Os autores desejam agradecer a Kami Harris para o projeto da primeira demão, Ashley McKibbon Jessica Thomas-Eliakim para filmar e John Blakely, Alexandra Foley-Eby, Chris Langley, Julie Lewis, Kelsey McIntyre, Ashley McKibbon, Chris Zinck e Rosie o cão por aparecer na vídeo. A. M. K. foi apoiada pela Fundação Canadense para a pesquisa de doença de Lyme, e financiamento do projeto foi fornecido pelas ciências naturais e engenharia pesquisa Conselho de Canadá (NSERC). M. K. B. W. recebido salário financiamento da Fundação de inovação a Nova Brunswick (NBIF).

1. DNA isolamento de carrapatos
<ol><li>Adquira carrapatos através de coleção de campo, ou vigilância passiva de veterinários e membros do público. Carrapatos devem ser mortos por congelamento, colocados em um saco selado e enviados à temperatura ambiente.<ol>
<li>Usando um formulário de submissão, reunir informações sobre a data e a localização geográfica do encontro, status de acessório de carrapato, espécies de hospedeiros e história de viagem recente do hospedeiro.</li>
		<li>Desde que o PCR aninhado é inerentemente vulnerável à contaminação, certifique-se de que o espaço de trabalho do laboratório é criado para minimizar a Cruz-exposição de amostras. Isso envolve a execução de diferentes elementos do protocolo em separado dedicados espaços bem isolados uns dos outros que são cuidadosamente limpos e esterilizados, e garantindo que todos os instrumentos estão livres de contaminantes.</li>
		<li>Após receber a amostra, fotografar o carrapato e determinar a espécie, grau de desenvolvimento, sexo e status de ingurgitamento em comparação a uma chave de identificação32 .</li>
		<li>Sob condições assépticas, dividem o carrapato usando uma lâmina de barbear estéril ou bisturi e colocar os fragmentos de dois carrapato tubos microcentrifuga separado.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para extrair o DNA total, use qualquer procedimento de isolamento que produz o modelo compatível com PCR; Este protocolo demonstra uma abordagem simples de quelação.<ol>
<li>Comece adicionando um volume adequado (geralmente entre 50-200 µ l) de um reagente lítica de quelação para o fragmento de carrapato. A quantidade específica dependerá o status tamanho e ingurgitamento do espécime; as orientações devem ser fornecidas pelo fabricante. Homogeneizar usando um microtubo pilão.</li>
		<li>Incube as amostras num banho de água a 60 ° C, durante 45 min e o vórtice brevemente.</li>
		<li>Centrifugar amostras para 4 min a 16.276 x g (13.300 rpm) em uma área de trabalho microcentrifuga.</li>
		<li>Transferi o sobrenadante para um fresco, etiquetado microtubo contendo 50 µ l isopropanol, mix por inversão e re-centrifugar como (1.2.3).</li>
		<li>Decante o sobrenadante e lavar o sedimento de DNA com 50 µ l de etanol 70%.</li>
		<li>Remover o excesso etanol com uma pipeta e permitir a pelota secar ao ar durante 15 minutos à temperatura ambiente.</li>
		<li>Resuspenda o DNA, adicionar 50 µ l de pH de 1 mM Tris 7.0 e incubar as amostras em banho-maria por 1h a 60 ° C. Agora, o DNA pode ser armazenado a-20 ° C para futura análise molecular.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. detecção de PCR aninhado de Borrelia OspA e flacidez.
Nota: Uma panorâmica geral de práticas e princípios PCR é fornecida por Lorenz, 201233.
<ol><li>Sintetizar, ou obter as primeiras demão do oligonucleotide interior e exterior de gene-específico de Borrelia . Consulte a tabela 1 para a primeira demão de moda, amplicon respectivos tamanhos e temperaturas de fusão.</li>
</ol><table border="1"><tbody>
<tr>
<td>Nome da primeira demão</td>
			<td>Gene alvo</td>
			<td colspan="2">Sequência (5' - 3')</td>
			<td>Tamanho do amplicon</td>
			<td>Temperatura do recozimento</td>
		</tr>
<tr>
<td>Flacidez fora Fw</td>
			<td>Flacidez</td>
			<td colspan="2">gcatcactttcagggtctca</td>
			<td rowspan="2">503 bp</td>
			<td rowspan="2">55° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Flacidez fora Rv</td>
			<td>Flacidez</td>
			<td colspan="2">tggggaacttgattagcctg</td>
		</tr>
<tr>
<td>Flacidez em Fw</td>
			<td>Flacidez</td>
			<td colspan="2">ctttaagagttcatgttggag</td>
			<td rowspan="2">447 bp</td>
			<td rowspan="2">58° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Flacidez em Rv</td>
			<td>Flacidez</td>
			<td colspan="2">tcattgccattgcagattgt</td>
		</tr>
<tr>
<td>OspA Out Fw</td>
			<td>OspA</td>
			<td colspan="2">cttgaagttttcaaagaagat</td>
			<td rowspan="2">487 bp</td>
			<td rowspan="2">55° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>OspA Out Rv</td>
			<td>OspA</td>
			<td colspan="2">caactgctgacccctctaat</td>
		</tr>
<tr>
<td>OspA em Fw</td>
			<td>OspA</td>
			<td colspan="2">acaagagcagacggaaccag</td>
			<td rowspan="2">350 bp</td>
			<td rowspan="2">58° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>OspA em Rv</td>
			<td>OspA</td>
			<td colspan="2">ttggtgccatttgagtcgta</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: Interior e exterior primeiras demão para nPCR de Borrelia burgdorferiFlaB e OspA. Na prática, as primeiras demão FlaB detectam s.s. da B. burgdorferi e outros intimamente relacionado Borrelia genospecies, enquanto as primeiras demão OspA captura somente de b. burgdorferi s.s. amplificação de ambos os loci indicaria B. burgdorferi. s.s.
<ol start="2"><li>Pre-esterilize um gabinete PCR com UV luz e 70% de etanol. Nota: Para minimizar o potencial de contaminação de amostra, este espaço de trabalho deve ser distinto do local de dissecação de carrapato, extração de DNA e electroforese do gel.<ol>
<li>Para a execução inicial da PCR, use os primers exteriores em conjunto com o modelo de DNA recuperado na etapa 1.0 acima e configurar a mistura de reação, conforme descrito na tabela 2. Em paralelo, execute positivo controle executa consistindo de verificadas Borrelia ADN e controlo negativo executa incluindo reações não-modelo para detectar a contaminação do reagente e aerossol. Adicione o DNA no final para minimizar o potencial de contaminação dos reagentes. Certifique-se de que cada tubo é fechado em todos os momentos, quando os reagentes não estão sendo adicionados e fechem tubos imediatamente após a adição do DNA e antes de outros tubos são abertos.</li>
		<li>Programar um termociclador como segue: 95 ° C por 5 min; 40 ciclos de 95 ° C por 15 s, recozendo temperatura por 30 s, 72 ° C por 45 s; 72 ° C por 5 min; e mantenha a 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Realize a segunda rodada do PCR semelhante a primeira reação, exceto o uso de cartilhas internas com 2 µ l do primeiro produto do PCR (produzido em 2.2.2). Nota: Volumes de reação novamente são fornecidos na tabela 2. Deve ter cuidado para evitar contaminação cruzada de amplicons, garantindo que o ADN do molde é adicionado última e que apenas tubos correspondente a uma amostra são abertos ao mesmo tempo. 
	 
	<table border="1"><tbody>
<tr>
<td>Componente de</td>
				<td>Volumes PCR # 1</td>
				<td>PCR # 2 Volumes</td>
			</tr>
<tr>
<td>Taq polimerase Master Mix 2 X</td>
				<td>12,5 Μ l</td>
				<td>12,5 Μ l</td>
			</tr>
<tr>
<td>Água livre de nuclease</td>
				<td>Μ l 8,5</td>
				<td>Μ l 8,5</td>
			</tr>
<tr>
<td>10 µM primers forward e Reverse</td>
				<td>Primers exterior de 1,0 µ l</td>
				<td>Primers interna de 1,0 µ l</td>
			</tr>
<tr>
<td>Modelo de DNA</td>
				<td>2,0 µ l, de extração de amostra (1.2.7)</td>
				<td>2,0 µ l, do 1º round do PCR (2.2.2)</td>
			</tr>
</tbody></table>
Tabela 2: Misturas de reação de PCR para amplificações de primeiras e segunda. 
	 
	<ol>
<li>Programar o termociclador como antes, mas ajustar a temperatura do recozimento para acomodar os primers internos (veja tabela 1).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. imagem e eletroforese em Gel de Agarose
Nota: Para obter instruções básicas sobre separação de DNA por electroforese, consulte Lee et al., 201234.
<ol><li>Preparar um gel de agarose 1,2% usando buffer de SB X 20 (0.2 M NaOH, ácido bórico de 0,8 M pH 8), diluído a 1 X e adicionar aproximadamente 5 µ l de uma mancha de DNA, antes de derramar, se pre-coloração do gel é desejado.</li>
	<li>Carrega 10 µ l do produto da reação de PCR segundo (interna) de cada experimental e amostra de controle, ao lado de uma escada de bp 100 (5 µ l).<ol>
<li>Electrophorese por 1h no 107 V (5V/cm).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Visualizar e documentar o gel usando um transiluminador e associado da câmera e software.</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Ao longo de décadas de uso, técnicas de PCR-baseados têm consistentemente provado o seu valor na detecção de Borrelia de espécimes de artrópodes e mamíferos, se Borrelia vêm de origens ambientais ou clínicas. PCR oferece muitas melhorias sobre abordagens pré-existentes para vigilância. Nomeadamente, não é dependente do desenvolvimento e desempenho dos reagentes de anticorpos e em vez disso pode ser facilmente adaptado para detectar novos destinos turísticos simplesmente modificando sequências da primeira demão. PCR também acomoda a avaliação dos loci múltiplos em paralelo, isoladamente ou através de uma reação de multiplex. Pode ser aplicado às entradas de diversas amostras, incluindo tiques fresco e arquivados22, animal ou humanos fluidos corporais e tecido ressecado25. PCR também produz amplicons que pode ser ulteriormente, por exemplo por digestão enzimática de restrição, hibridização da sonda ou sequenciamento, para fornecer maior introspecção identidade microbiana21.
Como uma ferramenta clínica, PCR é conceitualmente preferível o padrão diagnóstico serológico, pois fornece uma indicação direta da presença bacteriana, em vez de depender de resposta imune do hospedeiro como medida secundária da infecção. No entanto, borreliose de Lyme é associado com uma carga microbiana relativamente modesta (< 50 organismos/mL de urina ou plasma) e spirochetemia transitória, que pode dar origem a falso negativo resulta25. A sensibilidade desta técnica na clínica varia consideravelmente dependendo do tipo de tecido, estágio de infecção e condição de amostra, caindo entre 12,5% e 62% em estudos existentes de sangue, líquido cefalorraquidiano e uma biópsia do tecido36. Limitações de sensibilidade molecular não são uma preocupação se PCR é realizado na sequência de uma cultura bacteriana, porém a recuperação de espiroquetas viáveis de amostras clínicas tem provado da mesma forma desafiante. Só recentemente protocolos foram otimizados para maior rendimento35. Enquanto isso, o intestino de um carrapato adulto infectado pode abrigar em média em qualquer lugar de 2.000 para mais 50.000 Borrelia37,38,39, que está solidamente dentro do intervalo de detecção do nPCR. Assim, o protocolo é bem adequado para os esforços de vigilância do carrapato.
Apesar de suas muitas vantagens, nPCR representam certos desafios e a capacidade desta técnica para relatar com precisão a infecção de carrapato, portanto, depende da seleção estratégica de genes e amplicons, fluxos de trabalho meticulosos experimentais que recuperar o DNA de qualidade partir de amostras, minimizando a Cruz-exposição de amostras e a utilização de controlos adequados que pode relatar contaminantes no ambiente de laboratório e reagentes. Antes de qualquer experimentação, o escopo e as intenções do inquérito devem ser claramente definidas para que o locus genéticos apropriados e regiões, podem ser selecionado. Se o objetivo é fornecer uma tela imparcial para os causadores de Lyme Borrelia burgdorferi s.l. complexos, primeiras demão devem ser criadas para detectar todas as tensões associadas com afinidade semelhante e eficiência de amplificação, sem captura independentes organismos de25. Novas cartilhas podem ser projetadas e avaliados em silico usando ferramentas de software tais como Primer-BLAST40, embora eles também devem ser validados experimentalmente contra o padrão de referência isola antes de ser aplicado às amostras descaracterizadas. O objetivo do processo de extração de DNA é recuperar o modelo microbiano intacto de uma amostra ambiental misturada (homogeneizado de carrapato). Uma etapa opcional antes de prosseguir com a PCR é avaliar a integridade do DNA extraído. Além disso, reações paralelas poderiam ser criadas para atingir um gene de limpeza no carrapato. O último método também pode indicar a presença de inibidores na mistura reacional, proporcionando o aumento da confiança que reações negativas Borrelia são devido à ausência do organismo e não à presença de um contaminante inibitório.
O aumento da sensibilidade da abordagem do PCR aninhado vem à custa de potencial contaminação que gera resultados falso-positivos. Modelo exógeno poderia ser introduzido a uma amostra durante a dissecção de carrapato e recuperação do DNA, ou no processo de criação as reações de amplificação externa e interna. Portanto, é especialmente importante seguir protocolos de prática melhores para PCR evitar modelo ou amplicon contaminação cruzada. Estes incluem o uso separado de estações de trabalho com fluxos de ar independentes, contenção em PCR e armários de segurança biológica, se for caso disso, minuciosa e químicas físicas limpeza e esterilização de superfícies e reagentes e cautelosa manipulação de DNA 41. controles não-modelo também são vitais na identificação de contaminação de reagentes de estoque. Uma vulnerabilidade específica do nPCR é o amplicon manipulação que ocorre quando transferir os produtos da reação primeiro para o segundo recipiente PCR. Desde que o alvo do DNA já sofreu exponencial enriquecimento em amostras positivas, este passo é especialmente propenso a contaminação cruzada, e um protocolo único-tubo nPCR foi desenvolvido para contornar esta limitação. Nesta abordagem, os dois conjuntos de primers para um determinado gene são adicionados juntos para um tubo de reação que permanecerá fechado para as duas rodadas de PCR31. Os pares de interior e exterior da primeira demão devem ser termodinamicamente distintos, tal que o casal exterior amplifica o modelo em uma alta temperatura de recozimento que é proibitivo para os primers internos. Na segunda rodada, a temperatura do recozimento é abaixada para acomodar o par interno. Não só isto faz ignorar uma etapa potencialmente confundimento, também permite o uso de adicionais anticontaminação mede31,,42. No entanto, essa modificação pode sacrificar alguma sensibilidade do ensaio. Independentemente da abordagem, aumentando o número de repetições técnicas executada independentemente numa amostra ajudará a identificar a contaminação espúria.
Técnicas moleculares têm continuado a evoluir desde a introdução do nPCR, e esses novos enfoques oferecem vantagens selecionadas sobre os desenhos originais, embora em aumento da despesa financeira. Como o nome sugere, PCR quantitativo (tempo qPCR ou real (RT)-PCR) permite a enumeração de patógenos em uma amostra, enquanto técnicas convencionais são qualitativas na natureza43. A sensibilidade do qPCR é supostamente semelhante do nPCR38, embora isto pode variar dependendo da primeira demão características28. Uma variação de qPCR que usa balizas moleculares (MB) no lugar do convencionais sondas TaqMan também se mostrou promissor na detecção de Borrelia em amostras clínicas44,,45,46. Devido à sua original estrutura secundária, balizas moleculares declaradamente produzem fluorescência de fundo inferior e superiores sinais legítimos, proporcionando sensibilidade superior47. Avaliações pré-clínicas sugerem um potencial limite de deteção de entre um e dez espiroquetas44,45. Além disso, a técnica tem sido aplicada com sucesso em multiplex reações simultaneamente detectar um gene de mamífero hospedeiro44 e outros patógenos tick-borne45, que não é tão facilmente alcançável com nPCR. Outras modificações de projeto incluem a tecnologia digital da gota do PCR (ddPCR), que pode quantificar o DNA sem a utilização de uma curva padrão39,48. O limite inferior de deteção desta técnica para Borrelia é igualmente cerca de dez espiroquetas/amostra39. Em comparação com nPCR, essas abordagens também têm a vantagem de reduzido potencial de contaminação, como eles só exigem um protocolo único de amplificação.
Se o objectivo da vigilância é, ao invés de perfil variado conteúdo bacteriano de um carrapato, triagem de metagenomic do 16S rRNA é uma opção atraente de49. Embora essa abordagem é mais cara, requer especializadas sequenciadores de DNA não foi encontrados em todos os laboratórios de biologia molecular e exige mais sofisticado de interpretação baseada em bioinformática, ele pode capturar com precisão de um amplo espectro de micróbios a mais representam a carga do agente patogénico do vetor.
Enquanto qPCR e seus derivados são métodos de escolha para aplicações quantitativas e telas metagenomics fornecem amplos inventários de microbiome o carrapato, os esforços de vigilância orientada frequentemente estão preocupados com a comunicação binária da presença ou ausência de um ou alguns patógenos em um vetor. Sob tais circunstâncias, essas abordagens mais novas, mais elaboradas podem introduzir complexidade desnecessária e encargos financeiros do processo. Por estas razões, nPCR tem resistido ao teste do tempo como uma técnica fundamental em testes de carrapato.

Doença de Lyme (LD) é a infecção mais prevalente vetorial no hemisfério norte, e sua incidência continua a aumentar1. Esta doença debilitante é causada por patógenos spirocheteal do Lyme borreliose (LB) complexo (comumente referido como Borrelia burgdorferi sensu lato, ou s.l.), que compreende historicamente o patógeno norte-americana predominante, B. burgdorferi stricto sensu (s.e.), além de b. afzelii e b. garinii, que são difundidos em toda a Europa e Ásia e são espécies de emergentes relevância clínica2,3. Estas bactérias são transmitidas aos seres humanos através da picada de infectado Ixodes carrapatos2. Embora os principais vetores norte-americanos são I. scapularis e I. pacificus, várias espécies deste género foram encontrados para abrigar e transmitir a bactéria4. Em humanos, b. burgdorferi pode causar sintomas multisistêmica afetando a pele, articulações, coração, sistema nervoso, glândulas endócrinas, trato gastrointestinal e órgãos internos5,6,7, 8,9,10. O centro de controle e prevenção de doenças atualmente estima que mais de 300.000 novos casos humanos anualmente nos Estados Unidos11,12. Enquanto o prognóstico costuma ser favorável quando a doença é diagnosticada e tratada na fase inicial, estudos têm sugerido que, em qualquer lugar entre 10% e 60% dos pacientes que receberam o regime antibiótico recomendado continuado a experimentar sintomas após terapia cessação, em um fenômeno denominado síndrome de Lyme Doença de tratamento Post (PTLDS)13,14,15. Além disso, os atrasos na intervenção clínica podem surgir como resultado de falta de consciência de uma picada de carrapato, inespecíficas de apresentação da doença inicial e a baixa sensibilidade do diagnóstico tradicional baseado em sorologia quando usado no início da infecção. Falha para tratar rapidamente e de forma adequada permite a progressão de sintoma que pode se manifestar em cada vez mais debilitantes complicações16,17. Prevenção da doença de Lyme, portanto, é uma pedra angular da gestão de riscos. Estratégias para combater esta ameaça crescente incluem medidas de vigilância robustos para indicar a prevalência do patógeno em tiques e identificam as regiões geográficas de preocupação.
Este artigo demonstra a utilidade da reação em cadeia da polimerase aninhada (nPCR) como uma ferramenta de triagem molecular pelo qual identificar carrapatos infectados. Para aumentar a especificidade, dois genes de Borrelia são utilizados para amplificação paralela. B Flagellin (FlaB) codifica uma proteína grande filamento do flagelo18, e o gene está localizado no cromossomo linear único, enquanto o produto de lipoproteína da proteína de superfície exterior A (OspA) Medeia midgut carrapato colonização, e é codificado em plasmídeo19,20. O fluxo de trabalho consiste em coleção de carrapato, extração de DNA e em seguida uma rodada inicial de PCR para detectar Borrelia-loci específicos. PCR subsequente usa o produto da primeira reação como um novo modelo para gerar fragmentos menores, interno de amplificação. Um carrapato é considerado positivo para Borrelia burgdorferi quando amplicons interna de ambos os genes de Borrelia pode ser detectada pela eletroforese em gel de agarose.
A técnica do nPCR e a flacidez e alvos de gene OspA , têm sido amplamente utilizados para vigilância ecológica e detecção clínica da espiroqueta de Lyme desde o início da década de 199021,22,23 ,24,25. Antes do desenvolvimento de protocolos moleculares, carrapatos foram avaliados sujeitando o conteúdo do intestino de anti -Borrelia mancha da imunofluorescência (IF), cultura microbiana ou uma combinação destes26. Essas abordagens sofrem limitações inerentes, incluindo o crescimento lento e a natureza exigente de Borrelia27, problemas de desempenho do anticorpo e a exigência de tiques ao vivo para se processamento21. PCR foi posteriormente aprovado para fornecer a identificação rápida, sensível e específica de vetores infectados. Ele ofereceu melhorias marcadas sobre a metodologia tradicional, incluindo a cultura independente aplicação direta aos tipos de amostra diversos, tais como carrapatos mortos e arquivados que seriam inadequados para testes21,22 . Aninhados desenhos experimentais mais melhoram a especificidade e a sensibilidade do PCR clássica empregando dois conjuntos distintos de gene-específico primers em duas rodadas consecutivas de amplificação25,28.
Sucesso experimental é criticamente dependente de design amplicon e seleção de gene estratégica. Para estimar com precisão a presença de Borrelia burgdorferi, primeiras demão devem detectar os patógenos relevantes sem cross-reacting com febre relapsing espiroquetas também no gênero Borrelia . No caso de flacidez, essa especificidade é conseguida pela segmentação uma região variável interna de gene, ao invés de sequências flanqueando relativamente conservadas que são compartilhadas por diversas bactérias (Figura 1)24,29 , 30.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56471/56471fig1.jpg"> Figura 1: O conceito do nPCR, conforme ilustrado usando Borrelia FlaB gene como um alvo. A termini 5' e 3' do gene é comuns aos organismos além de Borrelia burgdorferi s.l., tornando essas regiões impróprias para a avaliação específica dos agentes patogénicos causadores de Lyme. Duas rodadas de PCR usando as sequências interiores menos-conservada como alvos da primeira demão, são executadas para detectar um amplicon final, interno. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56471/56471fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Em um teste da sua capacidade discriminatória, interior FlaB primers foram avaliadas com mais de 80 diferentes isolados de Borrelia e encontrados para identificar apenas aqueles associados com a doença de Lyme24. Limite inferior de deteção do nPCR tem sido documentado em entre seis24 e dez31 bactérias de uma cultura pura, embora a sensibilidade pode ser melhorada pelo sul da mancha o amplicon e hybridizing um marcadas com radioisótopos ou sonda quimioluminescente. As técnicas de acoplamento reduz a deteccao de threshold para um único espiroqueta31. Por comparação directa, PCR convencional, unprobed de single-rodada foi encontrado para relatar a presença de um mínimo de 104 espiroquetas31. Convém, no entanto, que a sensibilidade do ensaio será inferior ao trabalhar com amostras ambientais e clínicas complexas, devido a presença esmagadora de ADN não relacionado e substâncias inibidoras potenciais. Esses desafios podem ser contornados em grande parte pelo uso do nPCR.
Apesar dos avanços em tecnologias moleculares nas últimas décadas, nPCR permanece uma técnica descontínuas em esforços de vigilância moderna. Se é tomado na concepção e execução do presente protocolo, é uma abordagem poderosa, adaptável e relativamente simples para captar a presença de agentes patogénicos em vetores de carrapato.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="830">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">LabGard Class II, Type A2 biological safety cabinet</td>
			<td style="width:192px;">Nuaire</td>
			<td style="width:140px;">ES AIR NU-543&#160;</td>
			<td style="width:199px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Razor blades</td>
			<td style="width:192px;">VWR</td>
			<td style="width:140px;">55411-050</td>
			<td>0.22 mm thickness</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Microfuge Tubes (Microtubes 1.5 mL)</td>
			<td style="width:192px;">Axygen</td>
			<td style="width:140px;">311-08-051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">AquaGenomic&#160;</td>
			<td style="width:192px;">MultiTarget Pharmaceuticals</td>
			<td style="width:140px;">2030</td>
			<td>DNA extraction reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Microtube Pestle</td>
			<td style="width:192px;">Diamed</td>
			<td style="width:140px;">DIATEC610-1551</td>
			<td>Designed for 1.5 ml tubes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Water bath - Isotemp 202</td>
			<td style="width:192px;">Fishse Scientific</td>
			<td style="width:140px;">15-462-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Vortex</td>
			<td style="width:192px;">Labnet</td>
			<td style="width:140px;">S0100 CAN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Spectrafuge 24D Digital Microcentrifuge</td>
			<td style="width:192px;">Labnet</td>
			<td style="width:140px;">C2400</td>
			<td style="width:199px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:192px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:140px;">190764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">BIS-TRIS</td>
			<td style="width:192px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:140px;">B9754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Primer Synthesis</td>
			<td style="width:192px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:140px;">OLIGO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">PCR Cabinet</td>
			<td style="width:192px;">Misonix</td>
			<td style="width:140px;">PCR6-482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">PCR tube with attached flat caps 0.2mL</td>
			<td style="width:192px;">VWR</td>
			<td style="width:140px;">20170-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">GoTaq Green Master Mix 2x</td>
			<td style="width:192px;">Promega</td>
			<td style="width:140px;">M7123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Nuclease-free water</td>
			<td style="width:192px;">Promega</td>
			<td style="width:140px;">M7123</td>
			<td>The water comes with the GTG</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Spectrafuge Mini</td>
			<td style="width:192px;">Labnet</td>
			<td style="width:140px;">C1301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">SYBR Safe DNA Stain 10,000X Concentration</td>
			<td style="width:192px;">EDVOTEK</td>
			<td style="width:140px;">608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">Froggarose LE (Molecular Biology Grade Agarose)</td>
			<td style="width:192px;">FroggaBio</td>
			<td style="width:140px;">A87-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">GD 100 bp DNA Ladder</td>
			<td style="width:192px;">FroggaBio</td>
			<td style="width:140px;">DM001-R500&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Electrophoresis power pack&#160;</td>
			<td style="width:192px;">VWR</td>
			<td style="width:140px;">VWR 105</td>
			<td>EC Apparatus Corporation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">Fluor-S MultiImager&#160;</td>
			<td style="width:192px;">BioRad</td>
			<td style="width:140px;">170-7700 (Serial number 433B0154)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:299px;">Quantity One 1-D Analysis Software (V. 4.5.2)</td>
			<td style="width:192px;">BioRad</td>
			<td style="width:140px;">1709600</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detecting the lyme disease spirochete, borrelia burgdorferi, in ticks using nested pcr

Doença de Lyme é uma infecção grave vetorial que é causada pela Borrelia burgdorferi sensu lato da família das espiroquetas, que são transmitidas aos seres humanos através da picada de carrapatos infectados Ixodes . O principal agente etiológico na América do Norte é Borrelia burgdorferi sensu stricto. Como expandem as regiões de risco geográfico, é prudente apoiar programas de vigilância robusto que podem medir as taxas de infecção de carrapato e comunicar as conclusões para os médicos, veterinários e público em geral. A técnica molecular de reação em cadeia da polimerase aninhada (nPCR) tem sido muito utilizada para esta finalidade, e continua a ser uma abordagem central, barata e robusta na detecção de Borrelia em carrapatos e animais selvagens.
Este artigo demonstra a aplicação do nPCR tiquetaquear extratos de DNA para identificar espécimes infectados. Independente de duas metas de b. burgdorferi , genes codificação Flagellin B (flacidez) e proteína de superfície exterior A (OspA), têm sido amplamente utilizados com esta técnica. O protocolo envolve coleta de carrapato, extração de DNA e então uma rodada inicial de PCR para detectar cada uma a dois Borrelia-loci específicos. Subsequente cadeia da polimerase (PCR) usa o produto da primeira reação como um novo modelo para gerar fragmentos menores, interno de amplificação. A abordagem aninhada melhora a especificidade e a sensibilidade do PCR convencional. Um carrapato é considerado positivo para o patógeno quando amplicons interna de ambos os genes de Borrelia pode ser detectada pela eletroforese em gel de agarose.

nPCR é uma abordagem elegante para aumentar a especificidade e a sensibilidade de detecção do patógeno, particularmente quando amostras ambientais complexas estão sob investigação. Conforme representado na Figura 1, a duas rodadas de PCR como alvo uma região estratégica do locus FlaB Borrelia (e OspA, não na foto) podem relatar a presença da bactéria Borrelia burgdorferi através da geração de curto interno amplicons. Quando resolvida por eletroforese em gel, as flacidez e OspA produtos de reacção de cada carrapato podem ser visualmente marcou e comparados com controles. Na Figura 2, identificadores de espécime único são fornecidos na parte superior de cada gel e controles não-modelo e aerossóis são representados na extrema esquerda e direita, respectivamente, adjacente para as escadas.
Amplicon robusto bandas são claramente visíveis em selecionadas amostras experimentais, e são facilmente distinguidos de excedentes primários e DNA residual (Figura 2). Baseia-se nos princípios de desenho experimental estabelecidos, um carrapato é considerado positivo para Borrelia quando paralelo controles negativos demonstram sem amplificação e amplicons internas são produzidos a partir de primers tanto a flacidez e a OspA . Neste caso, espécimes T907, T604 e T606 preencheram critérios de vigilância para o patógeno de Lyme (Figura 2). By Contrast, T923 só foi positivo para OspA, um resultado para o qual existem várias explicações possíveis: A) o carrapato de origem foi negativo para Borrelia, mas a preparação de PCR OspA exterior ou interior spuriously foi contaminada com DNA de modelo (note que contaminação sistêmica dos reagentes foi descartada através de controles negativos), B) o carrapato carregava Lyme Borrelia, mas baixo modelo montantes ou erro experimental impediu a amplificação de flacidez, ou C) um organismo esteve presente que continha a sequência conservada da OspA , mas faltava Flagellin ou tinha identidade insuficiente na região alvo de flacidez para recozer para as primeiras demão. De facto, semelhanças de sequência OspA registaram-se em uma variedade de organismos, incluindo plantas e animais28. A situação de inverso, amplificação dos mais conservados Flagellin gene, mas não o gene da OspA , poderia indicar uma espécie Borrelia relacionada. Na prática, este protocolo produz resultados de single-positivo OspA mais do que as primeiras demão FlaB , sugerindo que o cenário 'A' é a explicação menos provável. Sem mais análise experimental da amostra contenciosa, no entanto, não é possível determinar a fonte do único-positivo resultado. Aumento do número de repetições técnicas realizadas em amostras equívocas pode ajudar a conciliar sua verdadeira condição, desde que quaisquer contaminantes que spuriously foram introduzidos para reações anteriores não estaria presentes no DNA arquivado. No entanto, se as reações subsequentes com estas primeiras demão não fornecem resultados conclusivos, outros loci de Borrelia poderia ser investigado pela PCR. Amplicons gerados a partir dessas reações também poderia ser sequenciados e comparados entre isolados para ajudar a atribuir identidade e estimar o grau de divergência de estirpe. SAPI e colegas fornecem um exemplo deste fluxo de trabalho usando amostras clínicas humana35.
Todos os fatores considerados, os critérios de protocolo e interpretação delineados foram estimados para produzir falsas positivas e falsas taxas negativas de 0,17% e 0.0063%, respectivamente.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56471/56471fig2.jpg"> Figura 2 : Deteção de Borrelia burgdorferi em marcações individuais por nPCR de FlaB e OspA. Os códigos atribuídos a cada instante são representados no topo dos géis e identidades alinham verticalmente para relatar a detecção da OspA e flacidez em cada amostra. Faixas intitulado B à esquerda dos controles de modelo não representam a imagem, enquanto um (pistas de mão direita) são controles de aerossol para capturar a contaminação do ambiente laboratorial. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56471/56471fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Detecting the Lyme Disease Spirochete, Borrelia Burgdorferi, in Ticks Using Nested PCR

PCR aninhado é uma técnica simples, sensível e específica que pode ser aplicada a escala que DNA extrai para sondar para Borrelia burgdorferi, o agente causador da doença de Lyme. A experiência inicial da PCR usa primeiras demão gene-específico para gerar amplicons longo, que em seguida tornar-se modelos para uma reação subsequente usando iniciadores internos.

Detectando a doença de Lyme espiroqueta, a Borrelia Burgdorferi, em carrapatos usando PCR aninhado

Lyme disease is a serious vector-borne infection that is caused by the Borrelia burgdorferi sensu lato family of spirochetes, which are transmitted to ...

detecting-lyme-disease-spirochete-borrelia-burgdorferi-ticks-using

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Detecting the Lyme Disease Spirochete, Borrelia Burgdorferi, in Ticks Using Nested PCR

17.8K visualizações.  Mount Allison University. PCR aninhado é uma técnica simples, sensível e específica que pode ser aplicada a escala que DNA extrai para sondar para Borrelia burgdorferi, o agente causador da doença de Lyme. A experiência inicial da PCR usa primeiras demão gene-específico para gerar amplicons longo, que em seguida tornar-se modelos para uma reação subsequente usando iniciadores internos.

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Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and accuracy of the assay. These primer/probe sets are pre-designed to &gt;98% of the human and mouse genomes and feature significant improvements from previously available technologies. These improvements were made possible by virtue of a novel design algorithm, developed by Thermo Scientific bioinformatics experts.
Several convenient features have been incorporated into the Solaris qPCR Assay to streamline the process of performing quantitative real-time PCR. First, the protocol is similar to commonly employed alternatives, so the methods used during qPCR are likely to be familiar. Second, the master mix is blue, which makes setting the qPCR reactions easier to track. Third, the thermal cycling conditions are the same for all assays (genes), making it possible to run many samples at a time and reducing the potential for error. Finally, the probe and primer sequence information are provided, simplifying the publication process.
Here, we demonstrate how to obtain the appropriate Solaris reagents using the GENEius product search feature found on the ordering web site (www.thermo.com/solaris) and how to use the Solaris reagents for performing qPCR using the standard curve method.

The Solaris qPCR Gene Expression Assays are novel pre-designed qPCR primer/probe combinations designed to simplify the qPCR process without sacrificing the specificity and robustness of the assay.

Quantitativas Real-Time PCR usando o Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

Biologia

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA lesions with respect to survival and preservation of genomic integrity. An early response to the induction of DSBs is phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX1. Following induction of DSBs, H2AX is rapidly phosphorylated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PIKK) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Typically, only a few base-pairs (bp) are implicated in a DSB, however, there is significant signal amplification, given the importance of chromatin modifications in DNA damage signalling and repair. Phosphorylation of H2AX mediated predominantly by ATM spreads to adjacent areas of chromatin, affecting approximately 0.03% of total cellular H2AX per DSB2,3. This corresponds to phosphorylation of approximately 2000 H2AX molecules spanning ~2 Mbp regions of chromatin surrounding the site of the DSB and results in the formation of discrete &gamma;H2AX foci which can be easily visualized and quantitated by immunofluorescence microscopy2. The loss of &gamma;H2AX at DSB reflects repair, however, there is some controversy as to what defines complete repair of DSBs; it has been proposed that rejoining of both strands of DNA is adequate however, it has also been suggested that re-instatement of the original chromatin state of compaction is necessary4-8. The disappearence of &gamma;H2AX involves at least in part, dephosphorylation by phosphatases, phosphatase 2A and phosphatase 4C5,6. Further, removal of &gamma;H2AX by redistribution involving histone exchange with H2A.Z has been implicated7,8. Importantly, the quantitative analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in medical and nuclear research. Here, we demonstrate the most commonly used immunofluorescence method for evaluation of initial DNA damage by detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in &gamma;-irradiated adherent human keratinocytes9.

Quantification of &#947;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of DNA double-strand streaks using &gamma;H2AX formation as a molecular marker has become an invaluable tool in radiation biology. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantification of &gamma;H2AX foci after exposure of cells to radiation.

Quantificação de γH2AX Focos em resposta à radiação ionizante

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer (Agrilus planipennis) Using Quantitative Real Time-PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB continues to spread rapidly and attacks ash trees of different ages, from saplings to mature trees. However, to date very little or no molecular knowledge exists for EAB. We are interested in deciphering the molecular-based physiological processes at the tissue level that aid EAB in successful colonization of ash trees. In this report we show the effective use of quantitative real-time PCR (qRT-PCR) to ascertain mRNA levels in different larval tissues (including midgut, fat bodies and cuticle) and different developmental stages (including 1st-, 2nd-, 3rd-, 4th-instars, prepupae and adults) of EAB. As an example, a peritrophin gene (herein named, AP-PERI1) is exemplified as the gene of interest and a ribosomal protein (AP-RP1) as the internal control. Peritrophins are important components of the peritrophic membrane/matrix (PM), which is the lining of the insect gut. The PM has diverse functions including digestion and mechanical protection to the midgut epithelium.

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer Agrilus planipennis Using Quantitative Real Time-PCR

Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) is an effective tool to diagnose mRNA levels in different insect tissues and developmental stages. In this report we show the use of qRT-PCR to ascertain mRNA levels in different larval tissues and developmental stages of the invasive insect species, emerald ash borer.

Análise de Expressão Gênica em Emerald Borer Ash ( Agrilus planipennis) Usando Quantitativa em Tempo Real-PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB ...

Rapid PCR Thermocycling using Microscale Thermal Convection

Many molecular biology assays depend in some way on the polymerase chain reaction (PCR) to amplify an initially dilute target DNA sample to a detectable concentration level. But the design of conventional PCR thermocycling hardware, predominantly based on massive metal heating blocks whose temperature is regulated by thermoelectric heaters, severely limits the achievable reaction speed1. Considerable electrical power is also required to repeatedly heat and cool the reagent mixture, limiting the ability to deploy these instruments in a portable format.
Thermal convection has emerged as a promising alternative thermocycling approach that has the potential to overcome these limitations2-9. Convective flows are an everyday occurrence in a diverse array of settings ranging from the Earth's atmosphere, oceans, and interior, to decorative and colorful lava lamps. Fluid motion is initiated in the same way in each case: a buoyancy driven instability arises when a confined volume of fluid is subjected to a spatial temperature gradient. These same phenomena offer an attractive way to perform PCR thermocycling. By applying a static temperature gradient across an appropriately designed reactor geometry, a continuous circulatory flow can be established that will repeatedly transport PCR reagents through temperature zones associated with the denaturing, annealing, and extension stages of the reaction (Figure 1). Thermocycling can therefore be actuated in a pseudo-isothermal manner by simply holding two opposing surfaces at fixed temperatures, completely eliminating the need to repeatedly heat and cool the instrument.
One of the main challenges facing design of convective thermocyclers is the need to precisely control the spatial velocity and temperature distributions within the reactor to ensure that the reagents sequentially occupy the correct temperature zones for a sufficient period of time10,11. Here we describe results of our efforts to probe the full 3-D velocity and temperature distributions in microscale convective thermocyclers12. Unexpectedly, we have discovered a subset of complex flow trajectories that are highly favorable for PCR due to a synergistic combination of (1) continuous exchange among flow paths that provides an enhanced opportunity for reagents to sample the full range of optimal temperature profiles, and (2) increased time spent within the extension temperature zone the rate limiting step of PCR. Extremely rapid DNA amplification times (under 10 min) are achievable in reactors designed to generate these flows.

We describe a novel method to perform DNA replication via the polymerase chain reaction (PCR). Thermal convection is harnessed to continuously shuttle reagents between denaturing, annealing, and extension conditions by maintaining opposing surfaces of the reactor at constant temperature. This inherently simple design promises to make rapid PCR more accessible.

Rápida ciclagem térmica PCR usando convecção térmica em micro

Many molecular biology assays depend in some way on the polymerase chain reaction (PCR) to amplify an initially dilute target DNA sample to a detectable ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway that polypeptide chain follows during co-translational folding to achieve its functional form is still an enigma. In order to understand this process and to determine the exact conformation of the co-translational folding intermediates, it is essential to develop techniques that allow the isolation of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes to allow their further structural analysis.
SecM (secretion monitor) is a 170 amino acid E. coli protein that regulates expression of the downstream SecA (secretion driving) ATPase in the secM-secA operon6. Nakatogawa and Ito originally found that a 17 amino acid long sequence (150-FSTPVWISQAQGIRAGP-166) in the C-terminal region of the SecM protein is sufficient and necessary to cause stalling of SecM elongation at Gly165, thereby producing peptidyl-glycyl-tRNA stably bound to the ribosomal P-site7-9. More importantly, it was found that this 17 amino acid long sequence can be fused to the C-terminus of virtually any full-length and/or truncated protein thus allowing the production of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes7. Thus, when fused or inserted into the target protein, SecM stalling sequence produces arrest of the polypeptide chain elongation and generates stable RNCs both in vivo in E. coli cells and in vitro in a cell-free system. Sucrose gradient centrifugation is further utilized to isolate RNCs.
The isolated RNCs can be used to analyze structural and functional features of the co-translational folding intermediates. Recently, this technique has been successfully used to gain insights into the structure of several ribosome bound nascent chains10,11. Here we describe the isolation of bovine Gamma-B Crystallin RNCs fused to SecM and generated in an in vitro translation system.

We describe here a technique that is now routinely used to isolate stably bound ribosome nascent chain complexes (RNCs). This technique takes advantage of the discovery that a 17 amino acid long SecM "arrest sequence" can halt translation elongation in a prokaryotic (E. coli) system, when inserted into (or fused to the C-terminus) of virtually any protein.

Usando Seqüência de Detenção SECM como uma ferramenta para isolar Ribossomos Polipeptídeos encadernados

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Transposon mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is less time consuming, less costly, and does not require completed genome information, there are two weaknesses in this method: (1) the possibility of a disparate mutants in the mixed mutant library that counter-selects mutants with decreased competition; and (2) the possibility of partial gene inactivation whereby genes do not entirely lose their function following the insertion of a transposon. Single-gene deletion analysis may compensate for the drawbacks associated with transposon mutagenesis. To improve the efficiency of genome-wide single gene deletion, we attempt to establish a high-throughput technique for genome-wide single gene deletion using Streptococcus sanguinis as a model organism. Each gene deletion construct in S. sanguinis genome is designed to comprise 1-kb upstream of the targeted gene, the aphA-3 gene, encoding kanamycin resistance protein, and 1-kb downstream of the targeted gene. Three sets of primers F1/R1, F2/R2, and F3/R3, respectively, are designed and synthesized in a 96-well plate format for PCR-amplifications of those three components of each deletion construct. Primers R1 and F3 contain 25-bp sequences that are complementary to regions of the aphA-3 gene at their 5' end. A large scale PCR amplification of the aphA-3 gene is performed once for creating all single-gene deletion constructs. The promoter of aphA-3 gene is initially excluded to minimize the potential polar effect of kanamycin cassette. To create the gene deletion constructs, high-throughput PCR amplification and purification are performed in a 96-well plate format. A linear recombinant PCR amplicon for each gene deletion will be made up through four PCR reactions using high-fidelity DNA polymerase. The initial exponential growth phase of S. sanguinis cultured in Todd Hewitt broth supplemented with 2.5% inactivated horse serum is used to increase competence for the transformation of PCR-recombinant constructs. Under this condition, up to 20% of S. sanguinis cells can be transformed using ~50 ng of DNA. Based on this approach, 2,048 mutants with single-gene deletion were ultimately obtained from the 2,270 genes in S. sanguinis excluding four gene ORFs contained entirely within other ORFs in S. sanguinis SK36 and 218 potential essential genes. The technique on creating gene deletion constructs is high throughput and could be easy to use in genome-wide single gene deletions for any transformable bacteria.

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

An efficient genome-wide single gene mutation method has been established using Streptococcus sanguinis as a model organism. This method has achieved via high throughput recombinant PCRs and transformations.

Do genoma deleções de genes em<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Por PCR de Alto Rendimento

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

Here, we present methods for the development of assays to query potentially clinically significant nonsynonymous changes using in vivo complementation in zebrafish. Zebrafish (Danio rerio) are a useful animal system due to their experimental tractability; embryos are transparent to enable facile viewing, undergo rapid development ex vivo, and can be genetically manipulated.1 These aspects have allowed for significant advances in the analysis of embryogenesis, molecular processes, and morphogenetic signaling. Taken together, the advantages of this vertebrate model make zebrafish highly amenable to modeling the developmental defects in pediatric disease, and in some cases, adult-onset disorders. Because the zebrafish genome is highly conserved with that of humans (~70% orthologous), it is possible to recapitulate human disease states in zebrafish. This is accomplished either through the injection of mutant human mRNA to induce dominant negative or gain of function alleles, or utilization of morpholino (MO) antisense oligonucleotides to suppress genes to mimic loss of function variants. Through complementation of MO-induced phenotypes with capped human mRNA, our approach enables the interpretation of the deleterious effect of mutations on human protein sequence based on the ability of mutant mRNA to rescue a measurable, physiologically relevant phenotype. Modeling of the human disease alleles occurs through microinjection of zebrafish embryos with MO and/or human mRNA at the 1-4 cell stage, and phenotyping up to seven days post fertilization (dpf). This general strategy can be extended to a wide range of disease phenotypes, as demonstrated in the following protocol. We present our established models for morphogenetic signaling, craniofacial, cardiac, vascular integrity, renal function, and skeletal muscle disorder phenotypes, as well as others.

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

Here, we present a systematic approach for developing physiologically relevant, sensitive and specific in vivo assays for interpreting variation in human pathology. Transient genetic manipulation via microinjection of WT and mutant human mRNA and morpholino (MO) antisense oligonucleotides harness the tractability of the developing zebrafish embryo to rapidly assay pathogenic mutations, especially, but not exclusively, in the context of human developmental disorders.

In Vivo Modelagem do Morbid Genoma Humano utilizando Danio rerio

Here,  we present methods for the development of assays to query potentially clinically  significant nonsynonymous changes using in  vivo complementation ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic tools have been introduced, including multiple strategies for inducing mutations and generating transgenic lines. However, large-scale screening is limited by traditional genotyping methods, which are time-consuming and labor-intensive. Here we describe a technique to analyze zebrafish genotypes by PCR combined with high-resolution melting analysis (HRMA).&#160;This approach is rapid, sensitive, and inexpensive, with lower risk of contamination artifacts.&#160;Genotyping by PCR with HRMA can be used for embryos or adult fish, including in high-throughput screening protocols.

PCR combined with high-resolution melt analysis (HRMA) is demonstrated as a rapid and efficient method to genotype zebrafish.

Rápida e eficiente Zebrafish Genotipagem Usando PCR com alta resolução Análise Melt

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different lineages. A single cell transcriptome assay can be a new approach for dissecting individual variation. We have developed the single cell qRT-PCR method, and confirmed that this method works well in several gene expression profiles. In single cell level, each human embryonic stem cell, sorted by OCT4::EGFP positive cells, has high expression in OCT4, but a different level of NANOG expression. Our single cell gene expression assay should be useful to interrogate population heterogeneities.

Single cell gene expression assay is needed for understanding stem cell heterogeneities.

Profiling Individual células estaminais embrionárias humanas por RT-PCR quantitativo

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

Detecting Estrogenic Ligands in Personal Care Products using a Yeast Estrogen Screen Optimized for the Undergraduate Teaching Laboratory

The Yeast Estrogen Screen (YES) is used to detect estrogenic ligands in environmental samples and has been broadly applied in studies of endocrine disruption. Estrogenic ligands include both natural and manmade &#34;Environmental Estrogens&#34; (EEs) found in many consumer goods including Personal Care Products (PCPs), plastics, pesticides, and foods. EEs disrupt hormone signaling in humans and other animals, potentially reducing fertility and increasing disease risk. Despite the importance of EEs and other Endocrine Disrupting Chemicals (EDCs) to public health, endocrine disruption is not typically included in undergraduate curricula. This shortcoming is partly due to a lack of relevant laboratory activities that illustrate the principles involved while also being accessible to undergraduate students. This article presents an optimized YES for quantifying ligands in personal care products that bind estrogen receptors alpha (ER&#945;) and/or beta (ER&#946;). The method incorporates one of the two colorimetric substrates (ortho-nitrophenyl-&#946;-D-galactopyranoside (ONPG) or chlorophenol red-&#946;-D-galactopyranoside (CPRG)) that are cleaved by &#946;-galactosidase, a 6-day refrigerated incubation step to facilitate use in undergraduate laboratory courses, an automated application for LacZ calculations, and R code for the associated 4-parameter logistic regression analysis. The protocol has been designed to allow undergraduate students to develop and conduct experiments in which they screen products of their choosing for estrogen mimics. In the process, they learn about endocrine disruption, cell culture, receptor binding, enzyme activity, genetic engineering, statistics, and experimental design. Simultaneously, they also practice fundamental and broadly applicable laboratory skills, such as: calculating concentrations; making solutions; demonstrating sterile technique; serially diluting standards; constructing and interpolating standard curves; identifying variables and controls; collecting, organizing, and analyzing data; constructing and interpreting graphs; and using common laboratory equipment such as micropipettors and spectrophotometers. Thus, implementing this assay encourages students to engage in inquiry-based learning while exploring emerging issues in environmental science and health.

This article presents an optimized yeast estrogen screen for quantifying ligands in Personal Care Products (PCPs) that bind estrogen receptors alpha (ER&#945;) and/or beta (ER&#946;). The method incorporates two colorimetric substrate options, a six-day refrigerated incubation for use in undergraduate courses, and statistical tools for data analysis.

Detecção de ligantes estrogênicos em produtos de cuidados pessoal usando uma tela de estrogênio de levedura otimizada para o laboratório de ensino de graduação