Los autores desean dar las gracias a Kami Harris para el primer diseño, Ashley McKibbon y Jessica Thomas-Ebbett para rodaje, John Blakely, Alexandra Foley-Eby, Chris Langley, Julie Lewis, Kelsey McIntyre, Ashley McKibbon, Chris Zinck y Rosie el perro que aparece en la video. A. M. K. fue apoyado por la Fundación Canadiense de investigación de la enfermedad de Lyme, y financiación del proyecto fue proporcionada por las ciencias naturales e Ingeniería investigación Consejo de Canadá (NSERC). M. K. B. W. había recibido sueldo fondos de la Fundación de innovación de Nuevo Brunswick (NBIF).

1. ADN aislado de las garrapatas
<ol><li>Adquirir las garrapatas mediante colección de campo, o vigilancia pasiva de veterinarios y miembros del público. Garrapatas deben matadas congelando, colocadas en una bolsa sellada y enviadas a temperatura ambiente.<ol>
<li>Utilizando un formulario de presentación, recabar información sobre la fecha y la ubicación geográfica del encuentro, estado del accesorio de garrapata, especie e historia de viaje reciente de la hostia.</li>
		<li>Puesto que la polimerización en cadena jerarquizada es intrínsecamente vulnerable a la contaminación, asegúrese de que está configurado el espacio de trabajo de laboratorio para minimizar la Cruz-exposición de muestras. Esto implica ejecutar diferentes elementos del protocolo en espacios separados, dedicados bien aislados entre sí completamente limpiados y esterilizados, y asegurando que todos los instrumentos son libres de contaminantes.</li>
		<li>Al recibir a la muestra, fotografiar los ticks y determinar la especie, etapa de desarrollo, sexo y estado de ingurgitación en comparación a una identificación dominante32 .</li>
		<li>Bajo condiciones asépticas, biseca la garrapata con una hoja de afeitar estéril o bisturí y colocar los fragmentos de dos garrapatas en tubos de microcentrífuga separado.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para extraer el ADN total, utilizar cualquier procedimiento de aislamiento que produce la plantilla compatible con PCR; Este protocolo muestra una sencilla estrategia basada en la quelación.<ol>
<li>Comenzar agregando un volumen apropiado (a menudo entre los 50-200 μL) de un reactivo lítico quelación al fragmento de garrapata. El monto específico dependerá de la condición ejemplar de tamaño y congestión; directrices deben ser provistas por el fabricante. Homogeneizar con un mortero de microtubo.</li>
		<li>Incubar las muestras en un baño de agua a 60 ° C durante 45 minutos y agitar brevemente.</li>
		<li>Centrifugar las muestras durante 4 minutos a 16.276 x g (13.300 rpm) en una microcentrífuga de sobremesa.</li>
		<li>Transferir el sobrenadante a un microtubo fresco, rotulado conteniendo 50 de μl isopropanol, mezclar por inversión y volver a centrifugar como en (1.2.3).</li>
		<li>Decantar el sobrenadante y lavar el pellet de ADN con 50 μl de etanol al 70%.</li>
		<li>Quitar exceso etanol con una pipeta y permiten la pelotilla airear por 15 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Para Resuspender el ADN, añada 50 μl de 1 mM de Tris de pH 7.0 e incubar las muestras en un baño de agua durante 1 h a 60 ° C. Ahora, el ADN puede almacenarse a-20 ° C para futuros análisis molecular.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. nested PCR detección de Borrelia OspA y FlaB.
Nota: Se proporciona un resumen general PCR principios y prácticas de Lorenz, 201233.
<ol><li>Sintetizar u obtener cartillas de gene-específicas del oligonucleótido exterior e interior de Borrelia . Vea la tabla 1 para primer conjuntos, sus respectivos productos tamaños y temperatura de fusión.</li>
</ol><table border="1"><tbody>
<tr>
<td>Primer nombre</td>
			<td>Objetivo gene</td>
			<td colspan="2">Secuencia (5' - 3')</td>
			<td>Tamaño de amplicón</td>
			<td>Temperatura de recocido</td>
		</tr>
<tr>
<td>FlaB a Fw</td>
			<td>FlaB</td>
			<td colspan="2">gcatcactttcagggtctca</td>
			<td rowspan="2">503 bp</td>
			<td rowspan="2">55° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>FlaB a Rv</td>
			<td>FlaB</td>
			<td colspan="2">tggggaacttgattagcctg</td>
		</tr>
<tr>
<td>FlaB en Fw</td>
			<td>FlaB</td>
			<td colspan="2">ctttaagagttcatgttggag</td>
			<td rowspan="2">447 bp</td>
			<td rowspan="2">58° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>FlaB en Rv</td>
			<td>FlaB</td>
			<td colspan="2">tcattgccattgcagattgt</td>
		</tr>
<tr>
<td>OspA a Fw</td>
			<td>OspA</td>
			<td colspan="2">cttgaagttttcaaagaagat</td>
			<td rowspan="2">487 bp</td>
			<td rowspan="2">55° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>OspA fuera Rv</td>
			<td>OspA</td>
			<td colspan="2">caactgctgacccctctaat</td>
		</tr>
<tr>
<td>OspA en Fw</td>
			<td>OspA</td>
			<td colspan="2">acaagagcagacggaaccag</td>
			<td rowspan="2">350 bp</td>
			<td rowspan="2">58° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>OspA en Rv</td>
			<td>OspA</td>
			<td colspan="2">ttggtgccatttgagtcgta</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: Cartillas interiores y exteriores para nPCR de Borrelia burgdorferiFlaB y OspA. En la práctica, los iniciadores del FlaB detectan B. burgdorferi s.s. y otros estrechamente relacionados genospecies de Borrelia , mientras OspA cartillas capturan sólo B. burgdorferi s.s. amplificación de ambos loci indicaría B. burgdorferi. s.s.
<ol start="2"><li>Esterilizar previamente un gabinete PCR con UV luz y 70% etanol. Nota: Para minimizar la potencial contaminación de las muestras, este espacio de trabajo debe ser distinto de la localización de la disección de la garrapata, la extracción de ADN y electrophoresis del gel.<ol>
<li>Para el funcionamiento inicial de la PCR, utilizar los iniciadores externos junto con la plantilla de ADN recuperado en el paso 1.0 anterior y establece la mezcla de reacción según se describe en la tabla 2. En paralelo, realizar positivos control funciona de verificado Borrelia DNA y control negativo funciona incluyendo reacciones no-plantilla para detectar contaminación del reactivo y el aerosol. Añadir ADN al final para minimizar la contaminación potencial de los reactivos. Asegurar que cada tubo está cerrado en todo momento cuando los reactivos no se agregan y cerrar tubos inmediatamente después de la adición de ADN y antes de que se abran otros tubos.</li>
		<li>Un termociclador de programa como sigue: 95 ° C por 5 min; 40 ciclos de 95 ° C por 15 s, recocido temperatura por 30 s, 72 ° C por 45 s; 72 ° C por 5 min; y mantener a 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Realizar la segunda ronda de PCR similar a la primera reacción, excepto utilizar imprimaciones interiores con 2 μl del producto PCR primer (producido en 2.2.2). Nota: Los volúmenes de reacción otra vez son proporcionados en la tabla 2. Debe tenerse cuidado para evitar la contaminación con amplicones que DNA de la plantilla se agrega último y que solamente los tubos correspondientes a una muestra están abiertos a la vez. 
	 
	<table border="1"><tbody>
<tr>
<td>Componente</td>
				<td>Volúmenes PCR # 1</td>
				<td>Polimerización en cadena # 2 volúmenes</td>
			</tr>
<tr>
<td>Taq polimerasa Master Mix 2 X</td>
				<td>12.5 ΜL</td>
				<td>12.5 ΜL</td>
			</tr>
<tr>
<td>Agua libre de nucleasas</td>
				<td>8,5 ΜL</td>
				<td>8,5 ΜL</td>
			</tr>
<tr>
<td>10 μm cartillas de avance y retroceso</td>
				<td>1,0 μL iniciadores exterior</td>
				<td>Cartillas interior 1,0 μL</td>
			</tr>
<tr>
<td>Plantilla de la DNA</td>
				<td>2.0 μL, de la extracción de la muestra (1.2.7)</td>
				<td>2.0 μL, 1 ronda de PCR (2.2.2)</td>
			</tr>
</tbody></table>
Tabla 2: Mezclas de reacción de PCR para amplificaciones primeras y segunda. 
	 
	<ol>
<li>Programar al termociclador como antes, pero ajustar la temperatura de recocido para acomodar los cebadores internos (véase cuadro 1).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. proyección de imagen y electroforesis en Gel de agarosa
Nota: Para instrucciones básicas de separación de ADN por electroforesis, ver Lee et al., 201234.
<ol><li>Preparar un gel de agarosa al 1.2% con buffer de SB X 20 0.2 M NaOH, 0,8 M ácido bórico pH 8, diluido al 1 X y añadir aproximadamente 5 μl de una tinción de ADN, antes de verter, si se desea la tinción del gel.</li>
	<li>Cargar 10 μl del producto de la segunda reacción de PCR (interna) de cada uno experimental y la muestra de control, junto a una escalera de bp 100 (5 μl).<ol>
<li>Electrophorese por 1 h a 107 V (5V/cm).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vista y documento el gel utilizando un transiluminador y asociados de la cámara y el software.</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Décadas de uso, técnicas basadas en PCR han demostrado ser constantemente su valor en la detección de Borrelia de muestras de artrópodos y mamíferas, si Borrelia provienen de origen clínico o ambiental. PCR ofrece muchas mejoras sobre enfoques existentes para la vigilancia. En particular, no es dependiente en el desarrollo y rendimiento de los reactivos de anticuerpos y en su lugar puede ser fácilmente adaptado para detectar nuevos objetivos de interés simplemente modificando secuencias de la cartilla. PCR también tiene capacidad para la evaluación de múltiples loci en paralelo, ya sea independientemente o a través de una reacción multiplex. Puede ser aplicado a las entradas de diversas muestras, incluyendo garrapatas fresco y archivados22, animal o humanos fluidos corporales y tejido resecado25. PCR también rinde amplicones que pueden ser procesados, por ejemplo por enzima de la restricción digestión, sonda hibridación o secuenciación, para proporcionar la mayor penetración en la identidad microbiana21.
Como una herramienta clínica, la PCR es expresiones preferible para el diagnóstico serológico estándar, ya que proporciona una indicación directa de presencia bacteriana, en lugar de confiar en la respuesta inmune del huésped como medida secundaria de la infección. Sin embargo, borreliosis de Lyme se asocia con una carga microbiana relativamente modesta (< 50 organismos/mL de orina o plasma) y25spirochetemia transitoria, que puede dar lugar a falsos negativos. La sensibilidad de esta técnica en la clínica varía considerablemente dependiendo del tipo de tejido, etapa de la infección y la condición de la muestra, comprendida entre 12,5% y 62% en los estudios de sangre, líquido cefalorraquídeo y tejido hecho una biopsia36. Limitaciones de sensibilidad molecular no son una preocupación si PCR se lleva a cabo con posterioridad a la cultura bacteriana, sin embargo la recuperación de la espiroqueta viable de especímenes clínicos se ha demostrado igualmente desafiante. Sólo recientemente se han optimizado los protocolos para mayor rendimiento35. Mientras tanto, la tripa de una garrapata adulta infectada puede albergar en promedio en cualquier lugar de 2.000 a más de 50.000 Borrelia37,38,39, que es firmemente dentro de la gama de detección de nPCR. Así, el protocolo es idóneo para esfuerzos de vigilancia de la garrapata.
A pesar de sus muchas ventajas, nPCR plantean ciertos retos y la capacidad de esta técnica para informar con precisión infección de garrapata por lo tanto depende de la estratégica selección de genes y amplicones, flujos de trabajo experimentales meticuloso que recuperan ADN de calidad de especímenes y reducir al mínimo la Cruz-exposición de muestras y el uso de los controles adecuados que pueden contaminantes en el ambiente de laboratorio y reactivos. Antes de cualquier experimentación, el alcance y la intención de la investigación debe definirse claramente para que lugares geométricos genéticos apropiados y regiones, se pueden seleccionar. Si el objetivo es proporcionar una pantalla imparcial para los causantes de Lyme burgdorferi de Borrelia s.l. complejo, imprimaciones deben crearse para detectar todas las cepas asociadas con similar afinidad y eficiencia de amplificación, sin capturarlos sin relación organismos25. Nuevas cartillas pueden ser diseñadas y evaluado en silico utilizando herramientas de software como el Primer chorro40, aunque también debe ser validados experimentalmente contra referencia estándar aislantes antes de ser aplicados a muestras no caracterizadas. El procedimiento de extracción de ADN pretende recuperar intacto plantilla microbiana de una muestra ambiental mixta (homogeneizado de garrapata). Un paso opcional antes de proceder con la PCR es evaluar la integridad del ADN extraído. Además, se podrían configurar reacciones paralelas a un gen de la limpieza en la señal de destino. Este último método también puede indicar la presencia de inhibidores en la mezcla de reacción, proporcionando mayor confianza que las reacciones negativas de Borrelia son debido a la ausencia del organismo y no a la presencia de un inhibidor de contaminantes.
El aumento de la sensibilidad de la estrategia PCR anidada viene a expensas de la posible contaminación que genera resultados falsos positivos. Plantilla de exógeno podría introducirse a una muestra durante la disección de la garrapata y la recuperación de ADN, o en el proceso de creación de las reacciones de amplificación externa e interna. Por lo tanto es especialmente importante seguir mejores protocolos de práctica para PCR evitar la plantilla o amplicones contaminación cruzada. Estos incluyen el uso de estaciones de trabajo separadas con corrientes de aire independiente, contención en PCR y gabinetes de seguridad biológica en su caso, cuidadosa química física limpieza y esterilización de superficies y reactivos y prudente manejo de ADN 41. No-plantilla controles también son vitales en la identificación de contaminación de los reactivos comunes. Una vulnerabilidad particular de nPCR es el amplicon manipulación que se produce al transferir los productos de la primera reacción en el segundo recipiente de polimerización en cadena. Puesto que el ADN diana ya ha sufrido enriquecimiento exponencial en las muestras positivas, este paso es especialmente propenso a la contaminación cruzada, y se ha desarrollado un protocolo del solo-tubo nPCR para sortear esta limitación. En este enfoque, ambos juegos de cebadores para un gen dado se suman a un tubo de reacción que queda sellado para dos rondas de PCR31. Los pares de imprimación interior y exterior deben ser termodinámicamente distintos, tal que el par externo amplifica la plantilla a una alta temperatura de recocido que es prohibitiva para los cebadores internos. En la segunda vuelta, se baja la temperatura de recocido para acomodar al par interno. No sólo hace de este puente un paso potencialmente confusión, también permite el uso de más medidas de lucha contra la contaminación de31,42. Sin embargo, esta modificación puede sacrificar cierta sensibilidad del ensayo. Independientemente del enfoque, aumentando el número de repeticiones técnicas realizado independientemente en una muestra le ayudará a identificar contaminación espuria.
Técnicas moleculares han continuado evolucionando desde la introducción del nPCR y estos enfoques más recientes ofrecen seleccionarlos ventajas sobre los diseños originales, aunque en mayor gastos financieros. Como su nombre indica, PCR cuantitativa (qPCR o real tiempo (RT)-PCR) permite la enumeración de patógenos en una muestra, mientras que las técnicas convencionales son cualitativas en naturaleza43. La sensibilidad de qPCR es presuntamente similar a la de nPCR38, aunque puede variar dependiendo de la imprimación de características28. Una variación de qPCR que utiliza balizas moleculares (MB) en lugar de sondas TaqMan convencionales también ha demostrado promesa en la detección de Borrelia en muestras clínicas44,45,46. Debido a su estructura secundaria única, moleculares beacons al parecer producen fluorescencia del fondo inferior y superiores señales legítimas, proporcionando así una sensibilidad superior47. Evaluaciones preclínicas sugieren un potencial umbral de detección de entre uno y diez las espiroquetas44,45. Por otra parte, la técnica se ha aplicado con éxito en reacciones multiplexores para detectar simultáneamente un huésped mamífero gen44 y otros patógenos tick-borne45, que no es fácilmente alcanzable con nPCR. Otras modificaciones en el diseño incluyen gota PCR (ddPCR) la tecnología digital, que puede cuantificar ADN sin el uso de una curva estándar39,48. El límite inferior de detección de esta técnica para Borrelia es además alrededor de diez muestra espiroquetas39. En comparación con nPCR, estos enfoques también tienen la ventaja de reducido potencial para la contaminación, ya que sólo requieren un protocolo de amplificación individuales.
Si el objetivo de la vigilancia es en lugar de otro perfil el contenido bacteriano variado de una garrapata, 16S rRNA metagenómica es un atractivo49. Aunque este enfoque es más costoso, requiere especializados secuenciadores de ADN que no se encuentra en todos los laboratorios de biología molecular y exige una interpretación más sofisticada basada en la bioinformática, puede capturar un amplio espectro de microbios más exactamente representa la carga del patógeno del vector.
QPCR y sus derivados son métodos de elección para aplicaciones cuantitativas y metagenómica pantallas proporcionan amplios inventarios del microbioma de la garrapata, esfuerzos de vigilancia específica a menudo se refieren a información binaria de la presencia o ausencia de uno o varios patógenos en un vector. Bajo tales circunstancias, estos enfoques nuevos y más elaborados pueden introducir complejidad innecesaria y carga financiera en el proceso. Por estas razones, nPCR ha resistido la prueba del tiempo como una técnica fundamental en señal de prueba.

La enfermedad de Lyme (LD) es la infección transmitida por vectores más frecuente en el hemisferio norte, y su incidencia sigue aumentando1. Esta enfermedad debilitante es causada por patógenos spirocheteal de la borreliosis de Lyme (LB) complejo (comúnmente referido como Borrelia burgdorferi sensu lato, s.l.), que comprende históricamente el patógeno predominante de América del norte, B. burgdorferi sensu stricto (s.s), además de B. afzelii y B. garinii, que están extendidos por toda Europa y Asia y son especies de emergente importancia clínica2,3. Estas bacterias se transmiten a los seres humanos a través de la picadura de infectado Ixodes garrapatas2. Aunque los vectores principales de América del norte son I. scapularis e I. pacificus, múltiples especies dentro de este género se han encontrado para abrigar y transmitir la bacteria4. En los seres humanos, B. burgdorferi puede causar síntomas del multisistema que afectan a la piel, articulaciones, corazón, sistema nervioso, glándulas endocrinas, aparato gastrointestinal y órganos internos5,6,7, 8,9,10. Actualmente, el centro de Control y prevención de enfermedades calcula más de 300.000 nuevos casos humanos anuales en los Estados Unidos11,12. Mientras que el pronóstico suele ser favorable cuando la enfermedad es diagnosticada y tratada en las primeras etapas, los estudios han sugerido en cualquier lugar entre 10% y el 60% de los pacientes que recibieron el régimen antibiótico recomendado continuado sufriendo síntomas después de terapia cesación, en un fenómeno había denominado síndrome de la enfermedad de Lyme de Post tratamiento (PTLDS)13,14,15. Por otra parte, retrasos en la intervención clínica pueden presentarse como resultado de la falta de conciencia de una picadura de garrapata, la presentación no específica de la enfermedad inicial y la baja sensibilidad del diagnóstico basado en la serología tradicional cuando se utiliza en el inicio de la infección. Si no se tratan rápida y adecuadamente permite la progresión de síntomas que puede manifestar en cada vez más debilitantes complicaciones16,17. Prevención de la enfermedad de Lyme es una piedra angular de la gestión del riesgo. Estrategias para combatir esta creciente amenaza incluyen medidas de vigilancia sólido para indicar que la prevalencia del patógeno en las garrapatas e identifican las regiones geográficas de interés.
Este artículo demuestra la utilidad de la reacción en cadena jerarquizada de polimerasa (nPCR) como una herramienta de detección molecular mediante el cual se identifican las garrapatas infectadas. Para aumentar la especificidad, dos genes de Borrelia se utilizan para la amplificación de paralelo. B de flagelina (FlaB) codifica una proteína de gran filamento del flagelo18, y el gen se encuentra en el único cromosoma lineal, mientras que el producto de la lipoproteína de exterior superficie proteína A (OspA) media del midgut de la garrapata colonización, y es codificada por el plásmido19,20. El flujo de trabajo consiste en colección de garrapata, la extracción de ADN y luego una ronda inicial de la PCR para detectar Borrelia-loci específicos. Posterior PCR utiliza el producto de la primera reacción como una nueva plantilla para generar fragmentos de amplificación más pequeño e interno. Una garrapata se considera positiva para Borrelia burgdorferi cuando amplicones de interior de ambos genes de Borrelia pueden ser detectada por electroforesis en gel de agarosa.
La técnica de nPCR y FlaB y objetivos de gen OspA , han sido ampliamente utilizados para la vigilancia ecológica y detección clínica de la espiroqueta de Lyme desde principios del decenio de 199021,22,23 ,24,25. Antes del desarrollo de protocolos moleculares, las garrapatas fueron evaluadas al someter contenido estomacal a anti -Borrelia inmunofluorescencia (IF) de tinción, cultivo microbiano o una combinación de éstos26. Estos enfoques adolecen de limitaciones inherentes, incluyendo el crecimiento lento y la naturaleza fastidiosa de Borrelia27problemas de performance de anticuerpo y el requisito de garrapatas vivo IF proceso21. PCR fue posteriormente adoptado para identificación rápida, sensible y específico de vectores infectados. Ofreció mejoras marcadas en la metodología tradicional, incluyendo la aplicación directa de la cultura-independiente a tipos de muestras diversas, como las garrapatas muertas y archivados que serían inadecuadas para la prueba de21,22 . Diseños experimentales anidados más lejos mejoran la especificidad y sensibilidad de la PCR clásica empleando dos conjuntos distintos de cartillas gene-específicas en dos rondas consecutivas de amplificación25,28.
Éxito experimental es críticamente dependiente de diseño selección y productos estratégicos gene. Para estimar con precisión la presencia de Borrelia burgdorferi, cartillas deberán detectar los patógenos pertinentes sin antigénico con la espiroqueta de la fiebre recurrente también en el género Borrelia . En el caso del FlaB, esta especificidad se logra apuntando a una región interna variable del gen, en lugar de las secuencias flanqueantes relativamente conservadas que son compartidas por diversas bacterias (figura 1)24,29 , 30.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56471/56471fig1.jpg"> Figura 1: el concepto de nPCR, tal como se ilustra usando Borrelia FlaB gene como objetivo. El termini de 5' y 3' del gen es comunes a los organismos más allá de burgdorferi de Borrelia s.l., representación de estas regiones no aptos para la evaluación específica de los agentes patógenos causantes de Lyme. Usando las secuencias interiores conservan menos como objetivos de la cartilla, se ejecutan dos rondas de PCR para detectar un amplicon final, interna. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56471/56471fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
En una prueba de su capacidad discriminatoria, interior FlaB cartillas fueron evaluadas con más de 80 diferentes cepas de Borrelia y encontró a identificar sólo aquellos asociados con la enfermedad de Lyme24. El límite inferior de detección de nPCR se ha documentado en entre seis24 y diez31 bacterias de cultivo puro, aunque la sensibilidad puede mejorarse por borrar el amplicon sur y cruza por hibridación una radiomarcados o sonda quimioluminiscente. Las técnicas de acoplamiento reduce el umbral de detección a un spirochete solo31. Por comparación directa, PCR solo redondo convencional, unprobed fue encontrado para informar de la presencia de un mínimo de 104 espiroquetas31. Sin embargo, cabe señalar que la sensibilidad del ensayo será menor cuando se trabaja con muestras ambientales y clínicas complejas, debido a la abrumadora presencia de ADN no relacionado y posibles sustancias inhibidoras. Estos desafíos pueden eludirse en gran parte por el uso de nPCR.
A pesar de avances en las tecnologías moleculares en las últimas décadas, nPCR sigue siendo una técnica básica en esfuerzos de vigilancia moderna. Si se tiene cuidado en el diseño y ejecución de este protocolo, es un enfoque potente, adaptable y relativamente sencillo para capturar la presencia de patógenos en vectores de garrapatas.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="830">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">LabGard Class II, Type A2 biological safety cabinet</td>
			<td style="width:192px;">Nuaire</td>
			<td style="width:140px;">ES AIR NU-543&#160;</td>
			<td style="width:199px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Razor blades</td>
			<td style="width:192px;">VWR</td>
			<td style="width:140px;">55411-050</td>
			<td>0.22 mm thickness</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Microfuge Tubes (Microtubes 1.5 mL)</td>
			<td style="width:192px;">Axygen</td>
			<td style="width:140px;">311-08-051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">AquaGenomic&#160;</td>
			<td style="width:192px;">MultiTarget Pharmaceuticals</td>
			<td style="width:140px;">2030</td>
			<td>DNA extraction reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Microtube Pestle</td>
			<td style="width:192px;">Diamed</td>
			<td style="width:140px;">DIATEC610-1551</td>
			<td>Designed for 1.5 ml tubes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Water bath - Isotemp 202</td>
			<td style="width:192px;">Fishse Scientific</td>
			<td style="width:140px;">15-462-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Vortex</td>
			<td style="width:192px;">Labnet</td>
			<td style="width:140px;">S0100 CAN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Spectrafuge 24D Digital Microcentrifuge</td>
			<td style="width:192px;">Labnet</td>
			<td style="width:140px;">C2400</td>
			<td style="width:199px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:192px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:140px;">190764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">BIS-TRIS</td>
			<td style="width:192px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:140px;">B9754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Primer Synthesis</td>
			<td style="width:192px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:140px;">OLIGO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">PCR Cabinet</td>
			<td style="width:192px;">Misonix</td>
			<td style="width:140px;">PCR6-482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">PCR tube with attached flat caps 0.2mL</td>
			<td style="width:192px;">VWR</td>
			<td style="width:140px;">20170-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">GoTaq Green Master Mix 2x</td>
			<td style="width:192px;">Promega</td>
			<td style="width:140px;">M7123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Nuclease-free water</td>
			<td style="width:192px;">Promega</td>
			<td style="width:140px;">M7123</td>
			<td>The water comes with the GTG</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Spectrafuge Mini</td>
			<td style="width:192px;">Labnet</td>
			<td style="width:140px;">C1301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">SYBR Safe DNA Stain 10,000X Concentration</td>
			<td style="width:192px;">EDVOTEK</td>
			<td style="width:140px;">608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">Froggarose LE (Molecular Biology Grade Agarose)</td>
			<td style="width:192px;">FroggaBio</td>
			<td style="width:140px;">A87-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">GD 100 bp DNA Ladder</td>
			<td style="width:192px;">FroggaBio</td>
			<td style="width:140px;">DM001-R500&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Electrophoresis power pack&#160;</td>
			<td style="width:192px;">VWR</td>
			<td style="width:140px;">VWR 105</td>
			<td>EC Apparatus Corporation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">Fluor-S MultiImager&#160;</td>
			<td style="width:192px;">BioRad</td>
			<td style="width:140px;">170-7700 (Serial number 433B0154)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:299px;">Quantity One 1-D Analysis Software (V. 4.5.2)</td>
			<td style="width:192px;">BioRad</td>
			<td style="width:140px;">1709600</td>
			<td></td>
		</tr>
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</table>

detecting the lyme disease spirochete, borrelia burgdorferi, in ticks using nested pcr

La enfermedad de Lyme es una infección grave transmitida por vectores que es causada por la Borrelia burgdorferi sensu lato familia de las espiroquetas, que son transmitidos a los seres humanos a través de la picadura de garrapatas Ixodes infectadas. El agente etiológico primario en América del norte es stricto del sensu del burgdorferi del Borrelia . Como amplían las regiones geográficas de riesgo, es prudente apoyar los programas de vigilancia robusta que pueden medir las tasas de infección de la garrapata y comunicar los resultados a los médicos, veterinarios y público en general. La técnica molecular de reacción en cadena jerarquizada de polimerasa (nPCR) ha sido utilizada para este propósito, y sigue siendo un enfoque central, barato y robusto en la detección de Borrelia en garrapatas y vida silvestre.
Este artículo demuestra la aplicación de nPCR en extractos de ADN para identificar los ejemplares infectados de la señal. Independiente dos objetivos de B. burgdorferi , genes de codificación B flagelina (michelines) y exterior superficie proteína A (OspA), se han utilizado ampliamente con esta técnica. El protocolo trata de colección de la marca, la extracción de ADN y luego una ronda inicial de la PCR para detectar cada uno de los dos Borrelia-loci específicos. Reacción en cadena subsecuente de la polimerasa (PCR) utiliza el producto de la primera reacción como una nueva plantilla para generar fragmentos de amplificación más pequeño e interno. El enfoque anidado mejora la especificidad y la sensibilidad de la PCR convencional. Una garrapata se considera positiva para el patógeno cuando amplicones de interior de ambos genes de Borrelia pueden ser detectada por electroforesis en gel de agarosa.

nPCR es un enfoque elegante para aumentar la especificidad y la sensibilidad de detección de patógenos, sobre todo cuando muestras ambientales complejas están bajo investigación. Como se muestra en la figura 1, dos rondas de PCR dirigidos a una región estratégica de la Borrelia FlaB locus (y OspA, no en la foto) pueden reportar la presencia de la bacteria Borrelia burgdorferi mediante la generación de corto interno amplicones. Cuando resolvieron por electroforesis en gel, los productos de reacción FlaB y OspA de cada señal pueden ser visualmente anotó y Comparado con controles. En la figura 2, identificadores de ejemplar único se proporcionan a lo largo de la parte superior de cada gel y controles no-plantilla y aerosol están representados a la izquierda y derecha, respectivamente, junto a las escaleras.
Sólido amplicón bandas son claramente visibles en seleccionadas muestras experimentales, y se distinguen fácilmente de cartillas sobrantes y ADN residual (figura 2). Basado en los principios de diseño experimental establecidos, una garrapata se considera positiva para Borrelia cuando paralelo controles negativos no demuestran amplificación, y amplicones internos se producen de cartillas FlaB y OspA . En este caso, muestras T907 T604 y T606 cumplieron los criterios de vigilancia para el patógeno de Lyme (figura 2). By Contrast, T923 sólo era positivo para la OspA, un resultado que hay varias posibles explicaciones: A) la señal de origen era negativa para Borrelia, pero la preparación interior o exterior de la OspA PCR cifra estaba contaminada con ADN de plantilla (nota que contaminación sistémica de los reactivos fue eliminada mediante controles negativos), B) la garrapata lleva a Lyme Borrelia, pero cantidades bajas de la plantilla o error experimental previno amplificación del FlaB, o C) un organismo estuvo presente contiene la secuencia conservada de la OspA , pero carecía de flagelina o tenía identidad insuficiente en la región específica del FlaB a templar a los iniciadores. De hecho, las similitudes de secuencia OspA se han observado en una variedad de organismos, incluyendo animales y plantas28. La situación de converse, la amplificación de más conserva el gen de la flagelina , pero no el gen OspA , podría indicar una especie relacionada de Borrelia . En la práctica, este protocolo rinde más los resultados positivos solo de la OspA de los iniciadores del FlaB , sugiriendo que el escenario 'A' es la explicación menos probable de hacer. Sin más análisis experimental de la muestra discutible, sin embargo, no es posible determinar la fuente del resultado positivo solo. Aumentar el número de repeticiones técnicas en muestras ambiguas puede ayudar a reconciliar su estado verdadero, ya que cualquier contaminante que cifra se introdujeron a las reacciones anteriores no estaría presente en el ADN archivado. Sin embargo, si las reacciones posteriores con estos iniciadores no proporcionan resultados concluyentes, otros loci de Borrelia podían ser investigados por PCR. Amplicones generados a partir de estas reacciones también podrían ordenados y comparados entre aislamientos para ayudar a asignar identidad y estimar el grado de divergencia de la tensión. SAPI y sus colegas proporcionan un ejemplo de este flujo de trabajo utilizando muestras clínicas humanas35.
Todos los factores considerados, los criterios de protocolo e interpretación se han estimado a producir falsos positivas y falsas negativas tasas de 0.17% y 0.0063%, respectivamente.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56471/56471fig2.jpg"> Figura 2 : Detección de Borrelia burgdorferi en garrapatas individuales por nPCR de FlaB y OspA. Códigos asignados a cada tick se representan en la parte superior de los geles y las identidades alinean verticalmente para reportar la detección de la OspA y michelines en cada muestra. Carriles derecho B a la izquierda de las imagen representan plantilla no los controles, mientras que un (carriles de mano derecha) son controles de aerosol para capturar la contaminación del medio ambiente de laboratorio. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56471/56471fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Detecting the Lyme Disease Spirochete, Borrelia Burgdorferi, in Ticks Using Nested PCR

PCR anidada es una técnica sensible, específica y directa que se puede aplicar a garrapata que extractos de ADN para sonda de burgdorferi de Borrelia, el agente causativo de la enfermedad de Lyme. El experimento inicial de PCR utiliza cartillas gene-específicas para generar amplicones de largo, que luego se convierten en plantillas para una posterior reacción usando cebadores internos.

Detectar el Spirochete de la enfermedad de Lyme, Burgdorferi de Borrelia, de garrapatas mediante PCR anidado

Lyme disease is a serious vector-borne infection that is caused by the Borrelia burgdorferi sensu lato family of spirochetes, which are transmitted to ...

detecting-lyme-disease-spirochete-borrelia-burgdorferi-ticks-using

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Detecting the Lyme Disease Spirochete, Borrelia Burgdorferi, in Ticks Using Nested PCR

17.8K vistas.  Mount Allison University. PCR anidada es una técnica sensible, específica y directa que se puede aplicar a garrapata que extractos de ADN para sonda de burgdorferi de Borrelia, el agente causativo de la enfermedad de Lyme. El experimento inicial de PCR utiliza cartillas gene-específicas para generar amplicones de largo, que luego se convierten en plantillas para una posterior reacción usando cebadores internos.

Video: Detecting the Lyme Disease Spirochete, Borrelia Burgdorferi, in Ticks Using Nested PCR

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and accuracy of the assay. These primer/probe sets are pre-designed to &gt;98% of the human and mouse genomes and feature significant improvements from previously available technologies. These improvements were made possible by virtue of a novel design algorithm, developed by Thermo Scientific bioinformatics experts.
Several convenient features have been incorporated into the Solaris qPCR Assay to streamline the process of performing quantitative real-time PCR. First, the protocol is similar to commonly employed alternatives, so the methods used during qPCR are likely to be familiar. Second, the master mix is blue, which makes setting the qPCR reactions easier to track. Third, the thermal cycling conditions are the same for all assays (genes), making it possible to run many samples at a time and reducing the potential for error. Finally, the probe and primer sequence information are provided, simplifying the publication process.
Here, we demonstrate how to obtain the appropriate Solaris reagents using the GENEius product search feature found on the ordering web site (www.thermo.com/solaris) and how to use the Solaris reagents for performing qPCR using the standard curve method.

The Solaris qPCR Gene Expression Assays are novel pre-designed qPCR primer/probe combinations designed to simplify the qPCR process without sacrificing the specificity and robustness of the assay.

Cuantitativas PCR en tiempo real utilizando el Thermo Scientific Solaris qPCR ensayo

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

Investigación

Biología

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA lesions with respect to survival and preservation of genomic integrity. An early response to the induction of DSBs is phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX1. Following induction of DSBs, H2AX is rapidly phosphorylated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PIKK) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Typically, only a few base-pairs (bp) are implicated in a DSB, however, there is significant signal amplification, given the importance of chromatin modifications in DNA damage signalling and repair. Phosphorylation of H2AX mediated predominantly by ATM spreads to adjacent areas of chromatin, affecting approximately 0.03% of total cellular H2AX per DSB2,3. This corresponds to phosphorylation of approximately 2000 H2AX molecules spanning ~2 Mbp regions of chromatin surrounding the site of the DSB and results in the formation of discrete &gamma;H2AX foci which can be easily visualized and quantitated by immunofluorescence microscopy2. The loss of &gamma;H2AX at DSB reflects repair, however, there is some controversy as to what defines complete repair of DSBs; it has been proposed that rejoining of both strands of DNA is adequate however, it has also been suggested that re-instatement of the original chromatin state of compaction is necessary4-8. The disappearence of &gamma;H2AX involves at least in part, dephosphorylation by phosphatases, phosphatase 2A and phosphatase 4C5,6. Further, removal of &gamma;H2AX by redistribution involving histone exchange with H2A.Z has been implicated7,8. Importantly, the quantitative analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in medical and nuclear research. Here, we demonstrate the most commonly used immunofluorescence method for evaluation of initial DNA damage by detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in &gamma;-irradiated adherent human keratinocytes9.

Quantification of &#947;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of DNA double-strand streaks using &gamma;H2AX formation as a molecular marker has become an invaluable tool in radiation biology. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantification of &gamma;H2AX foci after exposure of cells to radiation.

La cuantificación de γH2AX focos en respuesta a la radiación ionizante

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer (Agrilus planipennis) Using Quantitative Real Time-PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB continues to spread rapidly and attacks ash trees of different ages, from saplings to mature trees. However, to date very little or no molecular knowledge exists for EAB. We are interested in deciphering the molecular-based physiological processes at the tissue level that aid EAB in successful colonization of ash trees. In this report we show the effective use of quantitative real-time PCR (qRT-PCR) to ascertain mRNA levels in different larval tissues (including midgut, fat bodies and cuticle) and different developmental stages (including 1st-, 2nd-, 3rd-, 4th-instars, prepupae and adults) of EAB. As an example, a peritrophin gene (herein named, AP-PERI1) is exemplified as the gene of interest and a ribosomal protein (AP-RP1) as the internal control. Peritrophins are important components of the peritrophic membrane/matrix (PM), which is the lining of the insect gut. The PM has diverse functions including digestion and mechanical protection to the midgut epithelium.

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer Agrilus planipennis Using Quantitative Real Time-PCR

Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) is an effective tool to diagnose mRNA levels in different insect tissues and developmental stages. In this report we show the use of qRT-PCR to ascertain mRNA levels in different larval tissues and developmental stages of the invasive insect species, emerald ash borer.

Análisis de la expresión génica en el barrenador esmeralda del fresno ( Agrilus planipennis) Utilizando Real-PCR cuantitativa en tiempo

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB ...

Rapid PCR Thermocycling using Microscale Thermal Convection

Many molecular biology assays depend in some way on the polymerase chain reaction (PCR) to amplify an initially dilute target DNA sample to a detectable concentration level. But the design of conventional PCR thermocycling hardware, predominantly based on massive metal heating blocks whose temperature is regulated by thermoelectric heaters, severely limits the achievable reaction speed1. Considerable electrical power is also required to repeatedly heat and cool the reagent mixture, limiting the ability to deploy these instruments in a portable format.
Thermal convection has emerged as a promising alternative thermocycling approach that has the potential to overcome these limitations2-9. Convective flows are an everyday occurrence in a diverse array of settings ranging from the Earth's atmosphere, oceans, and interior, to decorative and colorful lava lamps. Fluid motion is initiated in the same way in each case: a buoyancy driven instability arises when a confined volume of fluid is subjected to a spatial temperature gradient. These same phenomena offer an attractive way to perform PCR thermocycling. By applying a static temperature gradient across an appropriately designed reactor geometry, a continuous circulatory flow can be established that will repeatedly transport PCR reagents through temperature zones associated with the denaturing, annealing, and extension stages of the reaction (Figure 1). Thermocycling can therefore be actuated in a pseudo-isothermal manner by simply holding two opposing surfaces at fixed temperatures, completely eliminating the need to repeatedly heat and cool the instrument.
One of the main challenges facing design of convective thermocyclers is the need to precisely control the spatial velocity and temperature distributions within the reactor to ensure that the reagents sequentially occupy the correct temperature zones for a sufficient period of time10,11. Here we describe results of our efforts to probe the full 3-D velocity and temperature distributions in microscale convective thermocyclers12. Unexpectedly, we have discovered a subset of complex flow trajectories that are highly favorable for PCR due to a synergistic combination of (1) continuous exchange among flow paths that provides an enhanced opportunity for reagents to sample the full range of optimal temperature profiles, and (2) increased time spent within the extension temperature zone the rate limiting step of PCR. Extremely rapid DNA amplification times (under 10 min) are achievable in reactors designed to generate these flows.

We describe a novel method to perform DNA replication via the polymerase chain reaction (PCR). Thermal convection is harnessed to continuously shuttle reagents between denaturing, annealing, and extension conditions by maintaining opposing surfaces of the reactor at constant temperature. This inherently simple design promises to make rapid PCR more accessible.

PCR rápido ciclo térmico con convección térmica microescala

Many molecular biology assays depend in some way on the polymerase chain reaction (PCR) to amplify an initially dilute target DNA sample to a detectable ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway that polypeptide chain follows during co-translational folding to achieve its functional form is still an enigma. In order to understand this process and to determine the exact conformation of the co-translational folding intermediates, it is essential to develop techniques that allow the isolation of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes to allow their further structural analysis.
SecM (secretion monitor) is a 170 amino acid E. coli protein that regulates expression of the downstream SecA (secretion driving) ATPase in the secM-secA operon6. Nakatogawa and Ito originally found that a 17 amino acid long sequence (150-FSTPVWISQAQGIRAGP-166) in the C-terminal region of the SecM protein is sufficient and necessary to cause stalling of SecM elongation at Gly165, thereby producing peptidyl-glycyl-tRNA stably bound to the ribosomal P-site7-9. More importantly, it was found that this 17 amino acid long sequence can be fused to the C-terminus of virtually any full-length and/or truncated protein thus allowing the production of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes7. Thus, when fused or inserted into the target protein, SecM stalling sequence produces arrest of the polypeptide chain elongation and generates stable RNCs both in vivo in E. coli cells and in vitro in a cell-free system. Sucrose gradient centrifugation is further utilized to isolate RNCs.
The isolated RNCs can be used to analyze structural and functional features of the co-translational folding intermediates. Recently, this technique has been successfully used to gain insights into the structure of several ribosome bound nascent chains10,11. Here we describe the isolation of bovine Gamma-B Crystallin RNCs fused to SecM and generated in an in vitro translation system.

We describe here a technique that is now routinely used to isolate stably bound ribosome nascent chain complexes (RNCs). This technique takes advantage of the discovery that a 17 amino acid long SecM "arrest sequence" can halt translation elongation in a prokaryotic (E. coli) system, when inserted into (or fused to the C-terminus) of virtually any protein.

Usar secuencias de detención SecM como una herramienta para aislar Ribosome polipéptidos enlazados

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Transposon mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is less time consuming, less costly, and does not require completed genome information, there are two weaknesses in this method: (1) the possibility of a disparate mutants in the mixed mutant library that counter-selects mutants with decreased competition; and (2) the possibility of partial gene inactivation whereby genes do not entirely lose their function following the insertion of a transposon. Single-gene deletion analysis may compensate for the drawbacks associated with transposon mutagenesis. To improve the efficiency of genome-wide single gene deletion, we attempt to establish a high-throughput technique for genome-wide single gene deletion using Streptococcus sanguinis as a model organism. Each gene deletion construct in S. sanguinis genome is designed to comprise 1-kb upstream of the targeted gene, the aphA-3 gene, encoding kanamycin resistance protein, and 1-kb downstream of the targeted gene. Three sets of primers F1/R1, F2/R2, and F3/R3, respectively, are designed and synthesized in a 96-well plate format for PCR-amplifications of those three components of each deletion construct. Primers R1 and F3 contain 25-bp sequences that are complementary to regions of the aphA-3 gene at their 5' end. A large scale PCR amplification of the aphA-3 gene is performed once for creating all single-gene deletion constructs. The promoter of aphA-3 gene is initially excluded to minimize the potential polar effect of kanamycin cassette. To create the gene deletion constructs, high-throughput PCR amplification and purification are performed in a 96-well plate format. A linear recombinant PCR amplicon for each gene deletion will be made up through four PCR reactions using high-fidelity DNA polymerase. The initial exponential growth phase of S. sanguinis cultured in Todd Hewitt broth supplemented with 2.5% inactivated horse serum is used to increase competence for the transformation of PCR-recombinant constructs. Under this condition, up to 20% of S. sanguinis cells can be transformed using ~50 ng of DNA. Based on this approach, 2,048 mutants with single-gene deletion were ultimately obtained from the 2,270 genes in S. sanguinis excluding four gene ORFs contained entirely within other ORFs in S. sanguinis SK36 and 218 potential essential genes. The technique on creating gene deletion constructs is high throughput and could be easy to use in genome-wide single gene deletions for any transformable bacteria.

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

An efficient genome-wide single gene mutation method has been established using Streptococcus sanguinis as a model organism. This method has achieved via high throughput recombinant PCRs and transformations.

Genoma escala supresiones de genes en<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Por PCR de alto rendimiento

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

Here, we present methods for the development of assays to query potentially clinically significant nonsynonymous changes using in vivo complementation in zebrafish. Zebrafish (Danio rerio) are a useful animal system due to their experimental tractability; embryos are transparent to enable facile viewing, undergo rapid development ex vivo, and can be genetically manipulated.1 These aspects have allowed for significant advances in the analysis of embryogenesis, molecular processes, and morphogenetic signaling. Taken together, the advantages of this vertebrate model make zebrafish highly amenable to modeling the developmental defects in pediatric disease, and in some cases, adult-onset disorders. Because the zebrafish genome is highly conserved with that of humans (~70% orthologous), it is possible to recapitulate human disease states in zebrafish. This is accomplished either through the injection of mutant human mRNA to induce dominant negative or gain of function alleles, or utilization of morpholino (MO) antisense oligonucleotides to suppress genes to mimic loss of function variants. Through complementation of MO-induced phenotypes with capped human mRNA, our approach enables the interpretation of the deleterious effect of mutations on human protein sequence based on the ability of mutant mRNA to rescue a measurable, physiologically relevant phenotype. Modeling of the human disease alleles occurs through microinjection of zebrafish embryos with MO and/or human mRNA at the 1-4 cell stage, and phenotyping up to seven days post fertilization (dpf). This general strategy can be extended to a wide range of disease phenotypes, as demonstrated in the following protocol. We present our established models for morphogenetic signaling, craniofacial, cardiac, vascular integrity, renal function, and skeletal muscle disorder phenotypes, as well as others.

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

Here, we present a systematic approach for developing physiologically relevant, sensitive and specific in vivo assays for interpreting variation in human pathology. Transient genetic manipulation via microinjection of WT and mutant human mRNA and morpholino (MO) antisense oligonucleotides harness the tractability of the developing zebrafish embryo to rapidly assay pathogenic mutations, especially, but not exclusively, in the context of human developmental disorders.

En Vivo Modelado del Genoma Humano Morbid usando Danio rerio

Here,  we present methods for the development of assays to query potentially clinically  significant nonsynonymous changes using in  vivo complementation ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic tools have been introduced, including multiple strategies for inducing mutations and generating transgenic lines. However, large-scale screening is limited by traditional genotyping methods, which are time-consuming and labor-intensive. Here we describe a technique to analyze zebrafish genotypes by PCR combined with high-resolution melting analysis (HRMA).&#160;This approach is rapid, sensitive, and inexpensive, with lower risk of contamination artifacts.&#160;Genotyping by PCR with HRMA can be used for embryos or adult fish, including in high-throughput screening protocols.

PCR combined with high-resolution melt analysis (HRMA) is demonstrated as a rapid and efficient method to genotype zebrafish.

Rápido y Eficiente de pez cebra Genotipado Utilizando PCR con análisis del derretimiento de alta resolución

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different lineages. A single cell transcriptome assay can be a new approach for dissecting individual variation. We have developed the single cell qRT-PCR method, and confirmed that this method works well in several gene expression profiles. In single cell level, each human embryonic stem cell, sorted by OCT4::EGFP positive cells, has high expression in OCT4, but a different level of NANOG expression. Our single cell gene expression assay should be useful to interrogate population heterogeneities.

Single cell gene expression assay is needed for understanding stem cell heterogeneities.

Perfiles de Células Madre Embrionarias Humanas individual por RT-PCR cuantitativa

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

Detecting Estrogenic Ligands in Personal Care Products using a Yeast Estrogen Screen Optimized for the Undergraduate Teaching Laboratory

The Yeast Estrogen Screen (YES) is used to detect estrogenic ligands in environmental samples and has been broadly applied in studies of endocrine disruption. Estrogenic ligands include both natural and manmade &#34;Environmental Estrogens&#34; (EEs) found in many consumer goods including Personal Care Products (PCPs), plastics, pesticides, and foods. EEs disrupt hormone signaling in humans and other animals, potentially reducing fertility and increasing disease risk. Despite the importance of EEs and other Endocrine Disrupting Chemicals (EDCs) to public health, endocrine disruption is not typically included in undergraduate curricula. This shortcoming is partly due to a lack of relevant laboratory activities that illustrate the principles involved while also being accessible to undergraduate students. This article presents an optimized YES for quantifying ligands in personal care products that bind estrogen receptors alpha (ER&#945;) and/or beta (ER&#946;). The method incorporates one of the two colorimetric substrates (ortho-nitrophenyl-&#946;-D-galactopyranoside (ONPG) or chlorophenol red-&#946;-D-galactopyranoside (CPRG)) that are cleaved by &#946;-galactosidase, a 6-day refrigerated incubation step to facilitate use in undergraduate laboratory courses, an automated application for LacZ calculations, and R code for the associated 4-parameter logistic regression analysis. The protocol has been designed to allow undergraduate students to develop and conduct experiments in which they screen products of their choosing for estrogen mimics. In the process, they learn about endocrine disruption, cell culture, receptor binding, enzyme activity, genetic engineering, statistics, and experimental design. Simultaneously, they also practice fundamental and broadly applicable laboratory skills, such as: calculating concentrations; making solutions; demonstrating sterile technique; serially diluting standards; constructing and interpolating standard curves; identifying variables and controls; collecting, organizing, and analyzing data; constructing and interpreting graphs; and using common laboratory equipment such as micropipettors and spectrophotometers. Thus, implementing this assay encourages students to engage in inquiry-based learning while exploring emerging issues in environmental science and health.

This article presents an optimized yeast estrogen screen for quantifying ligands in Personal Care Products (PCPs) that bind estrogen receptors alpha (ER&#945;) and/or beta (ER&#946;). The method incorporates two colorimetric substrate options, a six-day refrigerated incubation for use in undergraduate courses, and statistical tools for data analysis.

Detección de ligandos estrogénica en productos de Cuidado Personal con una pantalla de estrógeno levadura optimizado para el laboratorio de enseñanza de pregrado