Gli autori desiderano ringraziare Kami Harris per disegno dell'iniettore, Ashley McKibbon e Jessica Thomas-Ebbett per le riprese e John Blakely, Alexandra Foley-Eby, Chris Langley, Julie Lewis, Kelsey McIntyre, Ashley McKibbon, Chris Zinck e Rosie il cane per essere apparso nella video. A. M. K. è stata sostenuta dalla Fondazione canadese per la ricerca malattia di Lyme, e finanziamento del progetto è stato fornito dalle scienze naturali e ingegneria ricerca Consiglio del Canada (NSERC). M. K. B. W. ha ricevuto un finanziamento di stipendio da New Brunswick Innovation Foundation (NBIF).

1. DNA isolamento da zecche
<ol><li>Acquisire le zecche via campo insieme o sorveglianza passiva da veterinari e membri del pubblico. Zecche dovrebbero essere ucciso da congelamento, inserite in un sacchetto sigillato e spedite a temperatura ambiente.<ol>
<li>Utilizzando un modulo di presentazione, raccogliere informazioni sulla data e la posizione geografica dell'incontro, lo stato di attaccamento tick, specie ospite e storia recente viaggio dell'host.</li>
		<li>Poiché la PCR annidata è intrinsecamente vulnerabile alla contaminazione, assicurarsi che l'area di lavoro di laboratorio è impostato per minimizzare la croce-esposizione dei campioni. Ciò comporta l'esecuzione di diversi elementi del protocollo in spazi separati, dedicati ben isolati da altro sono accuratamente puliti e sterilizzati, e garantire che tutti gli strumenti sono prive di sostanze contaminanti.</li>
		<li>Dopo aver ricevuto l'esemplare, fotografare il segno di spunta e determinare la specie, Stadio di sviluppo, sesso e stato di congestione in confronto a un'identificazione chiave32 .</li>
		<li>In condizioni asettiche, bisecare il segno di spunta utilizzando una lama di rasoio sterile o bisturi e inserire i frammenti di due segni di graduazione in microcentrifuga separato.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Per estrarre il DNA totale, utilizzare qualsiasi procedura di isolamento che produce il modello di PCR-compatibile; Questo protocollo viene illustrato un semplice approccio basato su chelazione.<ol>
<li>Inizia aggiungendo un volume adeguato (spesso tra 50-200 µ l) di un reagente litico chelazione per il frammento di segni di graduazione. L'importo specifico dipenderà molto lo stato di dimensione e ingorgo esemplare; linee guida dovrebbero essere fornite dal produttore. Omogeneizzare con un pestello di Conetti.</li>
		<li>Incubare i campioni in un bagno di acqua a 60 ° C per 45 min e vortexare brevemente.</li>
		<li>Centrifugare i campioni per 4 min a 16.276 x g (13.300 giri/min) in una microcentrifuga desktop.</li>
		<li>Trasferire il surnatante in una fresca, con etichetta microprovetta contenente 50 µ l isopropanolo, mix di inversione e ri-Centrifugare come in (1.2.3).</li>
		<li>Decantare il supernatante e sciacquare la pallina di DNA con 50 µ l di etanolo al 70%.</li>
		<li>Eliminare l'etanolo in eccesso con una pipetta e lasciar asciugare all'aria per 15 min a temperatura ambiente il pellet.</li>
		<li>Risospendere il DNA, aggiungere 50 µ l di 1 mM a Tris pH 7.0 e incubare i campioni in un bagno di acqua per 1 h a 60 ° C. Ora, il DNA può essere conservato a-20 ° C per future analisi molecolari.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. nested PCR Detection di OspA Borrelia e ciccia.
Nota: Una panoramica dei generali principi PCR e pratiche è fornita da Lorenz, 201233.
<ol><li>Sintetizzare o ottenere iniettori del oligonucleotide di interni ed esterni di gene-specifico di Borrelia . Vedere la tabella 1 per set di primer, loro rispettivi amplicone dimensioni e temperature di fusione.</li>
</ol><table border="1"><tbody>
<tr>
<td>Nome di primer</td>
			<td>Gene bersaglio</td>
			<td colspan="2">Sequenza (5' - 3')</td>
			<td>Dimensione del amplicon</td>
			<td>Temperatura di annealing</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ciccia su Fw</td>
			<td>Ciccia</td>
			<td colspan="2">gcatcactttcagggtctca</td>
			<td rowspan="2">503 bp</td>
			<td rowspan="2">55° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ciccia su Rv</td>
			<td>Ciccia</td>
			<td colspan="2">tggggaacttgattagcctg</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ciccia nel Fw</td>
			<td>Ciccia</td>
			<td colspan="2">ctttaagagttcatgttggag</td>
			<td rowspan="2">447 bp</td>
			<td rowspan="2">58° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ciccia In Rv</td>
			<td>Ciccia</td>
			<td colspan="2">tcattgccattgcagattgt</td>
		</tr>
<tr>
<td>OspA Out Fw</td>
			<td>OspA</td>
			<td colspan="2">cttgaagttttcaaagaagat</td>
			<td rowspan="2">487 bp</td>
			<td rowspan="2">55° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>OspA Out Rv</td>
			<td>OspA</td>
			<td colspan="2">caactgctgacccctctaat</td>
		</tr>
<tr>
<td>OspA nel Fw</td>
			<td>OspA</td>
			<td colspan="2">acaagagcagacggaaccag</td>
			<td rowspan="2">350 bp</td>
			<td rowspan="2">58° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>OspA In Rv</td>
			<td>OspA</td>
			<td colspan="2">ttggtgccatttgagtcgta</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: Primer interno ed esterno per nPCR di Borrelia burgdorferiFlaB e OspA. In pratica, i primer di ciccia rilevare B. burgdorferi s.s. e altri strettamente correlati Borrelia genospecies, mentre gli iniettori OspA catturano solo b. burgdorferi s.s. amplificazione da entrambi loci indicherebbe B. burgdorferi. s.s.
<ol start="2"><li>Pre-sterilizzare un armadietto PCR con UV luce e 70% di etanolo. Nota: Per minimizzare la potenziale contaminazione del campione, questa area di lavoro deve essere distinta dalla posizione della dissezione di tick, estrazione del DNA ed elettroforesi del gel.<ol>
<li>Per l'esecuzione iniziale di PCR, è possibile utilizzare il primer esterno in combinazione con il modello DNA recuperato nel passaggio 1.0 sopra e impostata la miscela di reazione, come descritto nella tabella 2. In parallelo, eseguire positivo controllo esegue composto verificato Borrelia DNA e controllo negativo esegue incluse reazioni no-modello per rilevare la contaminazione del reagente e aerosol. Aggiungere del DNA al fine di minimizzare la potenziale contaminazione dei reagenti. Garantire che ogni tubo è chiuso a tutti i tempi quando i reagenti non vengono aggiunti e chiudere tubi immediatamente dopo l'aggiunta di DNA e prima di altri tubi sono aperti.</li>
		<li>Programma un termociclatore come segue: 95 ° C per 5 min; 40 cicli di 95 ° C per 15 s, ricottura temperatura per 30 s, 72 ° C per 45 s; 72 ° C per 5 min; e tenere a 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eseguire il secondo round della PCR simile alla prima reazione, tranne usare primer interno con 2 µ l del primo prodotto PCR (prodotto in 2.2.2). Nota: Volumi di reazione sono nuovamente disponibili in tabella 2. Deve prestare attenzione per evitare la contaminazione incrociata degli ampliconi assicurando che il DNA del modello viene aggiunto ultima e che soli tubi corrispondenti a un campione siano aperte alla volta. 
	 
	<table border="1"><tbody>
<tr>
<td>Componente</td>
				<td>Volumi PCR # 1</td>
				<td>PCR # 2 volumi</td>
			</tr>
<tr>
<td>Taq polimerasi Master Mix 2 X</td>
				<td>12,5 Μ l</td>
				<td>12,5 Μ l</td>
			</tr>
<tr>
<td>Nuclease-free Water</td>
				<td>Μ l 8.5</td>
				<td>Μ l 8.5</td>
			</tr>
<tr>
<td>10 µM primer forward e Reverse</td>
				<td>1,0 µ l primer esterno</td>
				<td>1,0 µ l primer interno</td>
			</tr>
<tr>
<td>Modello di DNA</td>
				<td>µ L 2.0, dall'estrazione del campione (1.2.7)</td>
				<td>µ L 2.0, dal 1 ° giro della PCR (2.2.2)</td>
			</tr>
</tbody></table>
Tabella 2: Miscele di reazione di PCR per amplificazioni di primi e secondo. 
	 
	<ol>
<li>Programmare il termociclatore come prima, ma regolare la temperatura di ricottura per ospitare i primer interni (Vedi tabella 1).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Imaging ed elettroforesi su Gel di agarosio al
Nota: Per le istruzioni di base sulla separazione del DNA tramite l'elettroforesi, vedere Lee et al., 201234.
<ol><li>Preparare un gel di agarosio all'1.2% utilizzando 20 X SB buffer (0.2 M NaOH, 0,8 M acido borico pH 8), diluito a 1 X e aggiungere circa 5 µ l di una macchia di DNA, prima di versare, se pre-macchiatura del gel è desiderata.</li>
	<li>Caricare 10 µ l del prodotto dalla seconda reazione di PCR (interno) da ogni sperimentale e campione di controllo, insieme a una scala di 100 bp (5 µ l).<ol>
<li>Elettroforesi per 1 h a 107 V (5 v/cm).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Visualizzare e documentare il gel utilizzando un transilluminatore e telecamera associata e software.</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

In decenni di uso, tecniche basate sulla PCR hanno costantemente dimostrato il loro valore nella rilevazione di Borrelia da esemplari di mammiferi e artropodi, se Borrelia provengono da origini ambientali o clinici. PCR offre numerosi miglioramenti rispetto pre-esistenti approcci alla sorveglianza. In particolare, esso non si basa sullo sviluppo e le prestazioni dei reagenti dell'anticorpo e invece può essere facilmente adattato per rilevare nuovi target di interesse semplicemente modificando le sequenze dell'iniettore. PCR può ospitare anche la valutazione dei luoghi multipli in parallelo, in modo indipendente o tramite una reazione multiplex. Può essere applicato agli ingressi dei campioni diversi, tra cui zecche fresco e archiviati22, animale o umani fluidi corporei e tessuto resecato25. PCR produce anche ampliconi che possono essere ulteriormente elaborati, per esempio di digestione degli enzimi di restrizione, ibridazione della sonda o sequenziamento, di fornire una maggiore comprensione nella identità microbica21.
Come strumento clinico, PCR è concettualmente preferibile la diagnostica sierologica standard, in quanto fornisce un'indicazione diretta della presenza batterica, piuttosto che fare affidamento sulla risposta immunitaria ospite come misura secondaria di infezione. Tuttavia, la borreliosi di Lyme è associata con un relativamente modesto onere microbico (< 50 organismi/mL di urina o plasma) e spirochetemia transitoria, che può dar luogo a falsi negativi risultati25. La sensibilità di questa tecnica nella clinica varia considerevolmente a seconda del tipo di tessuto, fase dell'infezione e la condizione di campione, che cade tra il 12,5% e il 62% negli studi esistenti di sangue, liquido cerebrospinale e tessuto biopsiato36. Limitazioni di sensibilità molecolari non sono una preoccupazione se PCR è intrapresa a seguito di coltura batterica, tuttavia il recupero della spirocheta praticabile da campioni clinici ha dimostrato allo stesso modo stimolante. Solo recentemente i protocolli sono stati ottimizzati per maggiore resa35. Nel frattempo, l'intestino di una zecca infetta adulta può harbor mediamente ovunque da 2.000 a oltre 50.000 Borrelia37,38,39, che è solidamente all'interno della gamma di rilevazione di nPCR. Così, il protocollo è adatto agli sforzi di sorveglianza di segni di graduazione.
Nonostante i suoi molti vantaggi, nPCR pongono alcune sfide e la capacità di questa tecnica di segnalare con precisione infezione tick dipende quindi dalla scelta strategica di geni e sequenze amplificate, meticolose dei flussi di lavoro sperimentale che recuperare DNA di qualità da campioni, riducendo al minimo la croce-esposizione dei campioni e l'uso di adeguati controlli che può segnalare contaminanti nell'ambiente di laboratorio e reagenti. Prima di qualsiasi sperimentazione, l'ambito e le intenzioni dell'indagine opportuno definire chiaramente affinché appropriati loci genetici e regioni ivi, possono essere selezionati. Se l'obiettivo è quello di fornire uno schermo imparziale per la causa di Lyme Borrelia burgdorferi s.l. complessi, primer deve essere creato per rilevare tutti i ceppi associati con simile affinità ed efficienza di amplificazione, senza catturare indipendente organismi25. Nuovi primer può essere progettato e valutato in silico utilizzando strumenti software come Primer-BLAST40, anche se dovrebbe anche essere validati sperimentalmente contro standard di riferimento isola prima di essere applicate ai campioni atipici. L'obiettivo della procedura di estrazione del DNA è di recuperare modello microbica intatto da un campione ambientale misto (tick omogeneato). Un passaggio facoltativo prima di procedere con la PCR è di valutare l'integrità del DNA estratto. Inoltre, reazioni in parallelo potrebbero essere impostare come destinazione un gene housekeeping nel segno di spunta. Quest'ultimo metodo può anche indicare la presenza di inibitori nella miscela di reazione, fornendo una maggiore fiducia che le reazioni negative di Borrelia sono a causa dell'assenza dell'organismo e non alla presenza di un contaminante inibitorio.
La sensibilità aumentata dell'approccio PCR annidata a scapito di potenziale contaminazione che genera risultati falsi-positivi. Modello esogeno potrebbe essere introdotto in un campione durante la dissezione di segni di graduazione ed il recupero di DNA, o nel processo di creazione le reazioni di amplificazione esterna e interna. Pertanto è particolarmente importante seguire protocolli di pratica migliore per PCR evitare modello o amplicon contaminazione incrociata. Questi includono l'uso di stazioni di lavoro separata con flussi d'aria indipendente, contenimento in PCR e armadietti di sicurezza biologici eventualmente approfondita chimico e fisico pulizia e sterilizzazione delle superfici e dei reagenti e gestione prudente del DNA 41. No-modello controlli sono inoltre vitali nell'identificare la contaminazione dei reagenti stock. Una particolare vulnerabilità del nPCR è l'amplicone movimentazione che si verifica quando si trasferiscono i prodotti della reazione prima nel secondo recipiente di PCR. Poiché il DNA dell'obiettivo ha già subito l'arricchimento esponenziale in campioni positivi, questo passaggio è particolarmente soggetto a contaminazioni e un tubo singolo nPCR protocollo è stato sviluppato per aggirare questa limitazione. In questo approccio, entrambi i set di primer per un dato gene vengono aggiunti insieme ad un tubo di reazione che rimane sigillato per entrambi i turni di PCR31. Le coppie di primer esterno e quello interno devono essere termodinamicamente distinte, tale che la coppia esterna amplifica modello ad alta temperatura ricottura che è proibitiva per i primers interni. Nel secondo turno, si abbassa la temperatura di ricottura per ospitare l'accoppiamento interno. Non solo fa questo ignorare un passaggio potenzialmente di confusione, permette inoltre l'utilizzo di ulteriori misure anti-contaminazione31,42. Tuttavia, questa modifica può sacrificare alcune sensibilità. Indipendentemente dall'approccio, aumentando il numero delle ripetizioni tecniche eseguita in modo indipendente su un campione vi aiuterà a identificare spurie contaminazioni.
Tecniche molecolari hanno continuato ad evolversi dall'introduzione del nPCR, e questi approcci più recenti offrono vantaggi selezionare sopra i disegni originali, seppur a aumentato degli oneri finanziari. Come suggerisce il nome, PCR quantitativa (qPCR o real time (RT)-PCR) consente l'enumerazione dei patogeni in un campione, mentre le tecniche convenzionali sono di natura43qualitative. La sensibilità di qPCR è piuttosto simile a quella del nPCR38, anche se esso può oscillare a seconda del primer caratteristiche28. Una variazione di qPCR che utilizza molecular beacon (MB) al posto di sonde TaqMan tradizionali inoltre ha indicato la promessa nella rilevazione di Borrelia in campioni clinici44,45,46. Grazie alla loro struttura secondaria unica, molecular beacon riferito produrre fluorescenza di fondo inferiore e superiori segnali legittimi, fornendo in tal modo una sensibilità superiore47. Valutazioni pre-cliniche suggeriscono una potenziale soglia di rilevamento della tra uno e dieci le spirochete44,45. Inoltre, la tecnica è stata applicata correttamente in multiplex reazioni per rilevare contemporaneamente un mammifero ospite gene44 e altri agenti patogeni da zecche45, che non è così facilmente realizzabile con nPCR. Altre modifiche di progettazione includono gocciolina digitale tecnologia PCR (ddPCR), che può quantificare il DNA senza l'uso di una curva standard39,48. Il limite inferiore di rilevamento di questa tecnica per Borrelia è similarmente circa dieci spirocheta/campione39. Rispetto a nPCR, questi approcci hanno anche il vantaggio del ridotto potenziale per contaminazione, dato che richiedono solo un protocollo di amplificazione singola.
Se l'obiettivo della sorveglianza è invece per analizzare il contenuto batterico variato di un tick, 16S rRNA metagenomica screening è un' opzione attraente49. Sebbene questo approccio è più costoso, richiede specializzati Sequenziatori di DNA non trovati in tutti i laboratori di biologia molecolare e richiede più sofisticati basati su bioinformatica interpretazione, può catturare un vasto spettro di microbi più accuratamente rappresentano il carico agente patogeno del vettore.
Mentre qPCR e suoi derivati sono metodi di scelta per le applicazioni quantitative e metagenomica schermate forniscono ampi inventari del microbioma tick, sforzi di sorveglianza mirata sono spesso interessati con binario di segnalazione della presenza o dell'assenza di uno o più agenti patogeni in un vettore. In tali circostanze, questi approcci più recenti, più elaborati possono introdurre inutili complessità e onere finanziario nel processo. Per questi motivi, nPCR ha resistito alla prova del tempo come una tecnica fondamentale in graduazione del test.

Malattia di Lyme (LD) è l'infezione di vettore-sopportata più diffusa nell'emisfero settentrionale, e la sua incidenza continua ad aumentare di1. Questa malattia debilitante è causata da agenti patogeni spirocheteal della borreliosi di Lyme (LB) complesso (comunemente come lato di sensu di burgdorferi di Borrelia , o s.l.), che comprende storicamente predominante patogeno nordamericano, B. burgdorferi sensu stricto (s.s.), oltre a b. afzelii e b. garinii, che sono diffuse in tutta Europa e Asia e sono specie della emergente rilevanza clinica2,3. Questi batteri vengono trasmessi all'uomo attraverso il morso di infetti Ixodes battiti2. Anche se i principali vettori nordamericani sono scapularis I. e I. pacificus, specie multiple all'interno di questo genere sono stati trovati per harbor e trasmettere il batterio4. In esseri umani, b. burgdorferi può causare sintomi di sistema multiplo che interessa la pelle, articolazioni, cuore, sistema nervoso, ghiandole endocrine, tratto gastrointestinale e organi interni5,6,7, 8,9,10. Il Center for Disease Control and Prevention stima attualmente oltre 300.000 nuovi casi umani annualmente negli Stati Uniti11,12. Mentre la prognosi è spesso favorevole quando la malattia è diagnosticata e trattata nelle fasi iniziali, gli studi hanno suggerito che ovunque tra 10% e il 60% dei pazienti che hanno ricevuto i dosaggi raccomandati di antibiotico ha continuato ad avvertire i sintomi dopo la terapia cessazione, in un fenomeno definito Post trattamento malattia di Lyme sindrome (PTLDS)13,14,15. Inoltre, possono verificarsi ritardi nell'intervento clinico a causa della mancanza di consapevolezza di un morso del battito, la presentazione non specifica della malattia iniziale e la bassa sensibilità della tradizionale basato su sierologia diagnostica quando utilizzato all'inizio dell'infezione. Fallimento per trattare rapidamente e in modo appropriato consente la progressione di sintomo che può manifestarsi in sempre più debilitanti complicazioni16,17. Prevenzione della malattia di Lyme è pertanto un elemento fondamentale della gestione del rischio. Strategie per combattere questa minaccia crescente includono misure di sorveglianza robusto per indicare la prevalenza del patogeno in segni di graduazione e identificano regioni geografiche di preoccupazione.
Questo articolo dimostra l'utilità della reazione a catena annidata della polimerasi (nPCR) come strumento di screening molecolare da cui identificare zecche infette. Per aumentare la specificità, due geni di Borrelia sono utilizzati per l'amplificazione parallelo. B flagellina (ciccia) codifica per una proteina del filamento principale del flagello18, e il gene è localizzato sul cromosoma lineare singolo, mentre il prodotto della lipoproteina di proteina di superficie esterno A (OspA) media del midgut tick colonizzazione, è codificato in plasmide19,20. Il flusso di lavoro è costituito da tick raccolta, estrazione del DNA e poi un giro iniziale di PCR per rilevare Borrelia-loci specifici. PCR successive utilizza il prodotto della prima reazione come un nuovo modello per generare frammenti di amplificazione interna, più piccola. Un segno di spunta viene considerato positivo per Borrelia burgdorferi quando interna ampliconi di entrambi i geni Borrelia possono essere rilevato tramite l'elettroforesi del gel dell'agarosi.
Sia la tecnica nPCR e la ciccia e OspA geni bersaglio, è stati ampiamente usati per sorveglianza ecologica e rilevazione clinica dello spirochete Lyme dal primi anni 199021,22,23 ,24,25. Prima dello sviluppo di protocolli molecolari, le zecche sono state valutate sottoponendo la gut contenuto anti -Borrelia colorazione di immunofluorescenza (IF), coltura microbica o una loro combinazione26. Questi approcci soffrono di limitazioni inerenti, compreso la crescita lenta e la natura fastidiosa di Borrelia27, problemi di prestazioni dell'anticorpo e il requisito di segni di graduazione diretta per se elaborazione21. PCR è stata successivamente adottata per fornire l'identificazione veloce, sensibile e specifica di vettori infetti. Ha offerto miglioramenti notevoli sopra la metodologia tradizionale, compresa la coltura-indipendente diretta applicazione per tipi di campioni diversi, quali zecche morte e archiviati che altrimenti sarebbero inadatti per il test21,22 . Disegni sperimentali nidificati ulteriormente migliorano la specificità e la sensibilità della PCR classica impiegando due insiemi distinti di iniettori di gene-specific in due turni consecutivi di amplificazione25,28.
Sperimentale successo dipende criticamente dalla design di selezione e amplicon di gene strategico. Per stimare con precisione la presenza di Borrelia burgdorferi, primer dovrebbe rilevare gli agenti patogeni rilevanti senza grado di reagire con la spirocheta di febbre di ricaduta anche nel genere Borrelia . Nel caso di ciccia, questa specificità è ottenuta prendendo di mira una regione interna variabile del gene, piuttosto che le sequenze fiancheggianti relativamente conservate che sono condivisi da diversi batteri (Figura 1)24,29 , 30.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56471/56471fig1.jpg"> Figura 1: il concetto di nPCR, come illustrato utilizzando Borrelia ciccia gene come bersaglio. Stazione termini 5' e 3' del gene sono comuni per gli organismi di là di Borrelia burgdorferi s.l., rendering di queste regioni non idonei per la valutazione specifica degli agenti patogeni che causano Lyme. Utilizzando le sequenze interne conservati meno di target primer, due cicli di PCR vengono eseguiti per rilevare un amplicone finale, interno. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56471/56471fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
In una prova della loro capacità discriminatoria, interni FlaB primer sono stati valutati con più di 80 diversi isolati di Borrelia e trovato per identificare solo quelli associati con la malattia di Lyme24. Il limite inferiore di rilevamento del nPCR è stato documentato presso tra sei24 e dieci31 batteri da coltura pura, anche se la sensibilità può essere ulteriormente migliorata mediante Southern blotting amplicon e ibridando un radiomarcato o sonda a chemiluminescenza. Le tecniche di accoppiamento riduce la soglia di rilevamento a un singolo spirochete31. Tramite il confronto diretto, PCR con un unico arrotondamento convenzionale, inesplorata è stato trovato per segnalare la presenza di un minimo di 104 spirocheta31. Dovrebbe essere notato, tuttavia, che la sensibilità del test sarà inferiore quando si lavora con campioni ambientali e clinici complessi, a causa della presenza schiacciante di DNA estraneo e potenziali sostanze inibitorie. Queste sfide possono essere aggirate in gran parte dall'utilizzo di nPCR.
Malgrado gli avanzamenti nelle tecnologie molecolari negli ultimi decenni, nPCR rimane una tecnica fiocco in sforzi di sorveglianza moderna. Se la cura nella progettazione e nell'esecuzione del presente protocollo, è un approccio relativamente semplice, potente e adattabile per catturare la presenza di agenti patogeni in vettori di graduazione.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="830">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">LabGard Class II, Type A2 biological safety cabinet</td>
			<td style="width:192px;">Nuaire</td>
			<td style="width:140px;">ES AIR NU-543&#160;</td>
			<td style="width:199px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Razor blades</td>
			<td style="width:192px;">VWR</td>
			<td style="width:140px;">55411-050</td>
			<td>0.22 mm thickness</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Microfuge Tubes (Microtubes 1.5 mL)</td>
			<td style="width:192px;">Axygen</td>
			<td style="width:140px;">311-08-051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">AquaGenomic&#160;</td>
			<td style="width:192px;">MultiTarget Pharmaceuticals</td>
			<td style="width:140px;">2030</td>
			<td>DNA extraction reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Microtube Pestle</td>
			<td style="width:192px;">Diamed</td>
			<td style="width:140px;">DIATEC610-1551</td>
			<td>Designed for 1.5 ml tubes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Water bath - Isotemp 202</td>
			<td style="width:192px;">Fishse Scientific</td>
			<td style="width:140px;">15-462-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Vortex</td>
			<td style="width:192px;">Labnet</td>
			<td style="width:140px;">S0100 CAN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Spectrafuge 24D Digital Microcentrifuge</td>
			<td style="width:192px;">Labnet</td>
			<td style="width:140px;">C2400</td>
			<td style="width:199px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:192px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:140px;">190764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">BIS-TRIS</td>
			<td style="width:192px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:140px;">B9754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Primer Synthesis</td>
			<td style="width:192px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:140px;">OLIGO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">PCR Cabinet</td>
			<td style="width:192px;">Misonix</td>
			<td style="width:140px;">PCR6-482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">PCR tube with attached flat caps 0.2mL</td>
			<td style="width:192px;">VWR</td>
			<td style="width:140px;">20170-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">GoTaq Green Master Mix 2x</td>
			<td style="width:192px;">Promega</td>
			<td style="width:140px;">M7123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Nuclease-free water</td>
			<td style="width:192px;">Promega</td>
			<td style="width:140px;">M7123</td>
			<td>The water comes with the GTG</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Spectrafuge Mini</td>
			<td style="width:192px;">Labnet</td>
			<td style="width:140px;">C1301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">SYBR Safe DNA Stain 10,000X Concentration</td>
			<td style="width:192px;">EDVOTEK</td>
			<td style="width:140px;">608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">Froggarose LE (Molecular Biology Grade Agarose)</td>
			<td style="width:192px;">FroggaBio</td>
			<td style="width:140px;">A87-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">GD 100 bp DNA Ladder</td>
			<td style="width:192px;">FroggaBio</td>
			<td style="width:140px;">DM001-R500&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Electrophoresis power pack&#160;</td>
			<td style="width:192px;">VWR</td>
			<td style="width:140px;">VWR 105</td>
			<td>EC Apparatus Corporation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">Fluor-S MultiImager&#160;</td>
			<td style="width:192px;">BioRad</td>
			<td style="width:140px;">170-7700 (Serial number 433B0154)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:299px;">Quantity One 1-D Analysis Software (V. 4.5.2)</td>
			<td style="width:192px;">BioRad</td>
			<td style="width:140px;">1709600</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detecting the lyme disease spirochete, borrelia burgdorferi, in ticks using nested pcr

Malattia di Lyme è una grave infezione trasmesse da vettori che è causata dalla Borrelia burgdorferi sensu lato famiglia delle spirochete, che vengono trasmessi all'uomo attraverso la puntura delle zecche Ixodes infette. L'agente eziologico primario in Nord America è Borrelia burgdorferi sensu stricto. Come espandono regioni rischio geografico, è prudente sostenere programmi di sorveglianza robusto che possono misurare i tassi di infezione tick e comunicare i risultati clinici, veterinari e il pubblico in generale. La tecnica molecolare della reazione a catena annidata della polimerasi (nPCR) lungo è stata utilizzata per questo scopo, e rimane un approccio centrale, economico e robusto nella rilevazione di Borrelia in segni di graduazione e la fauna selvatica.
Questo articolo viene illustrato l'applicazione del nPCR a spuntare gli estratti di DNA per identificare gli esemplari infetti. Due indipendente destinato a b. burgdorferi , geni codifica B flagellina (ciccia) e proteina di superficie esterno A (OspA), sono stati ampiamente utilizzati con questa tecnica. Il protocollo coinvolge tick raccolta, estrazione del DNA e poi un giro iniziale di PCR per rilevare tutte le due Borrelia-loci specifici. Successivi catena della polimerasi (PCR) utilizza il prodotto della prima reazione come un nuovo modello per generare frammenti di amplificazione interna, più piccola. L'approccio nidificato migliora la specificità e la sensibilità della PCR convenzionale. Un segno di spunta viene considerato positivo per l'agente patogeno quando interna ampliconi di entrambi i geni Borrelia possono essere rilevato tramite l'elettroforesi del gel dell'agarosi.

nPCR è un approccio elegante per aumentare la specificità e la sensibilità di rilevamento del patogeno, specialmente quando campioni ambientali complessi sono sotto inchiesta. Come descritto in Figura 1, due cicli di PCR destinazione è un'area strategica della Borrelia FlaB locus (e OspA, non nella foto) possono segnalare la presenza del batterio Borrelia burgdorferi attraverso la generazione di corte interna ampliconi. Quando risolto tramite l'elettroforesi del gel, i prodotti di reazione di ciccia e OspA da ogni segno di graduazione possono essere visivamente segnati e confrontati con controlli. Nella Figura 2, esemplare unico identificatori sono forniti nella parte superiore di ogni gel e controlli no-modello e aerosol sono rappresentati all'estrema sinistra e destra, rispettivamente, adiacente le scale.
Amplicon robusto bande sono chiaramente visibili nel selezionare campioni sperimentali, e si distinguono facilmente dagli iniettori surplus e residuo del DNA (Figura 2). Basato su principi di disegno sperimentale stabiliti, un segno di spunta viene considerato positivo per Borrelia quando parallelo controlli negativi non dimostrano amplificazione, e interni ampliconi sono prodotte da primer sia ciccia e OspA . In questo caso, gli esemplari T907, T604 e T606 incontrato i criteri di sorveglianza per l'agente patogeno di Lyme (Figura 2). Al contrario, T923 solo era positivo per OspA, un risultato per il quale esistono più spiegazioni possibili: A) il segno di spunta di origine era negativa per Borrelia, ma la preparazione di OspA PCR esterna o interna spurio è stata contaminata con modello DNA (si noti che sistematica contaminazione dei reagenti è stata esclusa tramite controlli negativi), B) il segno di spunta trasportato Lyme Borrelia, ma modello basso importi o errore sperimentale ha impedito l'amplificazione di ciccia, o C) un organismo era presente che conteneva la sequenza conservata di OspA , ma mancava la flagellina o avuto insufficiente identità della regione mirata della ciccia tempri gli iniettori. Infatti, OspA sequenza somiglianze sono state notate in una varietà di organismi, tra cui piante e animali28. La situazione di converse, amplificazione più conservato flagellina gene, ma non il gene OspA , potrebbe indicare una specie di Borrelia correlate. In pratica, questo protocollo produce più risultati di singolo-positivi di OspA di fanno gli iniettori di ciccia , suggerendo che scenario 'A' è la meno probabile spiegazione. Senza ulteriori analisi sperimentale dell'esemplare polemico, tuttavia, non è possibile determinare l'origine del singolo-positivo risultato. Aumentando il numero delle ripetizioni tecnici effettuati sui campioni di equivoci può aiutare a conciliare il loro status di vero, poiché eventuali contaminanti introdotti spurio per precedenti reazioni non sarebbero presenti nel DNA archiviato. Tuttavia, se le reazioni successive con questi iniettori non riescono a fornire risultati conclusivi, altri loci di Borrelia potrebbero essere studiati mediante PCR. Ampliconi generati da queste reazioni potrebbero anche essere sequenziato e rispetto tra gli isolati per assegnare identità e stimare il grado di divergenza di ceppo. SAPI e colleghi forniscono un esempio di questo flusso di lavoro utilizzando campioni clinici umani35.
Tutti i fattori considerati, i criteri delineati di protocollo e l'interpretazione sono stati stimati per produrre falsi positivi e falsi negativi tassi di 0,17% e 0.0063%, rispettivamente.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56471/56471fig2.jpg"> Figura 2 : Rilevazione di Borrelia burgdorferi nelle singole zecche di nPCR di Ciccia e OspA. Codici assegnati a ogni tick sono rappresentati nella parte superiore del gel e identità allineano verticalmente per segnalare l'individuazione di OspA e ciccia in ogni esemplare. Corsie intitolata B a sinistra dei controlli immagine rappresentano no-modello, mentre un (corsie di destra) sono controlli di aerosol per catturare la contaminazione dell'ambiente di laboratorio. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56471/56471fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Detecting the Lyme Disease Spirochete, Borrelia Burgdorferi, in Ticks Using Nested PCR

Nested PCR è una tecnica sensibile, specifica e semplice che può essere applicata a tick che DNA estratti per sonda per Borrelia burgdorferi, l'agente eziologico della malattia di Lyme. L'esperimento PCR iniziale utilizza gli iniettori di gene-specific per generare ampliconi lunghi, che poi diventano modelli per una successiva reazione utilizzando primers interna.

Rilevare il malattia di Lyme Spirochete, Borrelia Burgdorferi, in segni di graduazione utilizzando la PCR annidata

Lyme disease is a serious vector-borne infection that is caused by the Borrelia burgdorferi sensu lato family of spirochetes, which are transmitted to ...

detecting-lyme-disease-spirochete-borrelia-burgdorferi-ticks-using

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Detecting the Lyme Disease Spirochete, Borrelia Burgdorferi, in Ticks Using Nested PCR

17.8K Views.  Mount Allison University. Nested PCR è una tecnica sensibile, specifica e semplice che può essere applicata a tick che DNA estratti per sonda per Borrelia burgdorferi, l'agente eziologico della malattia di Lyme. L'esperimento PCR iniziale utilizza gli iniettori di gene-specific per generare ampliconi lunghi, che poi diventano modelli per una successiva reazione utilizzando primers interna.

Video: Detecting the Lyme Disease Spirochete, Borrelia Burgdorferi, in Ticks Using Nested PCR

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and accuracy of the assay. These primer/probe sets are pre-designed to &gt;98% of the human and mouse genomes and feature significant improvements from previously available technologies. These improvements were made possible by virtue of a novel design algorithm, developed by Thermo Scientific bioinformatics experts.
Several convenient features have been incorporated into the Solaris qPCR Assay to streamline the process of performing quantitative real-time PCR. First, the protocol is similar to commonly employed alternatives, so the methods used during qPCR are likely to be familiar. Second, the master mix is blue, which makes setting the qPCR reactions easier to track. Third, the thermal cycling conditions are the same for all assays (genes), making it possible to run many samples at a time and reducing the potential for error. Finally, the probe and primer sequence information are provided, simplifying the publication process.
Here, we demonstrate how to obtain the appropriate Solaris reagents using the GENEius product search feature found on the ordering web site (www.thermo.com/solaris) and how to use the Solaris reagents for performing qPCR using the standard curve method.

The Solaris qPCR Gene Expression Assays are novel pre-designed qPCR primer/probe combinations designed to simplify the qPCR process without sacrificing the specificity and robustness of the assay.

Quantitativa Real-Time PCR utilizzando il Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

Ricerca

Biologia

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA lesions with respect to survival and preservation of genomic integrity. An early response to the induction of DSBs is phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX1. Following induction of DSBs, H2AX is rapidly phosphorylated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PIKK) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Typically, only a few base-pairs (bp) are implicated in a DSB, however, there is significant signal amplification, given the importance of chromatin modifications in DNA damage signalling and repair. Phosphorylation of H2AX mediated predominantly by ATM spreads to adjacent areas of chromatin, affecting approximately 0.03% of total cellular H2AX per DSB2,3. This corresponds to phosphorylation of approximately 2000 H2AX molecules spanning ~2 Mbp regions of chromatin surrounding the site of the DSB and results in the formation of discrete &gamma;H2AX foci which can be easily visualized and quantitated by immunofluorescence microscopy2. The loss of &gamma;H2AX at DSB reflects repair, however, there is some controversy as to what defines complete repair of DSBs; it has been proposed that rejoining of both strands of DNA is adequate however, it has also been suggested that re-instatement of the original chromatin state of compaction is necessary4-8. The disappearence of &gamma;H2AX involves at least in part, dephosphorylation by phosphatases, phosphatase 2A and phosphatase 4C5,6. Further, removal of &gamma;H2AX by redistribution involving histone exchange with H2A.Z has been implicated7,8. Importantly, the quantitative analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in medical and nuclear research. Here, we demonstrate the most commonly used immunofluorescence method for evaluation of initial DNA damage by detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in &gamma;-irradiated adherent human keratinocytes9.

Quantification of &#947;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of DNA double-strand streaks using &gamma;H2AX formation as a molecular marker has become an invaluable tool in radiation biology. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantification of &gamma;H2AX foci after exposure of cells to radiation.

Quantificazione dei γH2AX Foci in risposta alle radiazioni ionizzanti

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer (Agrilus planipennis) Using Quantitative Real Time-PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB continues to spread rapidly and attacks ash trees of different ages, from saplings to mature trees. However, to date very little or no molecular knowledge exists for EAB. We are interested in deciphering the molecular-based physiological processes at the tissue level that aid EAB in successful colonization of ash trees. In this report we show the effective use of quantitative real-time PCR (qRT-PCR) to ascertain mRNA levels in different larval tissues (including midgut, fat bodies and cuticle) and different developmental stages (including 1st-, 2nd-, 3rd-, 4th-instars, prepupae and adults) of EAB. As an example, a peritrophin gene (herein named, AP-PERI1) is exemplified as the gene of interest and a ribosomal protein (AP-RP1) as the internal control. Peritrophins are important components of the peritrophic membrane/matrix (PM), which is the lining of the insect gut. The PM has diverse functions including digestion and mechanical protection to the midgut epithelium.

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer Agrilus planipennis Using Quantitative Real Time-PCR

Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) is an effective tool to diagnose mRNA levels in different insect tissues and developmental stages. In this report we show the use of qRT-PCR to ascertain mRNA levels in different larval tissues and developmental stages of the invasive insect species, emerald ash borer.

Analisi dell&#39;espressione genica in Borer Emerald Ash ( Agrilus planipennis) Utilizzando quantitativa Real Time-PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB ...

Rapid PCR Thermocycling using Microscale Thermal Convection

Many molecular biology assays depend in some way on the polymerase chain reaction (PCR) to amplify an initially dilute target DNA sample to a detectable concentration level. But the design of conventional PCR thermocycling hardware, predominantly based on massive metal heating blocks whose temperature is regulated by thermoelectric heaters, severely limits the achievable reaction speed1. Considerable electrical power is also required to repeatedly heat and cool the reagent mixture, limiting the ability to deploy these instruments in a portable format.
Thermal convection has emerged as a promising alternative thermocycling approach that has the potential to overcome these limitations2-9. Convective flows are an everyday occurrence in a diverse array of settings ranging from the Earth's atmosphere, oceans, and interior, to decorative and colorful lava lamps. Fluid motion is initiated in the same way in each case: a buoyancy driven instability arises when a confined volume of fluid is subjected to a spatial temperature gradient. These same phenomena offer an attractive way to perform PCR thermocycling. By applying a static temperature gradient across an appropriately designed reactor geometry, a continuous circulatory flow can be established that will repeatedly transport PCR reagents through temperature zones associated with the denaturing, annealing, and extension stages of the reaction (Figure 1). Thermocycling can therefore be actuated in a pseudo-isothermal manner by simply holding two opposing surfaces at fixed temperatures, completely eliminating the need to repeatedly heat and cool the instrument.
One of the main challenges facing design of convective thermocyclers is the need to precisely control the spatial velocity and temperature distributions within the reactor to ensure that the reagents sequentially occupy the correct temperature zones for a sufficient period of time10,11. Here we describe results of our efforts to probe the full 3-D velocity and temperature distributions in microscale convective thermocyclers12. Unexpectedly, we have discovered a subset of complex flow trajectories that are highly favorable for PCR due to a synergistic combination of (1) continuous exchange among flow paths that provides an enhanced opportunity for reagents to sample the full range of optimal temperature profiles, and (2) increased time spent within the extension temperature zone the rate limiting step of PCR. Extremely rapid DNA amplification times (under 10 min) are achievable in reactors designed to generate these flows.

We describe a novel method to perform DNA replication via the polymerase chain reaction (PCR). Thermal convection is harnessed to continuously shuttle reagents between denaturing, annealing, and extension conditions by maintaining opposing surfaces of the reactor at constant temperature. This inherently simple design promises to make rapid PCR more accessible.

Rapido PCR termici utilizzando microscala convezione termica

Many molecular biology assays depend in some way on the polymerase chain reaction (PCR) to amplify an initially dilute target DNA sample to a detectable ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway that polypeptide chain follows during co-translational folding to achieve its functional form is still an enigma. In order to understand this process and to determine the exact conformation of the co-translational folding intermediates, it is essential to develop techniques that allow the isolation of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes to allow their further structural analysis.
SecM (secretion monitor) is a 170 amino acid E. coli protein that regulates expression of the downstream SecA (secretion driving) ATPase in the secM-secA operon6. Nakatogawa and Ito originally found that a 17 amino acid long sequence (150-FSTPVWISQAQGIRAGP-166) in the C-terminal region of the SecM protein is sufficient and necessary to cause stalling of SecM elongation at Gly165, thereby producing peptidyl-glycyl-tRNA stably bound to the ribosomal P-site7-9. More importantly, it was found that this 17 amino acid long sequence can be fused to the C-terminus of virtually any full-length and/or truncated protein thus allowing the production of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes7. Thus, when fused or inserted into the target protein, SecM stalling sequence produces arrest of the polypeptide chain elongation and generates stable RNCs both in vivo in E. coli cells and in vitro in a cell-free system. Sucrose gradient centrifugation is further utilized to isolate RNCs.
The isolated RNCs can be used to analyze structural and functional features of the co-translational folding intermediates. Recently, this technique has been successfully used to gain insights into the structure of several ribosome bound nascent chains10,11. Here we describe the isolation of bovine Gamma-B Crystallin RNCs fused to SecM and generated in an in vitro translation system.

We describe here a technique that is now routinely used to isolate stably bound ribosome nascent chain complexes (RNCs). This technique takes advantage of the discovery that a 17 amino acid long SecM "arrest sequence" can halt translation elongation in a prokaryotic (E. coli) system, when inserted into (or fused to the C-terminus) of virtually any protein.

Utilizzando Sequence SECM arresto come uno strumento per isolare ribosoma Polipeptidi Bound

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Transposon mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is less time consuming, less costly, and does not require completed genome information, there are two weaknesses in this method: (1) the possibility of a disparate mutants in the mixed mutant library that counter-selects mutants with decreased competition; and (2) the possibility of partial gene inactivation whereby genes do not entirely lose their function following the insertion of a transposon. Single-gene deletion analysis may compensate for the drawbacks associated with transposon mutagenesis. To improve the efficiency of genome-wide single gene deletion, we attempt to establish a high-throughput technique for genome-wide single gene deletion using Streptococcus sanguinis as a model organism. Each gene deletion construct in S. sanguinis genome is designed to comprise 1-kb upstream of the targeted gene, the aphA-3 gene, encoding kanamycin resistance protein, and 1-kb downstream of the targeted gene. Three sets of primers F1/R1, F2/R2, and F3/R3, respectively, are designed and synthesized in a 96-well plate format for PCR-amplifications of those three components of each deletion construct. Primers R1 and F3 contain 25-bp sequences that are complementary to regions of the aphA-3 gene at their 5' end. A large scale PCR amplification of the aphA-3 gene is performed once for creating all single-gene deletion constructs. The promoter of aphA-3 gene is initially excluded to minimize the potential polar effect of kanamycin cassette. To create the gene deletion constructs, high-throughput PCR amplification and purification are performed in a 96-well plate format. A linear recombinant PCR amplicon for each gene deletion will be made up through four PCR reactions using high-fidelity DNA polymerase. The initial exponential growth phase of S. sanguinis cultured in Todd Hewitt broth supplemented with 2.5% inactivated horse serum is used to increase competence for the transformation of PCR-recombinant constructs. Under this condition, up to 20% of S. sanguinis cells can be transformed using ~50 ng of DNA. Based on this approach, 2,048 mutants with single-gene deletion were ultimately obtained from the 2,270 genes in S. sanguinis excluding four gene ORFs contained entirely within other ORFs in S. sanguinis SK36 and 218 potential essential genes. The technique on creating gene deletion constructs is high throughput and could be easy to use in genome-wide single gene deletions for any transformable bacteria.

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

An efficient genome-wide single gene mutation method has been established using Streptococcus sanguinis as a model organism. This method has achieved via high throughput recombinant PCRs and transformations.

Genome-wide gene delezioni in<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Da Throughput PCR ad alta

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

Here, we present methods for the development of assays to query potentially clinically significant nonsynonymous changes using in vivo complementation in zebrafish. Zebrafish (Danio rerio) are a useful animal system due to their experimental tractability; embryos are transparent to enable facile viewing, undergo rapid development ex vivo, and can be genetically manipulated.1 These aspects have allowed for significant advances in the analysis of embryogenesis, molecular processes, and morphogenetic signaling. Taken together, the advantages of this vertebrate model make zebrafish highly amenable to modeling the developmental defects in pediatric disease, and in some cases, adult-onset disorders. Because the zebrafish genome is highly conserved with that of humans (~70% orthologous), it is possible to recapitulate human disease states in zebrafish. This is accomplished either through the injection of mutant human mRNA to induce dominant negative or gain of function alleles, or utilization of morpholino (MO) antisense oligonucleotides to suppress genes to mimic loss of function variants. Through complementation of MO-induced phenotypes with capped human mRNA, our approach enables the interpretation of the deleterious effect of mutations on human protein sequence based on the ability of mutant mRNA to rescue a measurable, physiologically relevant phenotype. Modeling of the human disease alleles occurs through microinjection of zebrafish embryos with MO and/or human mRNA at the 1-4 cell stage, and phenotyping up to seven days post fertilization (dpf). This general strategy can be extended to a wide range of disease phenotypes, as demonstrated in the following protocol. We present our established models for morphogenetic signaling, craniofacial, cardiac, vascular integrity, renal function, and skeletal muscle disorder phenotypes, as well as others.

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

Here, we present a systematic approach for developing physiologically relevant, sensitive and specific in vivo assays for interpreting variation in human pathology. Transient genetic manipulation via microinjection of WT and mutant human mRNA and morpholino (MO) antisense oligonucleotides harness the tractability of the developing zebrafish embryo to rapidly assay pathogenic mutations, especially, but not exclusively, in the context of human developmental disorders.

In Vivo Modellazione del genoma umano Morbid utilizzando Danio rerio

Here,  we present methods for the development of assays to query potentially clinically  significant nonsynonymous changes using in  vivo complementation ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic tools have been introduced, including multiple strategies for inducing mutations and generating transgenic lines. However, large-scale screening is limited by traditional genotyping methods, which are time-consuming and labor-intensive. Here we describe a technique to analyze zebrafish genotypes by PCR combined with high-resolution melting analysis (HRMA).&#160;This approach is rapid, sensitive, and inexpensive, with lower risk of contamination artifacts.&#160;Genotyping by PCR with HRMA can be used for embryos or adult fish, including in high-throughput screening protocols.

PCR combined with high-resolution melt analysis (HRMA) is demonstrated as a rapid and efficient method to genotype zebrafish.

Rapido ed efficiente Zebrafish genotipizzazione Uso PCR con ad alta risoluzione Melt Analysis

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different lineages. A single cell transcriptome assay can be a new approach for dissecting individual variation. We have developed the single cell qRT-PCR method, and confirmed that this method works well in several gene expression profiles. In single cell level, each human embryonic stem cell, sorted by OCT4::EGFP positive cells, has high expression in OCT4, but a different level of NANOG expression. Our single cell gene expression assay should be useful to interrogate population heterogeneities.

Single cell gene expression assay is needed for understanding stem cell heterogeneities.

Profiling cellule staminali embrionali umane individuale mediante RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

Detecting Estrogenic Ligands in Personal Care Products using a Yeast Estrogen Screen Optimized for the Undergraduate Teaching Laboratory

The Yeast Estrogen Screen (YES) is used to detect estrogenic ligands in environmental samples and has been broadly applied in studies of endocrine disruption. Estrogenic ligands include both natural and manmade &#34;Environmental Estrogens&#34; (EEs) found in many consumer goods including Personal Care Products (PCPs), plastics, pesticides, and foods. EEs disrupt hormone signaling in humans and other animals, potentially reducing fertility and increasing disease risk. Despite the importance of EEs and other Endocrine Disrupting Chemicals (EDCs) to public health, endocrine disruption is not typically included in undergraduate curricula. This shortcoming is partly due to a lack of relevant laboratory activities that illustrate the principles involved while also being accessible to undergraduate students. This article presents an optimized YES for quantifying ligands in personal care products that bind estrogen receptors alpha (ER&#945;) and/or beta (ER&#946;). The method incorporates one of the two colorimetric substrates (ortho-nitrophenyl-&#946;-D-galactopyranoside (ONPG) or chlorophenol red-&#946;-D-galactopyranoside (CPRG)) that are cleaved by &#946;-galactosidase, a 6-day refrigerated incubation step to facilitate use in undergraduate laboratory courses, an automated application for LacZ calculations, and R code for the associated 4-parameter logistic regression analysis. The protocol has been designed to allow undergraduate students to develop and conduct experiments in which they screen products of their choosing for estrogen mimics. In the process, they learn about endocrine disruption, cell culture, receptor binding, enzyme activity, genetic engineering, statistics, and experimental design. Simultaneously, they also practice fundamental and broadly applicable laboratory skills, such as: calculating concentrations; making solutions; demonstrating sterile technique; serially diluting standards; constructing and interpolating standard curves; identifying variables and controls; collecting, organizing, and analyzing data; constructing and interpreting graphs; and using common laboratory equipment such as micropipettors and spectrophotometers. Thus, implementing this assay encourages students to engage in inquiry-based learning while exploring emerging issues in environmental science and health.

This article presents an optimized yeast estrogen screen for quantifying ligands in Personal Care Products (PCPs) that bind estrogen receptors alpha (ER&#945;) and/or beta (ER&#946;). The method incorporates two colorimetric substrate options, a six-day refrigerated incubation for use in undergraduate courses, and statistical tools for data analysis.

Rilevamento di ligandi estrogenici nei prodotti di cura personale utilizzando un lievito estrogeno schermo ottimizzato per il laboratorio di insegnamento universitari