저자는 그랜트 번호 31003A-1분의 132,358, 31003A_152972 및 번호 151948에 대한 스위스 국립 과학 재단 (National Science Foundation)을 인정하고 Fundation 피에르 메르 라 과학을 붓는다.

화학 물질 및 장비의 1. 준비 <ol><li> 1 %의 나트륨 헥사 (SHMP) (나포 3) N 용액 500 mL로하고 고압 증기 멸균에 의해 소독. </li><li> 폐 유리 페트리 접시에서 고압 증기 멸균에 의해 멸균 니트로 셀룰로오스 (NC) 필터 (기공 크기 0.22 μm의 직경 47mm). </li><li> 폐 유리 페트리 접시에서 고압 증기 멸균에 의해 NC 필터 (기공 크기 0.22 μm의 직경 25mm)를 소독. </li><li> 무게 (에 캡) 멸균 50 ㎖ 튜브의 빈 무게 (샘플 당 하나의 튜브를) 참고. </li><li> EDTA 트리스 완충액 (TE 버퍼) (1X)를 준비 : 10 mM 트리스 (트리스 (히드 록시 메틸) 아미노 메탄) 및 1 mM의 EDTA 완충액 용액을 만든다. 8 산도를 조정하고 고압 증기 멸균에 의해 소독. </li><li> 1 ㎖의 TE 완충액에 리소자임 0.02 g을 용해하여 리소자임 용액 (20 ㎎ / ㎖)을 제조. 이상적으로, 때마다 신선한합니다. 더 이상 1 이상 주 4 ℃에서 보관하십시오. </li><li> 8g / L 염화 나트륨을 용해시켜 용액을 제조 생리증류수 (염화나트륨). 고압 증기 멸균에 의해 소독. </li></ol> 퇴적물에서 바이오 매스 2. 분리 <ol><li> 퇴적물 시료 3 g을 에탄올 골조 금속 국자를 사용하여 50 ㎖ 튜브를 멸균 무게를 사전에 추가합니다. 오염을 방지하기 위해 깨끗하고 자외선 살균 바이오 안전성 캐비닛에이를 수행합니다. </li><li> 멸균이 뷰렛을 졸업 사용하여 샘​​플에 1 % 살균 (멸균) SHMP 솔루션의 15 ML을 추가합니다. SHMP 용액은 오염을 방지하기 위해 필터링 될 수있다. </li><li> 액체 분산기 / 균질 (예를 들어, 울트라 타락 균질)와 침전물과 SHMP 솔루션을 균질화. 70 % 에탄올 소독 또는 사용하기 전에 분산 로터를 압력솥. 17,500 rpm에서 1 분간 균질화를 실행합니다. 2 분 동안 샘플 나머지를하자 같은 회 전자 속도에서 1 분 동안 균질화를 반복합니다. </li><li> 샘플은 10 분 동안 서 보자. 이 단계에서 가장 무거운 입자 (미네랄) 해결됩니다. 그러나 세포와 w 샘플 중 유기 성분병이 용액에 남아 있습니다. 퇴적물 펠렛을 방해하지 않도록주의하면서 그 후, 깨끗한 50 ML 튜브에 뜨는 용액 (포함하는 세포 바이오 매스)을 전송합니다. </li><li> 침전물 펠릿에 멸균이 뷰렛을 졸업하여 1 % 살균 (멸균) SHMP 솔루션 다시 15 ml를 추가합니다. 그런 다음 반복 2.3 및 2.4 단계를 반복합니다. 이 반복은 퇴적물의 미네랄 성분으로부터 세포 및 유기 입자의 최대 양의 분리를 보장한다. 이 제 2 분리의 상등액을 제 1 분리에서 상등액과 병합 될 수있다. 주 : 다음 단계는 모든 (셀 바이오 매스를 포함) 상층 액에서 수행된다. 미네랄 성분 (퇴적물 펠렛) 폐기 될 수있다. </li><li> 1 분 20 XG에서 샘플을 원심 분리기. 생물 세포 물질은 여전히​​ 용액에 남아있는 동안이 단계는 작은 광물 입자를 해결하기에 충분 G-힘을 증가시킨다. 원심 분리 후, 상청에 용액 (세포 함유 매스)를 전송할깨끗한 50 ML 튜브. 미네랄 펠렛을 폐기하십시오. </li><li> 샘플을 계량하여 바이오 매스를 함유하는 용액의 최종 부피를 결정한다. 가중치 결정 눈금 실린더에 시료를 전송하는 데 및 오염의 위험을 감소 피한다. </li></ol> 필터 멤브레인에 바이오 매스의 3 컬렉션 <ol><li> 여과 장치 (47mm 직경 멤브레인) 및 진공 펌프를 준비합니다. 고온 가압 멸균하여 70 % 에탄올을 분무 분젠 버너로 타오르는 그래피 (파이렉스 유리의 경우) 중 여과 부 소독. 이 프로토콜을 계속하기 전에 식혀 보자. </li><li> 에탄올 골조 멸균 집게를 사용하여 여과 장치에 멸균 NC 멤브레인을 추가합니다. </li><li> 진공 펌프를 사용하여 멤브레인에 세포 막 여과 장치에 (단계 2.6)에서 시료의 상층 액의 절반을 첨가하고 수집한다. </li><li> 액체가 완전히 필터를 통과 한 경우, 진공 펌프를 정지하고 이단을 사용하여 조심스럽게 제거 막OL-불꽃 집게를 소독. 멸균 페트리 접시에 막 놓습니다. <ol><li> 에탄올 골조 멸균 가위를 사용하여 반으로 막을 잘라. 별도의 2 ML 튜브에 막의 각각의 절반을 추가합니다. 멤브레인의 절반은 DNA 추출 및 사회 전체 박테리아의 분석을 위해 사용된다. 필터의 다른 절반은 -80 ° C에서 저장 및 백업의 역할을한다. </li></ol></li><li> 여과 유닛 상에 새로운 NC 멤브레인을두고 진공 펌프를 사용하여 (단계 260)에서 샘플 볼륨의 후반에서 미생물을 모은다. </li><li> 액체가 완전히 필터를 통과 한 경우, 진공 펌프를 정지하고 신중 에탄올 골조 멸균 집게를 사용하여 멤브레인을 제거한다. 별도의 2 ML 튜브로 전체 막 놓습니다. 이 샘플은 식물 세포로부터 내생 포자를 분리하는 처리를 위해 사용될 것이다. 시료를 사용할 때까지 -20 ℃에서 저장 될 수있다. </li></ol> 식물 세포의 용해 (4) <ol><li> 수행치료 이전에 NC 막 (단계 3.6)에 수집 된 바이오 매스에 식물 세포에서 내생 포자를 분리합니다. <ol><li> 멤브레인이 동결 된 경우 해동 실온에서 10 분 동안두고. 그런 다음 멸균 페트리 접시에서 막을 배치하고 에탄올 골조 멸균 가위를 사용하여 작은 조각으로 (약 4 배)를 잘라. 그런 다음 멸균 2 ML 튜브에 모든 멤브레인 필터 조각을 배치합니다. </li></ol></li><li> 샘플 멤브레인을 포함하는 튜브에 1X TE (트리스 - EDTA) 버퍼의 900 μl를 (1.5 참조) 추가 소용돌이에 의해 철저하게 섞는다. 이 단계에서, 바이오 매스-TE 완충액으로 막으로부터 제거된다. </li><li> 10 분 80 rpm으로 65 ° C에서 인큐베이터에서 튜브를 놓습니다. 그 후 인큐베이터에서 튜브를 제거하고 15 분 동안 냉각 수 있습니다. </li><li> 2 mg / ml의 최종 농도에 도달하기 위해 새로 제조 라이소자임 (1.5 참조) 100 ㎕를 추가한다. 샘플을 37 ℃로 냉각되기 전에이 내지 수 있기 때문에, 라이소자임를 추가하지 마십시오효소 rade. </li><li> 리소자임에 대한 최적 조건은 식물 세포를 용해시키기 위하여, 60 분, 80 rpm으로 37 ℃에서 샘플을 배양한다. </li><li> 용해가 완료되면, 3 N 수산화 나트륨 (NaOH) 샘플 6 % 도데 실 황산나트륨 (SDS) 용액을 250 μL의 250 μL를 추가한다. 이 첨가에 의해, 시료 부피는 1.5 ㎖에 도달하여, 0.5 N NaOH를 최종 농도 1 % SDS의 최종 농도가있다. </li><li> 60 분 80 rpm으로 실온에서이 믹스를 품어. 베이스와 세제를 추가하면 최종 세포 용해에 도움이 될 것입니다. 식물 세포를 용균 동안 이러한 세제의 농도는, 내생 포자를 해치지하도록 최적화되어있다. </li><li> (파이렉스 유리의 경우) 70 % 에탄올로 분무하고 분젠 버너 화염을 오토 클레이브에 의해 직경 25mm 막을 보유, 또는 멸균 여과 유닛을 준비한다. 이 식히십시오. </li><li> 에탄올 화염 멸균 집게를 사용하여 여과 유닛에 0.2 μm의 NC 막 (25mm 직경)을 배치했다. &lt;/ 리&gt; <li> 멤브레인 상 단계 4.7에서 샘플을 추가하고, 진공 펌프를 사용하는 액체 필터. 액체가 통과되면, 진공 펌프의 전원을 끄십시오. 이 막 상에 유지되지 않기 때문에이 단계에서 분해 된 식물 세포의 재료가 제거된다. 만 내생 포자는 막에 남아있을 것이다. </li><li> 잔류 세제를 씻어 진공 펌프를 사용하여 액체를 필터링하는 멸균 생리 용액 2 ㎖를 추가한다. </li><li> 액체가 완전히 여과되면, 진공 펌프의 전원을 끄십시오. 여과 장치의 멤브레인을 남겨주세요. </li></ol> 5. DNase의 치료 주 : 여과막에 직접 D​​Nase의 처리를 수행한다. 이 여과 장치가 누출되지 않는 것이 중요하고, 진공 펌프는 턴 오프된다. <ol><li> 필터 막에 멸균 물 450 μL, 직접 D​​Nase의 반응 버퍼 (1X) 0.5 μL DNase의 효소의 50 μl를 추가하고 15 분 동안 서 보자. 가능하면, 약간 전쟁 방에서이 소화 할평균 RT보다 르, 효소는 위의 25 ° C에서의 온도에서 잘 작동하기 때문이다. 주 : 분젠 버너를 늘리지 따로 여과 장치는 또한 온도가 증가하고 무균 환경을 유지하는 추가적인 장점을 가지며, 따라서 샘플의 오염의 위험을 감소시켰다. </li><li> DNase의 분해가 완료되면, 샘플로부터 효소를 제거하기 위해 진공 펌프를 켜. </li><li> 추가 및 생리 액 1ml를 필터링하여 잔여 효소를 씻어 내십시오. </li><li> 액체가 완전히 통과 한 경우, 진공 펌프를 끄고 멸균 집게를 사용하여 멸균 페트리 접시에 배치 내생 포자가 들어있는 필터 멤브레인을 제거합니다. 주 : 분리 내생 포자의 샘플을 지금 다운 스트림 분석을위한 준비가되어 있습니다. 발아와 재배에 사용되는 경우 -20 ° C에서 보관은 DNA 추출을 위해 또는 다른 4 ° C에서 사용합니다. </li></ol>

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L., Law, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+purification+of+bacterial+endospores+from+soils:+UV+resistance+of+natural+Sonoran+desert+soil+populations+of+Bacillus+spp.+with+reference+to+B.+subtilis+strain+168.">Method for purification of bacterial endospores from soils: UV resistance of natural Sonoran desert soil populations of Bacillus spp. with reference to B. subtilis strain 168.</a> J Microbiol Methods. 35 (1), 13-21 (1999).</li></ol>

저자가 공개하는 게 없다.

외부 공격적인 물리 화학적 요인 (예를 들면, 온도 또는 세제)에 내생 포자의 저항은 환경 시료에서 식물 세포에서 세균 내생 포자를 분리하는 방법을 고안 하였다. 이것은 비파괴 방식으로 환경 시료로부터 내생 포자를 분리하는 제 광범위한 방법이다. , 양을 감지하거나 샘플 내생 포자를 분석하는 이전 방법 등 dipicolinic 산 또는 특정 마커 유전자와 같은 내생 포자에 대한 특정 프록시의 측정을 기반으로했다. 대조적으로, 프로토콜, 여기에 제시된 내생 포자 이외의 샘플 성분은 제거되고 있으므로 결국 내생 포자 시료의 단독 및 정제 된 잔재로 남아있다. 이러한 살균 또는 밀도 구배 원심 분리 등의 다른 방법이 내생 포자 22 풍부 제안하였으나, 우리의 실험은 밀도 구배 원심 분리는 환경 시료에 대한 일반적인 방법으로 적합하지 않은 것으로 밝혀인해 생리적 차이 내생 포자 형성 제의 여러 종의 다른 밀도로 (데이터는 미도시). 대조적으로, 우리는 프로토콜을 쉽게 환경 시료의 모든 유형에 적용되는 분자 또는 배양 방법을 포함 하류 용도에 적합 할 수있다. 프로토콜에서 두 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫 번째는 시료 매트릭스 (즉, 퇴적물 입자)에서 바이오 매스의 분리입니다. 이 다양성의 부분을 간과하지 않도록 매트릭스로부터 분리 셀의 수가 최대가되는 것이 중요하다. 침전물 시료를 들어, 여기에서 사용 된 바와 같이, 프로토콜의 주요한 제한 사항 중 하나는 일부 세포 또는 포자 퇴적물 매트릭스에서 분리되지 않은 때문에있어서의 전위 한계이다 하류 분석에 포함되지 않을 수도 있다는 사실이다 . (휴믹산이있는 경우 예를 들어) 샘플 매트릭스에 따라, 세포는 단단히 결합 및 분리하는 것이 어려울 수있다.균질 또는 믹서와 오르토 - 인산 버퍼의 사용뿐만 아니라 좋은 균질화이 단계에서 중요하다. 작성된 프로토콜로 회복을 향상하기 위해, 균질화 및 바이오 매스의 제거 절차를 두번 반복한다. 여기에 설명 된 프로토콜을 개발하고 민물 호수 퇴적물의 시료에 최적화되어 있습니다. 일부 매개 변수는 샘플 다른 유형의 최적되지 않을 수 있습니다. 잠재적 과정에서 간과 된 커뮤니티 분획을 분석하는 한 가지 방법은 DNA 추출 및 앰플 리콘 서열에 퇴적물 행렬 대상하는 것이다. 기술 가능한 변형으로서, 샘플 매트릭스에서의 바이오 매스의 분리 단계를 생략 할 수있다. 환경 시료 하류 프로토콜 (예를 들면, 물, 또는 다른 액체 정제 된 배양 물)을 방해 할 수있는 유기 재료 또는 무기 입자를 포함하지 않는 경우 특히, 종래 분리가 필요하지 않을 수도있다. 액체 샘플에 대한 프로토콜은 제 3 장에서 직접 시작할 수 있습니다(필터 막에 바이오 매스의 수집). 프로토콜의 두번째 중요한 단계는 리소자임, 열, 수산화 나트륨 및 SDS가 파괴하는 식물 세포 치료이다. 세포를 파괴하는 동안 온도, 시간뿐만 아니라 화학 물질의 농도는 모두 내생 포자를 손상하지로 최적화되었다. 그들이 이러한 파라미터는 엄격 따라서 유지되어야한다. 65 ℃에서 샘플을 가열하는 제 1 단계의 사용은 특히 일반적 아니다 방선균, 점액 세균, 시아 노 박테리아 박테리아 phyla의 사이에서 발생하는 박테리아 포자 또는 포자 등 다른 유형의 구조에 비해 내생 포자를 위해 선택하는 것이 매우 효과적이었다 내열. 표 1에서 알 수있는 바와 같이, 비 - 포자 형성 박테리아 여전히 치료 (14 %, 8.3 %) 이후에 존재한다. 이것에 대한 일부 설명은 퇴적물 샘플이 매우 복잡하고 또한 저항 비 포자 세포를 정박 할 수 있습니다. 또한, 남은 유기물을 특정 허락<html> ttached 세포 치료를 살아남을 수 있습니다. 상기 처리 된 샘플들에 비 - 포자 형성 세포의 비율을 감소시키기 위해, 상기 방법은 각각의 표본 타입에 기초하여 최적화되어야한다. 이 방법은 환경 시료의 내생 포자 형성 제의 대상으로 연구를위한 새로운 도구를 나타냅니다. 식물 세포를 파괴하는 치료는 세포의 내생 포자 순수 배양 테스트 셀의 개별 저항 맞게 적응 될 수있다. 세포의 파괴는도 2에 도시 된 처리 군의 곡선에서 알 수있다. 처리 된 배양 성장 지연으로 인해 다시 내생 포자 발아 지수 적 성장 단계로 이동해야 할 시간이 될 수있다. 이 지연에 대한 다른 가능한 설명은 또한 치료 후 내생 포자 배양 또는 낮은 세포 수의 약화 될 수있다. 분리 내생 포자는 DNA 추출을 위해 사용되지 않는 경우의 DNase 처리의 마지막 단계는 생략 될 수있다. NT는 &quot;&gt;이 기술의 미래 애플리케이션 병원성 내생 포자를 검출 할 필요가 산업 분야에서 고찰 될 수있다. 한 가지 예는 식품 산업 및 임상 연구의 어디에 검출 및 내생 포자의 (식별) 분석, 및 식물 세포로부터 분화 (예를 들면, 우유 또는 우유 기반 제품으로 식품 제품에서) 매우 중요합니다.이은 따라서 것, 많은 표준 절차 내생 포자를 용균하도록 구성되지 않은 용균 효소를 사용하여 샘​​플에서 직접 D​​NA 추출을 고려하는 것이 고려 관련 특정 수 있습니다 간과 될 수있다. 여기에 제시된 방법으로, 세포를 제거 할 수 있고, 후속하는 분석은 세포 반대로 내생 포자의 유무에 대한 해답을 제공한다. 다른 응용 예 얼음 또는 퇴적물 코어의 (상이한 환경 시료에서 내생 포자 커뮤니티의 분석을 포함 ) 환경 조건의 역사적 아카이브됩니다. 상대적으로 안정적인 environmen 많은 환경에서(예를 들어, 호수의 퇴적물 표면) 탈 조건 내생 포자 형성 후벽 균이 식물 세포의 형태로 번창 할 수 있습니다. 조건 (퇴적물 매장 또는 혐기성 조건으로 이동하는 동안 영양 결핍에 의해 예를 들어)이 저하되면 세포는 내생 포자 상태로 이동합니다. 따라서, 퇴적물 코어에서 검색 내생 포자의 지역 사회는 매장의시의 환경 조건을 반영 할 수있어 매장 이전 조건 paleoecological 지표로 사용될 수. 그러나, 우리는 여전히 정보를 수집하는 것은이 주장을 뒷받침한다.

이 연구의 목적은 환경 시료에서 식물 세균 세포에서 세균 내생 포자의 분리를위한 프로토콜을 제공하는 것이다. 박테리아 내생 포자의 형성은 문 후벽 균 1 그룹에 속하는 박테리아의 수에서 발견 생존 전략, 보통 기아에 의해 유발된다. 내생 포자 형성 세균이 잘 균주의 수는 병원균 따라서 의료의 중요성 (예를 들어, 탄저균이나 클로스 트리 디움 디피)의 주로하기 때문에, 연구한다. 내생 포자 형성 박테리아의 환경 균주는 거의 모든 환경 (토양, 물, 퇴적물, 공기, 얼음, 인간의 직감, 동물의 창자 등) 1-3에서 고립되었다. 따라서, 후벽 균 배양 컬렉션 (4)에서 두 번째로 가장 풍부한 문이다. 때문에 튼튼한 외부 피질 및 보호 핵심 단백질, 내생 포자는 FR에 이르기까지 극단적 인 환경 조건을 견딜 수높은 방사선, 극한의 온도 및 유해 화학 물질 5 옴 탈수. 이 놀라운 저항은 내생 포자 6-8에서 DNA를 추출하는 도전한다. 그들은 환경 시퀀싱 연구 9,10에서 간과 된 이유는 가능성을 설명합니다. 형광 항체 (11)에 의해 환경 시료의 내생 포자의 대상과 같은 다른 방법, 토양 12, 퇴적물 13 dipicolinic 산의 정량 (DPA)은 14 유동 세포 계측법 또는 저온 살균 이후 재배 (15, 16)는에 내생 포자를 검색하거나 정량화하는데 사용되어왔다 환경 시료. 최근, 최적화 된 DNA 추출 방법뿐만 아니라, 특정 분자 프라이머 내생 포자 특정 유전자 서열은 10,17-20 개발 된 타겟팅한다. 이 박테리아 (21)이 그룹들 사이에서 더 많은 생물 다양성을 나타 내기 위해 도움이 또한 내생 포자의 검출을위한 산업 및 의학에 응용하게되었다, 우유 분말 (19)의 예를 들어. 여기에 제시된 프로토콜은 식물 세포에 대하여 내생 포자의 세균 (예 : 열 및 세제 등) 유해한 물리 화학적 조건에 저항의 차이에 기초한다. 샘플에서 식물 세포를 파괴하기 위해, 우리는 연속적으로 열, 리소자임과 세제의 낮은 농도를 적용합니다. 포자를 파괴하지만, 모든 식물 세포를 용균하지 않도록 이러한 치료의 시간과 강도를 최적화되었다. 환경 세포 풀의 일부 셀들은 다른 것보다 더 내성이므로, 모든 식물 세포 파괴의 확률을 증가시키기 위해, 우리는 세 가지 다른 치료를 적용한다. 이 방법의 장점 및 신규성은 치료 후 내생 포자는 그대로이며, 하류의 분석에 이용 될 수 있다는 것이다. 이들은 D를 감소 따라서 DNA 추출, 정량 PCR (qPCR에) 및 앰플 리콘 또는 특히 내생 포자의 그룹을 대상으로 metagenomic 시퀀싱 (및 포함iversity) 범위 증가한다. 또한 하류 내생 포자 배양 또는 형광 현미경으로 정량에 사용될 수있는, 유동 세포 계측법, 또는 DPA의 검출. 이 방법의 중요한 특징은 처리 된 샘플과 미처리 샘플과 비교하여, 하나의 셀에 대응하는 식물 성분 외에 환경 샘플에서 내생 포자의 양과 다양성을 추론 할 수 있다는 점이다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="596">
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Whatman nitrocellulose membrane filters, 0,2 um pore size, 47 mm diameter</td>
			<td style="width:95px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td colspan="2" style="width:285px;">WHA7182004 Aldrich&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tris(hydroxymethyl)aminomethane</td>
			<td style="width:95px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>252859 Sigma-Aldrich</td>
			<td>CAS 77-86-1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9884 Sigma-Aldrich</td>
			<td>CAS&#160; 60-00-4&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Lysozyme from chicken egg white</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>62971 Fluka</td>
			<td>powder, CAS&#160; 12650-88-3&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ultra-Turrax homogenizer T18 basic</td>
			<td style="width:95px;">IKA</td>
			<td>3720000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Glass filter holders for 47 mm membranes, pyrex glass</td>
			<td style="width:95px;">EMD Millipore</td>
			<td>XX10 047 00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Chemical duty vacuum pump</td>
			<td style="width:95px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">WP6122050</td>
			<td>220 V/50 Hz</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Manifold sampling filtration for 25 mm membranes</td>
			<td style="width:95px;">Millipore</td>
			<td>1225 Sampling Manifold</td>
			<td>polypropylene</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dnase</td>
			<td style="width:95px;">New England Biolabs</td>
			<td>M0303S</td>
			<td>Rnase free</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NaOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5881 Sigma-Aldrich</td>
			<td>CAS&#160; 1310-73-2&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium dodecyl sulfphate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3771 Sigma&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Whatman nitrocellulose membrane filters, 0,2 um pore size, 25 mm diameter</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td colspan="2">WHA7182002 Aldrich</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

physical isolation of endospores from environmental samples by targeted lysis of vegetative cells

Endospore formation is a survival strategy found among some bacteria from the phylum Firmicutes. During endospore formation, these bacteria enter a morpho-physiological resting state that enhances survival under adverse environmental conditions. Even though endospore-forming Firmicutes are one of the most frequently enriched and isolated bacterial groups in culturing studies, they are often absent from diversity studies based on molecular methods. The resistance of the spore core is considered one of the factors limiting the recovery of DNA from endospores. We developed a method that takes advantage of the higher resistance of endospores to separate them from other cells in a complex microbial community using physical, enzymatic and chemical lysis methods. The endospore-only preparation thus obtained can be used for re-culturing or to perform downstream analysis such as tailored DNA extraction optimized for endospores and subsequent DNA sequencing. This method, applied to sediment samples, has allowed the enrichment of endospores and after sequencing, has revealed a large diversity of endospore-formers in freshwater lake sediments. We expect that the application of this method to other samples will yield a similar outcome.

여기에 제시된 결과는 이전 10,21 발표되었다. 데이터의 환경 적 해석과 설명은 해당 문서를 참조하십시오. 전체 절차를도 1에 요약 및 세 개의 주요 단계에 해당된다 : 첫째, 침전물 또는 다른 환경적인 행렬에서의 바이오 매스의 분리; 둘째, 식물 세포의 파괴; 그리고 세 번째, 분리 된 내생 포자의 하류 분석. 하류 분석 다양성을 결정하는 DNA 추출 및 앰플 리콘 서열, 예를 들어, 구성 될 수있다. 내생 포자의 용해를 확보 할 수 있도록 DNA 추출을 최적화 할 필요가있다. 침전물 시료에서는 강제 순차 DNA 추출 과정 (10)를 이용하여이를 달성했다. 퇴적물에있어서의 애플리케이션은 분리 후 내생 포자 형성 후벽 균의 분획의 상당한 증가를 보여준다. 16S rRNA의의 앰플 리콘 시퀀싱에서유전자 치료 샘플 후벽 균 (전체 커뮤니티) 만에 8.0 시퀀스의 19.0 % (표 1) 맞습니다. 대조적으로, 처리 후는 90.6 % 후벽 균과 내생 포자 - 농후 시료 83.9 %을 나타낸다. 내생 포자 형성 후벽 균, Bacilliales 및 Clostridiales의 두 가지 주요 순서는, 비 내생 포자 형성 후벽 균 것을 Lactobacilliales 같은 주문의 부재와 대조, 방법 풍부했다. 해당 방법 내생 포자의 농축에 특히 적합하다는 것을 증명하기 위하여, 포어 형 구조를 생성 할 수있는 다른 그룹도 분석 하였다. 따라서, 방선균, 시아 노 박테리아와 Myxococcales의 주파수 용균하는 처리 후 감소 하였다. 치료의 효율성은 순수 문화를 사용하여 증명되었다. 내생 포자 제제 파 에니 alvei의 (&gt; 95 % 내생 포자), 바실러스 서브 틸리 스 (Bacillus subtilis), 바실러스 메가 테 리움 </식물 세포의 용해를위한 프로토콜에 기재된 바와 같이 EM&gt;뿐만 아니라 대장균의 식물 세포 배양은 처리 하였다. 모든 배양 한 후 37 ° C에서 영양 액체 배지에서 배양하고 성장은 파장 600nm에서 광학 밀도를 측정 하였다. 더 성장 치료 E. 관찰되지하면서 성장 내생 포자 배양 관찰되었다 그 식물 세포를 증명하는 대장균 문화는 비가 역적 (그림 2) 손상됩니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53411/53411fig1.jpg" /> 실험 절차의 그림 1. 개요. 절차는 환경 시료에서 내생 포자 형성 균을 풍부하게하는 데 사용됩니다. 환경 매트릭스에서 세포와 내생 포자를 분리하는 단계는 표본의 유형 (즉, 물 샘플)에 따라 생략 될 수있다. 그림에서 하류 방법은 포자 풍부한 분수 corre에 적용DNA 추출 및 높은 처리량 시퀀싱 않고 단지. 이 단계 배양에 의해 대체 될 수있다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53411/53411fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/53411/53411fig2.jpg" /> 순수 배양에 치료도 2 검증. 바실러스 서브 틸리 스 (Bacillus subtilis), 바실러스 메가 테 리움, 및 파 에니 alvei 및 용해 방법으로 처리 된 대장균의 세포 배양의 내생 포자의 현탁액으로부터 내생 포자 - 형성 박테리아의 성장을 확인 성장 곡선 세포의. = ○ 치료. 처리되지 않은 = ●. 3 개의 독립적 인 문화에서 오차 막대. 제어 문화 및 치료 문화의 재성장의 성장은 600 nm 파장에서 광학 밀도를 측정 하였다. 이 수치는 f를 다시 인쇄 된ROM Wunderlin 등. 2014 권한이. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53411/53411fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:129px;"></td><td style="width:80px;"> 침전물 1 </td><td style="width:80px;"></td><td style="width:80px;"> 침전물 2 </td><td style="width:80px;"></td></tr><tr height="38"><td height="38" style="height:39px;"></td><td style="width:80px;"> 전체 커뮤니티 </td><td style="width:80px;"> 내생 포자 강화 </td><td style="width:80px;"> 전체 커뮤니티 </td><td style="width:80px;"> 내생 포자 강화 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> 후벽 균 </td><td> 8.0 </td><td> 90.6 </td><td> 19.0 </td><td>83.9 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> 간균 </td><td> 0.5 </td><td> 10.0 </td><td> 5.7 </td><td> 15.1 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> 클로스 트리 디아 </td><td> 7.4 </td><td> 76.9 </td><td> 12.5 </td><td> 63.2 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> 방선균 </td><td> 2.4 </td><td> 1.0 </td><td> 4.4 </td><td> 2.1 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> 시아 노 박테리아 </td><td> 1.1 </td><td> 0.1 </td><td> 0.7 </td><td> 0.1 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> Myxococcales </td><td> 0.7 </td><td> 0.0 </td><td> 0.2 </td><td> 0.0 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> 다른 박테리아 </td><td> 87.8 </td><td> 8.3 </td><td> 75.7 </td><td> 13.9 </td></tr></tbody></table> &lt;P 클래스 = &quot;jove_content&quot;&gt; 표 내생 포자 및 기타 포자 형성 세균 그룹의 1 풍부. 후벽 균 (내생 포자 형성 자) 및 기타 세균 그룹 전체에 대응하는 2 개의 침전물 샘플에서 포자와 같은 구조를 생산하는 상대 주파수 (치료) 및 (처리) 지역 사회를 내생 포자 강화.

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Physical Isolation of Endospores from Environmental Samples by Targeted Lysis of Vegetative Cells

A method to single out bacterial endospores from complex microbial communities was developed to perform tailored culture or molecular studies of this group of bacteria.

식물 세포의 표적으로 용해하여 환경 시료에서 내생 포자의 물리적 분리

Endospore formation is a survival strategy found among some bacteria from the phylum Firmicutes. During endospore formation, these bacteria enter a ...

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Nanyang Technological University

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Environment

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EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. I. Collection of Virus Samples

EPA Method 1615 was developed with a goal of providing a standard method for measuring enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. The standardized sampling component of the method concentrates viruses that may be present in water by passage of a minimum specified volume of water through an electropositive cartridge filter. The minimum specified volumes for surface and finished/ground water are 300 L and 1,500 L, respectively. A major method limitation is the tendency for the filters to clog before meeting the sample volume requirement. Studies using two different, but equivalent, cartridge filter options showed that filter clogging was a problem with 10% of the samples with one of the filter types compared to 6% with the other filter type. Clogging tends to increase with turbidity, but cannot be predicted based on turbidity measurements only. From a cost standpoint one of the filter options is preferable over the other, but the water quality and experience with the water system to be sampled should be taken into consideration in making filter selections.

EPA Method 1615 uses an electropositive filter to concentrate enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. This manuscript describes the procedure for collecting samples for Method 1615 analyses.

엔테로 바이러스 및 문화 RT-qPCR에 의해 물에서 노로 바이러스의 발생의 EPA 방법 1615 측정. 바이러스 샘플의 I. 컬렉션

EPA Method 1615 was developed with a goal of providing a standard method for measuring enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. ...

연구

환경과학

Physical, Chemical and Biological Characterization of Six Biochars Produced for the Remediation of Contaminated Sites

The physical and chemical properties of biochar vary based on feedstock sources and production conditions, making it possible to engineer biochars with specific functions (e.g. carbon sequestration, soil quality improvements, or contaminant sorption). In 2013, the International Biochar Initiative (IBI) made publically available their Standardized Product Definition and Product Testing Guidelines (Version 1.1) which set standards for physical and chemical characteristics for biochar. Six biochars made from three different feedstocks and at two temperatures were analyzed for characteristics related to their use as a soil amendment. The protocol describes analyses of the feedstocks and biochars and includes: cation exchange capacity (CEC), specific surface area (SSA), organic carbon (OC) and moisture percentage, pH, particle size distribution, and proximate and ultimate analysis. Also described in the protocol are the analyses of the feedstocks and biochars for contaminants including polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs), polychlorinated biphenyls (PCBs), metals and mercury as well as nutrients (phosphorous, nitrite and nitrate and ammonium as nitrogen). The protocol also includes the biological testing procedures, earthworm avoidance and germination assays. Based on the quality assurance / quality control (QA/QC) results of blanks, duplicates, standards and reference materials, all methods were determined adequate for use with biochar and feedstock materials. All biochars and feedstocks were well within the criterion set by the IBI and there were little differences among biochars, except in the case of the biochar produced from construction waste materials. This biochar (referred to as Old biochar) was determined to have elevated levels of arsenic, chromium, copper, and lead, and failed the earthworm avoidance and germination assays. Based on these results, Old biochar would not be appropriate for use as a soil amendment for carbon sequestration, substrate quality improvements or remediation.

Biochar is a carbon-rich material used as a soil amendment with the ability to sustainably sequester carbon, improve substrate quality and sorb contaminants. This protocol describes the 17 analytical methods used for the characterization of biochar, which is required prior to large scale implementation of these amendments in the environment.

물리, 화학에 대한 생산 식스 Biochars의 생물학적 특성 오염 된 사이트의 재조정

The physical and chemical properties of biochar vary based on feedstock sources and production conditions, making it possible to engineer biochars with ...

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. Part III. Virus Detection by RT-qPCR

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a standardized method for use in multiple analytical laboratories during monitoring period 3 of the Unregulated Contaminant Monitoring Rule. Herein we present the protocol for extraction of viral ribonucleic acid (RNA) from water sample concentrates and for quantitatively measuring enterovirus and norovirus concentrations using reverse transcription-quantitative PCR (RT-qPCR). Virus concentrations for the molecular assay are calculated in terms of genomic copies of viral RNA per liter based upon a standard curve. The method uses a number of quality controls to increase data quality and to reduce interlaboratory and intralaboratory variation. The method has been evaluated by examining virus recovery from ground and reagent grade waters seeded with poliovirus type 3 and murine norovirus as a surrogate for human noroviruses. Mean poliovirus recoveries were 20% in groundwaters and 44% in reagent grade water. Mean murine norovirus recoveries with the RT-qPCR assay were 30% in groundwaters and 4% in reagent grade water.

Here we present a procedure to quantify enterovirus and norovirus in environmental and drinking waters using reverse transcription-quantitative PCR. Mean virus recovery from groundwater with this standardized procedure from EPA Method 1615 was 20% for poliovirus and 30% for murine norovirus.

엔테로 바이러스 및 문화와 RT-qPCR에 의해 물에서 노로 바이러스의 발생의 EPA 방법 1615 측정. 파트 III. RT-qPCR에 의한 바이러스 검출

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a ...

Automated Gel Size Selection to Improve the Quality of Next-generation Sequencing Libraries Prepared from Environmental Water Samples

Next-generation sequencing of environmental samples can be challenging because of the variable DNA quantity and quality in these samples. High quality DNA libraries are needed for optimal results from next-generation sequencing. Environmental samples such as water may have low quality and quantities of DNA as well as contaminants that co-precipitate with DNA. The mechanical and enzymatic processes involved in extraction and library preparation may further damage the DNA. Gel size selection enables purification and recovery of DNA fragments of a defined size for sequencing applications. Nevertheless, this task is one of the most time-consuming steps in the DNA library preparation workflow. The protocol described here enables complete automation of agarose gel loading, electrophoretic analysis, and recovery of targeted DNA fragments. 
In this study, we describe a high-throughput approach to prepare high quality DNA libraries from freshwater samples that can be applied also to other environmental samples. We used an indirect approach to concentrate bacterial cells from environmental freshwater samples; DNA was extracted using a commercially available DNA extraction kit, and DNA libraries were prepared using a commercial transposon-based protocol. DNA fragments of 500 to 800 bp were gel size selected using Ranger Technology, an automated electrophoresis workstation. Sequencing of the size-selected DNA libraries demonstrated significant improvements to read length and quality of the sequencing reads.

This manuscript describes an automated gel size selection approach for purifying DNA fragments for next-generation sequencing. The Ranger Technology provides complete automation of the entire process of agarose gel loading, electrophoretic analysis, and recovery of targeted DNA fragments allowing for high-throughput and high quality next-generation sequencing libraries.

자동 젤 사이즈 선택은 환경 물 샘플에서 준비 차세대 시퀀싱 라이브러리의 질을 향상시키기 위해

Next-generation sequencing of environmental samples can be challenging because of the variable DNA quantity and quality in these samples. High quality DNA ...

Removal of Trace Elements by Cupric Oxide Nanoparticles from Uranium In Situ Recovery Bleed Water and Its Effect on Cell Viability

In situ recovery (ISR) is the predominant method of uranium extraction in the United States. During ISR, uranium is leached from an ore body and extracted through ion exchange. The resultant production bleed water (PBW) contains contaminants such as arsenic and other heavy metals. Samples of PBW from an active ISR uranium facility were treated with cupric oxide nanoparticles (CuO-NPs). CuO-NP treatment of PBW reduced priority contaminants, including arsenic, selenium, uranium, and vanadium. Untreated and CuO-NP treated PBW was used as the liquid component of the cell growth media and changes in viability were determined by the MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) assay in human embryonic kidney (HEK 293) and human hepatocellular carcinoma (Hep G2) cells. CuO-NP treatment was associated with improved HEK and HEP cell viability. Limitations of this method include dilution of the PBW by growth media components and during osmolality adjustment as well as necessary pH adjustment. This method is limited in its wider context due to dilution effects and changes in the pH of the PBW which is traditionally slightly acidic&#160;however; this method could have a broader use assessing CuO-NP treatment in more neutral waters.

Removal of Trace Elements by Cupric Oxide Nanoparticles from Uranium In Situ Recovery Bleed Water and Its Effect on Cell Viability

Production bleed water (PBW) was treated with cupric oxide nanoparticles (CuO-NPs) and cellular toxicity was assessed in cultured human cells. The goal of this protocol was to integrate the native environmental sample into a cell culture format assessing the changes in toxicity due to CuO-NP treatment.

우라늄에서 구리 산화물 나노 입자에 의한 미량 원소의 제거<em&gt; 현장에서</em&gt; 복구 블리드 물과 세포 생존에 미치는 영향

In situ recovery (ISR) is the predominant method of uranium extraction in the United States. During ISR, uranium is leached from an ore body and extracted ...

Preparation and Testing of Impedance-based Fluidic Biochips with RTgill-W1 Cells for Rapid Evaluation of Drinking Water Samples for Toxicity

This manuscript describes how to prepare fluidic biochips with Rainbow trout gill epithelial (RTgill-W1) cells for use in a field portable water toxicity sensor. A monolayer of RTgill-W1 cells forms on the sensing electrodes enclosed within the biochips. The biochips are then used for testing in a field portable electric cell-substrate impedance sensing (ECIS) device designed for rapid toxicity testing of drinking water. The manuscript further describes how to run a toxicity test using the prepared biochips. A control water sample and the test water sample are mixed with pre-measured powdered media and injected into separate channels of the biochip. Impedance readings from the sensing electrodes in each of the biochip channels are measured and compared by an automated statistical software program. The screen on the ECIS instrument will indicate either "Contamination Detected" or "No Contamination Detected" within an hour of sample injection. Advantages are ease of use and rapid response to a broad spectrum of inorganic and organic chemicals at concentrations that are relevant to human health concerns, as well as the long-term stability of stored biochips in a ready state for testing. Limitations are the requirement for cold storage of the biochips and limited sensitivity to cholinesterase-inhibiting pesticides. Applications for this toxicity detector are for rapid field-portable testing of drinking water supplies by Army Preventative Medicine personnel or for use at municipal water treatment facilities.

This manuscript describes how to prepare fluidic biochips with Rainbow trout gill epithelial cells for use in a field portable electric cell-substrate impedance sensor. The protocol for running a rapid drinking water toxicity test with the sensor is also described.

준비 및 시험 독성에 대한 신속한 평가 음주의 물 샘플에 대한 RTgill-W1 세포와 유체 바이오칩을 임피던스 기반

This manuscript describes how to prepare fluidic biochips with Rainbow trout gill epithelial (RTgill-W1) cells for use in a field portable water toxicity ...

A Bending Test for Determining the Atterberg Plastic Limit in Soils

The thread rolling test is the most commonly used method to determine the plastic limit (PL) in soils. It has been widely criticized, because a considerable subjective judgment from the operator that carries out the test is involved during its performance, which may affect the final result significantly. Different alternative methods have been put forward, but they cannot compete with the standard rolling test in speed, simplicity and cost.
In an earlier study by the authors, a simple method with a simple device to determine the PL was presented (the &#34;thread bending test&#34; or simply &#34;bending test&#34;); this method allowed the PL to be obtained with minimal operator interference. In the present paper a version of the original bending test is shown. The experimental basis is the same as the original bending test: soil threads which are 3 mm in diameter and 52 mm long are bent until they start to crack, so that both the bending produced and its related moisture content are determined. However, this new version enables the calculation of PL from an equation, so it is not necessary to plot any curve or straight line to obtain this parameter and, in fact, the PL can be achieved with only one experimental point (but two experimental points are recommended).
The PL results obtained with this new version are very similar to those obtained through the original bending test and the standard rolling test by a highly experienced operator. Only in particular cases of high plasticity cohesive soils, there is a greater difference in the result. Despite this, the bending test works very well for all types of soil, both cohesive and very low plasticity soils, where the latter are the most difficult to test via the standard thread rolling method.

The traditional standardized test for determining the plastic limit in soils is performed by hand, and the result varies depending on the operator. An alternative method based on bending measurements is presented in this study. This allows the plastic limit to be obtained with a clear and objective criterion.

The thread rolling test is the most commonly used method to determine the plastic limit (PL) in soils. It has been widely criticized, because a ...

Use of a Filter Cartridge for Filtration of Water Samples and Extraction of Environmental DNA

Recent studies demonstrated the use of environmental DNA (eDNA) from fishes to be appropriate as a non-invasive monitoring tool. Most of these studies employed disk fiber filters to collect eDNA from water samples, although a number of microbial studies in aquatic environments have employed filter cartridges, because the cartridge has the advantage of accommodating large water volumes and of overall ease of use. Here we provide a protocol for filtration of water samples using the filter cartridge and extraction of eDNA from the filter without having to cut open the housing. The main portions of this protocol consists of 1) filtration of water samples (water volumes &#8804;4 L or &gt;4 L); (2) extraction of DNA on the filter using a roller shaker placed in a preheated incubator; and (3) purification of DNA using a commercial kit. With the use of this and previously-used protocols, we perform metabarcoding analysis of eDNA taken from a huge aquarium tank (7,500 m3) with known species composition, and show the number of detected species per library from the two protocols as the representative results. This protocol has been developed for metabarcoding eDNA from fishes, but is also applicable to eDNA from other organisms.

We describe a protocol for filtration of water samples with a filter cartridge and extraction of environmental DNA (eDNA) without having to cut open the housing to remove the filter. This protocol is developed for metabarcoding eDNA from fishes, but is also applicable to eDNA from other organisms.

여과 물 샘플 및 환경 DNA의 추출을위한 필터 카트리지의 사용

Recent studies demonstrated the use of environmental DNA (eDNA) from fishes to be appropriate as a non-invasive monitoring tool. Most of these studies ...

Dispersion of Nanomaterials in Aqueous Media: Towards Protocol Optimization

The sonication process is commonly used for de-agglomerating and dispersing nanomaterials in aqueous based media, necessary to improve homogeneity and stability of the suspension. In this study, a systematic step-wise approach is carried out to identify optimal sonication conditions in order to achieve a stable dispersion. This approach has been adopted and shown to be suitable for several nanomaterials (cerium oxide, zinc oxide, and carbon nanotubes) dispersed in deionized (DI) water. However, with any change in either the nanomaterial type or dispersing medium, there needs to be optimization of the basic protocol by adjusting various factors such as sonication time, power, and sonicator type as well as temperature rise during the process. The approach records the dispersion process in detail. This is necessary to identify the time points as well as other above-mentioned conditions during the sonication process in which there may be undesirable changes, such as damage to the particle surface thus affecting surface properties. Our goal is to offer a harmonized approach that can control the quality of the final, produced dispersion. Such a guideline is instrumental in ensuring dispersion quality repeatability in the nanoscience community, particularly in the field of nanotoxicology.

Here, we present a step-wise protocol for the dispersion of nanomaterials in aqueous media with real-time characterization to identify the optimal sonication conditions, intensity, and duration for improved stability and uniformity of nanoparticle dispersions without impacting the sample integrity.

수성 미디어에 나노 재료의 분산: 프로토콜 최적화 쪽으로

The sonication process is commonly used for de-agglomerating and dispersing nanomaterials in aqueous based media, necessary to improve homogeneity and ...

Isolation of Mandibular Gland Reservoir Contents from Bornean 'Exploding Ants' (Formicidae) for Volatilome Analysis by GC-MS and MetaboliteDetector

The aim of this manuscript is to present a protocol describing the metabolomic analysis of Bornean &#39;exploding ants&#39; belonging to the Colobopsis cylindrica (COCY) group. For this purpose, the model species C. explodens is used. Ants belonging to the minor worker caste possess distinctive hypertrophied mandibular glands (MGs). In territorial combat, they use the viscous contents of their enlarged mandibular gland reservoirs (MGRs) to kill rival arthropods in characteristic suicidal &#39;explosions&#39; by voluntary rupture of the gastral integument (autothysis). We show the dissection of worker ants of this species for the isolation of the gastral portion of the wax-like MGR contents as well as listing the necessary steps required for solvent-extraction of the therein contained volatile compounds with subsequent gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) analysis and putative identification of metabolites contained in the extract. The dissection procedure is performed under cooled conditions and without the use of any dissection buffer solution to minimize the changes in the chemical composition of the MGR contents. After solvent-based extraction of volatile metabolites contained therein, the necessary steps for analyzing the samples via liquid-injection-GC-MS are presented. Lastly, data processing and putative metabolite identification with the use of the open-source software MetaboliteDetector is shown. With this approach, the profiling and identification of volatile metabolites in MGRs of ants belonging to the COCY group via GC-MS and the MetaboliteDetector software become possible.

Isolation of Mandibular Gland Reservoir Contents from Bornean 'Exploding Ants' Formicidae for Volatilome Analysis by GC-MS and MetaboliteDetector

Minor workers of the ant species Colobopsis explodens are dissected to isolate the wax-like content stored in their hypertrophied mandibular gland reservoirs for subsequent solvent-extraction and analysis by gas chromatography-mass spectrometry. The&#160;annotation and identification of volatile constituents using the open-source software MetaboliteDetector is also described.

악의 선 저수지 내용 보에서의 절연 ' 개미 (Formicidae) GC-MS와 MetaboliteDetector Volatilome 분석에 대 한 폭발

The aim of this manuscript is to present a protocol describing the metabolomic analysis of Bornean &#39;exploding ants&#39; belonging to the Colobopsis ...