Gli autori riconoscono la National Science Foundation svizzero per Grant No. 31003A-132358/1, 31003A_152972 e n 151.948, e Fondazione Pierre Mercier pour la Science.

1. Preparazione di prodotti chimici e attrezzature <ol><li> Fare 500 ml di una esametafosfato di sodio all&#39;1% (SHMP) (NaPO 3) n soluzione e sterilizzare in autoclave. </li><li> Sterilizzare nitrocellulosa (NC) filtri (diametro dei pori 0,22 micron, 47 mm di diametro) in autoclave in vetro chiuso Petri. </li><li> Sterilizzare filtri NC (dimensione dei pori di 0,22 micron, 25 mm di diametro) in autoclave in vetro chiuso piastre di Petri. </li><li> Pesare e prendere nota del peso a vuoto di sterili provette da 50 ml (con tappo) (un tubo per campione). </li><li> Preparare Tris-EDTA-buffer (TE-buffer) 1x: rendere la soluzione di 10 mM Tris (tris (idrossimetil) aminometano) e 1 tampone mM EDTA. Regolare il pH a 8 e sterilizzare in autoclave. </li><li> Preparare la soluzione di lisozima (20 mg / ml) sciogliendo 0,02 g di lisozima in 1 ml di TE-buffer. Idealmente, fare fresco ogni volta. Conservare a 4 ° C per non più di 1 settimana. </li><li> Preparare la soluzione fisiologica sciogliendo 8 g / l di cloruro di sodio(NaCl) in acqua distillata. Sterilizzare in autoclave. </li></ol> 2. Separazione di biomassa da sedimenti <ol><li> Aggiungere 3 g di campione di sedimento di pre-pesare sterili provette da 50 ml con palline di metallo etanolo fiammato. Eseguire questo in una, UV sterilizzata armadio biosicurezza pulito per evitare la contaminazione. </li><li> Aggiungere 15 ml di una sterile (autoclave) Soluzione SHMP 1% al campione utilizzando una sterile buretta. La soluzione può SHMP inoltre il filtraggio per evitare la contaminazione. </li><li> Omogeneizzare il sedimento e la soluzione SHMP con un dispersore liquido / omogeneizzatore (ad esempio, Ultra-Turrax omogeneizzatore). 70% di etanolo o sterilizzare in autoclave il rotore di dispersione prima dell&#39;uso. Eseguire l&#39;omogeneizzazione per 1 min a 17.500 rpm. Lasciare riposare campione per 2 minuti e ripetere l&#39;omogeneizzazione per 1 min alla stessa velocità del rotore. </li><li> Lasciate riposare il campione per 10 min. A questo punto, le particelle più pesanti (minerali) si sistemerà. Le cellule ei componenti organici del campione tuttavia wmalato rimangono in soluzione. Successivamente, trasferire la soluzione surnatante (contenente biomassa cellulare) in una provetta pulita da 50 ml, facendo attenzione a non disturbare il pellet sedimento. </li><li> Per il pellet sedimento aggiungere nuovamente 15 ml di una sterile (autoclave) Soluzione SHMP 1% con una sterile buretta. Poi ripetere i punti 2.3 e 2.4. Questa ripetizione assicura la separazione della quantità massima di cellule e particelle organiche dalla componente minerale del sedimento. Il supernatante di questa seconda separazione può essere fusa con il supernatante dal prima separazione. Nota: Le seguenti operazioni sono tutti fatti sul surnatante (contenente biomassa cellulare). La componente minerale (sedimenti pellet) può essere scartato. </li><li> Centrifugare il campione a 20 xg per 1 min. Questo passaggio aumenta la forza g sufficiente per risolvere piccole particelle minerali mentre il materiale cellula biologica rimane in soluzione. Dopo centrifugazione, trasferire la soluzione surnatante (contenente biomassa cellulare) in unpulito tubo da 50 ml. Eliminare il pellet minerale. </li><li> Determinare il volume finale della soluzione contenente biomassa pesando il campione. La determinazione del peso evita di dover trasferire il campione ad un cilindro graduato e riduce il rischio di contaminazione. </li></ol> 3. Raccolta di biomassa su membrana filtrante <ol><li> Preparare unità di filtrazione (per 47 mm di membrane di diametro) e pompa del vuoto. Sterilizzare l&#39;unità di filtrazione sia in autoclave o (se Pyrex vetro) spruzzando con il 70% di etanolo e fiamme con un becco Bunsen. Lasciate raffreddare prima di continuare con il protocollo. </li><li> Aggiungere sterili membrana NC all&#39;unità di filtrazione con pinze sterilizzate etanolo fiammato. </li><li> Aggiungere metà del campione surnatante (dal punto 2.6) sul gruppo di filtrazione a membrana e raccogliere le cellule sulla membrana utilizzando la pompa a vuoto. </li><li> Quando il liquido è completamente passata attraverso il filtro, arrestare la pompa per vuoto e rimuovere con cautela la membrana utilizzando ethanol-fiamma pinza sterilizzata. Posizionare la membrana in una piastra di Petri sterile. <ol><li> Tagliare la membrana a metà con le forbici sterilizzate etanolo fiammato. Aggiungere ogni metà della membrana su un tubo separato 2 ml. Una metà della membrana sarà utilizzata per l&#39;estrazione del DNA e l&#39;analisi dell&#39;intera comunità batterica. L&#39;altra metà del filtro sarà conservato a -80 ° C e serve come backup. </li></ol></li><li> Posizionare nuova membrana NC sul gruppo di filtrazione e raccogliere biomassa dalla seconda metà del volume del campione (dal punto 2.6) con la pompa a vuoto. </li><li> Quando il liquido è completamente passata attraverso il filtro, arrestare la pompa per vuoto e rimuovere con cautela la membrana con pinze sterili etanolo fiammato. Posizionare tutta la membrana in un tubo separato 2 ml. Questo campione verrà utilizzato per il trattamento di separare endospore da cellule vegetative. Il campione può essere conservato a -20 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li></ol> 4. Lisi di cellule vegetative <ol><li> Eseguire latrattamento per separare endospore dalle cellule vegetative sulla biomassa precedentemente raccolto su una membrana NC (passo 3.6). <ol><li> Se la membrana è stato congelato, lasciarlo a temperatura ambiente per 10 minuti per scongelare. Poi posto la membrana in una piastra di Petri sterile e tagliarlo (circa 4 volte) in pezzi più piccoli con le forbici sterilizzate etanolo fiammato. Poi posto tutti i pezzi del filtro a membrana in una provetta sterile da 2 ml. </li></ol></li><li> Aggiungere 900 ml di 1x TE (Tris-EDTA) Buffer (vedi 1.5) per il tubo contenente la membrana campione e mescolare accuratamente vortice. A questo punto, la biomassa viene rimosso dalla membrana nella soluzione TE-buffer. </li><li> Porre il tubo in un incubatore a 65 ° C per 10 min e 80 rpm. Successivamente rimuovere il tubo dal termostato e lasciarlo raffreddare per 15 minuti. </li><li> Aggiungere 100 ml di lisozima preparata di fresco (vedi 1.5) per ottenere una concentrazione finale di 2 mg / ml. Non aggiungere il lisozima prima che il campione è raffreddato a 37 ° C, in quanto questo potrebbe degRade l&#39;enzima. </li><li> Incubare il campione a 37 ° C per 60 min e 80 rpm, le condizioni ottimali per il lisozima di lisare cellule vegetative. </li><li> Dopo lisi è completa, aggiungere 250 ml di idrossido di 3 N di sodio (NaOH) e 250 ml di soluzione al 6% sodio dodecilsolfato (SDS) al campione. Aggiungendo questo, il volume del campione raggiunge 1,5 ml e vi è una concentrazione finale di 0,5 N NaOH e concentrazione finale di 1% SDS. </li><li> Incubare la miscela a temperatura ambiente per 60 min e 80 rpm. Aggiunta la base e detergenti aiuterà nella lisi cellulare finale. La concentrazione di questi detergenti è stato ottimizzato per non danneggiare le endospore, mentre lisi cellule vegetative. </li><li> Preparare un&#39;unità di filtrazione sterile che contiene 25 mm di diametro membrane in autoclave, o (se Pyrex vetro) spruzzandolo con 70% etanolo e fiamme con un becco Bunsen. Lasciate raffreddare. </li><li> Posizionare un NC membrana 0,2 micron (diametro 25 mm) in unità di filtrazione con pinze etanolo fiamma sterilizzati. &lt;/ li&gt; <li> Aggiungere il campione dal punto 4.7 sulla membrana e filtrare il liquido con la pompa a vuoto. Quando il liquido è passato attraverso, spegnere pompa a vuoto. A questo punto, il materiale cellula vegetativa lisato viene rimosso, in quanto non è trattenuto sulla membrana. Solo endospore rimarranno sulla membrana. </li><li> Aggiungere 2 ml di soluzione fisiologica sterile per lavare detergenti residue e filtrare il liquido con la pompa a vuoto. </li><li> Quando il liquido è completamente filtrato, spegnere la pompa del vuoto. Lasciare la membrana sul gruppo di filtrazione. </li></ol> 5. Il trattamento DNasi Nota: eseguire il trattamento DNasi direttamente sulla membrana del filtro. È importante che l&#39;unità di filtrazione non perde e la pompa a vuoto è spento. <ol><li> Aggiungere 450 ml di acqua sterile, 50 ml di tampone di reazione DNasi (1x) e 0,5 microlitri DNasi enzima direttamente sulla membrana del filtro e lasciar riposare per 15 minuti. Se possibile, fare questo digestione in una stanza che è un po &#39;di guerramer della media RT, poiché l&#39;enzima funziona meglio a temperature di 25 ° C e oltre. Nota: Mantenere il becco Bunsen parte l&#39;unità di filtrazione aumenta anche la temperatura e ha il vantaggio di mantenere le frazioni sterile, quindi ridotto rischio di contaminazione dei campioni. </li><li> Quando la digestione DNasi è terminato, accenda la pompa del vuoto per rimuovere l&#39;enzima dal campione. </li><li> Lavare enzimatica residua aggiungendo e filtrando 1 ml di soluzione fisiologica. </li><li> Se del liquido è completamente superato, spegnere pompa del vuoto e rimuovere la membrana filtro contenente endospore con pinza sterile e posizionarlo in una piastra di Petri sterile. Nota: Il campione di endospore separati è ora pronto per l&#39;analisi a valle. Conservare a -20 ° C se utilizzato per l&#39;estrazione del DNA oppure a 4 ° C se utilizzato per la germinazione e la coltivazione. </li></ol>

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La resistenza di endospore a fattori fisico-chimici aggressivi esterni (ad esempio, temperatura o detergenti) è stato usato per elaborare un metodo per separare endospore batteriche da cellule vegetative in campioni ambientali. Questo è il primo metodo completo per isolare endospore da campioni ambientali in modo non distruttivo. I metodi precedenti per quantificare, rilevare o analizzare endospore in campioni erano basati sulla misurazione delle deleghe specifiche per endospore come l&#39;acido dipicolinico o geni marcatori specifici. Al contrario, con il protocollo qui presentati, i componenti del campione diversi endospore vengono rimossi e quindi le endospore eventualmente rimangono come unico e purificati resti del campione. Sebbene altri metodi come la pastorizzazione o centrifugazione in gradiente di densità sono state proposte per arricchire per endospore 22 I test hanno mostrato che in gradiente di densità centrifugazione non è appropriato come un metodo generale per campioni ambientali, A causa delle differenze fisiologiche e differenti densità di varie specie di endospora-formatori (dati non riportati). Al contrario, il nostro protocollo può essere facilmente applicato a tutti i tipi di campioni ambientali ed è adatto per applicazioni a valle compresi metodi molecolari o coltura. Ci sono due passi fondamentali nel protocollo. La prima è la separazione della biomassa dalla matrice del campione (cioè particelle di sedimento). È essenziale che il numero di cellule separate dalla matrice essere massimizzata, in modo da non trascurare parte della diversità. Per campioni di sedimento, come qui utilizzato, una delle principali limitazioni del protocollo è il fatto che alcune cellule o spore potrebbero non essere state staccate dalla matrice sedimenti e quindi non inclusi nell&#39;analisi a valle, che è una potenziale limitazione del metodo . A seconda della matrice del campione (ad esempio se vi sono acidi umici), le cellule possono essere strettamente legati ad esso e quindi difficili da rilasciare.L&#39;uso di tampone ortofosfato, nonché una buona omogeneizzazione con un omogeneizzatore o frullatore sono importanti in questa fase. Per stimolare la ripresa, la procedura di omogeneizzazione e la rimozione della biomassa è ripetuta due volte come scritto nel protocollo. Il protocollo qui descritto è stato sviluppato e ottimizzato per i campioni di sedimenti lago d&#39;acqua dolce. Alcuni parametri possono non essere ottimale per altri tipi di campioni. Un modo per analizzare la frazione comunità che è stata potenzialmente trascurato nel processo sarebbe quello di sottoporre la matrice sedimento di estrazione del DNA e amplicon sequenziamento. Come possibili modifiche alla tecnica, la fase di separazione della biomassa dalla matrice del campione può essere omessa. In particolare, se il campione ambientale non contiene materiali o minerali particelle organiche che potrebbero interferire con il protocollo a valle (ad esempio, acqua, altri liquidi o culture purificate), può non essere necessaria la separazione prima. Per i campioni di liquido il protocollo può iniziare direttamente a capitolo 3(Collezione di biomassa su membrana filtrante). Il secondo passo importante del protocollo è il trattamento con lisozima, il calore, NaOH e SDS per distruggere le cellule vegetative. Temperatura, durata e concentrazione di sostanze chimiche sono stati ottimizzati per non danneggiare endospore, mentre distrugge le cellule. Questi parametri devono essere pertanto strettamente mantenute come sono. L&#39;uso di una prima fase di riscaldamento del campione a 65 ° C è molto efficace per selezionare specificamente per endospore rispetto ad altri tipi di spore batteriche o strutture spore simili si verificano tra i phyla batterica Actinobacteria, Myxobacteria, cianobatteri, che non sono generalmente resistente al calore. Come si vede nella Tabella 1, non formano spore batteri sono ancora presenti dopo il trattamento (8,3% al 14%). Alcune spiegazioni per questo sono che i campioni di sedimenti sono molto complessi e possono anche porto cellule non-spore resistenti. Inoltre, il materiale organico residuo può consentire una certa<html> cellule ttached di sopravvivere al trattamento. Al fine di ridurre ulteriormente la percentuale di cellule non sporigeni nei campioni trattati, il metodo deve essere ottimizzato il tipo di campione individuale. Il metodo rappresenta uno strumento innovativo per lo studio mirato di endospora-formatori in campioni ambientali. Il trattamento per distruggere le cellule vegetative può essere testata su colture pure di cellule e endospore ed adattabile ad resistenza individuale di cellule. La distruzione di cellule può essere visto nelle curve di colture trattate mostrati in Figura 2. Il ritardo della crescita delle colture trattate può essere dovuto al tempo che endospore bisogno di ri-germinare e passare alla fase di crescita esponenziale. Altre spiegazioni possibili per questo ritardo potrebbe anche essere un indebolimento della cultura endospore oi numeri cellulari inferiori dopo il trattamento. Se le endospore separati non sono utilizzati per l&#39;estrazione del DNA, l&#39;ultima fase di trattamento DNasi può essere omesso. nt &quot;&gt; potrebbe prevedere future applicazioni di questa tecnica in settori in cui è necessario rilevare endospore patogeni. Un esempio è nell&#39;industria alimentare e ricerca clinica, dove la rilevazione e l&#39;analisi (per l&#39;identificazione) di endospore, e la sua differenziazione da cellule vegetative (ad esempio, da prodotti di alimenti come il latte o a base di latte) è fondamentale. Questo potrebbe essere particolarmente rilevante se si considera che molte procedure standard considerano estrazione del DNA direttamente da un campione utilizzando enzimi litici che non sono adatte per la lisi endospore, che sarà quindi essere trascurato. Con il metodo qui presentato, le cellule possono essere rimossi e successiva analisi forniranno risposte alla presenza o assenza di endospore in contrapposizione alle cellule. Altre applicazioni includono l&#39;analisi delle comunità endospora diversi campioni ambientali (ad esempio ghiaccio o di sedimenti ) che sono archivi storici delle condizioni ambientali. In molti ambienti con environmen relativamente stabilecondizioni Tal (ad esempio lago superficiale di sedimenti)-endospora formando Firmicutes può prosperare in forma di cellule vegetative. Quando le condizioni si deteriorano (ad esempio esaurimento degli elementi nutritivi durante sedimenti sepoltura o l&#39;orientamento verso condizioni anaerobiche) le cellule si muovono in endospora stato. Pertanto, le comunità endospora recuperati da campioni di sedimenti in grado di riflettere le condizioni ambientali al momento della sepoltura e quindi essere utilizzata come indicatore paleoecologica delle condizioni preliminari per la sepoltura. Tuttavia, stiamo ancora raccogliendo informazioni a sostegno di questa affermazione.

L&#39;obiettivo di questo lavoro è quello di fornire un protocollo per la separazione di endospore batteriche da cellule batteriche vegetative in campioni ambientali. La formazione di endospore batteriche è una strategia di sopravvivenza, di solito innescato da inedia, trovato in un certo numero di gruppi di batteri appartenenti al phylum Firmicutes 1. Batteri che formano endospore sono ben studiati, soprattutto a causa di un numero di ceppi sono patogeni e quindi di importanza medica (per esempio, il Bacillus anthracis o Clostridium difficile). Ceppi ambientali di batteri che formano endospora sono stati isolati da praticamente ogni ambiente (suolo, acqua, sedimenti, aria, ghiaccio, intestino umano, gli animali intestino, e altro) 1-3. Pertanto, Firmicutes sono la seconda phylum più abbondante nel collezioni di colture 4. A causa delle loro proteine ​​resistenti corteccia esterna e nucleo protettivo, endospore possono sopravvivere a condizioni ambientali estreme che vanno from essiccazione a radiazioni elevate, temperature estreme e sostanze chimiche nocive 5. Questo notevole resistenza lo rende una sfida per estrarre il DNA da endospore 6-8. Questo probabilmente spiega perché sono stati trascurati negli studi di sequenziamento ambientale 9,10. Altri metodi, come ad esempio il targeting di endospore in campioni ambientali da anticorpi fluorescenti 11, la quantificazione di acido dipicolinico (DPA) nel suolo e nei sedimenti 13 12, citofluorimetria 14 o la pastorizzazione e la successiva coltivazione 15,16 sono stati utilizzati per recuperare o quantificare endospores in campioni ambientali. Negli ultimi anni, metodi di estrazione del DNA ottimizzato così come primers molecolari specifici per indirizzare sequenze geniche specifiche endospora sono stati sviluppati 10,17-20. Ciò ha contribuito a rivelare di più la biodiversità tra questo gruppo di batteri 21 e ha portato anche ad applicazioni nell&#39;industria e in medicina per il rilevamento di endospore, Per esempio in latte in polvere 19. Il protocollo qui presentata si basa sulla differenza di resistenza alle condizioni fisico-chimiche nocive (quali calore e detergenti) di endospore batteriche relativi alle cellule vegetative. Per distruggere le cellule vegetative in un campione, noi applichiamo consecutivamente calore, lisozima e basse concentrazioni di detergenti. Il tempo e la forza di questi trattamenti sono stati ottimizzati in modo da non distruggere le spore, ma per lisare tutte le cellule vegetative. Alcune cellule in un pool di cellule ambientale sono più resistenti di altre, per cui al fine di aumentare la probabilità di distruggere tutte le cellule vegetative, si applicano tre diversi trattamenti. Il vantaggio e la novità di questo metodo è che i endospore dopo il trattamento sono ancora intatte e possono essere utilizzati per ulteriori analisi a valle. Questi includono l&#39;estrazione del DNA, PCR quantitativa (qPCR) e amplicone o sequenziamento metagenomica (di mira in particolare il gruppo di endospore e riducendo diversity, aumentando la copertura). Le endospore potrebbero essere utilizzati anche per la coltivazione a valle o la quantificazione mediante microscopia a fluorescenza, citometria a flusso, o il rilevamento di DPA. Una caratteristica importante di questo metodo è che confrontando un campione non trattato con un campione trattato, si può dedurre la quantità e la diversità di endospore in un campione ambientale, oltre alla componente corrispondente al vegetative cellule.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="596">
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Whatman nitrocellulose membrane filters, 0,2 um pore size, 47 mm diameter</td>
			<td style="width:95px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td colspan="2" style="width:285px;">WHA7182004 Aldrich&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tris(hydroxymethyl)aminomethane</td>
			<td style="width:95px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>252859 Sigma-Aldrich</td>
			<td>CAS 77-86-1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9884 Sigma-Aldrich</td>
			<td>CAS&#160; 60-00-4&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Lysozyme from chicken egg white</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>62971 Fluka</td>
			<td>powder, CAS&#160; 12650-88-3&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ultra-Turrax homogenizer T18 basic</td>
			<td style="width:95px;">IKA</td>
			<td>3720000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Glass filter holders for 47 mm membranes, pyrex glass</td>
			<td style="width:95px;">EMD Millipore</td>
			<td>XX10 047 00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Chemical duty vacuum pump</td>
			<td style="width:95px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">WP6122050</td>
			<td>220 V/50 Hz</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Manifold sampling filtration for 25 mm membranes</td>
			<td style="width:95px;">Millipore</td>
			<td>1225 Sampling Manifold</td>
			<td>polypropylene</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dnase</td>
			<td style="width:95px;">New England Biolabs</td>
			<td>M0303S</td>
			<td>Rnase free</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NaOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5881 Sigma-Aldrich</td>
			<td>CAS&#160; 1310-73-2&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium dodecyl sulfphate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3771 Sigma&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Whatman nitrocellulose membrane filters, 0,2 um pore size, 25 mm diameter</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td colspan="2">WHA7182002 Aldrich</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

physical isolation of endospores from environmental samples by targeted lysis of vegetative cells

Endospore formation is a survival strategy found among some bacteria from the phylum Firmicutes. During endospore formation, these bacteria enter a morpho-physiological resting state that enhances survival under adverse environmental conditions. Even though endospore-forming Firmicutes are one of the most frequently enriched and isolated bacterial groups in culturing studies, they are often absent from diversity studies based on molecular methods. The resistance of the spore core is considered one of the factors limiting the recovery of DNA from endospores. We developed a method that takes advantage of the higher resistance of endospores to separate them from other cells in a complex microbial community using physical, enzymatic and chemical lysis methods. The endospore-only preparation thus obtained can be used for re-culturing or to perform downstream analysis such as tailored DNA extraction optimized for endospores and subsequent DNA sequencing. This method, applied to sediment samples, has allowed the enrichment of endospores and after sequencing, has revealed a large diversity of endospore-formers in freshwater lake sediments. We expect that the application of this method to other samples will yield a similar outcome.

I risultati presentati qui sono stati pubblicati in precedenza 10,21. Si prega di fare riferimento a tali articoli per l&#39;interpretazione ambientale e discussione dei dati. La procedura generale è riassunto in Figura 1 e corrisponde a tre fasi principali: in primo luogo, la separazione della biomassa da sedimenti o qualsiasi altra matrice ambientale; secondo, la distruzione di cellule vegetative; e terzo, l&#39;analisi a valle delle endospore separati. Analisi valle potrebbe consistere, ad esempio, di estrazione del DNA e amplicon sequencing per determinare diversità. L&#39;estrazione di DNA deve essere ottimizzato per garantire lisi di endospore. In campioni di sedimento, abbiamo raggiunto questo utilizzando un forte DNA sequenziale procedura di estrazione 10. L&#39;applicazione del metodo in sedimenti dimostra un significativo aumento della frazione di-endospora formare Firmicutes dopo la separazione. In ampliconi sequenziamento del 16S rRNAgene, Firmicutes nei campioni non trattati (un&#39;intera comunità) corrispondeva solo 8,0 e 19,0% delle sequenze (Tabella 1). Al contrario, dopo il trattamento Firmicutes rappresentato 90,6% e 83,9% del campione endospore arricchito. I due principali ordini di-endospora formare Firmicutes, Bacilliales e Clostridiales, sono stati arricchiti con il metodo, in contrasto con l&#39;assenza di ordini come Lactobacilliales che sono non-endospora formando Firmicutes. Per dimostrare che il metodo è particolarmente adatto per l&#39;arricchimento dei veri endospore, sono stati analizzati anche altri gruppi capaci di produrre strutture spore-like. Pertanto, la frequenza di Actinobacteria, cianobatteri e Myxococcales diminuito dopo il trattamento per lisare le cellule. L&#39;efficacia del trattamento è stata anche dimostrata usando colture pure. Una preparazione endospore (&gt; 95%) di endospore Paenibacillus alvei, Bacillus subtilis e Bacillus megaterium </em&gt;, così come una coltura cellulare vegetativa Escherichia coli, sono stati trattati come descritto nel protocollo per la lisi delle cellule vegetative. Tutte le colture sono state poi incubate in brodo nutriente a 37 ° C e la crescita è stata misurata utilizzando densità ottica a 600 nm di lunghezza d&#39;onda. La crescita è stata osservata per le culture endospora mentre nessuna crescita è stata osservata nel E. trattata cultura coli, dimostrando che le cellule vegetative sono irreversibilmente danneggiato (Figura 2). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53411/53411fig1.jpg" /> Figura 1. Panoramica della procedura sperimentale. Procedura utilizzata per arricchire i batteri endospora formando in campioni ambientali. La fase di separare cellule e endospore dalla matrice ambientale può essere omessa a seconda del tipo di campione (cioè, campione d&#39;acqua). Nella figura i metodi applicati a valle sulla frazione corre spore arricchitaspondere a estrazione del DNA e sequenziamento ad alta produttività. Questi passaggi possono essere sostituite da colture. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53411/53411fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53411/53411fig2.jpg" /> Figura 2. Verifica del trattamento su colture pure. Le curve di crescita verifica la crescita di batteri endospora formando da una sospensione di endospore di Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, e Paenibacillus alvei e una coltura cellulare di Escherichia coli trattati con il metodo per la lisi di cellule. Trattata = ○. Non trattata = ●. Le barre di errore di tre culture indipendenti. La crescita di colture di controllo e ricrescita delle colture trattate è stata misurata come densità ottica a 600 nm di lunghezza d&#39;onda. Questo dato è stato ristampato from Wunderlin et al. 2014, con il permesso. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53411/53411fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:129px;"></td><td style="width:80px;"> Sedimenti 1 </td><td style="width:80px;"></td><td style="width:80px;"> Sedimenti 2 </td><td style="width:80px;"></td></tr><tr height="38"><td height="38" style="height:39px;"></td><td style="width:80px;"> tutta la comunità </td><td style="width:80px;"> endospora arricchita </td><td style="width:80px;"> tutta la comunità </td><td style="width:80px;"> endospora arricchita </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> Firmicutes </td><td> 8.0 </td><td> 90.6 </td><td> 19.0 </td><td>83.9 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> Bacilli </td><td> 0.5 </td><td> 10.0 </td><td> 5.7 </td><td> 15.1 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> Clostridi </td><td> 7.4 </td><td> 76.9 </td><td> 12.5 </td><td> 63.2 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> Actinobacteria </td><td> 2.4 </td><td> 1.0 </td><td> 4.4 </td><td> 2.1 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> I cianobatteri </td><td> 1.1 </td><td> 0.1 </td><td> 0.7 </td><td> 0.1 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> Myxococcales </td><td> 0.7 </td><td> 0.0 </td><td> 0.2 </td><td> 0.0 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> Altri batteri </td><td> 87.8 </td><td> 8.3 </td><td> 75.7 </td><td> 13.9 </td></tr></tbody></table> &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Tabella 1. Abbondanza di endospore e di altri gruppi di batteri sporigeni. Frequenza relativa di Firmicutes (endospora-makers) e di altri gruppi di batteri che producono spore strutture simili in due campioni di sedimenti corrispondenti alla intera (non trattato) e endospora arricchiti (trattati) comunità.

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Physical Isolation of Endospores from Environmental Samples by Targeted Lysis of Vegetative Cells

A method to single out bacterial endospores from complex microbial communities was developed to perform tailored culture or molecular studies of this group of bacteria.

Isolamento fisico di Endospore da campioni ambientali da mirata Lisi di cellule vegetative

Endospore formation is a survival strategy found among some bacteria from the phylum Firmicutes. During endospore formation, these bacteria enter a ...

physical-isolation-endospores-from-environmental-samples-targeted

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Environment

14.1K Views.  Macquarie University. A method to single out bacterial endospores from complex microbial communities was developed to perform tailored culture or molecular studies of this group of bacteria.

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EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. I. Collection of Virus Samples

EPA Method 1615 was developed with a goal of providing a standard method for measuring enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. The standardized sampling component of the method concentrates viruses that may be present in water by passage of a minimum specified volume of water through an electropositive cartridge filter. The minimum specified volumes for surface and finished/ground water are 300 L and 1,500 L, respectively. A major method limitation is the tendency for the filters to clog before meeting the sample volume requirement. Studies using two different, but equivalent, cartridge filter options showed that filter clogging was a problem with 10% of the samples with one of the filter types compared to 6% with the other filter type. Clogging tends to increase with turbidity, but cannot be predicted based on turbidity measurements only. From a cost standpoint one of the filter options is preferable over the other, but the water quality and experience with the water system to be sampled should be taken into consideration in making filter selections.

EPA Method 1615 uses an electropositive filter to concentrate enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. This manuscript describes the procedure for collecting samples for Method 1615 analyses.

Metodo EPA 1615. Misura di Enterovirus e Norovirus Evento in acqua per la cultura e RT-qPCR. I. Raccolta di campioni di virus

EPA Method 1615 was developed with a goal of providing a standard method for measuring enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. ...

Ricerca

Ambiente

Physical, Chemical and Biological Characterization of Six Biochars Produced for the Remediation of Contaminated Sites

The physical and chemical properties of biochar vary based on feedstock sources and production conditions, making it possible to engineer biochars with specific functions (e.g. carbon sequestration, soil quality improvements, or contaminant sorption). In 2013, the International Biochar Initiative (IBI) made publically available their Standardized Product Definition and Product Testing Guidelines (Version 1.1) which set standards for physical and chemical characteristics for biochar. Six biochars made from three different feedstocks and at two temperatures were analyzed for characteristics related to their use as a soil amendment. The protocol describes analyses of the feedstocks and biochars and includes: cation exchange capacity (CEC), specific surface area (SSA), organic carbon (OC) and moisture percentage, pH, particle size distribution, and proximate and ultimate analysis. Also described in the protocol are the analyses of the feedstocks and biochars for contaminants including polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs), polychlorinated biphenyls (PCBs), metals and mercury as well as nutrients (phosphorous, nitrite and nitrate and ammonium as nitrogen). The protocol also includes the biological testing procedures, earthworm avoidance and germination assays. Based on the quality assurance / quality control (QA/QC) results of blanks, duplicates, standards and reference materials, all methods were determined adequate for use with biochar and feedstock materials. All biochars and feedstocks were well within the criterion set by the IBI and there were little differences among biochars, except in the case of the biochar produced from construction waste materials. This biochar (referred to as Old biochar) was determined to have elevated levels of arsenic, chromium, copper, and lead, and failed the earthworm avoidance and germination assays. Based on these results, Old biochar would not be appropriate for use as a soil amendment for carbon sequestration, substrate quality improvements or remediation.

Biochar is a carbon-rich material used as a soil amendment with the ability to sustainably sequester carbon, improve substrate quality and sorb contaminants. This protocol describes the 17 analytical methods used for the characterization of biochar, which is required prior to large scale implementation of these amendments in the environment.

Fisica, chimica e caratterizzazione biologica di Six Biochars Prodotti per il risanamento dei siti contaminati

The physical and chemical properties of biochar vary based on feedstock sources and production conditions, making it possible to engineer biochars with ...

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. Part III. Virus Detection by RT-qPCR

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a standardized method for use in multiple analytical laboratories during monitoring period 3 of the Unregulated Contaminant Monitoring Rule. Herein we present the protocol for extraction of viral ribonucleic acid (RNA) from water sample concentrates and for quantitatively measuring enterovirus and norovirus concentrations using reverse transcription-quantitative PCR (RT-qPCR). Virus concentrations for the molecular assay are calculated in terms of genomic copies of viral RNA per liter based upon a standard curve. The method uses a number of quality controls to increase data quality and to reduce interlaboratory and intralaboratory variation. The method has been evaluated by examining virus recovery from ground and reagent grade waters seeded with poliovirus type 3 and murine norovirus as a surrogate for human noroviruses. Mean poliovirus recoveries were 20% in groundwaters and 44% in reagent grade water. Mean murine norovirus recoveries with the RT-qPCR assay were 30% in groundwaters and 4% in reagent grade water.

Here we present a procedure to quantify enterovirus and norovirus in environmental and drinking waters using reverse transcription-quantitative PCR. Mean virus recovery from groundwater with this standardized procedure from EPA Method 1615 was 20% for poliovirus and 30% for murine norovirus.

Metodo EPA 1615. Misura di Enterovirus e Norovirus Presenza in Water di Cultura e RT-qPCR. Parte III. Rilevamento virus mediante RT-qPCR

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a ...

Automated Gel Size Selection to Improve the Quality of Next-generation Sequencing Libraries Prepared from Environmental Water Samples

Next-generation sequencing of environmental samples can be challenging because of the variable DNA quantity and quality in these samples. High quality DNA libraries are needed for optimal results from next-generation sequencing. Environmental samples such as water may have low quality and quantities of DNA as well as contaminants that co-precipitate with DNA. The mechanical and enzymatic processes involved in extraction and library preparation may further damage the DNA. Gel size selection enables purification and recovery of DNA fragments of a defined size for sequencing applications. Nevertheless, this task is one of the most time-consuming steps in the DNA library preparation workflow. The protocol described here enables complete automation of agarose gel loading, electrophoretic analysis, and recovery of targeted DNA fragments. 
In this study, we describe a high-throughput approach to prepare high quality DNA libraries from freshwater samples that can be applied also to other environmental samples. We used an indirect approach to concentrate bacterial cells from environmental freshwater samples; DNA was extracted using a commercially available DNA extraction kit, and DNA libraries were prepared using a commercial transposon-based protocol. DNA fragments of 500 to 800 bp were gel size selected using Ranger Technology, an automated electrophoresis workstation. Sequencing of the size-selected DNA libraries demonstrated significant improvements to read length and quality of the sequencing reads.

This manuscript describes an automated gel size selection approach for purifying DNA fragments for next-generation sequencing. The Ranger Technology provides complete automation of the entire process of agarose gel loading, electrophoretic analysis, and recovery of targeted DNA fragments allowing for high-throughput and high quality next-generation sequencing libraries.

Automated Gel Selection Size per migliorare la qualità delle Biblioteche di sequenziamento di nuova generazione Preparato da campioni di acqua ambientale

Next-generation sequencing of environmental samples can be challenging because of the variable DNA quantity and quality in these samples. High quality DNA ...

Removal of Trace Elements by Cupric Oxide Nanoparticles from Uranium In Situ Recovery Bleed Water and Its Effect on Cell Viability

In situ recovery (ISR) is the predominant method of uranium extraction in the United States. During ISR, uranium is leached from an ore body and extracted through ion exchange. The resultant production bleed water (PBW) contains contaminants such as arsenic and other heavy metals. Samples of PBW from an active ISR uranium facility were treated with cupric oxide nanoparticles (CuO-NPs). CuO-NP treatment of PBW reduced priority contaminants, including arsenic, selenium, uranium, and vanadium. Untreated and CuO-NP treated PBW was used as the liquid component of the cell growth media and changes in viability were determined by the MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) assay in human embryonic kidney (HEK 293) and human hepatocellular carcinoma (Hep G2) cells. CuO-NP treatment was associated with improved HEK and HEP cell viability. Limitations of this method include dilution of the PBW by growth media components and during osmolality adjustment as well as necessary pH adjustment. This method is limited in its wider context due to dilution effects and changes in the pH of the PBW which is traditionally slightly acidic&#160;however; this method could have a broader use assessing CuO-NP treatment in more neutral waters.

Removal of Trace Elements by Cupric Oxide Nanoparticles from Uranium In Situ Recovery Bleed Water and Its Effect on Cell Viability

Production bleed water (PBW) was treated with cupric oxide nanoparticles (CuO-NPs) and cellular toxicity was assessed in cultured human cells. The goal of this protocol was to integrate the native environmental sample into a cell culture format assessing the changes in toxicity due to CuO-NP treatment.

Rimozione di Oligoelementi per Cupric nanoparticelle di ossido di uranio da<em&gt; In Situ</em&gt; Recupero Bleed Acqua e il suo effetto sulla vitalità cellulare

In situ recovery (ISR) is the predominant method of uranium extraction in the United States. During ISR, uranium is leached from an ore body and extracted ...

Preparation and Testing of Impedance-based Fluidic Biochips with RTgill-W1 Cells for Rapid Evaluation of Drinking Water Samples for Toxicity

This manuscript describes how to prepare fluidic biochips with Rainbow trout gill epithelial (RTgill-W1) cells for use in a field portable water toxicity sensor. A monolayer of RTgill-W1 cells forms on the sensing electrodes enclosed within the biochips. The biochips are then used for testing in a field portable electric cell-substrate impedance sensing (ECIS) device designed for rapid toxicity testing of drinking water. The manuscript further describes how to run a toxicity test using the prepared biochips. A control water sample and the test water sample are mixed with pre-measured powdered media and injected into separate channels of the biochip. Impedance readings from the sensing electrodes in each of the biochip channels are measured and compared by an automated statistical software program. The screen on the ECIS instrument will indicate either "Contamination Detected" or "No Contamination Detected" within an hour of sample injection. Advantages are ease of use and rapid response to a broad spectrum of inorganic and organic chemicals at concentrations that are relevant to human health concerns, as well as the long-term stability of stored biochips in a ready state for testing. Limitations are the requirement for cold storage of the biochips and limited sensitivity to cholinesterase-inhibiting pesticides. Applications for this toxicity detector are for rapid field-portable testing of drinking water supplies by Army Preventative Medicine personnel or for use at municipal water treatment facilities.

This manuscript describes how to prepare fluidic biochips with Rainbow trout gill epithelial cells for use in a field portable electric cell-substrate impedance sensor. The protocol for running a rapid drinking water toxicity test with the sensor is also described.

Preparazione e test di impedenza a base di biochip fluidici con le cellule RTgill-W1 per valutare rapidamente campioni di acqua potabile per la tossicità

This manuscript describes how to prepare fluidic biochips with Rainbow trout gill epithelial (RTgill-W1) cells for use in a field portable water toxicity ...

A Bending Test for Determining the Atterberg Plastic Limit in Soils

The thread rolling test is the most commonly used method to determine the plastic limit (PL) in soils. It has been widely criticized, because a considerable subjective judgment from the operator that carries out the test is involved during its performance, which may affect the final result significantly. Different alternative methods have been put forward, but they cannot compete with the standard rolling test in speed, simplicity and cost.
In an earlier study by the authors, a simple method with a simple device to determine the PL was presented (the &#34;thread bending test&#34; or simply &#34;bending test&#34;); this method allowed the PL to be obtained with minimal operator interference. In the present paper a version of the original bending test is shown. The experimental basis is the same as the original bending test: soil threads which are 3 mm in diameter and 52 mm long are bent until they start to crack, so that both the bending produced and its related moisture content are determined. However, this new version enables the calculation of PL from an equation, so it is not necessary to plot any curve or straight line to obtain this parameter and, in fact, the PL can be achieved with only one experimental point (but two experimental points are recommended).
The PL results obtained with this new version are very similar to those obtained through the original bending test and the standard rolling test by a highly experienced operator. Only in particular cases of high plasticity cohesive soils, there is a greater difference in the result. Despite this, the bending test works very well for all types of soil, both cohesive and very low plasticity soils, where the latter are the most difficult to test via the standard thread rolling method.

The traditional standardized test for determining the plastic limit in soils is performed by hand, and the result varies depending on the operator. An alternative method based on bending measurements is presented in this study. This allows the plastic limit to be obtained with a clear and objective criterion.

Una prova di flessione per la determinazione del limite di plastica Atterberg in terreni

The thread rolling test is the most commonly used method to determine the plastic limit (PL) in soils. It has been widely criticized, because a ...

Use of a Filter Cartridge for Filtration of Water Samples and Extraction of Environmental DNA

Recent studies demonstrated the use of environmental DNA (eDNA) from fishes to be appropriate as a non-invasive monitoring tool. Most of these studies employed disk fiber filters to collect eDNA from water samples, although a number of microbial studies in aquatic environments have employed filter cartridges, because the cartridge has the advantage of accommodating large water volumes and of overall ease of use. Here we provide a protocol for filtration of water samples using the filter cartridge and extraction of eDNA from the filter without having to cut open the housing. The main portions of this protocol consists of 1) filtration of water samples (water volumes &#8804;4 L or &gt;4 L); (2) extraction of DNA on the filter using a roller shaker placed in a preheated incubator; and (3) purification of DNA using a commercial kit. With the use of this and previously-used protocols, we perform metabarcoding analysis of eDNA taken from a huge aquarium tank (7,500 m3) with known species composition, and show the number of detected species per library from the two protocols as the representative results. This protocol has been developed for metabarcoding eDNA from fishes, but is also applicable to eDNA from other organisms.

We describe a protocol for filtration of water samples with a filter cartridge and extraction of environmental DNA (eDNA) without having to cut open the housing to remove the filter. This protocol is developed for metabarcoding eDNA from fishes, but is also applicable to eDNA from other organisms.

L&#39;utilizzo di una cartuccia filtrante per filtrazione di acqua campioni ed estrazione di DNA ambientale

Recent studies demonstrated the use of environmental DNA (eDNA) from fishes to be appropriate as a non-invasive monitoring tool. Most of these studies ...

Dispersion of Nanomaterials in Aqueous Media: Towards Protocol Optimization

The sonication process is commonly used for de-agglomerating and dispersing nanomaterials in aqueous based media, necessary to improve homogeneity and stability of the suspension. In this study, a systematic step-wise approach is carried out to identify optimal sonication conditions in order to achieve a stable dispersion. This approach has been adopted and shown to be suitable for several nanomaterials (cerium oxide, zinc oxide, and carbon nanotubes) dispersed in deionized (DI) water. However, with any change in either the nanomaterial type or dispersing medium, there needs to be optimization of the basic protocol by adjusting various factors such as sonication time, power, and sonicator type as well as temperature rise during the process. The approach records the dispersion process in detail. This is necessary to identify the time points as well as other above-mentioned conditions during the sonication process in which there may be undesirable changes, such as damage to the particle surface thus affecting surface properties. Our goal is to offer a harmonized approach that can control the quality of the final, produced dispersion. Such a guideline is instrumental in ensuring dispersion quality repeatability in the nanoscience community, particularly in the field of nanotoxicology.

Here, we present a step-wise protocol for the dispersion of nanomaterials in aqueous media with real-time characterization to identify the optimal sonication conditions, intensity, and duration for improved stability and uniformity of nanoparticle dispersions without impacting the sample integrity.

Dispersione dei nanomateriali in mezzi acquosi: verso l'ottimizzazione dei protocolli

The sonication process is commonly used for de-agglomerating and dispersing nanomaterials in aqueous based media, necessary to improve homogeneity and ...

Isolation of Mandibular Gland Reservoir Contents from Bornean 'Exploding Ants' (Formicidae) for Volatilome Analysis by GC-MS and MetaboliteDetector

The aim of this manuscript is to present a protocol describing the metabolomic analysis of Bornean &#39;exploding ants&#39; belonging to the Colobopsis cylindrica (COCY) group. For this purpose, the model species C. explodens is used. Ants belonging to the minor worker caste possess distinctive hypertrophied mandibular glands (MGs). In territorial combat, they use the viscous contents of their enlarged mandibular gland reservoirs (MGRs) to kill rival arthropods in characteristic suicidal &#39;explosions&#39; by voluntary rupture of the gastral integument (autothysis). We show the dissection of worker ants of this species for the isolation of the gastral portion of the wax-like MGR contents as well as listing the necessary steps required for solvent-extraction of the therein contained volatile compounds with subsequent gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) analysis and putative identification of metabolites contained in the extract. The dissection procedure is performed under cooled conditions and without the use of any dissection buffer solution to minimize the changes in the chemical composition of the MGR contents. After solvent-based extraction of volatile metabolites contained therein, the necessary steps for analyzing the samples via liquid-injection-GC-MS are presented. Lastly, data processing and putative metabolite identification with the use of the open-source software MetaboliteDetector is shown. With this approach, the profiling and identification of volatile metabolites in MGRs of ants belonging to the COCY group via GC-MS and the MetaboliteDetector software become possible.

Isolation of Mandibular Gland Reservoir Contents from Bornean 'Exploding Ants' Formicidae for Volatilome Analysis by GC-MS and MetaboliteDetector

Minor workers of the ant species Colobopsis explodens are dissected to isolate the wax-like content stored in their hypertrophied mandibular gland reservoirs for subsequent solvent-extraction and analysis by gas chromatography-mass spectrometry. The&#160;annotation and identification of volatile constituents using the open-source software MetaboliteDetector is also described.

Isolamento del contenuto serbatoio Mandibular della ghiandola da Bornean ' esplodere le formiche (Formicidae) per l'analisi di Volatilome di GC-MS e MetaboliteDetector

The aim of this manuscript is to present a protocol describing the metabolomic analysis of Bornean &#39;exploding ants&#39; belonging to the Colobopsis ...