Die Autoren möchte Kami Harris für besser gekleideteres Design, Ashley McKibbon und Jessica Thomas-Ebbett für Dreharbeiten, John Blakely, Alexandra Foley-Eby, Chris Langley, Julie Lewis, Kelsey McIntyre, Ashley McKibbon, Chris Zinck und Rosie den Hund für das erscheinen in der Video. A. M. K. wurde von der kanadischen Lyme-Borreliose-Forschungsgemeinschaft unterstützt und Projektförderung durch naturwissenschaftlich-technischen Forschung Rat von Kanada (NSERC) zur Verfügung gestellt wurde. M. K. B. W. finanziell Gehalt von New Brunswick Innovation Foundation (NBIF).

1. DNA-Isolierung von Zecken
<ol><li>Erwerben Sie Zecken über Feldauflistung oder passive Überwachung von Tierärzten und Mitgliedern der Öffentlichkeit. Zecken sollten getötet durch Einfrieren, platziert in einem versiegelten Beutel und verschickt bei Raumtemperatur.<ol>
<li>Verwenden ein Formular, informieren Sie sich auf das Datum und die geographische Lage der Begegnung, Tick Anlage Status, Wirtsarten und Zeitgeschichte reisen der Gastgeber.</li>
		<li>Da nested PCR von Natur aus anfällig für Verschmutzung ist, sicherzustellen Sie, dass die Labor-Arbeitsbereich eingerichtet wurde, dass Kreuz-minimieren der Proben. Dies beinhaltet Ausführung verschiedene Elemente des Protokolls in separaten, dedizierten Räumen gut voneinander isoliert, die gründlich gereinigt und sterilisiert werden, und um sicherzustellen, dass alle Instrumente sind frei von Verunreinigungen.</li>
		<li>Fotografieren Sie nach Erhalt der Probekörpers die Zecke zu und bestimmen Sie Arten, Entwicklungsstadium, Geschlecht und Milchstau Status im Vergleich zu einer Identifizierung wichtiger32 .</li>
		<li>Halbieren Sie unter aseptischen Bedingungen die Zecke mit Hilfe einer sterilen Rasierklinge oder einem Skalpell, und legen Sie die zwei Tick-Fragmente in separaten Mikrozentrifugenröhrchen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Um Gesamt-DNA zu extrahieren, verwenden Sie jede Isolierung-Prozedur, die PCR-kompatible Vorlage ergibt; Dieses Protokoll zeigt einen einfachen Chelat-basierten Ansatz.<ol>
<li>Zunächst fügen einem entsprechenden Volumen (oft zwischen 50-200 µL) eine lytische Chelat-Reagenz auf das Tick-Fragment. Die konkrete Höhe richtet sich nach der Probe Größe und Milchstau Status; Leitlinien sollten vom Hersteller bereitgestellt werden. Mit einem Reaktionscup Stößel zu homogenisieren.</li>
		<li>Inkubieren Sie Proben in einem Wasserbad bei 60 ° C für 45 min. und Vortex kurz.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie Proben für 4 min bei 16.276 x g (13.300 u/min) in eine Desktop-Microcentrifuge.</li>
		<li>Übertragen Sie überstand auf eine frische, beschriftete Reaktionscup mit 50 µL Isopropanol, Mix von Inversion und Zentrifugieren Sie erneut wie in (1.2.3).</li>
		<li>Abgießen Sie den Überstand, und spülen Sie das DNA-Pellet mit 50 µL 70 % Ethanol.</li>
		<li>Entfernen Sie überschüssige Ethanol mit einer Pipette und lassen Sie das Pellet 15 min bei Raumtemperatur an der Luft trocknen.</li>
		<li>Aufschwemmen DNA, hinzufügen 50 µL 1 mM Tris pH 7.0 und inkubieren Sie Proben in einem Wasserbad für 1 h bei 60 ° C. Die DNA kann jetzt bei-20 ° C für künftige molekulare Analysen gespeichert werden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. nested PCR-Nachweis von Borrelien OspA und Fettpölsterchen.
Hinweis: Eine Übersicht über allgemeine PCR-Prinzipien und Praktiken wird von Lorenz, 201233bereitgestellt.
<ol><li>Synthetisieren oder Borrelien äußeren und inneren Oligonukleotid-gen-spezifische Primer zu erhalten. Siehe Tabelle 1 für Grundierung Sets, ihre jeweiligen Amplikons Größen und Schmelztemperaturen.</li>
</ol><table border="1"><tbody>
<tr>
<td>Primer-Name</td>
			<td>Gen Ziel</td>
			<td colspan="2">Sequenz (5' - 3')</td>
			<td>Größe der Amplifikate</td>
			<td>Anlasstemperatur</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fettpölsterchen, Fw</td>
			<td>FlaB</td>
			<td colspan="2">gcatcactttcagggtctca</td>
			<td rowspan="2">503 bp</td>
			<td rowspan="2">55° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fettpölsterchen, Rv</td>
			<td>FlaB</td>
			<td colspan="2">tggggaacttgattagcctg</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fettpölsterchen In Fw</td>
			<td>FlaB</td>
			<td colspan="2">ctttaagagttcatgttggag</td>
			<td rowspan="2">447 bp</td>
			<td rowspan="2">58° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fettpölsterchen In Rv</td>
			<td>FlaB</td>
			<td colspan="2">tcattgccattgcagattgt</td>
		</tr>
<tr>
<td>OspA-Out Fw</td>
			<td>OspA</td>
			<td colspan="2">cttgaagttttcaaagaagat</td>
			<td rowspan="2">487 bp</td>
			<td rowspan="2">55° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>OspA-Out Rv</td>
			<td>OspA</td>
			<td colspan="2">caactgctgacccctctaat</td>
		</tr>
<tr>
<td>OspA In Fw</td>
			<td>OspA</td>
			<td colspan="2">acaagagcagacggaaccag</td>
			<td rowspan="2">350 bp</td>
			<td rowspan="2">58° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>OspA In Rv</td>
			<td>OspA</td>
			<td colspan="2">ttggtgccatttgagtcgta</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1: Innere und äußere Primer für nPCR von Borrelia BurgdorferiFlaB und OspA. In der Praxis die FlaB -Primer erkennen B. Burgdorferi s.s. und andere eng im Zusammenhang mit Borrelien Genospecies während OspA Primer nur B. Burgdorferi s.s. erfassen Verstärkung aus beiden Loci deutet darauf hin, B. Burgdorferi. s.s.
<ol start="2"><li>Pre-sterilisieren Sie einen PCR-Schrank mit UV-Licht und 70 % Ethanol. Hinweis: Um mögliche Kontamination der Probe zu minimieren, sollte in diesem Arbeitsbereich werden unterscheidet sich von der Lage der Zecke Dissektion, DNA-Extraktion, und gel-Elektrophorese.<ol>
<li>Verwenden Sie für den ersten PCR-Lauf die äußere Primer in Verbindung mit der Vorlage, die DNA erholt oben in Schritt 1.0, die und richten Sie das Reaktionsgemisch wie in Tabelle 2beschrieben. Parallel führen Sie positive Control läuft bestehend aus verifizierten Borrelien DNA und Negativkontrolle läuft einschließlich keine-Vorlage Reaktionen um Reagenz und Aerosol Kontamination zu erkennen. Fügen Sie DNA am Ende um mögliche Verschmutzung von Reagenzien zu minimieren. Stellen Sie sicher, dass jedes Rohr überhaupt geschlossen ist, mal als Reagenzien werden nicht hinzugefügt und enge Röhren sofort nach Zugabe der DNA und bevor andere Röhren geöffnet werden.</li>
		<li>Programmieren einer Thermocycler folgendermaßen: 95 ° C für 5 min; 40 Zyklen von 95 ° C für 15 s, Ausglühen Temperatur für 30 s, 72 ° C für 45 s; 72 ° C für 5 min; und bei 4 ° c halten</li>
	</ol>
</li>
	<li>Führen Sie die zweite Runde der PCR ähnlich wie die erste Reaktion, außer inneren Primer mit 2 µL der ersten PCR-Produkt (hergestellt in 2.2.2) verwenden. Hinweis: Reaktion Volumen sind wieder in Tabelle 2angegeben. Zur Vermeidung von Kreuzkontamination der Amplifikate indem sichergestellt wird, dass Vorlage DNA zuletzt hinzugefügt wird und dass nur Röhren entspricht einer Probe gleichzeitig geöffnet sind, muss darauf geachtet werden. 
	 
	<table border="1"><tbody>
<tr>
<td>Komponente</td>
				<td>PCR-# 1-Volumes</td>
				<td>PCR # 2 Bände</td>
			</tr>
<tr>
<td>Taq Polymerase Master Mix 2 X</td>
				<td>12,5 ΜL</td>
				<td>12,5 ΜL</td>
			</tr>
<tr>
<td>Nuklease-freies Wasser</td>
				<td>8.5 ΜL</td>
				<td>8.5 ΜL</td>
			</tr>
<tr>
<td>10 µM Forward und Reverse Primer</td>
				<td>1,0 µL äußere Primer</td>
				<td>1,0 µL innere Primer</td>
			</tr>
<tr>
<td>DNA-Vorlage</td>
				<td>2.0 µL, von der Probengewinnung (1.2.7)</td>
				<td>2.0 µL aus Runde 1 der PCR (2.2.2)</td>
			</tr>
</tbody></table>
Tabelle 2: PCR Reaktionsmischungen für erste und zweite Vergrößerungen. 
	 
	<ol>
<li>Programm der Thermocycler wie zuvor, aber passen Sie die Anlasstemperatur um die innere Primer zu berücksichtigen (siehe Tabelle 1).</li>
	</ol>
</li>
</ol>(3) Agarose-Gelelektrophorese und Bildgebung
Hinweis: Grundlegende Anweisungen DNA durch Elektrophorese zu trennen, finden Sie unter Lee Et Al., 201234.
<ol><li>Bereiten Sie eine 1,2 % Agarosegel mit 20 X SB Puffer (0,2 M NaOH, 0,8 M Borsäure pH 8), 1 X verdünnt und abschmecken Sie etwa 5 µL des Fleckes DNA vor dem Gießen, Pre-Färbung des Gels ist.</li>
	<li>Last 10 µL des Produkts von der zweiten (inneren) PCR-Reaktion aus jeder experimentellen und Kontrollprobe, neben einer 100 bp-Leiter (5 µL).<ol>
<li>Für 1 h bei 107 electrophorese V (5V/cm).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Zeigen Sie an und dokumentieren Sie das Gel mit einem Transilluminator und zugehörigen Kamera und Software.</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Über jahrzehntelange Nutzung, PCR-basierten Techniken haben immer wieder bewiesen ihren Wert in den Nachweis von Borrelien von Arthropoden und Säugetieren Proben, ob Borrelien aus ökologischen oder klinischen Herkunft kommen. PCR bietet viele Verbesserungen gegenüber bereits vorhandenen Ansätze zur Überwachung. Vor allem, es ist nicht angewiesen auf die Entwicklung und Leistung der Antikörper Reagenzien und stattdessen um neue Ziele von Interesse zu erkennen, einfach durch Ändern der Grundierung Sequenzen leicht angepasst werden. PCR beherbergt auch die Bewertung der mehrere Loci parallel, entweder eigenständig oder über eine Multiplex-Reaktion. Es kann zu vielfältigen Probe Eingänge, einschließlich frisch und archivierten Zecken22, Tier- oder menschlichen Körperflüssigkeiten und resezierten Gewebes25angewendet werden. PCR liefert auch Amplifikate, die weiter verarbeitet werden können, z. B. durch Beschränkung Enzym Verdauung, Sonde Hybridisierung oder Sequenzierung, erhöhte Einblick in mikrobiellen Identität21.
Als klinische Tool ist PCR standard serologische Diagnostik, konzeptionell vorzuziehen, da es einen direkten Hinweis auf bakterielle Präsenz, anstatt auf Host Immunantwort als sekundäre Maßnahme der Infektion bietet. Lyme-Borreliose ist aber verbunden mit einer relativ bescheidenen mikrobielle Belastung (< 50 Organismen/mL Urin oder Plasma) und vorübergehende Spirochetemia, die falsch-negativ hervorrufen kann Ergebnisse25. Die Empfindlichkeit dieser Technik in der Klinik sehr unterschiedlich je nach Gewebe, Stadium der Infektion und Probe Zustand zwischen 12,5 % und 62 % in vorhandene Untersuchungen von Blut, Liquor cerebrospinalis und biopsiert Gewebe36fallen. Molekulare Empfindlichkeit Einschränkungen sind kein Anliegen wenn PCR im Anschluss an die Bakterienkultur erfolgt, aber Erholung von lebensfähigen Spirochetes von klinischen Proben ebenso anspruchsvoll erwiesen hat. Erst kürzlich wurden Protokolle für höhere Ausbeute35optimiert. Unterdessen kann Darm von einer infizierten Zecke Erwachsene im Durchschnitt überall von 2.000 auf über 50.000 Borrelien37,38,39, Hafen fest im Erfassungsbereich des nPCR ist. Somit eignet sich das Protokoll zur Tick Überwachung Bemühungen.
Trotz vieler Vorteile stellt nPCR bestimmte Herausforderungen, und die Kapazität dieser Technik richtig angeben, dass Zecken Infektion hängt daher strategische Auswahl von Genen und Amplifikate, sorgfältige experimentelle Workflows, die Qualität DNA wiederherstellen von Proben bei gleichzeitiger Minimierung der Kreuz-Exposition von Proben und die Verwendung geeigneter Kontrollen, die Verunreinigungen in der Laborumgebung und Reagenzien melden können. Vor jedem Experiment sollte den Umfang und die Absichten der Untersuchung eindeutig festzulegen, dass darin, geeignete genetische Loci und Regionen ausgewählt werden können. Wenn das Ziel einen unvoreingenommenen Bildschirm für die Lyme-verursachenden Borrelia Burgdorferi s.l. komplexe soll, Primer geschaffen werden, um alle zugehörigen Stämme mit ähnlicher Affinität zu erkennen und Verstärkung Effizienz, ohne die Erfassung unabhängig Organismen25. Neue Primer können entworfen werden und bewertet in Silico mit Software-Tools wie Primer-BLAST40, obwohl sie gegen Standardwerk auch experimentell überprüft werden soll isoliert vor auf Fußgelenkes Proben angewendet wird. Die DNA-Extraktionsverfahren soll intakte mikrobielle Vorlage von ökologischen Mischprobe (Tick Homogenat) zu erholen. Ein optionaler Schritt, bevor Sie fortfahren mit PCR ist es, die Integrität der extrahierten DNA zu bewerten. Darüber hinaus könnten parallele Reaktionen auf ein Zimmermädchen-gen in die Zecke eingerichtet werden. Die letztere Methode kann auch angeben, dass die Anwesenheit von Inhibitoren in das Reaktionsgemisch, Bereitstellung von Selbstvertrauen, dass negative Borrelien Reaktionen aufgrund des Fehlens des Organismus und nicht auf das Vorhandensein von einem hemmenden Verunreinigung.
Die erhöhte Empfindlichkeit der verschachtelten PCR-Ansatz geht auf Kosten der möglichen Kontamination, die falsch-positiven Ergebnisse erwirtschaftet. Exogene Vorlage könnte zu einer Probe während Tick Dissektion und DNA-Recovery oder bei der Einrichtung der äußeren und inneren Amplifikationen eingeführt werden. Es ist daher besonders wichtig, beste Praxis Protokolle für PCR, Vorlage oder Amplifikate zu vermeiden folgen Cross-Kontamination. Dazu gehören die Verwendung von separaten Arbeitsstationen mit unabhängigen Luftströme, Eindämmung in PCR und biologische Sicherheitswerkbänke, gegebenenfalls gründliche chemische und physikalische Reinigung und Sterilisation von Oberflächen und Reagenzien und vorsichtigen Umgang mit DNA 41. Nr. Vorlagensteuerelemente sind auch entscheidend bei der Identifizierung von Kontamination der Lager Reagenzien. Eine besondere Gefährdung des nPCR ist der Amplifikate handling, das tritt auf, wenn die Produkte der ersten Reaktion in der zweiten PCR-Gefäß zu übertragen. Da das Ziel DNA exponentielle Anreicherung im positiven Proben bereits durchgemacht hat, dieser Schritt ist besonders anfällig für Cross-Kontamination und ein Single-Tube nPCR Protokoll wurde entwickelt, um diese Einschränkung zu umgehen. Bei diesem Ansatz werden beide Arten von Grundierungen für ein bestimmtes Gen zusammen ein Reaktionsgefäß hinzugefügt, die abgedichtet für beide Runden des PCR31bleibt. Die äußeren und inneren Grundierung Paare müssen thermodynamisch deutlich, so sein, dass das äußere paar Vorlage auf eine hohe Anlasstemperatur verstärkt, die für die innere Primer unerschwinglich ist. In der zweiten Runde wird die Anlasstemperatur abgesenkt, um das innere paar unterzubringen. Nicht nur ist dies einen potenziell verwirrende Schritt umgehen, es erlaubt auch die Verwendung von zusätzlichen Anti-Kontamination misst31,42. Diese Änderung kann jedoch einige Assay Sensibilität Opfern. Unabhängig von dem Ansatz helfen Erhöhung der Zahl der technischen Wiederholungen durchgeführt unabhängig voneinander auf einer Stichprobe, um vermeidbare Verunreinigung zu identifizieren.
Molekulare Techniken haben weiterhin seit der Einführung des nPCR zu entwickeln, und diese neueren Ansätze bieten ausgewählte Vorteile gegenüber den ursprünglichen Entwürfen, wenn auch an finanziellem Aufwand erhöht. Wie der Name schon sagt, quantitative PCR (qPCR oder Real Time (RT)-PCR) ermöglicht die Aufzählung der Erreger in einer Probe, während konventionelle Techniken qualitativer Natur43. Die Empfindlichkeit der qPCR ähnelt angeblich nPCR38, obwohl es je nach Grundierung Eigenschaften28schwanken kann. Eine Variation der qPCR, das molecular Beacons (MB) anstelle von herkömmlichen TaqMan-Sonden verwendet hat auch Versprechen in den Nachweis von Borrelien in klinischen Proben44,45,46gezeigt. Aufgrund ihrer einzigartigen Sekundärstruktur produzieren molecular Beacons angeblich geringere Hintergrundfluoreszenz und höhere legitime Signale, wodurch höhere Sensitivität47. Prä-klinischen Auswertungen vorschlagen einen möglichen Nachweisgrenze von zwischen einem und zehn Spirochäten44,45. Darüber hinaus wurde die Technik erfolgreich in Multiplex-Reaktionen gleichzeitig erkennen eine Säugetier-Wirt gen44 und andere durch Zecken übertragene Krankheitserreger45, das ist nicht so leicht erreichbar mit nPCR angewendet. Weitere Design-Modifikationen umfassen Tröpfchen digitale PCR (DdPCR)-Technologie, der ohne den Einsatz einer Standardkurve39,48DNA quantifizieren kann. Die untere Nachweisgrenze dieser Technik für Borrelien ist ebenfalls rund zehn Spirochäten/Probe39. Im Vergleich zu nPCR, haben diese Ansätze auch den Vorteil der reduzierten Potenzial für Verschmutzung, da sie nur ein einzelnes Verstärkung Protokoll erfordern.
Das Ziel der Überwachung statt ist, den abwechslungsreichen bakteriellen Inhalt einer Zecke zu profilieren, 16 s rRNA metagenomische Screening eine attraktive Option49. Obwohl dieser Ansatz teurer ist, spezielle DNA-Sequenzer nicht gefunden in allen molekularbiologischen Labors erfordert und anspruchsvollere Bioinformatik-basierte Auslegung erfordert, kann es ein breites Spektrum von Mikroben auf mehr genau erfassen. die Erreger-Last des Vektors zu vertreten.
Während qPCR und seine Derivate Methoden der Wahl für quantitative Anwendungen sind und Metagenomik Bildschirme breite Vorräte von der Zecke Mikrobiom bieten, gezielte Überwachung Bemühungen oft beschäftigen sich mit binären Berichterstattung über das Vorhandensein oder Fehlen von eine oder mehrere Erreger in einem Vektor. Unter solchen Umständen können diese neuere, aufwendigere Ansätze unnötiger Komplexität und finanzielle Belastung in den Prozess einführen. Aus diesen Gründen hat nPCR den Test der Zeit als eine zentrale Technik in Tick Prüfung standgehalten.

Lyme-Borreliose (LD) ist die am weitesten verbreiteten Vektoren übertragene Infektion in der nördlichen Hemisphäre, und die Inzidenz weiter um1zu erhöhen. Diese schwächende Krankheit wird verursacht durch spirocheteal Erreger der Lyme-Borreliose (LB) komplexe (gemeinhin als Borrelia Burgdorferi Sensu Lato oder s.l.), historisch die vorherrschende nordamerikanischen Erreger, B umfasst. Burgdorferi Sensu Stricto (SS), neben B. Afzelii und B. Garinii, die sind in Europa und Asien weit verbreitet, und Arten von neuen klinischen Relevanz2,3. Diese Bakterien sind für den Menschen durch den Biss von infizierten Ixodes Zecken2. übertragen. Obwohl die wichtigsten nordamerikanischen Vektoren I. Scapularis und I. Pacificussind, wurden mehrere Arten innerhalb dieser Gattung zu beherbergen und übertragen das Bakterium4gefunden. Beim Menschen verursachen B. Burgdorferi multisystemischen Symptome, die Auswirkungen auf die Haut, Gelenke, Herz, Nervensystem, endokrinen Drüsen, Magen-Darm-Trakt und inneren Organe5,6,7, 8,9,10. Das Center for Disease Control and Prevention schätzt derzeit mehr als 300.000 neue Fälle pro Jahr in den Vereinigten Staaten11,12. Während die Prognose oft günstig ist, wenn die Krankheit diagnostiziert und in den frühen Stadien behandelt, jedoch haben Studien gezeigt, dass überall zwischen 10 % und 60 % der Patienten, die die empfohlene antibiotische Therapie nach der Therapie Symptome weiterhin erhalten Einstellung, bezeichnet ein Phänomen Post Behandlung Lyme-Borreliose-Syndrom (PTLDS)13,14,15. Darüber hinaus können Verzögerungen in klinische Intervention aus Mangel an Bewusstsein für einen Zeckenstich, unspezifische Präsentation der ursprünglichen Krankheit, und die geringe Sensitivität der traditionellen Serologie-basierte Diagnostik bei Ausbruch der Infektion ergeben. Ausfall, rasch und angemessen zu behandeln kann Symptom Progression, die sich in immer mehr schwächenden Komplikationen16,17manifestieren kann. Lyme-Borreliose Prävention ist daher ein Eckpfeiler des Risiko-Managements. Strategien, um dieser wachsenden Bedrohung zu bekämpfen gehören robuste Überwachungsmaßnahmen um die Prävalenz der Erreger in Zecken anzugeben und geografische Regionen von Interesse zu identifizieren.
Dieser Artikel beschreibt das Dienstprogramm von verschachtelten Polymerase-Kettenreaktion (nPCR) als molekulare Screening-Instrument, um die infizierte Zecken zu identifizieren. Um die Spezifität zu erhöhen, sind zwei Borrelien Gene für parallele Verstärkung benutzt. Flagellin B (FlaB) kodiert ein großen Filament-Protein der Geissel18, und das Gen befindet sich auf der einzigen linearen Chromosom, während das Lipoprotein-Produkt des Outer Surface Protein A (OspA) Tick Mitteldarm vermittelt Kolonialisierung und Plasmid-kodierte19,20. Der Workflow besteht aus Tick Sammlung, DNA-Extraktion und dann eine erste Runde der PCR Borrelienerkennen-spezifische Loci. Anschließende PCR verwendet das Produkt der ersten Reaktion als eine neue Vorlage, um kleinere, interne Verstärkung Fragmente zu generieren. Eine Zecke gilt als positiv für Borrelia Burgdorferi , wenn innere Amplifikate aus beiden Borrelien -Gene durch Agarose-Gelelektrophorese nachgewiesen werden können.
Die nPCR Technik und Fettpölsterchen sowohl die OspA gen Ziele haben für ökologische Überwachung und klinischen Nachweis von Lyme Spirochäten seit den frühen 1990er Jahren21,22,23 weit verbreitet ,24,25. Vor der Entwicklung der molekularen Protokolle wurden Zecken von unterwirft Darminhalt zu beflecken Anti -Borrelia Immunfluoreszenz (IF), mikrobielle Kultur oder eine Kombination davon26bewertet. Diese Ansätze leiden inhärenten Beschränkungen, einschließlich des langsamen Wachstums und anspruchsvolle Art der Borrelien27, Antikörper-Performance-Probleme und das Erfordernis der live Zecken für IF Verarbeitung21. PCR wurde später angenommen, um schnelle, sensitive und spezifische Identifikation von infizierten Vektoren zur Verfügung zu stellen. Es bot deutliche Verbesserungen über die traditionellen Methodik, einschließlich kulturunabhängig direkte Anwendung auf verschiedenen Probenarten wie tot und archivierten Zecken, die sonst nicht geeignet zum Testen von21,22 . Verschachtelte experimentellen Designs weiter verbessert die Spezifität und Sensitivität der klassischen PCR durch den Einsatz von zwei unterschiedliche Sätze von Gen-spezifische Primer in zwei aufeinander folgenden Runden Verstärkung25,28.
Experimentelle Erfolg hängt entscheidend von strategischen gen Auswahl und Amplifikate Design. Um das Vorhandensein von Borrelia Burgdorferigenau abschätzen zu können, sollte Primer die relevanten Erreger erkennen, ohne kreuzreagierende mit Rückfallfieber Spirochäten auch in der Gattung Borrelia . Im Falle von Fettpölsterchenist diese Besonderheit erzielt durch die Ausrichtung auf eine interne Variable Region des Gens, anstatt die relativ erhaltenen flankierenden Sequenzen, die durch verschiedene Bakterien (Abbildung 1)24,29 geteilt werden , 30.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56471/56471fig1.jpg"> Abbildung 1: das Konzept der nPCR, wie abgebildet, mit Borrelien FlaB gen als Ziel. Der 5' und 3' Termini des Gens sind häufig auf Organismen über Borrelia Burgdorferi s.l., rendern diese Regionen ungeeignet für die spezifische Beurteilung der Lyme-verursachenden Erreger. Die weniger konserviert Innenraum Sequenzen als Grundierung Ziele verwenden, werden zwei Runden von PCR ausgeführt, um eine endgültige, interne Amplifikate zu erkennen. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56471/56471fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
In einem Test ihrer diskriminierenden Kapazitäten wurden innen FlaB -Primer mit über 80 verschiedenen Borrelien -Isolate ausgewertet und festgestellt, dass um nur diejenigen, die mit Lyme-Borreliose24verbunden zu ermitteln. Die untere Nachweisgrenze des nPCR wurde dokumentiert auf sechs24 bis zehn31 Bakterien aus Reinkultur, obwohl die Empfindlichkeit durch südliche Beflecken der Amplifikate und Hybridisierung ein möglicher weiter verbessert werden kann oder Chemilumineszenz-Sonde. Kupplung die Techniken reduziert die Nachweisgrenze auf einen einzigen Spirochete31. Durch direkten Vergleich ergab sich konventionelle, unprobed Einzel-Runde PCR, berichten die Präsenz von mindestens 104 Spirochäten31. Es sollte jedoch darauf hingewiesen, dass Assay Empfindlichkeit niedriger sein wird, bei der Arbeit mit komplexen Umwelt- und klinische Proben, durch die überwältigende Präsenz von unabhängigen DNA und mögliche hemmende Stoffe. Diese Herausforderungen können durch den Einsatz von nPCR weitgehend umgangen werden.
Trotz Fortschritten in der molekularen Technologien in den vergangenen Jahrzehnten bleibt nPCR eine Heftklammer Technik in modernen Überwachung Bemühungen. Wenn bei der Konzipierung und Durchführung dieses Protokolls geachtet wird, ist es leistungsfähig, anpassungsfähig und relativ unkompliziert Ansatz, das Vorhandensein von Krankheitserregern im Tick Vektoren zu erfassen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="830">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">LabGard Class II, Type A2 biological safety cabinet</td>
			<td style="width:192px;">Nuaire</td>
			<td style="width:140px;">ES AIR NU-543&#160;</td>
			<td style="width:199px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Razor blades</td>
			<td style="width:192px;">VWR</td>
			<td style="width:140px;">55411-050</td>
			<td>0.22 mm thickness</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Microfuge Tubes (Microtubes 1.5 mL)</td>
			<td style="width:192px;">Axygen</td>
			<td style="width:140px;">311-08-051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">AquaGenomic&#160;</td>
			<td style="width:192px;">MultiTarget Pharmaceuticals</td>
			<td style="width:140px;">2030</td>
			<td>DNA extraction reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Microtube Pestle</td>
			<td style="width:192px;">Diamed</td>
			<td style="width:140px;">DIATEC610-1551</td>
			<td>Designed for 1.5 ml tubes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Water bath - Isotemp 202</td>
			<td style="width:192px;">Fishse Scientific</td>
			<td style="width:140px;">15-462-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Vortex</td>
			<td style="width:192px;">Labnet</td>
			<td style="width:140px;">S0100 CAN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Spectrafuge 24D Digital Microcentrifuge</td>
			<td style="width:192px;">Labnet</td>
			<td style="width:140px;">C2400</td>
			<td style="width:199px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:192px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:140px;">190764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">BIS-TRIS</td>
			<td style="width:192px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:140px;">B9754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Primer Synthesis</td>
			<td style="width:192px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:140px;">OLIGO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">PCR Cabinet</td>
			<td style="width:192px;">Misonix</td>
			<td style="width:140px;">PCR6-482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">PCR tube with attached flat caps 0.2mL</td>
			<td style="width:192px;">VWR</td>
			<td style="width:140px;">20170-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">GoTaq Green Master Mix 2x</td>
			<td style="width:192px;">Promega</td>
			<td style="width:140px;">M7123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Nuclease-free water</td>
			<td style="width:192px;">Promega</td>
			<td style="width:140px;">M7123</td>
			<td>The water comes with the GTG</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Spectrafuge Mini</td>
			<td style="width:192px;">Labnet</td>
			<td style="width:140px;">C1301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">SYBR Safe DNA Stain 10,000X Concentration</td>
			<td style="width:192px;">EDVOTEK</td>
			<td style="width:140px;">608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">Froggarose LE (Molecular Biology Grade Agarose)</td>
			<td style="width:192px;">FroggaBio</td>
			<td style="width:140px;">A87-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">GD 100 bp DNA Ladder</td>
			<td style="width:192px;">FroggaBio</td>
			<td style="width:140px;">DM001-R500&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Electrophoresis power pack&#160;</td>
			<td style="width:192px;">VWR</td>
			<td style="width:140px;">VWR 105</td>
			<td>EC Apparatus Corporation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">Fluor-S MultiImager&#160;</td>
			<td style="width:192px;">BioRad</td>
			<td style="width:140px;">170-7700 (Serial number 433B0154)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:299px;">Quantity One 1-D Analysis Software (V. 4.5.2)</td>
			<td style="width:192px;">BioRad</td>
			<td style="width:140px;">1709600</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detecting the lyme disease spirochete, borrelia burgdorferi, in ticks using nested pcr

Lyme-Borreliose ist eine schwere Vektoren übertragene Infektion, die durch die Borrelia Burgdorferi Sensu Lato Familie der Spirochäten, verursacht wird, die durch den Biss von infizierten Ixodes Zecken auf den Menschen übertragen werden. Der primäre ätiologische Agent in Nordamerika ist Borrelia Burgdorferi Sensu Stricto. Als geografische Risikoregionen zu erweitern, ist es ratsam, robuste Überwachungsprogramme zu unterstützen, die können Tick Infektionsraten zu messen, und Ergebnisse, Ärzte, Tierärzte und der Öffentlichkeit zu kommunizieren. Die molekulare Technik der verschachtelten Polymerase-Kettenreaktion (nPCR) ist seit langem verwendet zu diesem Zweck, und es bleibt eine zentrale, billigen und robusten Ansatz in den Nachweis von Borrelien in Zecken und Wildtiere.
Dieser Artikel demonstriert die Anwendung der nPCR ankreuzen, DNA Extrakte zu infizierten Proben zu identifizieren. Zwei unabhängige B. Burgdorferi zielt, Gene codieren Flagellin B (FlaB) und Outer Surface Protein A (OspA), benutzt worden ausführlich mit dieser Technik. Das Protokoll beinhaltet Tick Sammlung, DNA-Extraktion und dann eine erste Runde der PCR, jeweils zwei Borrelienzu erkennen-spezifische Loci. Nachfolgenden Polymerase-Kettenreaktion (PCR) verwendet das Produkt der ersten Reaktion als eine neue Vorlage, um kleinere, interne Verstärkung Fragmente zu generieren. Die verschachtelte Ansatz verbessert die Spezifität und Sensitivität der konventionellen PCR. Eine Zecke gilt als positiv für den Erreger, wenn innere Amplifikate aus beiden Borrelien -Gene durch Agarose-Gelelektrophorese nachgewiesen werden können.

nPCR ist ein eleganter Ansatz zur Erhöhung der Spezifität und Sensitivität der Erregernachweis, insbesondere bei komplexen Umweltproben untersucht werden. Wie in Abbildung 1dargestellt, können zwei Runden von PCR gezielt eine strategisch wichtige Region der Borrelien FlaB Locus (und OspA, nicht im Bild) das Vorhandensein von Borrelia Burgdorferi -Bakterien durch die Generierung von kurzen inneren melden. Amplifikate. Wenn durch Gelelektrophorese gelöst, können die Fettpölsterchen und OspA Reaktionsprodukte aus jedem Tick visuell erzielte und Kontrollen verglichen. In Abbildung 2Unikat-IDs werden am oberen Rand jedes Gel zur Verfügung gestellt, und keine-Vorlage und Aerosol-Steuerelemente sind vertreten ganz links und rechts, bzw., angrenzend an den Leitern.
Robuste Amplikons Bands sind in ausgewählten experimentellen Proben deutlich sichtbar, und sie sind leicht zu unterscheiden von überschüssigen Primer und restliche DNA (Abbildung 2). Basierend auf den experimentellen Design Grundsätzen, eine Zecke positive Borrelien wenn parallel Negativkontrollen zeigen keine Verstärkung und inneren Amplifikate entstehen von Fettpölsterchen und OspA Primern gilt. In diesem Fall Kriterien Proben T907, T604 und T606 Überwachung für die Lyme-Erreger (Abbildung 2). Steckbrief, T923 war nur positiv für OspA, ein Ergebnis, dafür gibt es mehrere mögliche Erklärungen: A) die Zecke Ursprungs war negativ für Borrelien, aber die äußere oder innere OspA -PCR Zubereitung kontaminiert wurde fälschlicherweise mit Schablone DNA (Anmerkung, die systemische Kontamination von Reagenzien über Negativkontrollen ausgeschlossen wurde), B) das ticken getragene Lyme- Borrelien, aber niedrige Vorlage Beträge oder experimentellen Fehler verhindert Verstärkung der FlaB, oder C) ein Organismus anwesend war Das enthielt die konservierte OspA -Sequenz, aber fehlte Flagellin oder hatte nicht genügend Identität gezielt Fettpölsterchen , um die Zündkapseln Tempern und Umgebung. In der Tat, wurden in einer Vielzahl von Organismen, einschließlich Pflanzen und Tiere28 OspA Sequenz Ähnlichkeiten festgestellt. Die Situation umgekehrt, Verstärkung der mehr konserviert Flagellin -gen, aber nicht das OspA -gen, deutet eine Verwandten Borrelien -Arten. In der Praxis ergibt dieses Protokoll mehr OspA Single-Positive Ergebnisse als die FlaB -Primer, was darauf hindeutet, dass Szenario "A" die wenigsten wahrscheinliche Erklärung ist zu tun. Ohne weitere experimentelle Analyse der strittigen Probe ist jedoch nicht möglich, die Quelle des Single-positives Ergebnis zu bestimmen. Erhöhung der Anzahl der technischen Wiederholungen auf zweideutige Proben durchgeführt, kann helfen, um ihre wahre Stellung zu vereinbaren, da Verunreinigungen, die fälschlicherweise zu früheren Reaktionen eingeführt wurden nicht in die archivierte DNA vorhanden wäre. Wenn nachfolgende Reaktionen mit diesen Primer nicht schlüssige Ergebnisse liefern, konnten andere Borrelien -Loci mittels PCR untersucht werden. Amplifikate generiert aus diesen Reaktionen könnte auch sequenziert und unter Isolate zur Identität zuweisen, und schätzen Sie das Ausmaß der Belastung Divergenz verglichen werden. SAPI und Kollegen bieten ein Beispiel für diesen Workflow mit menschlichen klinischen Proben35.
Alle Faktoren berücksichtigt, die beschriebenen Protokoll und Interpretation Kriterien eingeschätzt wurden, bzw. falsche positive und falsche negative Zinsen von 0,17 % und 0,0063 % Ausbeute.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56471/56471fig2.jpg"> Abbildung 2 : Erkennung von Borrelia burgdorferi in einzelnen Zecken durch nPCR von FlaB und OspA. Codes zugewiesen jedem Tick sind am oberen Rand der Gele vertreten und Identitäten werden vertikal ausgerichtet, um den Nachweis von OspA und FlaB in jeder Probe zu melden. Lanes berechtigt B am linken Rand stellen keine Vorlage Bildsteuerung, während ein (rechten Fahrspuren) Aerosol Steuerelemente, Kontamination der Laborumgebung zu erfassen sind. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56471/56471fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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Detecting the Lyme Disease Spirochete, Borrelia Burgdorferi, in Ticks Using Nested PCR

Nested PCR ist eine sensible, spezifische und einfache Technik, die Zecke kann, die DNA extrahiert angewendet werden, um Borrelia Burgdorferi, dem Erreger der Lyme-Borreliose untersuchen. Das erste PCR-Experiment verwendet gen-spezifische Primer, um lange Amplifikate zu generieren, die dann Vorlagen für eine nachfolgende Reaktion unter Verwendung der internen Zündkapseln werden.

Das Lyme Krankheit Spirochete, Borrelia Burgdorferiin Zecken mit verschachtelten PCR zu erkennen

Lyme disease is a serious vector-borne infection that is caused by the Borrelia burgdorferi sensu lato family of spirochetes, which are transmitted to ...

detecting-lyme-disease-spirochete-borrelia-burgdorferi-ticks-using

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Detecting the Lyme Disease Spirochete, Borrelia Burgdorferi, in Ticks Using Nested PCR

17.8K Aufrufe.  Mount Allison University. Nested PCR ist eine sensible, spezifische und einfache Technik, die Zecke kann, die DNA extrahiert angewendet werden, um Borrelia Burgdorferi, dem Erreger der Lyme-Borreliose untersuchen. Das erste PCR-Experiment verwendet gen-spezifische Primer, um lange Amplifikate zu generieren, die dann Vorlagen für eine nachfolgende Reaktion unter Verwendung der internen Zündkapseln werden.

Serie: Detecting the Lyme Disease Spirochete, Borrelia Burgdorferi, in Ticks Using Nested PCR

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and accuracy of the assay. These primer/probe sets are pre-designed to &gt;98% of the human and mouse genomes and feature significant improvements from previously available technologies. These improvements were made possible by virtue of a novel design algorithm, developed by Thermo Scientific bioinformatics experts.
Several convenient features have been incorporated into the Solaris qPCR Assay to streamline the process of performing quantitative real-time PCR. First, the protocol is similar to commonly employed alternatives, so the methods used during qPCR are likely to be familiar. Second, the master mix is blue, which makes setting the qPCR reactions easier to track. Third, the thermal cycling conditions are the same for all assays (genes), making it possible to run many samples at a time and reducing the potential for error. Finally, the probe and primer sequence information are provided, simplifying the publication process.
Here, we demonstrate how to obtain the appropriate Solaris reagents using the GENEius product search feature found on the ordering web site (www.thermo.com/solaris) and how to use the Solaris reagents for performing qPCR using the standard curve method.

The Solaris qPCR Gene Expression Assays are novel pre-designed qPCR primer/probe combinations designed to simplify the qPCR process without sacrificing the specificity and robustness of the assay.

Quantitative Real-Time PCR unter Verwendung der Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

Forschung

Biologie

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA lesions with respect to survival and preservation of genomic integrity. An early response to the induction of DSBs is phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX1. Following induction of DSBs, H2AX is rapidly phosphorylated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PIKK) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Typically, only a few base-pairs (bp) are implicated in a DSB, however, there is significant signal amplification, given the importance of chromatin modifications in DNA damage signalling and repair. Phosphorylation of H2AX mediated predominantly by ATM spreads to adjacent areas of chromatin, affecting approximately 0.03% of total cellular H2AX per DSB2,3. This corresponds to phosphorylation of approximately 2000 H2AX molecules spanning ~2 Mbp regions of chromatin surrounding the site of the DSB and results in the formation of discrete &gamma;H2AX foci which can be easily visualized and quantitated by immunofluorescence microscopy2. The loss of &gamma;H2AX at DSB reflects repair, however, there is some controversy as to what defines complete repair of DSBs; it has been proposed that rejoining of both strands of DNA is adequate however, it has also been suggested that re-instatement of the original chromatin state of compaction is necessary4-8. The disappearence of &gamma;H2AX involves at least in part, dephosphorylation by phosphatases, phosphatase 2A and phosphatase 4C5,6. Further, removal of &gamma;H2AX by redistribution involving histone exchange with H2A.Z has been implicated7,8. Importantly, the quantitative analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in medical and nuclear research. Here, we demonstrate the most commonly used immunofluorescence method for evaluation of initial DNA damage by detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in &gamma;-irradiated adherent human keratinocytes9.

Quantification of &#947;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of DNA double-strand streaks using &gamma;H2AX formation as a molecular marker has become an invaluable tool in radiation biology. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantification of &gamma;H2AX foci after exposure of cells to radiation.

Die Quantifizierung der γH2AX Foci in Response to ionisierender Strahlung

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer (Agrilus planipennis) Using Quantitative Real Time-PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB continues to spread rapidly and attacks ash trees of different ages, from saplings to mature trees. However, to date very little or no molecular knowledge exists for EAB. We are interested in deciphering the molecular-based physiological processes at the tissue level that aid EAB in successful colonization of ash trees. In this report we show the effective use of quantitative real-time PCR (qRT-PCR) to ascertain mRNA levels in different larval tissues (including midgut, fat bodies and cuticle) and different developmental stages (including 1st-, 2nd-, 3rd-, 4th-instars, prepupae and adults) of EAB. As an example, a peritrophin gene (herein named, AP-PERI1) is exemplified as the gene of interest and a ribosomal protein (AP-RP1) as the internal control. Peritrophins are important components of the peritrophic membrane/matrix (PM), which is the lining of the insect gut. The PM has diverse functions including digestion and mechanical protection to the midgut epithelium.

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer Agrilus planipennis Using Quantitative Real Time-PCR

Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) is an effective tool to diagnose mRNA levels in different insect tissues and developmental stages. In this report we show the use of qRT-PCR to ascertain mRNA levels in different larval tissues and developmental stages of the invasive insect species, emerald ash borer.

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer ( Agrilus planipennis) Mittels quantitativer Real Time-PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB ...

Rapid PCR Thermocycling using Microscale Thermal Convection

Many molecular biology assays depend in some way on the polymerase chain reaction (PCR) to amplify an initially dilute target DNA sample to a detectable concentration level. But the design of conventional PCR thermocycling hardware, predominantly based on massive metal heating blocks whose temperature is regulated by thermoelectric heaters, severely limits the achievable reaction speed1. Considerable electrical power is also required to repeatedly heat and cool the reagent mixture, limiting the ability to deploy these instruments in a portable format.
Thermal convection has emerged as a promising alternative thermocycling approach that has the potential to overcome these limitations2-9. Convective flows are an everyday occurrence in a diverse array of settings ranging from the Earth's atmosphere, oceans, and interior, to decorative and colorful lava lamps. Fluid motion is initiated in the same way in each case: a buoyancy driven instability arises when a confined volume of fluid is subjected to a spatial temperature gradient. These same phenomena offer an attractive way to perform PCR thermocycling. By applying a static temperature gradient across an appropriately designed reactor geometry, a continuous circulatory flow can be established that will repeatedly transport PCR reagents through temperature zones associated with the denaturing, annealing, and extension stages of the reaction (Figure 1). Thermocycling can therefore be actuated in a pseudo-isothermal manner by simply holding two opposing surfaces at fixed temperatures, completely eliminating the need to repeatedly heat and cool the instrument.
One of the main challenges facing design of convective thermocyclers is the need to precisely control the spatial velocity and temperature distributions within the reactor to ensure that the reagents sequentially occupy the correct temperature zones for a sufficient period of time10,11. Here we describe results of our efforts to probe the full 3-D velocity and temperature distributions in microscale convective thermocyclers12. Unexpectedly, we have discovered a subset of complex flow trajectories that are highly favorable for PCR due to a synergistic combination of (1) continuous exchange among flow paths that provides an enhanced opportunity for reagents to sample the full range of optimal temperature profiles, and (2) increased time spent within the extension temperature zone the rate limiting step of PCR. Extremely rapid DNA amplification times (under 10 min) are achievable in reactors designed to generate these flows.

We describe a novel method to perform DNA replication via the polymerase chain reaction (PCR). Thermal convection is harnessed to continuously shuttle reagents between denaturing, annealing, and extension conditions by maintaining opposing surfaces of the reactor at constant temperature. This inherently simple design promises to make rapid PCR more accessible.

Rapid PCR Thermocycling mit Microscale thermische Konvektion

Many molecular biology assays depend in some way on the polymerase chain reaction (PCR) to amplify an initially dilute target DNA sample to a detectable ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway that polypeptide chain follows during co-translational folding to achieve its functional form is still an enigma. In order to understand this process and to determine the exact conformation of the co-translational folding intermediates, it is essential to develop techniques that allow the isolation of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes to allow their further structural analysis.
SecM (secretion monitor) is a 170 amino acid E. coli protein that regulates expression of the downstream SecA (secretion driving) ATPase in the secM-secA operon6. Nakatogawa and Ito originally found that a 17 amino acid long sequence (150-FSTPVWISQAQGIRAGP-166) in the C-terminal region of the SecM protein is sufficient and necessary to cause stalling of SecM elongation at Gly165, thereby producing peptidyl-glycyl-tRNA stably bound to the ribosomal P-site7-9. More importantly, it was found that this 17 amino acid long sequence can be fused to the C-terminus of virtually any full-length and/or truncated protein thus allowing the production of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes7. Thus, when fused or inserted into the target protein, SecM stalling sequence produces arrest of the polypeptide chain elongation and generates stable RNCs both in vivo in E. coli cells and in vitro in a cell-free system. Sucrose gradient centrifugation is further utilized to isolate RNCs.
The isolated RNCs can be used to analyze structural and functional features of the co-translational folding intermediates. Recently, this technique has been successfully used to gain insights into the structure of several ribosome bound nascent chains10,11. Here we describe the isolation of bovine Gamma-B Crystallin RNCs fused to SecM and generated in an in vitro translation system.

We describe here a technique that is now routinely used to isolate stably bound ribosome nascent chain complexes (RNCs). This technique takes advantage of the discovery that a 17 amino acid long SecM "arrest sequence" can halt translation elongation in a prokaryotic (E. coli) system, when inserted into (or fused to the C-terminus) of virtually any protein.

Mit SECM Arrest Sequenz als Werkzeug zum Ribosom gebunden Polypeptide isolieren

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Transposon mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is less time consuming, less costly, and does not require completed genome information, there are two weaknesses in this method: (1) the possibility of a disparate mutants in the mixed mutant library that counter-selects mutants with decreased competition; and (2) the possibility of partial gene inactivation whereby genes do not entirely lose their function following the insertion of a transposon. Single-gene deletion analysis may compensate for the drawbacks associated with transposon mutagenesis. To improve the efficiency of genome-wide single gene deletion, we attempt to establish a high-throughput technique for genome-wide single gene deletion using Streptococcus sanguinis as a model organism. Each gene deletion construct in S. sanguinis genome is designed to comprise 1-kb upstream of the targeted gene, the aphA-3 gene, encoding kanamycin resistance protein, and 1-kb downstream of the targeted gene. Three sets of primers F1/R1, F2/R2, and F3/R3, respectively, are designed and synthesized in a 96-well plate format for PCR-amplifications of those three components of each deletion construct. Primers R1 and F3 contain 25-bp sequences that are complementary to regions of the aphA-3 gene at their 5' end. A large scale PCR amplification of the aphA-3 gene is performed once for creating all single-gene deletion constructs. The promoter of aphA-3 gene is initially excluded to minimize the potential polar effect of kanamycin cassette. To create the gene deletion constructs, high-throughput PCR amplification and purification are performed in a 96-well plate format. A linear recombinant PCR amplicon for each gene deletion will be made up through four PCR reactions using high-fidelity DNA polymerase. The initial exponential growth phase of S. sanguinis cultured in Todd Hewitt broth supplemented with 2.5% inactivated horse serum is used to increase competence for the transformation of PCR-recombinant constructs. Under this condition, up to 20% of S. sanguinis cells can be transformed using ~50 ng of DNA. Based on this approach, 2,048 mutants with single-gene deletion were ultimately obtained from the 2,270 genes in S. sanguinis excluding four gene ORFs contained entirely within other ORFs in S. sanguinis SK36 and 218 potential essential genes. The technique on creating gene deletion constructs is high throughput and could be easy to use in genome-wide single gene deletions for any transformable bacteria.

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

An efficient genome-wide single gene mutation method has been established using Streptococcus sanguinis as a model organism. This method has achieved via high throughput recombinant PCRs and transformations.

Genomweiten Gen-Deletionen in<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Von High Throughput PCR

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

Here, we present methods for the development of assays to query potentially clinically significant nonsynonymous changes using in vivo complementation in zebrafish. Zebrafish (Danio rerio) are a useful animal system due to their experimental tractability; embryos are transparent to enable facile viewing, undergo rapid development ex vivo, and can be genetically manipulated.1 These aspects have allowed for significant advances in the analysis of embryogenesis, molecular processes, and morphogenetic signaling. Taken together, the advantages of this vertebrate model make zebrafish highly amenable to modeling the developmental defects in pediatric disease, and in some cases, adult-onset disorders. Because the zebrafish genome is highly conserved with that of humans (~70% orthologous), it is possible to recapitulate human disease states in zebrafish. This is accomplished either through the injection of mutant human mRNA to induce dominant negative or gain of function alleles, or utilization of morpholino (MO) antisense oligonucleotides to suppress genes to mimic loss of function variants. Through complementation of MO-induced phenotypes with capped human mRNA, our approach enables the interpretation of the deleterious effect of mutations on human protein sequence based on the ability of mutant mRNA to rescue a measurable, physiologically relevant phenotype. Modeling of the human disease alleles occurs through microinjection of zebrafish embryos with MO and/or human mRNA at the 1-4 cell stage, and phenotyping up to seven days post fertilization (dpf). This general strategy can be extended to a wide range of disease phenotypes, as demonstrated in the following protocol. We present our established models for morphogenetic signaling, craniofacial, cardiac, vascular integrity, renal function, and skeletal muscle disorder phenotypes, as well as others.

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

Here, we present a systematic approach for developing physiologically relevant, sensitive and specific in vivo assays for interpreting variation in human pathology. Transient genetic manipulation via microinjection of WT and mutant human mRNA and morpholino (MO) antisense oligonucleotides harness the tractability of the developing zebrafish embryo to rapidly assay pathogenic mutations, especially, but not exclusively, in the context of human developmental disorders.

In Vivo Modellierung des Morbid Human Genome mit Danio rerio

Here,  we present methods for the development of assays to query potentially clinically  significant nonsynonymous changes using in  vivo complementation ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic tools have been introduced, including multiple strategies for inducing mutations and generating transgenic lines. However, large-scale screening is limited by traditional genotyping methods, which are time-consuming and labor-intensive. Here we describe a technique to analyze zebrafish genotypes by PCR combined with high-resolution melting analysis (HRMA).&#160;This approach is rapid, sensitive, and inexpensive, with lower risk of contamination artifacts.&#160;Genotyping by PCR with HRMA can be used for embryos or adult fish, including in high-throughput screening protocols.

PCR combined with high-resolution melt analysis (HRMA) is demonstrated as a rapid and efficient method to genotype zebrafish.

Schnelle und effiziente Verwendung von Zebrafisch-Genotypisierung PCR mit Hochauflösende Schmelzanalyse

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different lineages. A single cell transcriptome assay can be a new approach for dissecting individual variation. We have developed the single cell qRT-PCR method, and confirmed that this method works well in several gene expression profiles. In single cell level, each human embryonic stem cell, sorted by OCT4::EGFP positive cells, has high expression in OCT4, but a different level of NANOG expression. Our single cell gene expression assay should be useful to interrogate population heterogeneities.

Single cell gene expression assay is needed for understanding stem cell heterogeneities.

Profiling Individuelle humanen embryonalen Stammzellen durch quantitative RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

Detecting Estrogenic Ligands in Personal Care Products using a Yeast Estrogen Screen Optimized for the Undergraduate Teaching Laboratory

The Yeast Estrogen Screen (YES) is used to detect estrogenic ligands in environmental samples and has been broadly applied in studies of endocrine disruption. Estrogenic ligands include both natural and manmade &#34;Environmental Estrogens&#34; (EEs) found in many consumer goods including Personal Care Products (PCPs), plastics, pesticides, and foods. EEs disrupt hormone signaling in humans and other animals, potentially reducing fertility and increasing disease risk. Despite the importance of EEs and other Endocrine Disrupting Chemicals (EDCs) to public health, endocrine disruption is not typically included in undergraduate curricula. This shortcoming is partly due to a lack of relevant laboratory activities that illustrate the principles involved while also being accessible to undergraduate students. This article presents an optimized YES for quantifying ligands in personal care products that bind estrogen receptors alpha (ER&#945;) and/or beta (ER&#946;). The method incorporates one of the two colorimetric substrates (ortho-nitrophenyl-&#946;-D-galactopyranoside (ONPG) or chlorophenol red-&#946;-D-galactopyranoside (CPRG)) that are cleaved by &#946;-galactosidase, a 6-day refrigerated incubation step to facilitate use in undergraduate laboratory courses, an automated application for LacZ calculations, and R code for the associated 4-parameter logistic regression analysis. The protocol has been designed to allow undergraduate students to develop and conduct experiments in which they screen products of their choosing for estrogen mimics. In the process, they learn about endocrine disruption, cell culture, receptor binding, enzyme activity, genetic engineering, statistics, and experimental design. Simultaneously, they also practice fundamental and broadly applicable laboratory skills, such as: calculating concentrations; making solutions; demonstrating sterile technique; serially diluting standards; constructing and interpolating standard curves; identifying variables and controls; collecting, organizing, and analyzing data; constructing and interpreting graphs; and using common laboratory equipment such as micropipettors and spectrophotometers. Thus, implementing this assay encourages students to engage in inquiry-based learning while exploring emerging issues in environmental science and health.

This article presents an optimized yeast estrogen screen for quantifying ligands in Personal Care Products (PCPs) that bind estrogen receptors alpha (ER&#945;) and/or beta (ER&#946;). The method incorporates two colorimetric substrate options, a six-day refrigerated incubation for use in undergraduate courses, and statistical tools for data analysis.