Die Autoren danken dem Schweizerischen Nationalfonds Grant No. 31003A-132358/1, 31003A_152972 und No. 151948 und Fundation Pierre Mercier Pour La Science.

1. Herstellung von Chemikalien und Geräte <ol><li> Bilden 500 ml einer 1% Natriumhexametaphosphat (SHMP) (NaPO 3) n-Lösung und durch Autoklavieren sterilisieren. </li><li> Sterilisieren Nitrocellulose (NC) Filter (Porengröße 0,22 um, Durchmesser 47 mm) durch Autoklavieren in geschlossenen Glaspetrischalen. </li><li> Sterilisieren NC-Filter (Porengröße 0,22 um, Durchmesser 25 mm) durch Autoklavieren in geschlossenen Glaspetrischalen. </li><li> Wiegen und beachten Sie das Leergewicht von sterilen 50-ml-Röhrchen (mit Kappe auf) (ein Röhrchen je Probe). </li><li> Vorbereitung Tris-EDTA-Puffer (TE-Puffer) 1x: make Lösung von 10 mM Tris (Tris (hydroxymethyl) aminomethan) und 1 mM EDTA Puffer. PH-Wert auf 8 und durch Autoklavieren sterilisieren. </li><li> Vorbereitung Lysozymlösung (20 mg / ml) durch Auflösen von 0,02 g Lysozym in 1 ml TE-Puffer. Im Idealfall machen frische jeder Zeit. Lagerung bei 4 ° C für nicht mehr als 1 Woche. </li><li> Vorbereitung physiologischen Lösung durch Lösen von 8 g / l Natriumchlorid(NaCl) in destilliertem Wasser. Durch Autoklavieren sterilisieren. </li></ol> 2. Trennung von Biomasse aus Sediment <ol><li> In 3 g Sedimentprobe, um vorher gewogenes steriles 50-ml-Röhrchen unter Verwendung von Ethanol-geflammt Metall Messlöffel. Führen Sie dies in einer sauberen, UV sterilisiert Biosicherheitswerkbank, um Verunreinigungen zu vermeiden. </li><li> 15 ml einer 1% igen sterilen (autoklaviert) SHMP Lösung zu der Probe unter Verwendung eines sterilen Bürette gefüllt. Die SHMP Lösung kann auch gefiltert, um Verunreinigungen zu vermeiden. </li><li> Homogenisieren das Sediment und SHMP-Lösung mit einer Flüssigkeit Dispergierer / Homogenisator (zB Ultra-Turrax-Homogenisator). 70% Ethanol-sterilisiert oder autoklaviert Dispergierlaufrades vor der Verwendung. Führen Sie die Homogenisierung für 1 min bei 17.500 Umdrehungen pro Minute. Ließ die Probe für 2 Minuten ruhen und wiederholen die Homogenisierung für 1 min bei der gleichen Rotordrehzahl. </li><li> Lassen Sie die Probe stehen für 10 min. Bei diesem Schritt werden die schwersten Teilchen (Mineralien) zu begleichen. Die Zellen und alle organischen Bestandteile der Probe jedoch wschlecht in Lösung bleiben. Danach den Überstand (enthaltend Zellbiomasse) in ein sauberes 50-ml-Tube, während kümmert sich nicht um das Sediment Pellet stören. </li><li> Um das Sediment Pellet hinzuzufügen erneut 15 ml einer 1% igen sterilen (autoklaviert) SHMP-Lösung mit einem sterilen Bürette. Dann wiederholen Sie die Schritte 2.3 und 2.4. Diese Wiederholung sorgt für die Trennung von der maximalen Anzahl von Zellen und organische Teilchen aus der Mineralkomponente des Sediments. Der Überstand dieser zweiten Trennung kann mit dem Überstand aus der ersten Trennzusammengeführt werden. Hinweis: Die folgenden Schritte werden alle auf dem Überstand durchgeführt (die Zellbiomasse). Die mineralische Komponente (Sediment Pellet) kann verworfen werden. </li><li> Zentrifugieren Sie die Probe bei 20 g für 1 min. Dieser Schritt erhöht die Beschleunigungskraft genug, um kleine Mineralpartikel absetzen, während die biologischen Zellmaterials noch in Lösung bleibt. Nach dem Zentrifugieren den Überstand (enthaltend Zellbiomasse) in einesauberes 50-ml-Tube. Entsorgen Sie die Mineral Pellet. </li><li> Bestimmen das endgültige Volumen der Lösung, die Biomasse durch Wiegen der Probe. Die Gewichtsbestimmung wird vermieden, daß die Probe in einem Messzylinder übertragen und reduziert die Gefahr einer Kontamination. </li></ol> 3. Sammlung von Biomasse auf Filter Membrane <ol><li> Bereiten Filtrationseinheit (47 mm Durchmesser Membranen) und Vakuumpumpe. Sterilisieren Sie die Filtereinheit entweder durch Autoklavieren oder (wenn Pyrexglas) durch Besprühen mit 70% Ethanol und flamm es mit einem Bunsenbrenner. Abkühlen lassen, bevor Sie mit dem Protokoll. </li><li> In sterilen NC-Membran in die Filtrationseinheit unter Verwendung von Ethanol-geflammt sterilisierten Pinzette. </li><li> Die Hälfte des Überstandsprobe (aus Schritt 2.6) auf der Membranfiltrationseinheit und sammeln Zellen auf der Membran unter Verwendung der Vakuumpumpe. </li><li> Wenn die Flüssigkeit vollständig durch den Filter geleitet, stoppen Sie die Vakuumpumpe und entfernen Sie vorsichtig die Membran unter Verwendung von Ethanol-Flamme sterilisierten Pinzette. Legen Sie die Membran in einer sterilen Petrischale. <ol><li> Schneiden Sie die Membran in die Hälfte unter Verwendung von Ethanol-geflammt sterilisierte Schere. Fügen Sie jede Hälfte der Membran in eine separate 2-ml-Tube. Eine Hälfte der Membran für die DNA-Extraktion und Analyse der gesamten Bakteriengesellschaft verwendet werden. Die andere Hälfte der Filter wird bei -80 ° C gelagert werden und dient als eine Sicherung. </li></ol></li><li> Zeigen neuen NC-Membran auf die Filtrationseinheit und sammeln Biomasse aus der zweiten Hälfte des Probenvolumens (aus Schritt 2.6) mit der Vakuumpumpe. </li><li> Wenn die Flüssigkeit vollständig durch den Filter geleitet, stoppen Sie die Vakuumpumpe und entfernen Sie vorsichtig die Membran unter Verwendung von Ethanol-geflammt sterilisierten Pinzette. Legen Sie die gesamte Membran in eine separate 2-ml-Tube. Diese Probe wird für die Behandlung, um Endosporen von vegetativen Zellen getrennt verwendet werden. Die Probe kann bei -20ºC bis zur Verwendung gelagert werden. </li></ol> 4. Lyse von vegetativen Zellen <ol><li> Führen Sie dieBehandlung Endosporen aus vegetativen Zellen auf der zuvor auf einem NC-Membran (Schritt 3.6) gesammelt Biomasse abzutrennen. <ol><li> Wenn die Membran war gefroren, lassen Sie es bei Raumtemperatur für 10 Minuten auftauen. Dann legen Sie die Membran in einer sterilen Petrischale und schneiden Sie es (etwa 4 mal) in kleinere Stücke unter Verwendung von Ethanol-geflammt sterilisierte Schere. Dann legen Sie alle Membranfilterstücke in ein steriles 2 ml-Tube. </li></ol></li><li> Fügen Sie 900 ul 1x TE (Tris-EDTA) Puffer (siehe 1.5) auf das Rohr, das die Probenmembran und mischen durch Wirbel. Bei diesem Schritt wird die Biomasse von der Membran in der TE-Pufferlösung entfernt. </li><li> Das Röhrchen wird in einen Inkubator bei 65 ° C für 10 min und 80 min. Danach entfernen Sie den Schlauch aus dem Inkubator und abkühlen lassen für 15 Minuten. </li><li> 100 ul frisch hergestelltes Lysozym (siehe 1.5), um eine Endkonzentration von 2 mg / ml zu erreichen. Nicht das Lysozym nicht hinzufügen, bevor die Probe auf 37 ° C abgekühlt, da dies könnte degrade des Enzyms. </li><li> Inkubieren der Probe bei 37 ° C für 60 min und 80 min werden die optimalen Bedingungen für die Lysozym vegetative Zellen zu lysieren. </li><li> Nach kompletter Lyse, fügen 250 ul 3 N Natriumhydroxid (NaOH) und 250 &amp; mgr; l 6% Natriumdodecylsulfat (SDS) Lösung zu der Probe. Durch das Hinzufügen dieses, das Probevolumen 1,5 ml erreicht und es besteht eine Endkonzentration von 0,5 N NaOH und einer Endkonzentration von 1% SDS. </li><li> Inkubieren dieser Mischung bei RT für 60 min und 80 min. Zugabe der Base und Reinigungsmittel werden in endgültige Zell-Lyse zu helfen. Die Konzentration dieser Reinigungsmittel hat, um nicht die Endosporen schaden optimiert, während Lysieren vegetativen Zellen. </li><li> Bereiten Sie eine sterile Filtrationseinheit, die Durchmesser von 25 mm Membranen hält durch Autoklavieren, oder (wenn Pyrexglas) Besprühen mit 70% Ethanol und flamm es mit einem Bunsenbrenner. Abkühlen lassen. </li><li> Legen Sie eine 0,2 um NC-Membran (Durchmesser 25 mm) an der Filtrationseinheit unter Verwendung von Ethanol-Flamme sterilisierten Pinzette. &lt;/ li&gt; <li> Hinzufügen der Probe aus Schritt 4.7 auf die Membran und Filtern der Flüssigkeit unter Verwendung der Vakuumpumpe. Wenn Flüssigkeit durchlaufen hat, schalten Sie Vakuumpumpe. Bei diesem Schritt wird die lysierte vegetative Zellmaterial entfernt wird, da es nicht auf die Membran zurückgehalten. Nur Endosporen auf der Membran verbleiben. </li><li> 2 ml steriler physiologischer Lösung zu waschen Rest Wasch- und filtern Sie die Flüssigkeit mit Hilfe der Vakuumpumpe. </li><li> Wenn Flüssigkeit vollständig gefiltert wurde, schalten Sie die Vakuumpumpe. Verlassen die Membran auf der Filtrationseinheit. </li></ol> 5. DNase-Behandlung Hinweis: Führen Sie die DNase-Behandlung direkt auf der Filtermembran. Es ist wichtig, dass die Filtereinheit nicht auslaufen und die Vakuumpumpe wird abgeschaltet. <ol><li> Fügen Sie 450 ul sterilem Wasser, 50 ul DNase-Reaktionspuffer (1x) und 0,5 ul DNase Enzym direkt auf der Filtermembran und lassen Sie es für 15 Minuten stehen gelassen. Wenn möglich, tun dies die Verdauung in einem Raum, der leicht ist Kriegmer als durchschnittliche RT, da das Enzym arbeitet besser bei Temperaturen von 25 ° C und darüber. Anmerkung: Halten des Bunsenbrenners Seite der Filtereinheit erhöht auch die Temperatur und hat den zusätzlichen Vorteil, halten die Umgebung steril daher reduzierten Risiko der Kontamination der Proben. </li><li> Wenn die DNase-Verdau beendet ist, schalten Sie Vakuumpumpe, um das Enzym aus der Probe zu entfernen. </li><li> Abzuwaschen restliche Enzym durch Zusatz und Filtrieren von 1 ml physiologischer Lösung. </li><li> Wenn Flüssigkeit vollständig durchlaufen hat, schalten Sie Vakuumpumpe und entfernen Sie die Filtermembran, Endosporen mit einer sterilen Pinzette und legen Sie sie in eine sterile Petrischale. Hinweis: Die Probe getrennt Endosporen ist nun bereit für Downstream-Analyse. Lagerung bei -20 ° C, wenn für die DNA-Extraktion oder alternativ bei 4 ° C verwendet werden, wenn für die Keimung und Kultivierung verwendet. </li></ol>

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	<li>Nicholson, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+Bacillus+endospores+in+the+environment.">Roles of Bacillus endospores in the environment.</a> Cell Mol Life Sci. 59 (3), 410-416 (2002).</li><li>Lester, E. D., Satomi, M., Ponce, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microflora+of+extreme+arid+Atacama+Desert+soils.">Microflora of extreme arid Atacama Desert soils.</a> Soil Biol Biochem. 39 (2), 704-708 (2007).</li><li>Wilson, M. S., Siering, P. L., White, C. L., Hauser, M. E., Bartles, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+archaea+and+bacteria+dominate+stable+microbial+communities+in+North+America's+Largest+Hot+Spring.">Novel archaea and bacteria dominate stable microbial communities in North America's Largest Hot Spring.</a> Microb Ecol. 56 (2), 292-305 (2008).</li><li>Hugenholtz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+prokaryotic+diversity+in+the+genomic+era.">Exploring prokaryotic diversity in the genomic era.</a> Genome Biol. 3 (2), (2002).</li><li>Onyenwoke, R. U., Brill, J. A., Farahi, K., Wiegel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sporulation+genes+in+members+of+the+low+G+C+Gram-type-positive+phylogenetic+branch+(Firmicutes).">Sporulation genes in members of the low G+C Gram-type-positive phylogenetic branch (Firmicutes).</a> Arch Microbiol. 182 (2-3), 182-192 (2004).</li><li>Delmont, T. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accessing+the+soil+metagenome+for+studies+of+microbial+diversity.">Accessing the soil metagenome for studies of microbial diversity.</a> Appl Environ Microbiol. 77 (4), 1315-1324 (2011).</li><li>Ricca, E., Henriques, A. O., Cutting, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bacterial spore formers: probiotics and emerging applications. , (2004).</li><li>Kuske, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-Scale+DNA+Sample+Preparation+Method+for+Field+PCR+Detection+of+Microbial+Cells+and+Spores+in+Soil.">Small-Scale DNA Sample Preparation Method for Field PCR Detection of Microbial Cells and Spores in Soil.</a> Appl Environ Microbiol. 64 (7), 2463-2472 (1998).</li><li>von Mering, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+phylogenetic+assessment+of+microbial+communities+in+diverse+environments.">Quantitative phylogenetic assessment of microbial communities in diverse environments.</a> Science. 315 (8515), 1126-1130 (2007).</li><li>Wunderlin, T., Junier, T., Roussel-Delif, L., Jeanneret, N., Junier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stage+0+sporulation+gene+A+as+a+molecular+marker+to+study+diversity+of+endospore-forming+Firmicutes.">Stage 0 sporulation gene A as a molecular marker to study diversity of endospore-forming Firmicutes.</a> Environ Microbiol Rep. 5 (6), 911-924 (2013).</li><li>Siala, A., Hill, I. R., Gray, T. R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Populations+of+spore-forming+bacteria+in+an+acid+forest+soil,+with+special+reference+to+Bacillus+subtilis.">Populations of spore-forming bacteria in an acid forest soil, with special reference to Bacillus subtilis.</a> J General Microbiol. 81 (1), 183-190 (1974).</li><li>Brandes Ammann, A., Kolle, L., Brandl, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+bacterial+endospores+in+soil+by+terbium+fluorescence.">Detection of bacterial endospores in soil by terbium fluorescence.</a> Int J Microbiol. , 435281 (2011).</li><li>Fichtel, J., Koster, J., Rullkotter, J., Saas, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+variations+in+endospore+numbers+within+tidal+flat+sediments+revealed+by+quantification+of+dipicolinic+acid.">High variations in endospore numbers within tidal flat sediments revealed by quantification of dipicolinic acid.</a> Geomicrobiol J. 25 (7-8), (2008).</li><li>Cronin, U. P., Wilkinson, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+of+flow+cytometry+in+the+study+of+Bacillus+cereus.">The potential of flow cytometry in the study of Bacillus cereus.</a> J Appl Microbiol. 108 (1), 1-16 (2010).</li><li>de Rezende, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dispersal+of+thermophilic+Desulfotomaculum+endospores+into+Baltic+Sea+sediments+over+thousands+of+years.">Dispersal of thermophilic Desulfotomaculum endospores into Baltic Sea sediments over thousands of years.</a> ISME J. 7 (1), 72-84 (2013).</li><li>Hubert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermophilic+anaerobes+in+Arctic+marine+sediments+induced+to+mineralize+complex+organic+matter+at+high+temperature.">Thermophilic anaerobes in Arctic marine sediments induced to mineralize complex organic matter at high temperature.</a> Environ Microbiol. 12 (4), 1089-1104 (2010).</li><li>Garbeva, P., van Veen, J. A., van Elsas, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predominant+Bacillus+spp.+in+agricultural+soil+under+different+management+regimes+detected+via+PCR-DGGE.">Predominant Bacillus spp. in agricultural soil under different management regimes detected via PCR-DGGE.</a> Microb Ecol. 45 (3), 302-316 (2003).</li><li>Brill, J. A., Wiegel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+between+spore-forming+and+asporogenic+bacteria+using+a+PCR+and+southern+hybridization+based+method.">Differentiation between spore-forming and asporogenic bacteria using a PCR and southern hybridization based method.</a> J Microbiol Methods. 31 (1-2), 29-36 (1997).</li><li>Rueckert, A., Ronimus, R. S., Morgan, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+real-time+PCR+assay+targeting+the+sporulation+gene,+spo0A.,+for+the+enumeration+of+thermophilic+bacilli+in+milk+powder.">Development of a real-time PCR assay targeting the sporulation gene, spo0A., for the enumeration of thermophilic bacilli in milk powder.</a> Food Microbiol. 23 (3), 220-230 (2006).</li><li>Bueche, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+endospore-forming+firmicutes+by+quantitative+PCR+with+the+functional+gene+spo0A.">Quantification of endospore-forming firmicutes by quantitative PCR with the functional gene spo0A.</a> Appl Environ Microbiol. 79 (17), 5302-5312 (2013).</li><li>Wunderlin, T., Junier, T., Roussel-Delif, L., Jeanneret, N., Junier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endospore-enriched+sequencing+approach+reveals+unprecedented+diversity+of+Firmicutes+in+sediments.">Endospore-enriched sequencing approach reveals unprecedented diversity of Firmicutes in sediments.</a> Environ Microbiol Rep. 6 (6), 631-639 (2014).</li><li>Nicholson, W. L., Law, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+purification+of+bacterial+endospores+from+soils:+UV+resistance+of+natural+Sonoran+desert+soil+populations+of+Bacillus+spp.+with+reference+to+B.+subtilis+strain+168.">Method for purification of bacterial endospores from soils: UV resistance of natural Sonoran desert soil populations of Bacillus spp. with reference to B. subtilis strain 168.</a> J Microbiol Methods. 35 (1), 13-21 (1999).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Der Widerstand der Endosporen externe aggressive physikochemische Faktoren (zB Temperatur oder Waschmittel) wurde verwendet, um ein Verfahren, um bakterielle Endosporen von vegetativen Zellen in Umweltproben getrennt entwickeln. Dies ist die erste umfassende Methode, um Endosporen aus Umweltproben in einem zerstörungsfrei zu isolieren. Früheren Methoden zu quantifizieren ist, nachzuweisen oder zu analysieren Endosporen Proben wurden über die Messung des spezifischen Proxies für Endosporen wie Dipicolinsäure oder spezifischer Marker-Gene. Demgegenüber ist bei dem hier vorgestellten Protokoll, ausgenommen Endosporen Probenbestandteile entfernt werden, so dass die Endosporen schließlich als einzige und gereinigten Reste der Probe bleibt. Obwohl auch andere Verfahren wie Pasteurisierung oder Dichtegradientenzentrifugation wurden vorgeschlagen, um für Endosporen 22 anzureichern, unsere Tests gezeigt, dass Dichtegradientenzentrifugation nicht geeignet ist als ein allgemeines Verfahren zur UmweltprobenAufgrund physiologischer Differenzen und unterschiedlichen Dichten der verschiedenen Arten von Endosporen Nern (Daten nicht gezeigt). Im Gegensatz dazu kann unser Protokoll leicht an alle Arten von Umweltproben verwendet werden und eignet sich für nachfolgende Anwendungen einschließlich molekularer Methoden oder Kultivierung. Es gibt zwei kritische Schritte in dem Protokoll. Die erste ist die Abtrennung von Biomasse aus der Probenmatrix (dh Sedimentpartikeln). Wesentlich ist, dass die Anzahl der Zellen von der Matrix getrennt ist, maximiert werden, um nicht einen Teil der Vielfalt zu übersehen. Für Sedimentproben, wie hier verwendet, ist eine der wichtigsten Einschränkungen des Protokolls ist die Tatsache, daß einige Zellen oder Sporen können nicht aus dem Sedimentmatrix abgelöst wurden und deshalb nicht in die nachgeschaltete Analyse, die eine potentielle Beschränkung des Verfahrens besteht darin enthaltenen . In Abhängigkeit von der Probenmatrix (zum Beispiel wenn es Huminsäuren) Zellen können fest daran gebunden werden kann und daher schwer zu lösen.Die Verwendung von ortho-Phosphat-Puffer sowie gute Homogenisierung mit einem Homogenisator oder Mischer sind wichtig bei diesem Schritt. Um die Wiederherstellung zu steigern, wird das Verfahren der Homogenisierung und Entfernung von Biomasse zweimal wiederholt, wie im Protokoll geschrieben. Das hier beschriebene Protokoll wurde entwickelt und für Proben von Süßwasser-See Sediment optimiert. Einige Parameter möglicherweise nicht optimal für die anderen Arten von Proben sein. Ein Weg, um die Gemeinschaft Fraktion, die möglicherweise in dem Verfahren übersehen wurde analysiert würde, um das Sediment Matrix zur DNA-Extraktion und Amplikon-Sequenzierung unterwerfen. Wie möglich Modifikationen der Technik, kann der Schritt der Abtrennung der Biomasse aus der Probenmatrix weggelassen werden. Insbesondere, wenn die Umweltprobe nicht enthält organisches Material oder mineralische Partikel, die mit dem stromabwärts-Protokoll (zB Wasser, andere Flüssigkeiten oder gereinigte Kulturen) stören könnten, können vor Trennung nicht erforderlich ist. Für flüssige Proben das Protokoll können Sie direkt im Kapitel 3 zu starten(Sammlung von Biomasse auf Filtermembran). Der zweite wichtige Schritt des Protokolls ist die Behandlung mit Lysozym, Hitze, NaOH und SDS zu zerstören vegetativen Zellen. Temperatur, Dauer sowie Chemikalienkonzentration wurden alle als nicht Endosporen schaden optimiert, während die Zellen zu zerstören. Diese Parameter sollten daher eng gehalten werden, wie sie sind. Die Verwendung eines ersten Schrittes des Erhitzens der Probe bei 65 ° C sehr wirksam war, um speziell für Endosporen wählen im Vergleich zu anderen Arten von bakteriellen Sporen oder Sporenartigen Strukturen unter den Bakterienstämmen von Actinobacteria Myxobakterien, Cyanobakterien auftritt, die im Allgemeinen nicht hitzebeständig. Wie in Tabelle 1 zu sehen ist, sind nicht-sporenbildender Bakterien nach der Behandlung noch (8,3% bis 14%) vor. Einige Erklärungen dafür sind, dass Sedimentproben sind sehr komplex und können auch den Hafen beständig nicht sporenZellen. Darüber hinaus können übrig gebliebene organische Material ein bestimmter ermöglichen<html> ttached Zellen überleben die Behandlung. Um den Anteil an nicht sporenbildenden Zellen in den behandelten Proben weiter zu reduzieren, sollte das Verfahren auf individuelle Probentyp optimiert werden. Das Verfahren stellt eine neuartige Werkzeug für die gezielte Untersuchung von endospore Nern in Umweltproben. Die Behandlung, um vegetative Zellen zerstören kann auf Reinkulturen von Zellen und Endosporen getestet und an die individuellen Widerstand der Zellen entsprechen. Die Zerstörung der Zellen kann in den Kurven in Figur 2 gezeigten behandelten Kulturen zu sehen. Das verzögerte Wachstum der behandelten Kulturen kann aufgrund der Zeit, die Endosporen müssen neu keimen und zu bewegen, in der exponentiellen Wachstumsphase sein. Andere mögliche Erklärungen für diese Verzögerung könnte auch eine Schwächung des endospore Kultur oder niedriger Zellzahlen nach der Behandlung sein. Wenn die getrennten Endosporen sind nicht für die DNA-Extraktion verwendet wird, kann der letzte Schritt der DNase-Behandlung verzichtet werden kann. nt &quot;&gt; Future Anwendungen dieser Technik konnten in Industrien pathogenen Endosporen erkannt werden müssen in Betracht gezogen werden. Ein Beispiel ist in der Lebensmittelindustrie und der klinischen Forschung, wo die Detektion und Analyse (zur Identifizierung) der Endosporen und seine Unterscheidung von vegetativen Zellen (beispielsweise von Lebensmitteln wie Milch oder Erzeugnisse auf Milchbasis) ist von entscheidender Bedeutung. Dies könnte insbesondere relevant bedenkt, dass viele Standardverfahren berücksichtigen direkten DNA-Extraktion aus einer Probe unter Verwendung lytischen Enzymen, die nicht dazu geeignet sind, Endosporen Lyse werden, was somit wird sehen werden kann. Mit dem hier vorgestellten Verfahren können die Zellen entfernt werden, und die anschließende Analyse Antworten auf die Anwesenheit oder Abwesenheit von Endosporen im Gegensatz zu den Zellen bereitzustellen. Andere Anwendungen umfassen die Analyse von Endosporen Ebene in verschiedenen Umweltproben (beispielsweise Eis oder Sedimentkernen ), die historischen Archive der Umweltbedingungen sind. In vielen Umgebungen mit relativ stabilen environmental Bedingungen (zB See Sedimentoberfläche) endospore bildenden Firmicutes können in Form von vegetativen Zellen gedeihen. Wenn die Bedingungen sich verschlechtern (beispielsweise durch Nährstoffverarmung im Sediment Beerdigung oder einer Verschiebung hin zu anaeroben Bedingungen) die Zellen zu verschieben, in Endospore Staat. Daher können die abgerufenen endospore Gemeinden aus Sedimentkernen die Umgebungsbedingungen zum Zeitpunkt der Bestattung zu reflektieren und damit als paläoökologische Indikator für die Bedingungen vor der Beerdigung verwendet werden. Wir sind jedoch immer noch das Sammeln von Informationen diesen Anspruch zu unterstützen.

Das Ziel dieser Arbeit besteht darin, ein Protokoll für die Abtrennung von bakteriellen Endosporen aus vegetativen Bakterienzellen in Umweltproben bereitzustellen. Die Bildung von bakteriellen Endosporen ist eine Überlebensstrategie, in der Regel durch Verhungern ausgelöst, in einer Anzahl von Bakteriengruppen zum Stamm Firmicutes 1 gehör gefunden. Endosporen-bildende Bakterien sind gut untersucht, vor allem, da eine Reihe von Stämmen sind Krankheitserreger und folglich der medizinischen Bedeutung (zB Bacillus anthracis oder Clostridium difficile). Umwelt Stämme von Endosporen-bildenden Bakterien wurden aus nahezu jedem Umfeld (Boden, Wasser, Sediment, Luft, Eis, menschlichen Darm, Tiere gut, und mehr) 1-3 isoliert. Daher sind Firmicutes das zweithäufigste Stamm in Stammsammlungen 4. Wegen ihrer hardy äußeren Rinde und Schutzkernproteine ​​können Endosporen extremen Umweltbedingungen im Bereich fr überlebenom Austrocknung zu hohe Strahlungs, extreme Temperaturen und schädliche Chemikalien 5. Diese bemerkenswerte Widerstandsfähigkeit macht es eine Herausforderung, DNA von Endosporen 6-8 extrahieren. Dies erklärt wahrscheinlich, warum sie in der Umweltsequenzierungsstudien 9,10 sehen worden. Andere Verfahren, wie die Zielrichtung Endosporen in Umweltproben durch fluoreszierende Antikörper 11, Quantifizierung von Dipicolinsäure (DPA) im Boden 12 und Sediment 13, Durchflusszytometrie 14 oder Pasteurisierung und anschließende Kultivierung 15,16 verwendet worden, um in abzurufen oder zu quantifizieren Endosporen Umweltproben. In den letzten Jahren optimierten DNA-Extraktionsverfahren als auch spezifische molekulare Primer zielen Endosporen spezifischer Gensequenzen wurden entwickelt 10,17-20. Dies hat dazu beigetragen, mehr Biodiversität in dieser Gruppe von Bakterien 21 offenbaren und hat sich auch auf Anwendungen in Industrie und Medizin zum Nachweis von Endosporen geführtZum Beispiel in Milchpulver 19. Das hier vorgestellte Protokoll basiert auf dem Unterschied in der Beständigkeit gegenüber Schad physikochemischen Bedingungen (wie Wärme und Reinigungsmittel) von bakteriellen Endosporen verglichen mit Zellen, vegetativen basiert. Vegetativen Zellen in einer Probe zu zerstören wir nacheinander erhitzen, Lysozym und niedrigen Konzentrationen von Detergentien. Die Zeit und die Kraft dieser Behandlungen sind optimiert worden, um nicht-Sporen zu zerstören, sondern um alle vegetativen Zellen lysieren. Einige Zellen in einer Umweltzellpool sind widerstandsfähiger als andere, so, um die Wahrscheinlichkeit der Zerstörung aller vegetativen Zellen zu erhöhen, verwenden wir drei verschiedene Behandlungen. Der Vorteil und die Neuheit dieses Verfahrens ist, dass die Endosporen nach der Behandlung noch intakt und kann für weitere Downstream-Analysen verwendet werden. Dazu gehören DNA-Extraktion, quantitative PCR (qPCR) und Amplikon oder Metagenom-Sequenzierung (Targeting gezielt die Gruppe der Endosporen und damit Reduzierung diversity, bei gleichzeitiger Erhöhung Deckung). Die Endosporen könnte auch für die nachgeschalteten Anbau oder die Quantifizierung durch Fluoreszenzmikroskopie verwendet werden, Durchflusszytometrie oder Detektion von DPA. Ein wichtiges Merkmal dieses Verfahrens ist, dass durch Vergleichen eines unbehandelten Probe mit einer behandelten Probe, kann man die Menge und Vielfalt von Endosporen in einer Umweltprobe zusätzlich zu der Komponente, die Zellen vegetativen abzuleiten.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="596">
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Whatman nitrocellulose membrane filters, 0,2 um pore size, 47 mm diameter</td>
			<td style="width:95px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td colspan="2" style="width:285px;">WHA7182004 Aldrich&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tris(hydroxymethyl)aminomethane</td>
			<td style="width:95px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>252859 Sigma-Aldrich</td>
			<td>CAS 77-86-1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9884 Sigma-Aldrich</td>
			<td>CAS&#160; 60-00-4&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Lysozyme from chicken egg white</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>62971 Fluka</td>
			<td>powder, CAS&#160; 12650-88-3&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ultra-Turrax homogenizer T18 basic</td>
			<td style="width:95px;">IKA</td>
			<td>3720000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Glass filter holders for 47 mm membranes, pyrex glass</td>
			<td style="width:95px;">EMD Millipore</td>
			<td>XX10 047 00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Chemical duty vacuum pump</td>
			<td style="width:95px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">WP6122050</td>
			<td>220 V/50 Hz</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Manifold sampling filtration for 25 mm membranes</td>
			<td style="width:95px;">Millipore</td>
			<td>1225 Sampling Manifold</td>
			<td>polypropylene</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dnase</td>
			<td style="width:95px;">New England Biolabs</td>
			<td>M0303S</td>
			<td>Rnase free</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NaOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5881 Sigma-Aldrich</td>
			<td>CAS&#160; 1310-73-2&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium dodecyl sulfphate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3771 Sigma&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Whatman nitrocellulose membrane filters, 0,2 um pore size, 25 mm diameter</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td colspan="2">WHA7182002 Aldrich</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

physical isolation of endospores from environmental samples by targeted lysis of vegetative cells

Endospore formation is a survival strategy found among some bacteria from the phylum Firmicutes. During endospore formation, these bacteria enter a morpho-physiological resting state that enhances survival under adverse environmental conditions. Even though endospore-forming Firmicutes are one of the most frequently enriched and isolated bacterial groups in culturing studies, they are often absent from diversity studies based on molecular methods. The resistance of the spore core is considered one of the factors limiting the recovery of DNA from endospores. We developed a method that takes advantage of the higher resistance of endospores to separate them from other cells in a complex microbial community using physical, enzymatic and chemical lysis methods. The endospore-only preparation thus obtained can be used for re-culturing or to perform downstream analysis such as tailored DNA extraction optimized for endospores and subsequent DNA sequencing. This method, applied to sediment samples, has allowed the enrichment of endospores and after sequencing, has revealed a large diversity of endospore-formers in freshwater lake sediments. We expect that the application of this method to other samples will yield a similar outcome.

Die hier vorgestellten Ergebnisse wurden bereits veröffentlicht 10,21. Bitte für die Umwelt Interpretation und Diskussion der Daten beziehen sich auf diesen Artikel. Das Gesamtverfahren ist in Figur 1 zusammengefaßt und entspricht drei Hauptschritten: Zuerst wird die Trennung von Biomasse aus Sediment oder andere umwelt Matrix; Zweitens ist die Zerstörung von vegetativen Zellen; und drittens die nachgeschaltete Analyse der getrennten Endosporen. Downstream Analyse könnte bestehen, beispielsweise der DNA-Extraktion und Amplikon-Sequenzierung Vielfalt bestimmen. Die DNA-Extraktion optimiert werden muss, um die Lyse von Endosporen gewährleisten. In Sedimentproben haben wir dies durch die Verwendung eines kraftvollen sequentielle DNA-Extraktionsverfahren 10 erreicht. Die Anwendung des Verfahrens im Sediment zeigt eine signifikante Zunahme in der Fraktion der Endosporen bildende Firmicutes nach der Trennung. Im Amplikon-Sequenzierung der 16S rRNAGens, Firmicutes in den unbehandelten Proben (ganze Gemeinde) entsprach nur 8,0 und 19,0% der Sequenzen (Tabelle 1). Im Gegensatz dazu nach der Behandlung Firmicutes repräsentiert 90,6% und 83,9% des endospore angereicherte Probe. Die zwei Großaufträge von Endosporen bildenden Firmicutes, Bacilliales und Clostridiales wurden mit der Methode angereichert, im Gegensatz zu der Abwesenheit von Aufträgen wie Lactobacilliales dass nicht endospore bildenden Firmicutes sind. Um zu zeigen, daß das Verfahren besonders geeignet ist für die Anreicherung von wahren Endosporen wurden andere Gruppen, die zur Herstellung von sporenartigen Strukturen analysiert. Dementsprechend ist die Frequenz des Actinobacteria, Cyanobakterien und Myxococcales nahm nach der Behandlung, um Zellen zu lysieren. Die Effizienz der Behandlung wurde ebenfalls unter Verwendung von Reinkulturen demonstriert. Ein endospore Herstellung (&gt; 95% Endosporen) Paenibacillus alvei, Bacillus subtilis und Bacillus megaterium </em&gt; sowie eine vegetative Zellkultur von Escherichia coli wurden behandelt, wie in dem Protokoll für die Lyse von vegetativen Zellen beschrieben. Alle Kulturen wurden anschließend in Nährbouillon bei 37 ° C inkubiert und das Wachstum wurde unter Verwendung von optischen Dichte bei 600 nm Wellenlänge gemessen. Wachstum wurde für die Endosporen Kulturen beobachtet, während kein Wachstum wurde in dem behandelten E. beobachtet coli-Kultur, was beweist, dass die vegetativen Zellen sind irreversibel geschädigt (Abbildung 2). <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53411/53411fig1.jpg" /> Figur 1. Übersicht der Versuchsdurchführung. Verfahren zur Ableitung Endosporen bildenden Bakterien in Umweltproben zu bereichern. Der Schritt der Abtrennung von Zellen und Endosporen vom Umweltmatrix kann in Abhängigkeit von der Art der Probe (dh Wasserprobe) weggelassen werden. In der Figur sind die nachgeschalteten Verfahren auf der Sporen angereicherte Fraktion corre angewendetchen, um DNA-Extraktion und Hochdurchsatz-Sequenzierung. Diese Schritte können durch Kultivieren ersetzt werden. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53411/53411fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53411/53411fig2.jpg" /> Figur 2. Überprüfung der Behandlung auf Reinkulturen. Wachstumskurven Verifizieren des Wachstums von Endosporen-bildende Bakterien von einer Suspension von Endosporen von Bacillus subtilis, Bacillus megaterium und Paenibacillus alvei und einer Zellkultur von Escherichia coli mit dem Verfahren zur Lyse behandelt der Zellen. Behandelt = ○. Unbehandelt = ●. Fehlerbalken aus drei unabhängigen Kulturen. Wachstum der Kontrollkulturen und Wiederwachstum des behandelten Kulturen wurde als optische Dichte bei 600 nm Wellenlänge gemessen. Diese Zahl wurde neu gedruckt from Wunderlin et al. 2014 mit Genehmigung. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53411/53411fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:129px;"></td><td style="width:80px;"> Sediment 1 </td><td style="width:80px;"></td><td style="width:80px;"> Sediment 2 </td><td style="width:80px;"></td></tr><tr height="38"><td height="38" style="height:39px;"></td><td style="width:80px;"> ganze Gemeinde </td><td style="width:80px;"> endospore angereicherte </td><td style="width:80px;"> ganze Gemeinde </td><td style="width:80px;"> endospore angereicherte </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> Firmicutes </td><td> 8.0 </td><td> 90,6 </td><td> 19,0 </td><td>83,9 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> Bazillen </td><td> 0,5 </td><td> 100 </td><td> 5.7 </td><td> 15.1 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> Clostridien </td><td> 7.4 </td><td> 76,9 </td><td> 12,5 </td><td> 63,2 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> Actinobacteria </td><td> 2.4 </td><td> 1.0 </td><td> 4.4 </td><td> 2.1 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> Cyanobakterien </td><td> 1.1 </td><td> 0.1 </td><td> 0.7 </td><td> 0.1 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> Myxococcales </td><td> 0.7 </td><td> 0.0 </td><td> 0,2 </td><td> 0.0 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> Andere Bakterien </td><td> 87,8 </td><td> 8.3 </td><td> 75,7 </td><td> 13,9 </td></tr></tbody></table> &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Tabelle 1 Fülle von Endosporen und andere sporenbildenden Bakteriengruppen. Relative Häufigkeit der Firmicutes (endospore Nern) und anderen Bakteriengruppen Herstellung sporenartige Strukturen in zwei Sedimentproben, die der gesamten (unbehandelt) und endospore angereicherte (behandelt) Gemeinden.

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Physical Isolation of Endospores from Environmental Samples by Targeted Lysis of Vegetative Cells

A method to single out bacterial endospores from complex microbial communities was developed to perform tailored culture or molecular studies of this group of bacteria.

Physische Isolierung von Endospores aus Umweltproben durch gezielte Lyse von vegetativen Zellen

Endospore formation is a survival strategy found among some bacteria from the phylum Firmicutes. During endospore formation, these bacteria enter a ...

physical-isolation-endospores-from-environmental-samples-targeted

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Environment

14.1K Aufrufe.  Macquarie University. A method to single out bacterial endospores from complex microbial communities was developed to perform tailored culture or molecular studies of this group of bacteria.

Serie: Physical Isolation of Endospores from Environmental Samples by Targeted Lysis of Vegetative Cells

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. I. Collection of Virus Samples

EPA Method 1615 was developed with a goal of providing a standard method for measuring enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. The standardized sampling component of the method concentrates viruses that may be present in water by passage of a minimum specified volume of water through an electropositive cartridge filter. The minimum specified volumes for surface and finished/ground water are 300 L and 1,500 L, respectively. A major method limitation is the tendency for the filters to clog before meeting the sample volume requirement. Studies using two different, but equivalent, cartridge filter options showed that filter clogging was a problem with 10% of the samples with one of the filter types compared to 6% with the other filter type. Clogging tends to increase with turbidity, but cannot be predicted based on turbidity measurements only. From a cost standpoint one of the filter options is preferable over the other, but the water quality and experience with the water system to be sampled should be taken into consideration in making filter selections.

EPA Method 1615 uses an electropositive filter to concentrate enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. This manuscript describes the procedure for collecting samples for Method 1615 analyses.

EPA-Methode 1615 Messung der Enterovirus und Norovirus Vorkommen in Wasser von Kultur und RT-qPCR. I. Sammlung von Virenproben

EPA Method 1615 was developed with a goal of providing a standard method for measuring enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. ...

Forschung

Umwelt

Physical, Chemical and Biological Characterization of Six Biochars Produced for the Remediation of Contaminated Sites

The physical and chemical properties of biochar vary based on feedstock sources and production conditions, making it possible to engineer biochars with specific functions (e.g. carbon sequestration, soil quality improvements, or contaminant sorption). In 2013, the International Biochar Initiative (IBI) made publically available their Standardized Product Definition and Product Testing Guidelines (Version 1.1) which set standards for physical and chemical characteristics for biochar. Six biochars made from three different feedstocks and at two temperatures were analyzed for characteristics related to their use as a soil amendment. The protocol describes analyses of the feedstocks and biochars and includes: cation exchange capacity (CEC), specific surface area (SSA), organic carbon (OC) and moisture percentage, pH, particle size distribution, and proximate and ultimate analysis. Also described in the protocol are the analyses of the feedstocks and biochars for contaminants including polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs), polychlorinated biphenyls (PCBs), metals and mercury as well as nutrients (phosphorous, nitrite and nitrate and ammonium as nitrogen). The protocol also includes the biological testing procedures, earthworm avoidance and germination assays. Based on the quality assurance / quality control (QA/QC) results of blanks, duplicates, standards and reference materials, all methods were determined adequate for use with biochar and feedstock materials. All biochars and feedstocks were well within the criterion set by the IBI and there were little differences among biochars, except in the case of the biochar produced from construction waste materials. This biochar (referred to as Old biochar) was determined to have elevated levels of arsenic, chromium, copper, and lead, and failed the earthworm avoidance and germination assays. Based on these results, Old biochar would not be appropriate for use as a soil amendment for carbon sequestration, substrate quality improvements or remediation.

Biochar is a carbon-rich material used as a soil amendment with the ability to sustainably sequester carbon, improve substrate quality and sorb contaminants. This protocol describes the 17 analytical methods used for the characterization of biochar, which is required prior to large scale implementation of these amendments in the environment.

Physikalische, chemische und biologische Charakterisierung von Six Biokohlen Produziert für die Sanierung von Altlasten

The physical and chemical properties of biochar vary based on feedstock sources and production conditions, making it possible to engineer biochars with ...

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. Part III. Virus Detection by RT-qPCR

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a standardized method for use in multiple analytical laboratories during monitoring period 3 of the Unregulated Contaminant Monitoring Rule. Herein we present the protocol for extraction of viral ribonucleic acid (RNA) from water sample concentrates and for quantitatively measuring enterovirus and norovirus concentrations using reverse transcription-quantitative PCR (RT-qPCR). Virus concentrations for the molecular assay are calculated in terms of genomic copies of viral RNA per liter based upon a standard curve. The method uses a number of quality controls to increase data quality and to reduce interlaboratory and intralaboratory variation. The method has been evaluated by examining virus recovery from ground and reagent grade waters seeded with poliovirus type 3 and murine norovirus as a surrogate for human noroviruses. Mean poliovirus recoveries were 20% in groundwaters and 44% in reagent grade water. Mean murine norovirus recoveries with the RT-qPCR assay were 30% in groundwaters and 4% in reagent grade water.

Here we present a procedure to quantify enterovirus and norovirus in environmental and drinking waters using reverse transcription-quantitative PCR. Mean virus recovery from groundwater with this standardized procedure from EPA Method 1615 was 20% for poliovirus and 30% for murine norovirus.

EPA-Methode 1615 Messung der Enterovirus und Norovirus Vorkommen in Wasser, Kultur und RT-qPCR. Teil III. Virenerkennung durch RT-qPCR

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a ...

Automated Gel Size Selection to Improve the Quality of Next-generation Sequencing Libraries Prepared from Environmental Water Samples

Next-generation sequencing of environmental samples can be challenging because of the variable DNA quantity and quality in these samples. High quality DNA libraries are needed for optimal results from next-generation sequencing. Environmental samples such as water may have low quality and quantities of DNA as well as contaminants that co-precipitate with DNA. The mechanical and enzymatic processes involved in extraction and library preparation may further damage the DNA. Gel size selection enables purification and recovery of DNA fragments of a defined size for sequencing applications. Nevertheless, this task is one of the most time-consuming steps in the DNA library preparation workflow. The protocol described here enables complete automation of agarose gel loading, electrophoretic analysis, and recovery of targeted DNA fragments. 
In this study, we describe a high-throughput approach to prepare high quality DNA libraries from freshwater samples that can be applied also to other environmental samples. We used an indirect approach to concentrate bacterial cells from environmental freshwater samples; DNA was extracted using a commercially available DNA extraction kit, and DNA libraries were prepared using a commercial transposon-based protocol. DNA fragments of 500 to 800 bp were gel size selected using Ranger Technology, an automated electrophoresis workstation. Sequencing of the size-selected DNA libraries demonstrated significant improvements to read length and quality of the sequencing reads.

This manuscript describes an automated gel size selection approach for purifying DNA fragments for next-generation sequencing. The Ranger Technology provides complete automation of the entire process of agarose gel loading, electrophoretic analysis, and recovery of targeted DNA fragments allowing for high-throughput and high quality next-generation sequencing libraries.

Automatisierte Gel Größenauswahl, um die Qualität der nächsten Generation Sequencing Libraries von Umweltwasserproben vorbereitet verbessern

Next-generation sequencing of environmental samples can be challenging because of the variable DNA quantity and quality in these samples. High quality DNA ...

Removal of Trace Elements by Cupric Oxide Nanoparticles from Uranium In Situ Recovery Bleed Water and Its Effect on Cell Viability

In situ recovery (ISR) is the predominant method of uranium extraction in the United States. During ISR, uranium is leached from an ore body and extracted through ion exchange. The resultant production bleed water (PBW) contains contaminants such as arsenic and other heavy metals. Samples of PBW from an active ISR uranium facility were treated with cupric oxide nanoparticles (CuO-NPs). CuO-NP treatment of PBW reduced priority contaminants, including arsenic, selenium, uranium, and vanadium. Untreated and CuO-NP treated PBW was used as the liquid component of the cell growth media and changes in viability were determined by the MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) assay in human embryonic kidney (HEK 293) and human hepatocellular carcinoma (Hep G2) cells. CuO-NP treatment was associated with improved HEK and HEP cell viability. Limitations of this method include dilution of the PBW by growth media components and during osmolality adjustment as well as necessary pH adjustment. This method is limited in its wider context due to dilution effects and changes in the pH of the PBW which is traditionally slightly acidic&#160;however; this method could have a broader use assessing CuO-NP treatment in more neutral waters.

Removal of Trace Elements by Cupric Oxide Nanoparticles from Uranium In Situ Recovery Bleed Water and Its Effect on Cell Viability

Production bleed water (PBW) was treated with cupric oxide nanoparticles (CuO-NPs) and cellular toxicity was assessed in cultured human cells. The goal of this protocol was to integrate the native environmental sample into a cell culture format assessing the changes in toxicity due to CuO-NP treatment.

Die Entfernung der Spurenelemente von Kupferoxid Nanopartikeln aus Uranium<em&gt; In-situ-</em&gt; Wiederherstellung Blutwasser und Auswirkungen auf die Zelllebensfähigkeit

In situ recovery (ISR) is the predominant method of uranium extraction in the United States. During ISR, uranium is leached from an ore body and extracted ...

Preparation and Testing of Impedance-based Fluidic Biochips with RTgill-W1 Cells for Rapid Evaluation of Drinking Water Samples for Toxicity

This manuscript describes how to prepare fluidic biochips with Rainbow trout gill epithelial (RTgill-W1) cells for use in a field portable water toxicity sensor. A monolayer of RTgill-W1 cells forms on the sensing electrodes enclosed within the biochips. The biochips are then used for testing in a field portable electric cell-substrate impedance sensing (ECIS) device designed for rapid toxicity testing of drinking water. The manuscript further describes how to run a toxicity test using the prepared biochips. A control water sample and the test water sample are mixed with pre-measured powdered media and injected into separate channels of the biochip. Impedance readings from the sensing electrodes in each of the biochip channels are measured and compared by an automated statistical software program. The screen on the ECIS instrument will indicate either "Contamination Detected" or "No Contamination Detected" within an hour of sample injection. Advantages are ease of use and rapid response to a broad spectrum of inorganic and organic chemicals at concentrations that are relevant to human health concerns, as well as the long-term stability of stored biochips in a ready state for testing. Limitations are the requirement for cold storage of the biochips and limited sensitivity to cholinesterase-inhibiting pesticides. Applications for this toxicity detector are for rapid field-portable testing of drinking water supplies by Army Preventative Medicine personnel or for use at municipal water treatment facilities.

This manuscript describes how to prepare fluidic biochips with Rainbow trout gill epithelial cells for use in a field portable electric cell-substrate impedance sensor. The protocol for running a rapid drinking water toxicity test with the sensor is also described.

Herstellung und Prüfung von impedanzbasierten Fluidic Biochips mit RTgill-W1 Zellen für die schnelle Auswertung von Trinkwasserproben für Toxizität

This manuscript describes how to prepare fluidic biochips with Rainbow trout gill epithelial (RTgill-W1) cells for use in a field portable water toxicity ...

A Bending Test for Determining the Atterberg Plastic Limit in Soils

The thread rolling test is the most commonly used method to determine the plastic limit (PL) in soils. It has been widely criticized, because a considerable subjective judgment from the operator that carries out the test is involved during its performance, which may affect the final result significantly. Different alternative methods have been put forward, but they cannot compete with the standard rolling test in speed, simplicity and cost.
In an earlier study by the authors, a simple method with a simple device to determine the PL was presented (the &#34;thread bending test&#34; or simply &#34;bending test&#34;); this method allowed the PL to be obtained with minimal operator interference. In the present paper a version of the original bending test is shown. The experimental basis is the same as the original bending test: soil threads which are 3 mm in diameter and 52 mm long are bent until they start to crack, so that both the bending produced and its related moisture content are determined. However, this new version enables the calculation of PL from an equation, so it is not necessary to plot any curve or straight line to obtain this parameter and, in fact, the PL can be achieved with only one experimental point (but two experimental points are recommended).
The PL results obtained with this new version are very similar to those obtained through the original bending test and the standard rolling test by a highly experienced operator. Only in particular cases of high plasticity cohesive soils, there is a greater difference in the result. Despite this, the bending test works very well for all types of soil, both cohesive and very low plasticity soils, where the latter are the most difficult to test via the standard thread rolling method.

The traditional standardized test for determining the plastic limit in soils is performed by hand, and the result varies depending on the operator. An alternative method based on bending measurements is presented in this study. This allows the plastic limit to be obtained with a clear and objective criterion.

Ein Biegetest zur Bestimmung der Atterberg Ausrollgrenze in Böden

The thread rolling test is the most commonly used method to determine the plastic limit (PL) in soils. It has been widely criticized, because a ...

Use of a Filter Cartridge for Filtration of Water Samples and Extraction of Environmental DNA

Recent studies demonstrated the use of environmental DNA (eDNA) from fishes to be appropriate as a non-invasive monitoring tool. Most of these studies employed disk fiber filters to collect eDNA from water samples, although a number of microbial studies in aquatic environments have employed filter cartridges, because the cartridge has the advantage of accommodating large water volumes and of overall ease of use. Here we provide a protocol for filtration of water samples using the filter cartridge and extraction of eDNA from the filter without having to cut open the housing. The main portions of this protocol consists of 1) filtration of water samples (water volumes &#8804;4 L or &gt;4 L); (2) extraction of DNA on the filter using a roller shaker placed in a preheated incubator; and (3) purification of DNA using a commercial kit. With the use of this and previously-used protocols, we perform metabarcoding analysis of eDNA taken from a huge aquarium tank (7,500 m3) with known species composition, and show the number of detected species per library from the two protocols as the representative results. This protocol has been developed for metabarcoding eDNA from fishes, but is also applicable to eDNA from other organisms.

We describe a protocol for filtration of water samples with a filter cartridge and extraction of environmental DNA (eDNA) without having to cut open the housing to remove the filter. This protocol is developed for metabarcoding eDNA from fishes, but is also applicable to eDNA from other organisms.

Die Verwendung einer Filterpatrone für die Filtration von Wasserproben und Extraktion von Umwelt-DNA

Recent studies demonstrated the use of environmental DNA (eDNA) from fishes to be appropriate as a non-invasive monitoring tool. Most of these studies ...

Dispersion of Nanomaterials in Aqueous Media: Towards Protocol Optimization

The sonication process is commonly used for de-agglomerating and dispersing nanomaterials in aqueous based media, necessary to improve homogeneity and stability of the suspension. In this study, a systematic step-wise approach is carried out to identify optimal sonication conditions in order to achieve a stable dispersion. This approach has been adopted and shown to be suitable for several nanomaterials (cerium oxide, zinc oxide, and carbon nanotubes) dispersed in deionized (DI) water. However, with any change in either the nanomaterial type or dispersing medium, there needs to be optimization of the basic protocol by adjusting various factors such as sonication time, power, and sonicator type as well as temperature rise during the process. The approach records the dispersion process in detail. This is necessary to identify the time points as well as other above-mentioned conditions during the sonication process in which there may be undesirable changes, such as damage to the particle surface thus affecting surface properties. Our goal is to offer a harmonized approach that can control the quality of the final, produced dispersion. Such a guideline is instrumental in ensuring dispersion quality repeatability in the nanoscience community, particularly in the field of nanotoxicology.

Here, we present a step-wise protocol for the dispersion of nanomaterials in aqueous media with real-time characterization to identify the optimal sonication conditions, intensity, and duration for improved stability and uniformity of nanoparticle dispersions without impacting the sample integrity.

Dispersion von Nanomaterialien in wässrigen Medien: zur Protokoll-Optimierung

The sonication process is commonly used for de-agglomerating and dispersing nanomaterials in aqueous based media, necessary to improve homogeneity and ...

Isolation of Mandibular Gland Reservoir Contents from Bornean 'Exploding Ants' (Formicidae) for Volatilome Analysis by GC-MS and MetaboliteDetector

The aim of this manuscript is to present a protocol describing the metabolomic analysis of Bornean &#39;exploding ants&#39; belonging to the Colobopsis cylindrica (COCY) group. For this purpose, the model species C. explodens is used. Ants belonging to the minor worker caste possess distinctive hypertrophied mandibular glands (MGs). In territorial combat, they use the viscous contents of their enlarged mandibular gland reservoirs (MGRs) to kill rival arthropods in characteristic suicidal &#39;explosions&#39; by voluntary rupture of the gastral integument (autothysis). We show the dissection of worker ants of this species for the isolation of the gastral portion of the wax-like MGR contents as well as listing the necessary steps required for solvent-extraction of the therein contained volatile compounds with subsequent gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) analysis and putative identification of metabolites contained in the extract. The dissection procedure is performed under cooled conditions and without the use of any dissection buffer solution to minimize the changes in the chemical composition of the MGR contents. After solvent-based extraction of volatile metabolites contained therein, the necessary steps for analyzing the samples via liquid-injection-GC-MS are presented. Lastly, data processing and putative metabolite identification with the use of the open-source software MetaboliteDetector is shown. With this approach, the profiling and identification of volatile metabolites in MGRs of ants belonging to the COCY group via GC-MS and the MetaboliteDetector software become possible.

Isolation of Mandibular Gland Reservoir Contents from Bornean 'Exploding Ants' Formicidae for Volatilome Analysis by GC-MS and MetaboliteDetector

Minor workers of the ant species Colobopsis explodens are dissected to isolate the wax-like content stored in their hypertrophied mandibular gland reservoirs for subsequent solvent-extraction and analysis by gas chromatography-mass spectrometry. The&#160;annotation and identification of volatile constituents using the open-source software MetaboliteDetector is also described.

Isolierung der Unterkiefer Drüse Reservoir Inhalt von Bornean "explodierende Ameisen (Ameisen) für die Volatilome Analyse von GC-MS und MetaboliteDetector

The aim of this manuscript is to present a protocol describing the metabolomic analysis of Bornean &#39;exploding ants&#39; belonging to the Colobopsis ...