivary glands, and saliva is important to study how tick-borne pathogens cause disease. In this protocol we demonstrate how to collect hemolymph and salivary glands from feeding Ixodes scapularis nymphs. We also demonstrate saliva collection from female I. scapularis adults.

Speichel, Speicheldrüse, und Hämolymphe Abholung Ixodes scapularis Zecken

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

Rearing Ixodes scapularis, the Black-legged Tick: Feeding Immature Stages on Mice

Ixodes scapularis, the vector of Lyme disease, is one of the most important disease vectors in the eastern and Midwestern United States. This species is a three host tick that requires a blood meal from a vertebrate host for each development stage, and the adult females require a blood meal for reproduction. Larval ticks attach to their host for 3 - 5 days for feeding and drop off the host when fully engorged. This dependency on several different hosts and the lengthy attachment time for engorgement complicates tick rearing in the laboratory setting. However, to understand tick biology and tick-pathogen interactions, the production of healthy, laboratory-reared ticks is essential. Here, we demonstrate a simple, cost-effective protocol for immature tick feeding on mice. We modified the existing protocols for decreased stress on mice and increased tick feeding success and survival by using disposable cages without mesh bottoms to avoid contact of ticks with water contaminated with mice urine and feces.

Rearing Ixodes scapularis, the Black-legged Tick: Feeding Immature Stages on Mice

The production of healthy laboratory-reared ticks is essential to studies on tick biology, and tick-pathogen interactions. Here we demonstrate a simple protocol for immature tick feeding that is cost-effective and less stressful to mice.

Aufzucht<em&gt; Ixodes scapularis,</em&gt; Die schwarzbeinigen Tick: Fütterung unreife Stadien auf Mäusen

Ixodes scapularis, the vector of Lyme disease, is one of the most important disease vectors in the eastern and Midwestern United States. This species is a ...

Disclosing Hemolymph Collection and Inoculation of Metarhizium Blastospores into Rhipicephalus Microplus Ticks Towards Invertebrate Pathology Studies

Ticks are obligate hematophagous ectoparasites and Rhipicephalus microplus has great importance in veterinary medicine because it causes anemia, weight loss, depreciation of the animals&#39; leather and also can act as a vector of several pathogens. Due to the exorbitant costs to control these parasites, damage to the environment caused by the inappropriate use of chemical acaricides, and the increased resistance against traditional parasiticides, alternative control of ticks, by the use of entomopathogenic fungi, for example, has been considered an interesting approach. Nevertheless, few studies have demonstrated how the tick&#39;s immune system acts to fight these entomopathogens. Therefore, this protocol demonstrates two methods used for entomopathogen inoculation into engorged females and two techniques used for hemolymph collection and hemocytes harvesting. Inoculation of pathogens at the leg insertion in the tick female&#39;s body allows evaluation of females biologic parameters unlike the inoculation between the scutum and capitulum, which frequently damages Gen&#233;&#39;s organ. Dorsal hemolymph collection yielded a higher volume recovery than collection through the legs. Some limitations of tick hemolymph collection and processing include i) high rates of hemocytes&#39; disruption, ii) hemolymph contamination with disrupted midgut, and iii) low hemolymph volume recovery. When hemolymph is collected through the leg cutting, the hemolymph takes time to accumulate at the leg opening, favoring the clotting process. In addition, fewer hemocytes are obtained in the collection through the leg compared to the dorsal collection, even though the first method is considered easier to be performed. Understanding the immune response in ticks mediated by entomopathogenic agents helps to unveil their pathogenesis and develop new targets for tick control. The inoculation processes described here require very low technological resources and can be used not only to expose ticks to pathogenic microorganisms. Similarly, the collection of tick hemolymph may represent the first step for many physiological studies.

Disclosing Hemolymph Collection and Inoculation of Metarhizium Blastospores into Rhipicephalus Microplus Ticks Towards Invertebrate Pathology Studies

Analysis of tick hemolymph represents an important source of information on how some pathogens cause disease and how ticks immunologically respond to this infection. The present study demonstrates how to inoculate fungal propagules and collect hemolymph from Rhipicephalus microplus engorged females.

Die Sammlung der Häkolymphe und die Inokulation von Metarhizium-Blastospores in Rhipicephalus Microplus Ticks Towards Pathology Studies

Ticks are obligate hematophagous ectoparasites and Rhipicephalus microplus has great importance in veterinary medicine because it causes anemia, weight ...

Exposition des Menschen gegenüber Larven von Zecken für die Erforschung von durch Zecken übertragenen Krankheiten

A Model for Experimental Exposure of Humans to Larval Ixodes scapularis Ticks

Tickborne diseases are a significant public health problem in the United States and worldwide. Ticks are obligate blood-feeding arthropods; an ixodid tick must remain attached to the skin of the host and complete its multi-day feeding process to acquire its blood meal. Exposing animals to ticks is a common practice for studying host responses to tick bites and tickborne diseases. We developed the procedure, conducted the first human research study, and published the findings on exposing human volunteers to uninfected larval Ixodes scapularis ticks. This article describes the methodology used to construct the containment dressing, how to apply and secure the ticks to the host, how to maintain the dressing, and how to remove the ticks from the host. Exposing volunteers to tick bites is an experimental procedure and must be performed under a clinical research protocol approved by the appropriate regulatory authorities. This method allows for translational research to better understand the human response to tick bites and foster the development of diagnostics, prevention, and therapies for tickborne diseases.

Autor im Rampenlicht: Kontrolliertes Expositionsmodell beim Menschen für die Zeckenforschung und Lyme-Borreliose-Studien

This article presents the methodology for exposing humans to larval Ixodes scapularis for clinical research. The technique is relatively simple, tolerable by the research volunteers, and can be modified according to experimental needs. Such research involving human subjects must be conducted under clinical study protocols approved by the appropriate regulatory authorities.

Ein Modell für die experimentelle Exposition von Menschen gegenüber Larven von Ixodes scapularis Zecken

Tickborne diseases are a significant public health problem in the United States and worldwide. Ticks are obligate blood-feeding arthropods; an ixodid tick ...

Detecting the Lyme Disease Spirochete, Borrelia Burgdorferi, in Ticks Using Nested PCR

Lyme disease is a serious vector-borne infection that is caused by the Borrelia burgdorferi sensu lato family of spirochetes, which are transmitted to humans through the bite of infected Ixodes ticks. The primary etiological agent in North America is Borrelia burgdorferi sensu stricto. As geographic risk regions expand, it is prudent to support robust surveillance programs that can measure tick infection rates, and communicate findings to clinicians, veterinarians, and the general public. The molecular technique of nested polymerase chain reaction (nPCR) has long been used for this purpose, and it remains a central, inexpensive, and robust approach in the detection of Borrelia in both ticks and wildlife. 
This article demonstrates the application of nPCR to tick DNA extracts to identify infected specimens. Two independent B. burgdorferi targets, genes encoding Flagellin B (FlaB) and Outer surface protein A (OspA), have been used extensively with this technique. The protocol involves tick collection, DNA extraction, and then an initial round of PCR to detect each of the two Borrelia-specific loci. Subsequent polymerase chain reaction (PCR) uses the product of the first reaction as a new template to generate smaller, internal amplification fragments. The nested approach improves upon both the specificity and sensitivity of conventional PCR. A tick is considered positive for the pathogen when inner amplicons from both Borrelia genes can be detected by agarose gel electrophoresis.

Detecting the Lyme Disease Spirochete, Borrelia Burgdorferi, in Ticks Using Nested PCR

Nested PCR is a sensitive, specific, and straightforward technique that can be applied to tick DNA extracts to probe for Borrelia burgdorferi, the causative agent of Lyme disease. The initial PCR experiment uses gene-specific primers to generate long amplicons, which then become templates for a subsequent reaction using internal primers.

Das Lyme Krankheit Spirochete, Borrelia Burgdorferiin Zecken mit verschachtelten PCR zu erkennen

Lyme disease is a serious vector-borne infection that is caused by the Borrelia burgdorferi sensu lato family of spirochetes, which are transmitted to ...

Biologie

A Versatile Model of Hard Tick Infestation on Laboratory Rabbits

The use of live animals in tick research is crucial for a variety of experimental purposes including the maintenance of hard tick colonies in the laboratory. In ticks, all developmental stages (except egg) are hematophagous, and acquiring a blood-meal when attached to their vertebrate hosts is essential for the successful completion of their life cycle. Here we demonstrate a simple method that uses easily openable capsules for feeding of hard ticks on rabbits. The advantages of the proposed method include its simplicity, short duration and most importantly versatile adjustment to the needs of specific experimental requirements. The method makes possible the use of multiple chambers (of various sizes) on the same animal, which permits feeding of multiple stages or different experimental groups while reducing the overall animal requirement. The non-irritating and easily accessible materials used minimizes discomfort to the animals, which can be easily recovered from an experiment and offered for adoption or reused if the ethical protocol allows it.

We have developed a simple and versatile system to feed hard ticks on laboratory rabbits. Our non-laborious protocol uses easily accessible materials and can be adjusted depending on the requirements of the various experimental settings. The method allows comfortable monitoring and/or sampling of ticks during the entire feeding period.

Fütterung von Zecken auf Tiere, die zur Übertragung und Xenodiagnosis in Lyme Disease Research

Zusammenfassung

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Methoden zur raschen Transfer und die Lokalisierung von Lyme-Borreliose Erreger innerhalb der Tick Gut

Visualisierung der Mikrobiota in Tick Mut durch ganze-Mount In Situ Hybridisierung

Speichel, Speicheldrüse, und Hämolymphe Abholung Ixodes scapularis Zecken

Aufzucht

Die Sammlung der Häkolymphe und die Inokulation von Metarhizium-Blastospores in Rhipicephalus Microplus Ticks Towards Pathology Studies

Ein Modell für die experimentelle Exposition von Menschen gegenüber Larven von Ixodes scapularis Zecken

Ein Modell für die experimentelle Exposition von Menschen gegenüber Larven von Ixodes scapularis Zecken

Ein Modell für die experimentelle Exposition von Menschen gegenüber Larven von Ixodes scapularis Zecken

Das Lyme Krankheit Spirochete, Borrelia Burgdorferiin Zecken mit verschachtelten PCR zu erkennen

Ein vielseitiges Modell schwer Tick Befall an Kaninchen, Labor