This work was supported by the US Army Medical Research and Materiel Command and by the Small Business Innovation Research and Small Business Technology Transfer program; Contract No. W81XWH-13-C-0093. We would like to thank Dr. Lucy Lee at the University of Fraser for being our RTgill-W1 cell culture mentor, and to acknowledge Dr. Niels Bols of Waterloo University for the development of the RTgill-W1cell line.

1. Herstellung von Testmaterialien HINWEIS: Um die Biochips für die Prüfung, mehrere konfluenten Flasche aus RTgill-W1 Zellen vorbereiten müssen bereit sein. Eine gute Schätzung der Anzahl der Flaschen benötigt wird, ist ein konfluenter T175-Kolben für 16 Biochips ausgesät werden. <ol><li> Führen Sie die folgenden Schritte in einer Klasse II biologischen Sicherheitsschrank (biohood) unter aseptischen Bedingungen. Verwenden Sie 70% Ethanol für die biohood Desinfektion und alle in der Haube platziert Materialien. <ol><li> Bereiten Fibronektin Substrat für die fluidische Biochips durch eine 1 mg Phiole von Fibronektin Auftau- und in 100 ml sterilem L-15-Medien für eine Konzentration von 10 ug / ml verdünnt. Einfrieren in 40 ml Aliquots in sterilen 50 ml konischen Polypropylen-Röhrchen bei -20 ° C. Bei Raumtemperatur auftauen mehrere Stunden vor der Biochips Aussaat. Nach dem Auftauen nicht wieder einfrieren. </li><li> Bereiten Zellkulturmedien mit 50 ml fötalem Rinderserum Zugabe von 5 ml 200 mM ein L-alanyl-L-glutamin supergänzen, und 5 ml einer Penicillin / Streptomycin-Lösung (10.000 Einheiten Penicillin / ml und 10.000 &amp; mgr; g Streptomycin / ml) Lager zu 500 ml L-15-Medien. Dies wird 560 ml Zellkulturmedien ergeben, enthaltend 9% Serum. Kalt stellen. Hinweis: Dadurch wird die komplette Zellkulturmedien für den Kulturflaschen und die Biochips verwendet werden. </li></ol></li><li> Pulverisierte Medien Vials <ol><li> Bereiten Sie vor der Zeit 0,1 Dram-Snap-cap Fläschchen mit 60 mg ± 0,5% L-15ex Pulver eine automatisierte Pulverspender verwenden. Beschriften Sie die Fläschchen mit dem Tag wurde das Pulver abgegeben und im Kühlschrank lagern Fläschchen (in Mengen von 50) in wiederverschließbaren metallisierter Poly-Taschen; die jeweils drei 1 g Kieselgel Austrocknungs Packungen. Anmerkung: L-15ex pulverisierten Medien Phiolen können hergestellt und für bis zu 9 Monate vor der Prüfung aufbewahrt werden. </li></ol></li><li> Machen Sie eine Lösung von 100 ml 20% Bleiche von Haushaltsbleiche mit entsalztem Wasser (DI) zu verdünnen. Schätzung, dass 5 ml Bleichlösung für jede bi benötigt werdenochip. </li><li> Machen Sie Biochip Röhrenanordnungen von 27 mm Abschnitte von autoklavierbaren bioverträglichen Rohrschneiden (2 Abschnitte für jeden Biochip werden ausgesät) und passen die beiden Enden des Rohres mit Polycarbonat-Rutsch Luerverbindungen. Platzieren Röhrenanordnungen in einem autoklavierbaren Beutel und Autoklaven für 8 min bei 134 ° C. Auch Autoklaven Biochip-Stecker (2 pro Biochip) in einem separaten Beutel bei den gleichen Einstellungen. </li><li> Autoklav DI-Wasser für 30 min at121 ° C. Hinweis: Dieses Wasser wird zum Spülen Biochips nach dem Aussäen verwendet werden. Schätzen, dass 10 ml für jeden Biochip benötigt werden. Anmerkung: Der tatsächliche Volumen jeder Biochip Kanal 2 ml, aber 5 ml sterilem Wasser durch jeden Kanal nach Entfernung der Bleichlösung gespült. </li><li> Machen Spritzeninjektionsröhrenanordnungen durch Schneiden 27 mm Abschnitte aus biokompatiblem Schläuche und Befestigungs männlichen Luer-Rutscheinrichtungen an beiden Enden des Schlauches. Legen Röhrenanordnungen in einem Papierheißsiegelsterilisationsbeutel und Autoklaven für 8 min bei 134 &amp;# 176; C. </li></ol> 2. Fluidic Biochip Impfvorgangs Hinweis: Führen Sie alle Verfahren, bei denen die Biochips oder die Medien in einer Klasse II biologischen Sicherheitsschrank unter aseptischen Bedingungen behandelt wird. <ol><li> Vierundzwanzig Stunden nach geplanten Aussaat vor, entfernen Sie die Biochips Hersteller Verpackung in der biohood und in sterilisierten Kunststoff Instrumentenkoffern. </li><li> Sterilisieren der Biochips eine 20% -ige Bleichlösung wie folgt Anmerkung: In der Vergangenheit diese Bleichverfahren wurde das Pilzwachstum in der Biochips bei Langzeitlagerung in dem Fall verhindert, dass die Plasmasterilisation der vom Hersteller durchgeführt Biochips nicht wirksam war. <ol><li> Unter Verwendung einer 20 ml sterile Spritze mit einem Spritzeninjektionsrohranordnung befestigt und in der Arbeits biohood injizieren 2 ml der 20% igen Bleichlösung in jeden Kanal des Biochips. Lassen Sie die Biochips für 1 Stunde mit der Bleichlösung zu sitzen. </li><li> Nach einer Stunde Unterdruck aspwütend die Bleichlösung aus beiden Kanälen eines sterilen männlichen Luer Slip Montage an dem Vakuum-Saug-Schlauch verwenden. Verwenden Sie eine der Biochip-Röhrenanordnungen als Drain, wenn die Biochips Spülung. </li><li> Mit einer sterilen 20-ml-Spritze mit einer sterilen Spritze Einpritzeinheit angebracht, spülen Sie jeden Kanal des Chips mit 5 ml sterilem Wasser, so dass das überschüssige Wasser in einen Behälter zu entleeren im biohood. Dann Vakuum absaugen das Wasser als nur für das Bleichmittel beschrieben und legen Sie die Biochips zurück in die Kunststoff-Instrumentenkoffern und im biohood verlassen, bis und mit Zellen besiedelt am folgenden Tag. </li></ol></li><li> Sechzig Minuten vor der Biochips Animpfen injizieren 2 ml der 10 ug / ml Fibronektin-Lösung in jeden Kanal des Biochips. Lassen Sie die Biochips in der biohood für 60 Minuten, und dann absaugen das Fibronektin Vakuum (wie in Schritt 2.2.3 beschrieben), bevor der Biochip mit Zellen Aussaat. Legen Sie zwei Abschnitte der sterilen Biochip Röhrenanordnungen (sieheAbschnitt 1.4) an den Anschlüssen der Biochips. </li><li> Trypsinize 16 ein konfluenter RTgill-W1 T175 - Kolben für jeweils 16 Biochips beschriebenen Verfahren in dem Blatt American Type Culture Collection (ATCC) Produktbeschreibung verwendet wird . <ol><li> Absaugen Medien aus dem konfluenten Kolben (n) von Zellen. </li><li> Spülen Sie die Zellschicht mit 15 ml PBS und dann absaugen. </li><li> In 6 ml Trypsin / EDTA auf die Zellschicht in jedem T175 Kolben und erlauben Zellen für ~ 5 min zu trypsinize. </li><li> 15 ml komplette L-15-Zellkulturmedien zu jedem Kolben Trypsinierung zu stoppen. </li><li> Kombinieren die Zellsuspensionen in einem sterilen Einweg-Behälter. Hinweis: Gebindegröße von 150 bis 500 ml, abhängig von der Anzahl von Biochips variieren wird ausgesät. Schätzung, die 5 ml Zellsuspension werden pro Biochips benötigt werden. </li></ol></li><li> Entfernen Sie ~ 1 ml der Zellsuspension und in einen Mikrozentrifugenröhrchen für die Zählung. Mit einem Hellfeldmikroskop mit 10-facher objectiVE und einem Hämocytometer, ein 10 ul - Aliquot der Zellen zählen und das Volumen des kompletten L-15 - Zellkulturmedien Berechnung erforderlich , um eine Zellsuspension von 2,5 x 10 5 Zellen / ml zu erreichen. Hinweis: Wenn Sie die Zellsuspension unter Verwendung von Kolben zu impfen, die Kultur fortzusetzen, ist dies der Punkt sein würde, dies zu tun. Stellen Sie die Zellsuspension Konzentration mit kompletten L-15-Zellkulturmedien. </li><li> Mit einer sterilen 20 ml syringeattached auf eine sterile Spritze Injektionsschlauchleitungsbaugruppe (siehe Abschnitt 1.6), Injizieren von 2,5 ml der Zellsuspension in die Außenöffnung jedes Kanals des Biochips (dh die Anschlüsse, angebracht nicht den Schlauch haben), einige der zusätzlichen Zellsuspension erlaubt in der biohood aus dem Schlauch in einen Abfallbehälter zu fließen. Hinweis: Dadurch wird sichergestellt, dass der gesamte Kanal und die angeschlossenen Schläuche der Zellsuspension wird voll sein. <ol><li> Erstellen Sie eine geschlossene Schleife für jeden Biochip-Kanal durch das freie Ende des Schlauches mit den Luer fitti Einsetzenng in die äußeren Anschlüsse für jeden Kanal. </li><li> Wischen Sie überschüssige Medien aus der geschlossenen Schleifen mit einem Papiertuch mit 70% Ethanol befeuchtet und legen Sie die Biochips zurück in die Kunststoff-Box in einem 20 ° C Inkubator. Geben Sie jedem Biochip eine eindeutige Identifikationsnummer. </li></ol></li><li> An den Tagen 4 und 7, die Biochips aus dem 20 ° C Inkubator entfernen und die Medien in allen der Biochips mit temperatur äquilibriert vollständigen L-15 Zellkulturmedium aufzufüllen. Folgen Sie dem gleichen Verfahren wie in Schritt 2.6 außer Gebrauch nur L-15-Zellkulturmedien statt (keine Zellsuspension). Legen Sie die Biochips in der 20 ° C-Inkubator zurück nach dem Tag 4 Fütterung. <ol><li> Nach dem Tag 7 Fütterung, zu entfernen und die Schläuche von den Chips zu verwerfen und die autoklaviert Ablassschrauben in den Biochips einlegen. </li><li> Legen Sie die Biochips in einer Kiste in einem 6 ° C Inkubator bis zum Testen verwendet. Anmerkung: Die Chips können für bis zu 9 Monate bei Kühltemperaturen gelagert werden und sind immer noch lebensfähig zum Testen in die ECIS Leser. </li></ol></li></ol> 3. ECIS Testen mit Biochips <ol><li> Bereiten Testchemikalien bei der Verwendung. (Siehe Brennan et al., 2012 7 zur Herstellung von Testchemikalien). </li><li> Entfernen ECIS Leser und Testlieferungen aus dem Koffer. Entfernen Sie eine vorbereitete Biochips aus dem 6 ° C Inkubator. Setzen Sie den Biochip auf einem Papiertuch. Schalten Sie den ECIS Leser. </li><li> Unter Verwendung von 10 ml Spritzen, verzichtet werden 10 ml Steuer Wasser in eine Unze 0,5 markierten durchsichtigen Kunststoff-Kontrollglas und 10 ml der Testprobe in eine Unze 0,5 markierten durchsichtigen Kunststoff-Messbecher. Anmerkung: 1) Achten Sie darauf, Blasen für eine genaue Messung zu entfernen. 2) Die Spritzen und Gläser sind farbcodiert; Blau für die Steuerung und rot für den Test. </li><li> Entfernen Sie die zwei pulverisierte Medien Fläschchen aus den Folienbeutel. Öffnen Sie eine der pulverförmigen Medien Fläschchen (Verwendung Mehrzweckwerkzeug, wenn nötig) und gesamte Inhalt einer Flasche in das Glas mit Steuer Wasser gießen, das gesamte Fläschchen fallen inLösung auch. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit dem Testglas. Cap und schütteln Sie die Gläser, um sicherzustellen, dass das Pulver vollständig gelöst ist. </li><li> Füllen Sie jedes der farbigen 10 ml Spritzen mit 9 ml entweder Kontrolle (blau Spritze) oder Test (rot Spritze) Lösungen aus den jeweiligen Fläschchen. Entfernen von Luftblasen aus Spritzen. </li><li> Entfernen Sie die Stecker aus den Biochip-Ports und den Abfluss befestigen. </li><li> Setzen Sie den Biochip in den abnehmbaren Plastikschale in der ECIS-Leser und den Deckel schließen. </li><li> Bringen Sie Spritzen an die äußeren Biochip-Ports und den Spritzenkolben befestigen. </li><li> Aus dem Hauptmenü die Option &quot;NEXT&quot; Pre-Test zu initiieren. Hinweis: Reader-Software Impedanzen überprüfen. Wenn Impedanzen durch den Benutzer innerhalb des Bereichs festgelegt sind ( in der Regel zwischen 1.000 und 3.000 Ohm) wird der Bildschirm Register &quot;Cartridge Bestanden&quot; , wie in Abbildung 3 angegeben ist , und den Benutzer anweisen, wählen Sie &quot;Weiter&quot; und die Software wird weitergehen 3.10 zu Schritt). Wenn die Impedanzen nicht innerhalbdie eingestellten Bereich wegen eines defekten Biochips oder fehlerhafte Verbindung des Biochips für den Leser (in der Regel aufgrund einer Fehlausrichtung der Elektroden), dann wird der Bildschirm Register &quot;Cartridge Failed&quot; und der Benutzer hat die Möglichkeit, entweder auf &quot;Abbrechen&quot; oder &quot;Überprüfen&quot; den Test. <ol><li> Wählen Sie &quot;Abbrechen&quot; zurück 3.9 zu Schritt). Wählen Sie &quot;Überprüfen&quot;, um fortzufahren 3.10 Schritt A) nach einem Empfang &quot;Cartridge Bestanden&quot; Nachricht und wählen Sie &quot;Weiter&quot;. Hinweis: Es ist am besten, den Biochip zu nehmen und visuell untersuchen Sie ihn auf Mängel oder undicht, wenn eine &quot;Cartridge fehlgeschlagen&quot; Nachricht, bevor Sie mit einem neuen Biochip empfangen wird. </li></ol></li></ol><img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53555/53555fig3.jpg" /> Abbildung 3:. ECIS Reader Screenshot eines Biochips mit Acceptable Impedanzmessungen Der Screenshot zeigt Anfangsimpedanzmessungen in Ohm jeder der vier Control Elektroden (CE) und 4 Testprobe Elektroden (SE) im fluidischen Biochip. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53555/53555fig3large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53555/53555fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <ol start="10"><li> Wenn der Leser aufgefordert, geben Sie Probeninformationen eine Soft-Tastatur verwenden und wählen Sie dann auf &quot;Akzeptieren&quot;, wenn Sie fertig. Hinweis: Die ECIS-Reader-Software automatisch bei jedem Datensatz mit dem Datumsstempel wird, Zeit und andere Informationen, die von dem Benutzer eingegeben; wie die Biochip-Nummer und die Art der chemischen und Konzentration. Zwei Minuten von Impedanzdaten werden aus dem eingesetzten Biochips gesammelt werden und ein On-Screen-Timer Countdown-Zeit. </li><li> Nach zwei Minuten, wenn sie durch Anweisungen auf dem Bildschirm aufgefordert, die in einem roten Feld blinken, klicken Sie auf &quot;Weiter&quot;. Wenn durch Blinken der grünen Box aufgefordert, &quot;Proben injizieren jetzt&quot;, injizieren, um die Kontroll- und Testmedien aus den beigefügten Spritzen gleichzeitig in den Biochip channels. Lassen Sie die Spritzen an Ort und Stelle auf den Biochips, wenn Sie fertig. Hinweis: Impedanzwerte werden einmal pro Minute für 60 Minuten gesammelt werden. Wenn der Leser Software ECIS bestimmt, dass der Behandlungskanal von dem Steuerkanal an einer beliebigen Stelle zwischen 10 und 60 Minuten nach Testbeginn, dann ist die On-Screen-Display zeigt an, dass die Probe &quot;verseucht&quot; statistisch unterschiedlich ist. Wenn die Behandlung nicht verschieden von dem Steuerkanal ist, dann wird der Bildschirm die Meldung &quot;Keine Kontamination erkannt&quot; am Ende des Testlaufs. </li><li> Nehmen Sie die Testergebnisse als kontaminiert oder nicht für jede Probe verunreinigt. </li><li> Am Ende des Testlaufs, zu entfernen und den Biochip zu verwerfen. Spülen und der Luft trocknen die Spritzen, Teströhrchen und herausnehmbaren Plastikschale, die den Biochip während der Tests untergebracht. Hinweis: Die ECIS Leser verfügt über 4 GB Onboard-Speicher für die Betriebssoftware, Steuerungsmodelle und die Testdateien generiert aus einem Test ausgeführt wird. Dies ermöglicht mehrere thousand Testdateien auf dem Lesegerät gespeichert werden. Die Dateien können mit einem USB-Sprung-Antrieb abgerufen werden und für weitere Analysen zu Forschungszwecken auf einen Computer übertragen, falls gewünscht. </li></ol>

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Opinions, interpretations, conclusions, and recommendations are those of the authors and are not necessarily endorsed by the U.S. Army. Citations of commercial organizations or trade names in this report do not constitute an official Department of the Army endorsement or approval of the products or services of these organizations. Authors Linda M. Brennan and Mark W. Widder, both of the US Army Center for Environmental Health Research, declare that they have no competing financial interests. Michael Mayo, Michael McAleer and Alex Greis are employees of Nanohmics that produces the disposable biochips and instruments used in this Article.10251980

Die ECIS Technologie eine gute Leistung in einer Laborumgebung und war in der Lage mögliche Wasser Verunreinigungen in Konzentrationen zu ermitteln, die für die menschliche Gesundheit relevant sind. Die Portabilität und Verpackung der Technologie macht es auf den Feldeinsatz förderlich. Kritische Schritte in dem Protokoll für den Erfolg der Technik sind wie folgt: 1) Halten Sie aseptischen Bedingungen während der Kultur, Säen und Fütterung der Biochips, 2) Halten Sie die ausgesäten Biochips in gekühlten Bedingungen bis zum Testen bereit, da die RTgill-W1-Zellen wird nicht sehr lange überleben, wenn sie auf Temperaturen über 25 ° C ausgesetzt sind, 3) wird genau das L-15ex in den pulverförmigen Phiolen Medien und genau die Wasserproben Fehlalarme zu vermeiden messen Herstellung, die durch eine Verschiebung der verursacht werden kann Osmolalität von Medien eher als Probe Toxizität, 4) zum Ausführen der Tests Gebrauchsanweisungen auf der ECIS Bildschirm. Die Software in dem Lesegerät alarmiert den Benutzer, wenn eine biochip ist nicht akzeptabel für die Prüfung (bezogen auf den anfänglichen Impedanzmessungen), wenn der Biochip zuerst in das Lesegerät eingeführt wird. Wenn die Impedanzniveaus nicht akzeptabel für die Prüfung sind, wird die Software nicht zulassen, dass der Benutzer mit der Prüfung fortfahren, bis ein neuer Biochip verwendet wird. Gründe für nicht akzeptabel Impedanzmessungen sind in der Regel aufgrund einer leichten Versatz der Biochip-Elektroden mit den ECIS Leser Stifte oder Flüssigkeitsleckage an einer der Verklebung Kanten des Biochips. Es gibt einige Grenzen dieser Technologie, da der ECIS Sensor nur mit Trinkwasser und nicht mit Oberflächenwasser getestet. Die RTgill-W1-Zellen, die auf dem Biochip sind, können nicht das Einfrieren oder die Temperaturen weit über 25 ° C für längere Zeit (Zeitrahmen abhängig von Stunden bis Tagen sein kann, von der Temperatur tolerieren. Die Biochips am besten funktionieren in einem Temperaturbereich von gekühlt Raumtemperatur 7. Sie sind sofort einsatzbereit, jedoch direkt nach r zu seinemoved von kalten Lagerung. Tragbare Kühlraumbehälter werden derzeit von Armeepersonal im Bereich für temperaturempfindliche Versorgungen verwendet. Diese gleichen Behälter können für geimpfte Biochip Transport verwendet werden. Eine weitere Beschränkung dieser Technik besteht darin, dass, obwohl es ein Breitbandsensor Toxizität ist, ist es nicht gut reagiert, wenn überhaupt, auf die Cholinesterase-hemmenden Verbindungen, wie einige Pestizide. Um diese Fähigkeit Lücke zu füllen, wird der ECIS-Sensor entwickelt, um mit einem im Handel erhältlichen schnellen Pestizid-Test-Test in Verbindung verwendet werden, wenn Wasserproben, um die Prüfung der Benutzer mit einem breiteren Spektrum von Toxizitätstests zur Verfügung zu stellen. Das Kit ist eine schnelle enzymatische Assays entwickelt, um Organophosphat und Carbamatpestiziden innerhalb von 30 Minuten zu erkennen. Die ECIS Sensor ergänzt das WQAS-PM (Water Quality Analysis System - Präventive Medizin) Bereich Wasser-Testsystem, das derzeit von militärischen Präventivmedizin Personal zur Erkennung, arsenic, Blei oder Zyanid in einer Trinkwasserprobe. Obwohl der ECIS Sensor nicht erkennen, was die Verunreinigung ist, zeigt es, wenn bestimmte Metalle oder organische Verbindungen vorhanden sind, was darauf hinweist, dass das Wasser nicht für den menschlichen Verzehr geeignet sind. Die ECIS Testergebnisse sind innerhalb einer Stunde zur Verfügung. Die Wasserproben können dann zur Identifizierung der kontaminierenden gesendet für eine weitere Analyse, wenn es ein positives Testergebnis. Wie oben beschrieben, wird der ECIS Leser ausgelegt ist Teil eines Systems sein, die eine separate enzymatische ACE-Kit, um ein breites Spektrum an Fremdkörperdetektion zur Deckung umfasst. Beide Leser werden in einem robusten Gehäuse verpackt für Feldtransport für den Feldeinsatz von Soldaten.

Das Ziel war es, ein Verfahren für die Zellaussaat, Lagerung und Prüfung von fluidischen Biochips im ECIS Biosensor zu entwickeln. Das Ziel für die Entwicklung dieses Biosensor war US-Armee Spezifikationen für ein Feld tragbares Gerät zu erfüllen, die eine mögliche Kontamination von Trinkwasserversorgung von Soldaten benutzt wird erkennen konnte. Die Anforderungen an die Toxizität Sensor waren, dass sie sich schnell ein breites Spektrum von toxischen Industrie Verbindungen erkennen konnte (innerhalb einer Stunde) in Konzentrationen relevant für die menschliche Gesundheit, dass das Gerät Feld tragbar sein, und die biologischen Komponenten würde eine Haltbarkeit haben, mindestens neun Monate. Kältetechnik, aber nicht das Einfrieren, die von verderblichen Komponenten war akzeptabel. Historisch gesehen haben, Feld tragbaren Wasser Prüftechnik mit einer biologischen Komponente , um sie (wie Antikörper, Enzyme oder Nucleinsäuren) Analyt-spezifischen 1-3. Der Nachteil dieser Art von Biosensoren ist, dass sie onl wirdy zu einem Zeitpunkt eine Art der chemischen Erkennung. Mehrere Sensoren benötigt werden, wenn vermutet wird, dass mehr als eine Chemikalie vorhanden ist. Wenn ein bestimmter Sensor nicht im Test Repertoire, chemische Verunreinigungen im Wasser ist, könnte leicht unentdeckt bleiben. Breit abgestütztes Toxizität Sensoren, auf der anderen Seite, haben das Potenzial, diese Technologielücke zu füllen. Diese haben in der Regel eine zelluläre Komponente , um sie 4-8. Die Vorteile der breit abgestützten Toxizität Biosensoren sind , dass sie das Vorhandensein einer Vielzahl von chemischen Verunreinigungen erkennen kann, einschließlich Mischungen und Unbekannten, in einem relativ kurzen Zeitraum 5,9,10. Das Konzept der Messung der elektrischen Impedanz von Zellmonolayern als mögliche Toxizitätssensor, der auch als elektrische Zell-Substrat - Impedanz - Mess (ECIS), wurde zuerst bekannt ist 11 von Giaever und Keese beschrieben. In den vergangenen zwei Jahrzehnten ein empfindlicher Indikator für Zell VIAB erwiesen wurdeility und Zytotoxizität. Grundsätzlich wird die Zellmonoschicht, die an die Elektroden auf den Biochips anhaftet auf Hochfrequenz ausgesetzt und niedriger Spannung und Stromstärke Wechselstromsignal. Die konfluente Monoschicht von Zellen behindert den Fluss der Elektronen. Wenn die Integrität der Zellmonoschicht beeinträchtigt ist (beispielsweise wenn eine giftige Chemikalie eingebracht wird), zeichnet der ECIS Sensor eine Änderung in der elektrischen Impedanz 11-14. 1 veranschaulicht das Prinzip der ECIS in Bezug auf die Zellmonoschicht auf dem Biochip . <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53555/53555fig1.jpg" /> Abbildung 1:.. Das Prinzip der ECIS Illustration einer Zellschicht auf einem Biochip mit vereinfachten ECIS Leser elektrisches Schema <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53555/53555fig1large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53555/53555fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> 12 beschrieben , verwendet. Diese Zellen waren nicht praktisch für den Feldeinsatz, aber, weil sie häufige Medienwechsel erforderlich ist , hatte eine begrenzte Haltbarkeit und erforderte eine künstliche CO 2 -Umgebung und 37 ° C Inkubationstemperatur. Es wurde entdeckt , daß ein im Handel erhältlicher Zelllinie , abgeleitet von Regenbogenforellen gill Epithelzellen (RTgill W-1 - Zellen) bei Raumtemperatur bei Umgebungs CO 2, getestet werden, um eine konfluente Monoschicht in den Biochips gebildet, könnte bei Kühltemperaturen gelagert werden, und hatte eine schnelle Reaktion (1 h oder weniger) zu einem breiten Spektrum an Chemikalien bei Konzentrationen relevant für die menschliche Gesundheit 12. Anwendungen von RTgill-W1 - Zellen in der Toxikologie, sowie in der Grundlagenforschung werden von Lee et al überprüft. 15 Verfahren für die Aussaat, Lagerung und Prüfung von fluidischen Biochips enthalten,Monoschichten von RTgill-W1 Zellen auf fluidische Biochips in einem Biosensor ECIS werden hier beschrieben. Die fluidische Biochips können für bis zu 9 Monate in einem gekühlten Zustand gelagert werden und kann zum Testen von Trinkwasser supplies.The begleitenden ECIS Leser, oder Testeinheiten werden separat ausgeliefert in einem kalten Lagerbehälter, versendet werden. Die Biochips haben zwei Komponenten zu ihnen; eine obere Polycarbonatschicht mit zwei getrennten Fluidkanäle, und eine untere Schicht, die elektronische vier Elektroden-Pads pro Kanal für die Impedanzabtastung enthält. Es gibt 10 Arbeitselektroden pro Pad; jede Elektrode 250 &amp; mgr; m im Durchmesser. Die versammelten Biochips haben Goldelektrodenanschlüsse zum Erfassen von Messwerten Impedanz, wenn sie in der ECIS Testgerät eingesetzt. Jede der beiden geschlossenen fluidischen U-förmige Kanäle hält 2 ml der RTgill-W1 Zellsuspension. 2 zeigt eine fluidische Biochip in dem ECIS Leser mit einer Vergrößerung von einer konfluenten Zellen auf einer einzelnen Sensorelektrode. Abbildung 2:.. Fluidic Biochip in ECIS Reader gezoomten Bereich zeigt eine konfluente Monoschicht von RTgill-W1 - Zellen auf einer einzigen Sensorelektrode <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53555/53555fig2large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53555/53555fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

<table><tbody><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Life Technologies, Inc. www.lifetechnologies.com</td><td>16000-085</td><td>Store @ -20 &amp;deg;C. Thaw @ room temperature before use. Ingredient for complete L-15 cell culture media (10%).</td></tr><tr><td>Fibronectin, bovine plasma</td><td>EMD Millipore Corp.&amp;nbsp;&amp;nbsp; www.emdmillipore.com&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>341631-1 mg</td><td>Store @ -20 &amp;deg;C. Thaw @ room temperature before use. Mix with L-15 media for a concentration of 10 &amp;#956;g/ml and freeze @ -20 &amp;deg;C in aliquots. Use as substrate for biochips.</td></tr><tr><td>L-15 media without L-glutamine</td><td>Lonza&amp;nbsp; www.lonzabioscience.com</td><td>12-700F</td><td>Basal media for cell culture and feeding biochips. Store at 6 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>L-15ex powdered media with phenol red</td><td>US Biological&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; www.usbio.net</td><td>L1501</td><td>Media is weighed out in 60 mg aliquots in 0.1 dram vials and stored at 6 &amp;deg;C in foil pouches with dessicant packs. Nine month shelf-life. Mixed with 10 ml of water sample for testing in biochips.</td></tr><tr><td>PBS, w/o Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; or Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;</td><td>Lonza&amp;nbsp; www.lonzabioscience.com</td><td>17-516F</td><td>Store at room temperature. Used for rinsing media when trypsinizing cell culture flasks.&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Trypsin, EDTA</td><td>Lonza&amp;nbsp; www.lonzabioscience.com</td><td>CC-5012</td><td>Store @ -20 &amp;deg;C. Thaw at room temperature and use to trypsinize cell culture flasks.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>T175 culture flasks</td><td>Fisher Scientific&lt;br/&gt; www.fishersci.com</td><td>12-565-30</td><td>Used for culturing RTgill-W1 cells.</td></tr><tr><td>Bleach</td><td>Chlorox&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; www.chlorox.com</td><td></td><td>Diluted to 20% with millique or distilled water for cleaning ECIS chips. Any household bleach is acceptable.</td></tr><tr><td>70% ethyl alcohol</td><td></td><td></td><td>For disinfecting biohood surfaces and any materials being placed in biohood.</td></tr><tr><td>Rainbow trout gill cells (RTgill-W1)&amp;nbsp;</td><td>American Type Tissue Culture Collection&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; www.atcc.org</td><td>CRL-2523</td><td>Cells cultured and used for biosensor (seeding biochips).</td></tr><tr><td>GlutaMAX-1 Supplement, 200 mM</td><td>Lonza&amp;nbsp; www.lonzabioscience.com</td><td>35050-061</td><td>Store at room temperature.&amp;nbsp; Ingredient for complete L-15 cell culture media (1%).</td></tr><tr><td>Penn/Strep Stock 10K/10K</td><td>Lonza&amp;nbsp; www.lonzabioscience.com</td><td>17-602E</td><td>Store @ -20 &amp;deg;C. Thaw @ room temperature before use. Ingredient for complete L-15 cell culture media (1%).</td></tr><tr><td>Pharmed BPT tubing</td><td>U.S. Plastic Corp.&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; www.usplastic.com</td><td>57317</td><td>Cut in 27 mm sections and autoclaved. Used for seeding biochips with cells and as a closed loop between media changes.</td></tr><tr><td>Polycarbonate luer fittings for Pharmed tubing assemblies</td><td>Value Plastics&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>MTLS210-9</td><td>Secured to each end of cut Pharmed tubing for insertion into bichips.</td></tr><tr><td>20 ml syringes, slip-tip</td><td>VWR Scientific&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; us.vwr.com</td><td>BD302831</td><td>Used for injection of cell suspension for seeding ECIS chips, as well as for feeding chips.</td></tr><tr><td>0.1 dram snap-cap polypropylene microvials</td><td>Bottles Jars and Tubes, Inc.&amp;nbsp;&amp;nbsp; www.bottlesjarsandtubes.com</td><td>30600</td><td>Used to store 60 mg aliquots of L-15ex powdered media.</td></tr><tr><td>60 mil Lexan fluidic ECIS biochips</td><td>Nanohmics, Inc.&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; www.nanohmics.com</td><td></td><td>Custom-made by Nanohmics, Inc. RTgill-W1 cells will be injected into the biochips and seeded chips will be placed in ECIS reader for testing.</td></tr><tr><td>Autoclavable Plastic Instrument Box&lt;br/&gt; 17 1/2&quot; x 7 3/4&quot; x 2 3/8&quot;</td><td>Medi-Dose EPS&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; medidose.com</td><td>IB701</td><td>Used to store the following; autoclaved plugs, biochips that have been cleaned, seeded biochips.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Paper heat-seal sterilization pouches, 7 &amp;frac12;&amp;rdquo; x 13&amp;rdquo;</td><td>CardinalHealth&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; www.cardinalhealth.com</td><td>90713</td><td>Used for autoclaving tubing and fittings and plugs.</td></tr><tr><td>Quantos automated powder dispenser</td><td>Mettler Toledo&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; www.mt.com</td><td>QB5</td><td>Automated dispension of 60 mg aliquots of powdered L-15ex into 0.1 dram vials.</td></tr><tr><td>ECIS reader</td><td>Nanohmics, Inc.&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; www.nanohmics.com</td><td></td><td>Custom-made by Nanohmics, Inc. Seeded biochip is inserted into the reader for conducting water toxicity testing.</td></tr><tr><td>3 x 5 metalized 2.5 mil polypropylene reclosable bags</td><td>Uline&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; www.uline.com</td><td>S-16893</td><td>Packaging and storage for both seeded biochips and powdered L-15ex media vials.</td></tr><tr><td>Leatherman squirt ps4</td><td>Amazon&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; www.Amazon.com</td><td></td><td>Used to open powdered media vials.</td></tr><tr><td>1 g silica gel desiccant packets&amp;nbsp;</td><td>Uline&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; www.uline.com</td><td>S-3902</td><td>Put in polypropylene bags with L-15ex powdered media vials to prevent the powder from picking up moisture.</td></tr><tr><td>Sterile 250 or 500 ml Nalgene bottles</td><td>Fisher Scientific&lt;br/&gt; www.fishersci.com</td><td>09-740-25C or E</td><td>Hold cell suspensions for seeding ECIS chips in biohood.</td></tr><tr><td>Plugs for biochips</td><td>Nanohmics, Inc.&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; www.nanohmics.com</td><td></td><td>Custom-made by Nanohmics, Inc. Used to seal ports on biochips before storage at 6 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Drains for ECIS biochips</td><td>Nanohmics, Inc.&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; www.nanohmics.com</td><td></td><td>Custom-made by Nanohmics, Inc. Placed on 2 inner ports on biochips prior to insertion in ECIS reader.&amp;nbsp; Allows for excess media to drain from channels during test injections.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Fisher Scientific&lt;br/&gt; www.fishersci.com</td><td>S17040</td><td>Needed for counting cells prior to adjusting cell suspension for injection into biochips.</td></tr><tr><td>Brightfield microscope w/ 10X objective</td><td>Leitz Labovert</td><td></td><td>Any brightfield microscope is acceptable.</td></tr><tr><td>Class II biological safety cabinet</td><td></td><td></td><td>Any class II biological safety cabinet where cell culture can be performed under sterile conditions is acceptable.</td></tr><tr><td>Microcentrifuge tubes, 0.6 ml</td><td>Fisher Scientific&lt;br/&gt; www.fishersci.com</td><td>02-681-311</td><td>Holds 1 ml of cell suspension prior to counting cells.</td></tr><tr><td>Slip 10 cc red syringes</td><td>Procedure Products, Inc.&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; www.procedureproducts.com</td><td>S/49S 30-R</td><td>Withdraws 9 ml of test water sample and used to inject sample into biochip.</td></tr><tr><td>Slip 10 cc blue syringes</td><td>Procedure Products, Inc.&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; www.procedureproducts.com</td><td>S/49S 30-B</td><td>Withdraws 9 ml of control water sample and used to inject sample into biochip.</td></tr><tr><td>&amp;frac12; oz. clear pet plastic jar w/ white ribbed lined caps</td><td>SKS Bottle &amp;amp; Packaging, Inc.&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; www.sks-bottle.com</td><td>0605-30</td><td>Sample vials used for mixing L-15ex powder and 10 ml of water sample for testing.</td></tr><tr><td>50 ml sterile conical polypropylene centrifuge tubes</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; www.fishersci.com</td><td>12-565-269</td><td>Used to hold 40 ml aliquots of 10 &amp;#956;g/ml fibronectin at -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>NIDS ACE Acetylcholinesterase Inhibitor Detection Test</td><td>ANP Technologies, Inc.&lt;br/&gt;www.anptinc.com</td><td>ACE-400</td><td>Sensor designed for the rapid detection of pesticides in drinking water</td></tr></tbody></table>

preparation and testing of impedance-based fluidic biochips with rtgill-w1 cells for rapid evaluation of drinking water samples for toxicity

This manuscript describes how to prepare fluidic biochips with Rainbow trout gill epithelial (RTgill-W1) cells for use in a field portable water toxicity sensor. A monolayer of RTgill-W1 cells forms on the sensing electrodes enclosed within the biochips. The biochips are then used for testing in a field portable electric cell-substrate impedance sensing (ECIS) device designed for rapid toxicity testing of drinking water. The manuscript further describes how to run a toxicity test using the prepared biochips. A control water sample and the test water sample are mixed with pre-measured powdered media and injected into separate channels of the biochip. Impedance readings from the sensing electrodes in each of the biochip channels are measured and compared by an automated statistical software program. The screen on the ECIS instrument will indicate either "Contamination Detected" or "No Contamination Detected" within an hour of sample injection. Advantages are ease of use and rapid response to a broad spectrum of inorganic and organic chemicals at concentrations that are relevant to human health concerns, as well as the long-term stability of stored biochips in a ready state for testing. Limitations are the requirement for cold storage of the biochips and limited sensitivity to cholinesterase-inhibiting pesticides. Applications for this toxicity detector are for rapid field-portable testing of drinking water supplies by Army Preventative Medicine personnel or for use at municipal water treatment facilities.

Die ECIS Technologie in diesem Papier beschrieben unterzog Prüfung bei der US Environmental Protection Agency (US-EPA) -sponsored Technik Prüf- und Evaluation Program (TTEP). Dreizehn Chemikalien wurden für die Prüfung als Vertreter eines breiten Spektrums von toxischen Industrie Verbindungen ausgewählt, die mögliche Verunreinigungen von Trinkwasser sein könnte. Während des Tests, 9 der 13 durch ECIS innerhalb einer Stunde bei Konzentrationen nachgewiesen wurden , die für die menschliche Gesundheit relevant sind 8. Tabelle 1 zeigt die Ergebnisse dieser Verunreinigungsprüfung. 4 Figur ist repräsentativ , was ein &quot;verseucht&quot; Ergebnis wie auf aussehen der ECIS Leser Bildschirm. Zum größten Teil, verminderte zelluläre Impedanzen für kontaminierte Proben im Vergleich zu Kontrollen. Gelegentlich können bestimmte Verbindungen, die eine Erhöhung der Impedanz verursachen. Auch in Tabelle 1 zusammengefasst </strong&gt; ist die saubere Wasserprüfung. Vierzig saubere Wasserproben wurden durchgeführt und keine Verunreinigung wurde in keiner der Proben (siehe Abbildung 5) für einen repräsentativen Screenshot von &quot;No Verunreinigung festgestellt&quot; erkannt. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/53555/53555fig4.jpg" /> Abbildung 4: ECIS Reader Screenshot einer &quot;verseucht&quot; Wasserprobe Ein Beispiel für eine normalisierte Impedanz Grafiken und Ergebnisse aus einer Wasserprobe , die verunreinigt war.. Blaue Linien stellen normalisierte Impedanzen von jeder der Steuerelektroden; roten Linien stellen normalisierte Impedanzen jedes der Testprobe Elektroden. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53555/53555fig4large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53555/53555fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/53555/53555fig5.jpg" /> Abbildung 5: ECIS Reader Screenshot einer &quot;No Verunreinigung festgestellt&quot; Wasserprobe Ein Beispiel für eine normalisierte Impedanz Grafiken und Ergebnisse aus einer Wasserprobe , die nicht verunreinigt war.. Blaue Linien stellen normalisierte Impedanzen von jeder der Steuerelektroden; roten Linien stellen normalisierte Impedanzen jedes der Testprobe Elektroden. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53555/53555fig5large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53555/53555fig5large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Kategorie </td><td> Contaminant </td><td colspan="3"> Getestete Konzentration (mg / L) 1 </td><td colspan="2"> Erkannt ≤1 Stunde n = 4/4 Chips </td></tr><tr><td rowspan="8"> Pestizide </td><td> Aldicarb </td><td colspan="3"> 0,17 </td><td colspan="2"> Nein </td></tr><tr><td> Arsen<html> ic (Natriumarsenit) </td><td colspan="3"> 4.5 </td><td colspan="2"> ja </td></tr><tr><td> Azid (Natriumazid) </td><td colspan="3"> 46.7 </td><td colspan="2"> ja </td></tr><tr><td> Fenamiphos </td><td colspan="3"> 0,56 </td><td colspan="2"> Nein </td></tr><tr><td> Methamidophos </td><td colspan="3"> 1.4 </td><td colspan="2"> Nein </td></tr><tr><td> methyl Parathion </td><td colspan="3"> 33.6 </td><td colspan="2"> ja </td></tr><tr><td> Paraquat (dichlorid) </td><td colspan="3"> 4.6 </td><td colspan="2"> Nein </td></tr><tr><td> Pentachlorophenate (Natrium) </td><td colspan="3"> 71,9 </td><td colspan="2"> ja </td></tr><tr><td rowspan="5"> Industriechemikalien </td><td> Ammoniak </td><td colspan="3"> 924 </td><td colspan="2"> ja </td></tr><tr><td> Kupfer (Kupfer-II-Sulfat) </td><td colspan="3"> 103 </td><td colspan="2"> ja </td></tr><tr><td> Cyanid (Natrium) </td>3 &quot;&gt; 14 </td><td colspan="2"> ja </td></tr><tr><td> Mercury (Chlorid) </td><td colspan="3"> 24.7 </td><td colspan="2"> ja </td></tr><tr><td> Toluol </td><td colspan="3"> 444 </td><td colspan="2"> ja </td></tr><tr><td> Clean Water 2 </td><td> keiner </td><td colspan="3"> N / A </td><td colspan="2"> Nein </td></tr><tr><td colspan="7"> 1 getesteten Konzentrationen sind die gleichen wie in dem Manuskript von Widder, et al. (2014). </td></tr><tr><td colspan="7"> 2 40 saubere Wasserproben wurden ohne Kontamination führen. </td></tr></tbody></table> Tabelle 1: Schadstoffe in Wasserproben durch ECIS erkannt.

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Preparation and Testing of Impedance-based Fluidic Biochips with RTgill-W1 Cells for Rapid Evaluation of Drinking Water Samples for Toxicity

Herstellung und Prüfung von impedanzbasierten Fluidic Biochips mit RTgill-W1 Zellen für die schnelle Auswertung von Trinkwasserproben für Toxizität

This manuscript describes how to prepare fluidic biochips with Rainbow trout gill epithelial cells for use in a field portable electric cell-substrate impedance sensor. The protocol for running a rapid drinking water toxicity test with the sensor is also described.

This manuscript describes how to prepare fluidic biochips with Rainbow trout gill epithelial (RTgill-W1) cells for use in a field portable water toxicity ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Environment

9.0K Aufrufe.  U.S. Army Center for Environmental Health Research. This manuscript describes how to prepare fluidic biochips with Rainbow trout gill epithelial cells for use in a field portable electric cell-substrate impedance sensor. The protocol for running a rapid drinking water toxicity test with the sensor is also described. 

Serie: Preparation and Testing of Impedance-based Fluidic Biochips with RTgill-W1 Cells for Rapid Evaluation of Drinking Water Samples for Toxicity

Regeneration of Arrayed Gold Microelectrodes Equipped for a Real-Time Cell Analyzer

The label-free cell-based assay is advantageous for biochemical study because of it does not require the use of experimental animals. Due to its ability to provide more dynamic information about cells under physiological conditions than classical biochemical assays, this label-free real-time cell assay based on the electric impedance principle is attracting more attention during the past decade. However, its practical utilization may be limited due to the relatively expensive cost of measurement, in which costly consumable disposable gold microchips are used for the cell analyzer. In this protocol, we have developed a general strategy to regenerate arrayed gold microelectrodes equipped for a commercial label-free cell analyzer. The regeneration process includes trypsin digestion, rinsing with ethanol and water, and a spinning step. The proposed method has been tested and shown to be effective for the regeneration and repeated usage of commercial electronic plates at least three times, which will help researchers save on the high running cost of real-time cell assays.

This protocol describes a general strategy to regenerate commercial arrayed gold microelectrodes equipped for a label-free cell analyzer aimed at saving on the high running costs ofmicrochip-based assays. The regeneration process includes trypsin digestion, rinsing with ethanol and water, and a spinning step, which enables repeated usage of microchips.

Regeneration der angeordneten Gold Mikroelektroden ausgestattet für eine Echtzeit-Zelle-Analyzer

The label-free cell-based assay is advantageous for biochemical study because of it does not require the use of experimental animals. Due to its ability ...

Forschung

Biochemie

Culturing and Electrophysiology of Cells on NRCC Patch-clamp Chips

Due to its exquisite sensitivity and the ability to monitor and control individual cells at the level of ion channels, patch-clamping is the gold standard of electrophysiology applied to disease models and pharmaceutical screens alike 1. The method traditionally involves gently contacting a cell with a glass pipette filled by a physiological solution in order to isolate a patch of the membrane under its apex 2. An electrode inserted in the pipette captures ion-channel activity within the membrane patch or, when ruptured, for the whole cell. In the last decade, patch-clamp chips have been proposed as an alternative 3, 4: a suspended film separates the physiological medium from the culture medium, and an aperture microfabricated in the film replaces the apex of the pipette. Patch-clamp chips have been integrated in automated systems and commercialized for high-throughput screening 5. To increase throughput, they include the fluidic delivery of cells from suspension, their positioning on the aperture by suction, and automated routines to detect cell-to-probe seals and enter into whole cell mode. We have reported on the fabrication of a silicon patch-clamp chip with optimized impedance and orifice shape that permits the high-quality recording of action potentials in cultured snail neurons 6; recently, we have also reported progress towards interrogating mammalian neurons 7. Our patch-clamp chips are fabricated at the Canadian Photonics Fabrication Centre 8, a commercial foundry, and are available in large series. We are eager to engage in collaborations with electrophysiologists to validate the use of the NRCC technology in different models. The chips are used according to the general scheme represented in Figure 1: the silicon chip is at the bottom of a Plexiglas culture vial and the back of the aperture is connected to a subterranean channel fitted with tubes at either end of the package. Cells are cultured in the vial and the cell on top of the probe is monitored by a measuring electrode inserted in the channel.The two outside fluidic ports facilitate solution exchange with minimal disturbance to the cell; this is an advantage compared to glass pipettes for intracellular perfusion.
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3288/3288fig1.jpg" />
Figure 1. Principle of measurement using the NRCC patch-clamp chip
We detail here the protocols to sterilize and prime the chips, load them with medium, plate them with cells, and finally use them for electrophysiological recordings.

We show how planar patch-clamp chips fabricated at the National Research Council of Canada are sterilized, primed, loaded with medium, plated with cells, and used for electrophysiological recordings.

Die Züchtung und Elektrophysiologie von Zellen auf NRCC Patch-Clamp-Chips

Due to its exquisite sensitivity and the ability to monitor and control individual cells at the level of ion channels, patch-clamping is the gold standard ...

Neurowissenschaften

A Microfluidic Chip for the Versatile Chemical Analysis of Single Cells

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this purpose, the cells are passively trapped in the middle of a microchamber. Upon activation of the control layer, the cell is isolated from the surrounding volume in a small chamber. The surrounding volume can then be exchanged without affecting the isolated cell. However, upon short opening and closing of the chamber, the solution in the chamber can be replaced within a few hundred milliseconds. Due to the reversibility of the chambers, the cells can be exposed to different solutions sequentially in a highly controllable fashion, e.g. for incubation, washing, and finally, cell lysis. The tightly sealed microchambers enable the retention of the lysate, minimize and control the dilution after cell lysis. Since lysis and analysis occur at the same location, high sensitivity is retained because no further dilution or loss of the analytes occurs during transport. The microchamber design therefore enables the reliable and reproducible analysis of very small copy numbers of intracellular molecules (attomoles, zeptomoles) released from individual cells. Furthermore, many microchambers can be arranged in an array format, allowing the analysis of many cells at once, given that suitable optical instruments are used for monitoring. We have already used the platform for proof-of-concept studies to analyze intracellular proteins, enzymes, cofactors and second messengers in either relative or absolute quantifiable manner.

In this article we present a microfluidic chip for single cell analysis. It allows the quantification of intracellular proteins, enzymes, cofactors, and second messengers by means of fluorescent assays or immunoassays.&#160;

Eine mikrofluidische Chip für die vielseitige chemische Analyse von Einzelzellen

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this ...

Biotechnik

Stress-induced Antibiotic Susceptibility Testing on a Chip

We have developed a rapid microfluidic method for antibiotic susceptibility testing in a stress-based environment. Fluid is passed at high speeds over bacteria immobilized on the bottom of a microfluidic channel. In the presence of stress and antibiotic, susceptible strains of bacteria die rapidly. However, resistant bacteria survive these stressful conditions. The hypothesis behind this method is new: stress activation of biochemical pathways, which are targets of antibiotics, can accelerate antibiotic susceptibility testing. As compared to standard antibiotic susceptibility testing methods, the rate-limiting step -&#160;bacterial growth -&#160;is omitted during antibiotic application. The technical implementation of the method is in a combination of standard techniques and innovative approaches. The standard parts of the method include bacterial culture protocols, defining microfluidic channels in polydimethylsiloxane&#160;(PDMS), cell viability monitoring with fluorescence, and batch image processing for bacteria counting. Innovative parts of the method are in the use of culture media flow for mechanical stress application, use of enzymes to damage but not kill the bacteria, and use of microarray substrates for bacterial attachment. The developed platform can be used in antibiotic and nonantibiotic related drug development and testing. As compared to the standard bacterial suspension experiments, the effect of the drug can be turned on and off repeatedly over controlled time periods. Repetitive observation of the same bacterial population is possible over the course of the same experiment.

We have developed a microfluidic platform for rapid antibiotic susceptibility testing. Fluid is passed at high speeds over bacteria immobilized on the bottom of a microfluidic channel. In the presence of stress and antibiotic, susceptible strains of bacteria die rapidly. However, resistant bacteria can survive these stressful conditions.

Stressinduzierte Antibiotika-Anfälligkeitstests auf einem Chip

We have developed a rapid microfluidic method for antibiotic susceptibility testing in a stress-based environment. Fluid is passed at high speeds over ...

A Microfluidic-based Electrochemical Biochip for Label-free DNA Hybridization Analysis

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration of pre-processing steps. Utilizing these devices towards the analysis of DNA hybridization events is important because it offers a technology for real time assessment of biomarkers at the point-of-care for various diseases. However, when the device footprint decreases the dominance of various physical phenomena increases. These phenomena influence the fabrication precision and operation reliability of the device. Therefore, there is a great need to accurately fabricate and operate these devices in a reproducible manner in order to improve the overall performance. Here, we describe the protocols and the methods used for the fabrication and the operation of a microfluidic-based electrochemical biochip for accurate analysis of DNA hybridization events. The biochip is composed of two parts: a microfluidic chip with three parallel micro-channels made of polydimethylsiloxane (PDMS), and a 3 x 3 arrayed electrochemical micro-chip. The DNA hybridization events are detected using electrochemical impedance spectroscopy (EIS) analysis. The EIS analysis enables monitoring variations of the properties of the electrochemical system that are dominant at these length scales. With the ability to monitor changes of both charge transfer and diffusional resistance with the biosensor, we demonstrate the selectivity to complementary ssDNA targets, a calculated detection limit of 3.8 nM, and a 13% cross-reactivity with other non-complementary ssDNA following 20 min&#160;of incubation. This methodology can improve the performance of miniaturized devices by elucidating on the behavior of diffusion at the micro-scale regime and by enabling the study of DNA hybridization events.

We present a microfluidic-based electrochemical biochip for DNA hybridization detection. Following ssDNA probe functionalization, the specificity, sensitivity, and detection limit are studied with complementary and non-complementary ssDNA targets. Results illustrate the influence of the DNA hybridization events on the electrochemical system, with a detection limit of 3.8 nM.

Einem mikrofluidischen Biochip-basierte Elektrochemische für Markierungsfreie DNA-Hybridisierungsanalyse

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration ...

Designing Microfluidic Devices for Studying Cellular Responses Under Single or Coexisting Chemical/Electrical/Shear Stress Stimuli

Microfluidic devices are capable of creating a precise and controllable cellular micro-environment of pH, temperature, salt concentration, and other physical or chemical stimuli. They have been commonly used for in vitro cell studies by providing in vivo like surroundings. Especially, how cells response to chemical gradients, electrical fields, and shear stresses has drawn many interests since these phenomena are important in understanding cellular properties and functions. These microfluidic chips can be made of glass substrates, silicon wafers, polydimethylsiloxane (PDMS) polymers, polymethylmethacrylate (PMMA) substrates, or polyethyleneterephthalate (PET) substrates. Out of these materials, PMMA substrates are cheap and can be easily processed using laser ablation and writing. Although a few microfluidic devices have been designed and fabricated for generating multiple, coexisting chemical and electrical stimuli, none of them was considered efficient enough in reducing experimental repeats, particular for screening purposes. In this report, we describe our design and fabrication of two PMMA-based microfluidic chips for investigating cellular responses, in the production of reactive oxygen species and the migration, under single or coexisting chemical/electrical/shear stress stimuli. The first chip generates five relative concentrations of 0, 1/8, 1/2, 7/8, and 1 in the culture regions, together with a shear stress gradient produced inside each of these areas. The second chip generates the same relative concentrations, but with five different electric field strengths created within each culture area. These devices not only provide cells with a precise, controllable micro-environment but also greatly increase the experimental throughput.

Micro-fabricated devices integrated with fluidic components provide an in vitro platform for cell studies mimicking the in vivo micro-environment. We developed polymethylmethacrylate-based microfluidic chips for studying cellular responses under single or coexisting chemical/electrical/shear stress stimuli.

Entwerfen Mikrofluidiksysteme für ein Studium zellulären Reaktionen Unter Einzel- oder Coexisting Chemie / Elektro / Schubspannung Stimuli

Microfluidic devices are capable of creating a precise and controllable cellular micro-environment of pH, temperature, salt concentration, and other ...

Dry Film Photoresist-based Electrochemical Microfluidic Biosensor Platform: Device Fabrication, On-chip Assay Preparation, and System Operation

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An easy-to-use and low-cost sensor platform is highly desired to measure various types of analytes (e.g., biomarkers, hormones, and drugs) quantitatively and specifically. For this reason, dry film photoresist technology - enabling cheap, facile, and high-throughput fabrication - was used to manufacture the microfluidic biosensor presented here. Depending on the bioassay used afterwards, the versatile platform is capable of detecting various types of biomolecules. For the fabrication of the device, platinum electrodes are structured on a flexible polyimide (PI) foil in the only clean-room process step. The PI foil serves as a substrate for the electrodes, which are insulated with an epoxy-based photoresist. The microfluidic channel is subsequently generated by the development and lamination of dry film photoresist (DFR) foils onto the PI wafer. By using a hydrophobic stopping barrier in the channel, the channel is separated into two specific areas: an immobilization section for the enzyme-linked assay and an electrochemical measurement cell for the amperometric signal readout.
The on-chip bioassay immobilization is performed by the adsorption of the biomolecules to the channel surface. The glucose oxidase enzyme is used as a transducer for electrochemical signal generation. In the presence of the substrate, glucose, hydrogen peroxide is produced, which is detected at the platinum working electrode. The stop-flow technique is applied to obtain signal amplification along with rapid detection. Different biomolecules can quantitatively be measured by means of the introduced microfluidic system, giving an indication of different types of diseases, or, in regard to therapeutic drug monitoring, facilitating a personalized therapy.

A microfluidic biosensor platform was designed and fabricated using low-cost dry film photoresist technology for the rapid and sensitive quantification of various analytes. This single-use system allows for the electrochemical readout of on-chip-immobilized enzyme-linked assays by means of the stop-flow technique.

Trockenen Film Photoresist-basierte elektrochemische mikrofluidischen Biosensor Plattform: Gerät Fertigung, On-Chip-Test Vorbereitung und Systembetrieb

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An ...

Fabrication and Validation of an Organ-on-chip System with Integrated Electrodes to Directly Quantify Transendothelial Electrical Resistance

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful research tools for studying human health and disease. To characterize the barrier function of cell layers cultured inside organ-on-chip devices, often transendothelial or transepithelial electrical resistance (TEER) is measured. To this end, electrodes are usually integrated into the chip by micromachining methods to provide more stable measurements than is achieved with manual insertion of electrodes into the inlets of the chip. However, these electrodes frequently hamper visual inspection of the studied cell layer or require expensive cleanroom processes for fabrication. To overcome these limitations, the device described here contains four easily integrated electrodes that are placed and fixed outside of the culture area, making visual inspection possible. Using these four electrodes the resistance of six measurement paths can be quantified, from which the TEER can be directly isolated, independent of the resistance of culture medium-filled microchannels. The blood-brain barrier was replicated in this device and its TEER was monitored to show the device applicability. This chip, the integrated electrodes and the TEER determination method are generally applicable in organs-on-chips, both to mimic other organs or to be incorporated into existing organ-on-chip systems.

This publication describes the fabrication of an organ-on-chip device with integrated electrodes for direct quantification of transendothelial electrical resistance (TEER). For validation, the blood-brain barrier was mimicked inside this microfluidic device and its barrier function was monitored. The presented methods for electrode integration and direct TEER quantification are generally applicable.

Herstellung und Validierung von einer Orgel-on-Chip-System mit integrierten Elektroden, direkt Transendothelial elektrischen Widerstand zu quantifizieren

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful ...

Bewertung von MOF-induzierten Änderungen des Zellverhaltens durch elektrische Zell-Substrat-Sensorik

Electric Cell-Substrate Sensing for Real-Time Evaluation of Metal-Organic Framework Toxicological Profiles

Metal-organic frameworks (MOFs) are hybrids formed through the coordination of metal ions and organic linkers in organic solvents. The implementation of MOFs in biomedical and industrial applications has led to concerns regarding their safety. Herein, the profile of a selected MOF, a zeolitic imidazole framework, was evaluated upon exposure to human lung epithelial cells. The platform for evaluation was a real-time technique (i.e., electric cell-substrate impedance sensing [ECIS]). This study identifies and discusses some of the deleterious effects of the selected MOF on the exposed cells. Furthermore, this study demonstrates the benefits of using the real-time method versus other biochemical assays for comprehensive cell evaluations. The study concludes that observed changes in cell behavior could hint at possible toxicity induced upon exposure&#160;to MOFs of different physicochemical characteristics and the dosage of those frameworks being used. By understanding changes in cell behavior, one foresees the ability to improve safe-by-design strategies of MOFs to be used for biomedical applications by specifically tailoring their physicochemical characteristics.

Autor im Rampenlicht: Fortschritte bei der Bewertung der Reaktion menschlicher Lungenepithelzellen auf metallorganische Gerüste 

The following study evaluates the toxicological profile of a selected metal-organic framework utilizing electric cell-substrate impedance sensing (ECIS), a real-time, high-throughput screening technique.

Elektrische Zell-Substrat-Sensorik zur Echtzeit-Bewertung von toxikologischen Profilen metallorganischer Gerüstverbindungen

Metal-organic frameworks (MOFs) are hybrids formed through the coordination of metal ions and organic linkers in organic solvents. The implementation of ...

Herstellung und Prüfung von impedanzbasierten Fluidic Biochips mit RTgill-W1 Zellen für die schnelle Auswertung von Trinkwasserproben für Toxizität

Zusammenfassung

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Regeneration der angeordneten Gold Mikroelektroden ausgestattet für eine Echtzeit-Zelle-Analyzer

Die Züchtung und Elektrophysiologie von Zellen auf NRCC Patch-Clamp-Chips

Eine mikrofluidische Chip für die vielseitige chemische Analyse von Einzelzellen

Stressinduzierte Antibiotika-Anfälligkeitstests auf einem Chip

Einem mikrofluidischen Biochip-basierte Elektrochemische für Markierungsfreie DNA-Hybridisierungsanalyse

Entwerfen Mikrofluidiksysteme für ein Studium zellulären Reaktionen Unter Einzel- oder Coexisting Chemie / Elektro / Schubspannung Stimuli

Trockenen Film Photoresist-basierte elektrochemische mikrofluidischen Biosensor Plattform: Gerät Fertigung, On-Chip-Test Vorbereitung und Systembetrieb

Herstellung und Validierung von einer Orgel-on-Chip-System mit integrierten Elektroden, direkt Transendothelial elektrischen Widerstand zu quantifizieren

Elektrische Zell-Substrat-Sensorik zur Echtzeit-Bewertung von toxikologischen Profilen metallorganischer Gerüstverbindungen

Elektrische Zell-Substrat-Sensorik zur Echtzeit-Bewertung von toxikologischen Profilen metallorganischer Gerüstverbindungen