המחברים מודים שוויצרי הקרן הלאומית למדע למענק מס &#39;31003A-132358/1, 31003A_152972 ומס&#39; 151,948, ומרכז המחקר הספרדי פייר מרסייה pour la מדע.

1. הכנת כימיקלים וציוד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך 500 מיליליטר של 1% hexametaphosphate נתרן (SHMP) (Napo 3) n פתרון ולעקר ידי מעוקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסננים לעקר nitrocellulose (NC) (גודל נקבובית 0.22 מיקרומטר, בקוטר 47 מ&quot;מ) על ידי מעוקר בצלחות פטרי זכוכית סגורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר מסנני NC (גודל נקבובית 0.22 מיקרומטר, בקוטר 25 מ&quot;מ) על ידי מעוקר בצלחות פטרי זכוכית סגורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול ולב המשקל הריק של 50 מיליליטר צינורות סטרילי (עם כובע על) (צינור אחד לדגימה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן טריס-EDTA-חיץ 1x (TE-חיץ): להפוך את הפתרון של 10 מ&quot;מ טריס (טריס aminomethane (hydroxymethyl)) וחיץ 1 mM EDTA. התאם ל- pH 8 ולעקר ידי מעוקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון יזוזים (20 מ&quot;ג / מיליליטר) על ידי המסת 0.02 גרם של יזוזים ב 1 מיליליטר TE-חיץ. באופן אידיאלי, לעשות טרי בכל פעם. חנות ב 4 מעלות צלזיוס במשך לא יותר מ 1 בשבוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון פיסיולוגי על ידי המסת 8 גרם נתרן כלורי / L(NaCl) במים מזוקקים. לעקר ידי מעוקר. </li></ol> 2. הפרדה של ביומסה ממשקעים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 3 גרם של מדגם משקעים מראש שקל סטרילי 50 מיליליטר צינורות באמצעות סקופים מתכת-בער אתנול. לבצע את זה ב, ארון בטיחות ביולוגית UV מעוקר נקי, כדי למנוע זיהום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 15 מיליליטר של פתרון 1% סטרילי (autoclaved) SHMP למדגם באמצעות סטרילי סיים ביורטה. פתרון SHMP גם יכול להיות מסונן כדי למנוע זיהום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Homogenize המשקעים ופתרון SHMP עם disperser הנוזלית / homogenizer (למשל, homogenizer-Turrax Ultra). 70% אתנול לעקר או החיטוי הרוטור הפיזור לפני השימוש. הפעל את המגון 1 דקות ב17,500 סל&quot;ד. תן את שאר המדגם למשך 2 דקות ולחזור על הומוגניות דקות 1 באותה מהירות הרוטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו המדגם לעמוד במשך 10 דקות. בשלב זה, החלקיקים הכבדים ביותר (מינרלים) יישבו. התאים וכל רכיבים אורגניים של המדגם עם זאת wחולה יישאר בפתרון. לאחר מכן, להעביר את פתרון supernatant (ביומסה תא המכיל) לתוך צינור 50 מיליליטר נקי, תוך הקפדה שלא להפריע גלולה המשקעים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגלולת המשקעים להוסיף שוב 15 מיליליטר של פתרון 1% סטרילי (autoclaved) SHMP באמצעות סטרילי סיים ביורטה. אז חזור על שלבים 2.3 ו -2.4. חזרה זו מבטיחה את ההפרדה מהסכום המרבי של תאים וחלקיקים אורגניים ממרכיב המינרלים של המשקעים. Supernatant של הפרדה שנייה זה יכול להיות התמזג עם supernatant מההפרדה הראשונה. הערה: כל השלבים הבאים נעשים על supernatant (המכילים ביומסה תא). רכיב המינרלים (גלולה משקעים) יכול להיות מושלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה המדגם ב 20 XG דקות 1. צעד זה מגדיל את G-Force מספיק כדי ליישב חלקיקים מינרליים קטנים בעוד שחומר התא הביולוגי עדיין בפתרון. לאחר צנטריפוגה, להעביר את פתרון supernatant (ביומסה תא המכיל) לשפופרת 50 מיליליטר נקי. זורק את כדור המינרלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את הנפח הסופי של התמיסה המכילה ביומסה על ידי שקילת המדגם. קביעת המשקל נמנעה צורך להעביר את הדגימה לגליל סיים ומפחיתה את הסיכון לזיהום. </li></ol> 3. אוסף של ביומסה בממברנה הסינון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן יחידת סינון (47 מ&quot;מ קרומי קוטר) ומשאבת ואקום. לעקר את יחידת הסינון או על ידי מעוקר או (אם פיירקס זכוכית) על ידי ריסוס אותו עם 70% אתנול ובוער זה עם מבער בונזן. תן לזה להתקרר לפני שימשיך בפרוטוקול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף קרום NC סטרילי ליחידת הסינון באמצעות מלקחיים מעוקרים-בער אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף מחצית ממדגם supernatant (משלב 2.6) על גבי יחידת סינון קרום ולאסוף תאים בקרום באמצעות משאבת הוואקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר הנוזל עבר באופן מלא דרך המסנן, לעצור את משאבת הוואקום ולהסיר בזהירות את הקרום באמצעות איתןol-להבה מעוקרת מלקחיים. מניחים את הקרום לצלחת פטרי סטרילית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את הקרום במחצית באמצעות מספריים מעוקרים-בער אתנול. להוסיף כל מחצית של הקרום לצינור נפרד 2 מיליליטר. מחצית מהקרום תשמש להפקת DNA וניתוח של קהילת החיידקים כולה. החצי השני של מסנן יאוחסן ב -80 ° C ומשמש כגיבוי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום קרום NC החדש על יחידת הסינון ולאסוף ביומסה מהמחצית השנייה של נפח דגימה (משלב 2.6) תוך שימוש במשאבת הוואקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר הנוזל עבר באופן מלא דרך המסנן, לעצור את משאבת הוואקום ולהסיר בזהירות את הקרום באמצעות מלקחיים מעוקרים-בער אתנול. מניחים את כל הקרום לתוך צינור נפרד 2 מיליליטר. מדגם זה ישמש לטיפול להפריד endospores מתאי צמח. המדגם ניתן לאחסן ב -20 ° C עד לשימוש. </li></ol> 4. תמוגה של תאים גטטיבי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצעטיפול להפריד endospores מהתאים של צמח ביומסה שנאספו בעבר על קרום NC (שלב 3.6). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם הקרום הוקפא, להשאיר אותו על RT במשך 10 דקות כדי להפשיר. לאחר מכן למקם את הקרום בצלחת פטרי סטרילי ולחתוך אותו (כ 4 פעמים) לחתיכות קטנות יותר באמצעות מספריים מעוקרים-בער אתנול. אז למקם את כל חלקי מסנן הקרום לתוך צינור 2 מיליליטר סטרילי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 900 ​​μl של חיץ 1x TE (טריס-EDTA) (ראה 1.5) לצינור המכיל קרום המדגם ומערבבים היטב על ידי מערבולת. בשלב זה, ביומסה היא להסיר את הקרום לפתרון TE-החיץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצינור בחממה על 65 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ו -80 סל&quot;ד. לאחר מכן להסיר את הצינור מהחממה ולתת לו להתקרר במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף של ליזוזים מוכן טרי (ראה 1.5) 100 μl להגיע לריכוז סופי של 2 מ&quot;ג / מיליליטר. אל תוסיף יזוזים לפני המדגם התקרר עד 37 ° C, כמו זה יכול מעלותRade האנזים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה המדגם ב 37 מעלות צלזיוס במשך 60 דקות ו -80 סל&quot;ד, התנאים אופטימליים ליזוזים לlyse תאי צמח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר תמוגה הושלמה, להוסיף 250 μl של 3 הידרוקסיד N נתרן (NaOH) ו -250 μl של 6% פתרון סולפט dodecyl נתרן (SDS) לדוגמא. על ידי הוספה זו, נפח הדגימה מגיע 1.5 מיליליטר ויש ריכוז סופי של 0.5 N NaOH וריכוז סופי של 1% SDS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה זו תערובת על RT במשך 60 דקות ו -80 סל&quot;ד. הוספת הבסיס וחומרי הניקוי תעזור בתמוגה תא סופית. הריכוז של חומרי ניקוי אלה כבר מותאם כדי לא לפגוע בendospores, בעוד lysing תאי צמח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן יחידת סינון סטרילי שמחזיקה קרומי קוטר 25 מ&quot;מ על ידי מעוקר, או (אם פיירקס זכוכית) ריסוס זה עם 70% אתנול ובוער זה עם מבער בונזן. תן לזה להתקרר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח קרום 0.2 מיקרומטר NC (25 מ&quot;מ קוטר) על יחידת הסינון באמצעות מלקחיים אתנול-להבה מעוקרת. &lt;/ Li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף את המדגם מהצעד 4.7 על הממברנה ולסנן את הנוזל באמצעות משאבת הוואקום. כאשר הנוזל עבר דרך, לכבות את משאבת ואקום. בשלב זה, את חומר התא וגטטיבי lysed מוסר, כפי שהוא לא שמר על הממברנה. רק endospores יישאר על הממברנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מיליליטר של תמיסה פיזיולוגית סטרילי כדי לשטוף את חומרי ניקוי שיורית ולסנן את הנוזל באמצעות משאבת הוואקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר נוזל מסונן באופן מלא, לכבות את משאבת הוואקום. השאר את הקרום ביחידת הסינון. </li></ol> 5. DNase טיפול הערה: בצע את טיפול DNase ישירות על קרום המסנן. חשובה שיחידת הסינון לא תדלוף ומשאבת הוואקום כבויה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 450 μl של מים סטריליים, 50 μl של חיץ תגובת DNase (1x) ו -0.5 אנזים DNase μl ישירות על גבי קרום המסנן ולתת לו לעמוד במשך 15 דקות. במידת האפשר, לעשות עיכול זה בחדר שהוא מעט מלחמהmer מ RT הממוצע, מאז האנזים עובד טוב יותר בטמפרטורות של 25 מעלות צלזיוס ומעלה. הערה: שמירה על המבער בונזן צד יחידת הסינון גם מעלה את הטמפרטורה ויש יתרון הנוסף של שמירה על הסביבה סטרילית, ולכן הפחית את הסיכון לזיהום של הדגימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר עיכול DNase הוא סיים, להפעיל משאבת ואקום כדי להסיר את האנזים מהמדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את האנזים שיורית על ידי הוספה וסינון 1 מיליליטר של תמיסה פיזיולוגית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם הנוזל עבר באופן מלא, לכבות את משאבת ואקום ולהסיר את הקרום המכיל מסנן endospores באמצעות מלקחיים סטרילי ולמקם אותו לתוך צלחת פטרי סטרילי. הערה: המדגם של endospores המופרד מוכן כעת לניתוח במורד הזרם. חנות ב -20 ° C אם משתמשת בו להפקת DNA או לחלופין על 4 מעלות צלזיוס אם משתמש בו לנביטה וטיפוח. </li></ol>

<ol>
	<li>Nicholson, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+Bacillus+endospores+in+the+environment.">Roles of Bacillus endospores in the environment.</a> Cell Mol Life Sci. 59 (3), 410-416 (2002).</li><li>Lester, E. D., Satomi, M., Ponce, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microflora+of+extreme+arid+Atacama+Desert+soils.">Microflora of extreme arid Atacama Desert soils.</a> Soil Biol Biochem. 39 (2), 704-708 (2007).</li><li>Wilson, M. S., Siering, P. L., White, C. L., Hauser, M. E., Bartles, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+archaea+and+bacteria+dominate+stable+microbial+communities+in+North+America's+Largest+Hot+Spring.">Novel archaea and bacteria dominate stable microbial communities in North America's Largest Hot Spring.</a> Microb Ecol. 56 (2), 292-305 (2008).</li><li>Hugenholtz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+prokaryotic+diversity+in+the+genomic+era.">Exploring prokaryotic diversity in the genomic era.</a> Genome Biol. 3 (2), (2002).</li><li>Onyenwoke, R. U., Brill, J. A., Farahi, K., Wiegel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sporulation+genes+in+members+of+the+low+G+C+Gram-type-positive+phylogenetic+branch+(Firmicutes).">Sporulation genes in members of the low G+C Gram-type-positive phylogenetic branch (Firmicutes).</a> Arch Microbiol. 182 (2-3), 182-192 (2004).</li><li>Delmont, T. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accessing+the+soil+metagenome+for+studies+of+microbial+diversity.">Accessing the soil metagenome for studies of microbial diversity.</a> Appl Environ Microbiol. 77 (4), 1315-1324 (2011).</li><li>Ricca, E., Henriques, A. O., Cutting, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bacterial spore formers: probiotics and emerging applications. , (2004).</li><li>Kuske, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-Scale+DNA+Sample+Preparation+Method+for+Field+PCR+Detection+of+Microbial+Cells+and+Spores+in+Soil.">Small-Scale DNA Sample Preparation Method for Field PCR Detection of Microbial Cells and Spores in Soil.</a> Appl Environ Microbiol. 64 (7), 2463-2472 (1998).</li><li>von Mering, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+phylogenetic+assessment+of+microbial+communities+in+diverse+environments.">Quantitative phylogenetic assessment of microbial communities in diverse environments.</a> Science. 315 (8515), 1126-1130 (2007).</li><li>Wunderlin, T., Junier, T., Roussel-Delif, L., Jeanneret, N., Junier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stage+0+sporulation+gene+A+as+a+molecular+marker+to+study+diversity+of+endospore-forming+Firmicutes.">Stage 0 sporulation gene A as a molecular marker to study diversity of endospore-forming Firmicutes.</a> Environ Microbiol Rep. 5 (6), 911-924 (2013).</li><li>Siala, A., Hill, I. R., Gray, T. R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Populations+of+spore-forming+bacteria+in+an+acid+forest+soil,+with+special+reference+to+Bacillus+subtilis.">Populations of spore-forming bacteria in an acid forest soil, with special reference to Bacillus subtilis.</a> J General Microbiol. 81 (1), 183-190 (1974).</li><li>Brandes Ammann, A., Kolle, L., Brandl, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+bacterial+endospores+in+soil+by+terbium+fluorescence.">Detection of bacterial endospores in soil by terbium fluorescence.</a> Int J Microbiol. , 435281 (2011).</li><li>Fichtel, J., Koster, J., Rullkotter, J., Saas, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+variations+in+endospore+numbers+within+tidal+flat+sediments+revealed+by+quantification+of+dipicolinic+acid.">High variations in endospore numbers within tidal flat sediments revealed by quantification of dipicolinic acid.</a> Geomicrobiol J. 25 (7-8), (2008).</li><li>Cronin, U. P., Wilkinson, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+of+flow+cytometry+in+the+study+of+Bacillus+cereus.">The potential of flow cytometry in the study of Bacillus cereus.</a> J Appl Microbiol. 108 (1), 1-16 (2010).</li><li>de Rezende, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dispersal+of+thermophilic+Desulfotomaculum+endospores+into+Baltic+Sea+sediments+over+thousands+of+years.">Dispersal of thermophilic Desulfotomaculum endospores into Baltic Sea sediments over thousands of years.</a> ISME J. 7 (1), 72-84 (2013).</li><li>Hubert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermophilic+anaerobes+in+Arctic+marine+sediments+induced+to+mineralize+complex+organic+matter+at+high+temperature.">Thermophilic anaerobes in Arctic marine sediments induced to mineralize complex organic matter at high temperature.</a> Environ Microbiol. 12 (4), 1089-1104 (2010).</li><li>Garbeva, P., van Veen, J. A., van Elsas, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predominant+Bacillus+spp.+in+agricultural+soil+under+different+management+regimes+detected+via+PCR-DGGE.">Predominant Bacillus spp. in agricultural soil under different management regimes detected via PCR-DGGE.</a> Microb Ecol. 45 (3), 302-316 (2003).</li><li>Brill, J. A., Wiegel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+between+spore-forming+and+asporogenic+bacteria+using+a+PCR+and+southern+hybridization+based+method.">Differentiation between spore-forming and asporogenic bacteria using a PCR and southern hybridization based method.</a> J Microbiol Methods. 31 (1-2), 29-36 (1997).</li><li>Rueckert, A., Ronimus, R. S., Morgan, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+real-time+PCR+assay+targeting+the+sporulation+gene,+spo0A.,+for+the+enumeration+of+thermophilic+bacilli+in+milk+powder.">Development of a real-time PCR assay targeting the sporulation gene, spo0A., for the enumeration of thermophilic bacilli in milk powder.</a> Food Microbiol. 23 (3), 220-230 (2006).</li><li>Bueche, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+endospore-forming+firmicutes+by+quantitative+PCR+with+the+functional+gene+spo0A.">Quantification of endospore-forming firmicutes by quantitative PCR with the functional gene spo0A.</a> Appl Environ Microbiol. 79 (17), 5302-5312 (2013).</li><li>Wunderlin, T., Junier, T., Roussel-Delif, L., Jeanneret, N., Junier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endospore-enriched+sequencing+approach+reveals+unprecedented+diversity+of+Firmicutes+in+sediments.">Endospore-enriched sequencing approach reveals unprecedented diversity of Firmicutes in sediments.</a> Environ Microbiol Rep. 6 (6), 631-639 (2014).</li><li>Nicholson, W. L., Law, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+purification+of+bacterial+endospores+from+soils:+UV+resistance+of+natural+Sonoran+desert+soil+populations+of+Bacillus+spp.+with+reference+to+B.+subtilis+strain+168.">Method for purification of bacterial endospores from soils: UV resistance of natural Sonoran desert soil populations of Bacillus spp. with reference to B. subtilis strain 168.</a> J Microbiol Methods. 35 (1), 13-21 (1999).</li></ol>

יש המחברים אין לחשוף.

ההתנגדות של endospores לגורמים חיצוניים אגרסיביים physicochemical (למשל, טמפרטורה או בדטרגנטים) שימשה כדי להמציא שיטה להפריד endospores חיידקים מהתאים של צמח בדגימות סביבתיות. זוהי השיטה המקיפה הראשונה לבודד endospores מדגימות סביבתיות באופן שאינו הרסני. שיטות קודמות לכמת, לזהות או לנתח endospores בדגימות המבוססות על המדידה של פרוקסי הספציפי לendospores כגון חומצת dipicolinic או גני סמן ספציפיים. לעומת זאת, בפרוטוקול שהוצג כאן, רכיבי מדגם אחרים מאשר endospores יוסרו וכך endospores סופו של דבר יישאר כשרידים היחידים ומטוהרים של המדגם. למרות ששיטות אחרות כגון צנטריפוגה פסטור או שיפוע צפיפות הוצעו להעשרה לendospores 22, הבדיקות שלנו הראו כי צנטריפוגה שיפוע צפיפות היא לא מתאימה כשיטת כללית לדגימות סביבתיות, בשל הבדלים פיסיולוגיים וצפיפויות שונות של מינים שונים של endospore-מעצבים (מידע לא מוצג). בניגוד לכך, הפרוטוקול שלנו יכול בקלות להיות מיושם על כל סוגי דגימות סביבתיות ומתאים ליישומים במורד הזרם כוללים שיטות או culturing מולקולריים. ישנם שני שלבים קריטיים בפרוטוקול. הראשון הוא ההפרדה של ביומסה ממטריצת מדגם (כלומר, חלקיקי משקעים). זה חיוני כי מספר התאים המופרדים מהמטריצה ​​להיות מוגדל, כדי שלא להתעלם חלק מהגיוון. לדגימות משקעים, כפי שכאן, אחת המגבלות העיקריות של הפרוטוקול היא העובדה כי חלק מהתאים או נבגים שאולי לא היו מנותקים ממטריצת המשקעים ולכן לא נכללו בניתוח במורד הזרם, שהוא הגבלת פוטנציאל של השיטה . בהתאם למטריצת המדגם (לדוגמא, אם יש חומצות הומיות), תאים עשויים להיות כרוך באופן הדוק לזה ולכן קשה לשחרר.השימוש במאגר Ortho-פוספט, כמו גם הומוגניזציה טובה עם homogenizer או בלנדר חשוב בשלב זה. כדי להגביר את ההתאוששות, ההליך של הומוגניות וההסרה של ביומסה חוזר על עצמו פעמיים כפי שנכתב בפרוטוקול. הפרוטוקול המתואר כאן פותח ומותאם במיוחד לדגימות של משקעי אגם מים מתוקים. פרמטרים מסוימים לא יהיו אופטימליים עבור סוגים אחרים של דגימות. דרך אחת לנתח את שבר הקהילה שהפוטנציאל התעלם בתהליך תהיה להכפיף את מטריצת המשקעים למיצוי DNA ורצף amplicon. כשינויים אפשריים לטכניקה, הצעד של הפרדה של ביומסה ממטריצת מדגם עשוי להיות מושמט. במיוחד אם המדגם הסביבתי אינו מכיל חלקיקי חומר או מינרלים אורגניים שיכול להפריע לפרוטוקול במורד הזרם (לדוגמא, מים, נוזלים אחרים או תרבויות מטוהרים), ייתכן שלא תהיה צורך בהפרדה מוקדמת. עבור דגימות נוזל הפרוטוקול יכול להתחיל ישירות בפרק 3(אוסף של ביומסה בקרום מסנן). הצעד החשוב השני של הפרוטוקול הוא הטיפול עם תאים של צמח יזוזים, חום, NaOH וSDS להרוס. טמפרטורה, משך, כמו גם ריכוז של חומרים כימיים שכל מוטבו לא לפגוע בendospores, תוך השמדת התאים. פרמטרים אלה צריכים להישמר בקפדנות ולכן כפי שהם. השימוש בשלב ראשון של חימום המדגם על 65 מעלות צלזיוס היה יעיל מאוד כדי לבחור במיוחד עבור endospores בהשוואה לסוגים אחרים של נבגי חיידקים או מבנים כמו נבג המתחוללים בין טווח מערכת החיידקים של Actinobacteria, Myxobacteria, כחוליות, שהם בדרך כלל לא עמידות לחום. כפי שניתן לראות בטבלה 1, חיידקי יוצרי נבגים שאינם עדיין קיימים לאחר הטיפול (8.3% עד 14%). כמה הסברים לכך הם שדגימות משקעים הן מורכבות מאוד וגם יכולות נמל תאים שאינם נבג עמידים. בנוסף, חומר אורגני שאריות עשוי לאפשר מסוימים<html> תאי ttached לשרוד הטיפול. על מנת להקטין את אחוז התאים שאינם יוצרי נבגים בדגימות שטופלו נוסף, השיטה צריכה להיות מותאמת המבוססת על סוג מדגם בודד. השיטה מהווה כלי חדשני למחקר הממוקד של endospore-מעצבים בדגימות סביבתיות. הטיפול להרס תאים של צמח יכול להיבדק על תרבויות טהורות של תאים וendospores ומותאם כדי להתאים התנגדות בודדת של תאים. ההרס של תאים שניתן לראות בעקומות של תרבויות שטופלו מוצגות באיור 2. הצמיחה המאוחרת של התרבויות טופלו יכולה להיות בגלל הזמן שendospores צריך מחדש לנבוט ולעבור לשלב הצמיחה המעריכית. הסברים אפשריים אחרים לעיכוב זה יכול להיות גם היחלשות של תרבות endospore או מספרים סלולריים נמוכים יותר לאחר טיפול. אם endospores המופרד אינו משמש להפקת DNA, ניתן להשמיט את השלב האחרון של טיפול DNase. NT &quot;&gt; יישומים עתידיים של טכניקה זו יכול להיות בחזונו בתעשיות שבי endospores פתוגניים צריך להיות מזוהה. דוגמא אחת היא בתעשיית המזון ובמחקר קליני, שבו זיהוי וניתוח (לזיהוי) של endospores, ובידולה מהתאים של צמח (לדוגמא, ממוצרי מזון כגון מוצרי חלב או על בסיס חלב) הוא חיוני. זה עשוי להיות רלוונטי במיוחד בהתחשב בכך שרבים נהלים סטנדרטיים לשקול מיצוי DNA ישיר ממדגם באמצעות אנזימי ממס שאינם מותאמים לlyse endospores, שכך יהיה להתעלם. בשיטה שהוצגה כאן, ניתן להסיר תאים וניתוח שלאחר מכן יספק תשובות לנוכחות או עדר של endospores בניגוד לתאים. יישומים אחרים כוללים ניתוח של קהילות endospore בדגימות סביבתיות שונות (לדוגמא ליבות קרח או משקעים ) שהוא ארכיון היסטורי של תנאים סביבתיים. בסביבות רבות עם לסביבה יציבה יחסיתתנאי טל (לדוגמא משטח משקעי אגם) Firmicutes יכול לשגשג בצורה של תאים וגטטיבי יוצרי endospore. כאשר תנאים להתדרדר (לדוגמא על ידי דלדול תזונתי במהלך קבורה משקעים או שינוי כיוון תנאים אנאירוביים) התאים לעבור לendospore מדינה. לכן, קהילות endospore אחזור מליבות משקעים יכולות לשקף את התנאים הסביבתיים בזמן הקבורה ובכך לשמש כאינדיקצית paleoecological של התנאים מוקדמים לקבורה. עם זאת, אנחנו עדיין אוספים מידע כדי לתמוך בטענה זו.

המטרה של עבודה זו היא לספק פרוטוקול להפרדת endospores חיידקים מתאי חיידקים וגטטיבי בדגימות סביבתיות. ההיווצרות של endospores חיידקים היא אסטרטגיית הישרדות, בדרך כלל מופעל על ידי רעב, שנמצאה במספר קבוצות חיידקים המשתייכות למשפחה החסרה 1 Firmicutes. חיידקי יוצרי Endospore נלמדים היטב, בעיקר בגלל מספר זני פתוגנים ומכאן חשיבות רפואית (למשל, anthracis Bacillus או קלוסטרידיום). זני סביבה של חיידקי יוצרי endospore היו מבודדים מכמעט כל סביבה (קרקע, מים, משקעים, בטן חיות אוויר, קרח, מעיים אנושיים, ועוד) 1-3. לכן, Firmicutes הוא המערכה הזאת השנייה בשכיחותו באוספי תרבות 4. בגלל חלבוני הקליפה חיצונית וליבת מגן הקשוח שלהם, endospores יכול לשרוד בתנאי הסביבה קיצוני החל frהתייבשות אום לקרינה גבוהה, טמפרטורות קיצוניות וכימיקלים מזיקים 5. התנגדות יוצאת דופן זה עושה את זה אתגר לחלץ DNA מendospores 6-8. זה סביר מסביר מדוע הם התעלמו במחקרי רצף סביבתי 9,10. שיטות אחרות, כגון מיקוד של endospores בדגימות סביבתיות על ידי נוגדני ניאון 11, כימות של חומצת dipicolinic (DPA) בקרקע 12 ומשקעים 13, cytometry זרימת 14 או פסטור וטיפוח לאחר מכן 15,16 כבר משמשים לאחזור או לכמת endospores ב דגימות סביבתיות. בשנים האחרונות, שיטות מיצוי DNA מותאם כמו גם פריימרים ספציפיים מולקולריים למקד רצפי גני endospore ספציפי פותחו 10,17-20. זה עזר לחשוף יותר מגוון ביולוגי בקרב קבוצה זו של חיידקים 21 וגם הוביל ליישומים בתעשייה וברפואה לצורך זיהוי של endospores, למשל באבקת חלב 19. הפרוטוקול המובא כאן מבוסס על ההבדל בהתנגדות לתנאי physicochemical מזיקים (כגון חום וחומרי ניקוי) של endospores חיידקים ביחס לתאים של צמח. להשמיד תאים של צמח במדגם, שנתקיים ברצף להחיל חום, יזוזים וריכוזים נמוכים של חומרי ניקוי. הזמן והכוח של טיפולים אלה כבר מותאמים כדי לא להרוס את הנבגים, אבל לlyse כל תאי הצמח. תאים מסוימים בבריכת תא סביבתית הם עמידים יותר מאחרים, ולכן כדי להגדיל את ההסתברות של השמדת כל התאים של הצמח, אנו מיישמים את שלושה טיפולים שונים. היתרון והחידוש של שיטה זו הוא שendospores לאחר הטיפול הוא עדיין שלם ויכול לשמש לניתוח נוסף במורד הזרם. אלה כוללים מיצוי DNA, PCR (qPCR) וamplicon או רצף metagenomic (מיקוד במיוחד הקבוצה של endospores וכך להקטין דiversity, תוך הגדלת כיסוי). Endospores יכול לשמש גם לטיפוח או כימות על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי במורד הזרם, cytometry זרימה, או זיהוי של DPA. תכונה חשובה של שיטה זו היא שעל ידי השוואת מדגם שלא טופל עם מדגם מטופלים, אחד יכול להסיק את הכמות ומגוון של endospores במדגם סביבתי בנוסף לרכיב המקביל לשל צמח תאים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="596">
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Whatman nitrocellulose membrane filters, 0,2 um pore size, 47 mm diameter</td>
			<td style="width:95px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td colspan="2" style="width:285px;">WHA7182004 Aldrich&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tris(hydroxymethyl)aminomethane</td>
			<td style="width:95px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>252859 Sigma-Aldrich</td>
			<td>CAS 77-86-1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9884 Sigma-Aldrich</td>
			<td>CAS&#160; 60-00-4&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Lysozyme from chicken egg white</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>62971 Fluka</td>
			<td>powder, CAS&#160; 12650-88-3&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ultra-Turrax homogenizer T18 basic</td>
			<td style="width:95px;">IKA</td>
			<td>3720000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Glass filter holders for 47 mm membranes, pyrex glass</td>
			<td style="width:95px;">EMD Millipore</td>
			<td>XX10 047 00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Chemical duty vacuum pump</td>
			<td style="width:95px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">WP6122050</td>
			<td>220 V/50 Hz</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Manifold sampling filtration for 25 mm membranes</td>
			<td style="width:95px;">Millipore</td>
			<td>1225 Sampling Manifold</td>
			<td>polypropylene</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dnase</td>
			<td style="width:95px;">New England Biolabs</td>
			<td>M0303S</td>
			<td>Rnase free</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NaOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5881 Sigma-Aldrich</td>
			<td>CAS&#160; 1310-73-2&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium dodecyl sulfphate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3771 Sigma&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Whatman nitrocellulose membrane filters, 0,2 um pore size, 25 mm diameter</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td colspan="2">WHA7182002 Aldrich</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

physical isolation of endospores from environmental samples by targeted lysis of vegetative cells

Endospore formation is a survival strategy found among some bacteria from the phylum Firmicutes. During endospore formation, these bacteria enter a morpho-physiological resting state that enhances survival under adverse environmental conditions. Even though endospore-forming Firmicutes are one of the most frequently enriched and isolated bacterial groups in culturing studies, they are often absent from diversity studies based on molecular methods. The resistance of the spore core is considered one of the factors limiting the recovery of DNA from endospores. We developed a method that takes advantage of the higher resistance of endospores to separate them from other cells in a complex microbial community using physical, enzymatic and chemical lysis methods. The endospore-only preparation thus obtained can be used for re-culturing or to perform downstream analysis such as tailored DNA extraction optimized for endospores and subsequent DNA sequencing. This method, applied to sediment samples, has allowed the enrichment of endospores and after sequencing, has revealed a large diversity of endospore-formers in freshwater lake sediments. We expect that the application of this method to other samples will yield a similar outcome.

התוצאות שהוצגו כאן כבר פורסמה קודם לכן 10,21. אנא עיין במאמרים אלה לפרשנות והדיון הסביבתיים של נתונים. ההליך הכולל מסוכם באיור 1 ומתאים לשלושה שלבים עיקריים: ראשון, ההפרדה של ביומסה ממשקעים או כל מטריצה ​​סביבתית אחרת; שני, ההרס של תאים של צמח; והשלישי, הניתוח במורד הזרם של endospores המופרד. ניתוח במורד הזרם יכול להיות מורכב, למשל, של מיצוי DNA ורצף amplicon לקבוע גיוון. מיצוי DNA צריך להיות מותאם כדי להבטיח תמוגה של endospores. בדגימות משקעים, שהשגנו זאת על ידי שימוש בהליך מיצוי DNA רציף כוחני 10. יישום השיטה במשקעים מדגים גידול משמעותי בחלק של Firmicutes יוצרי endospore לאחר הפרדה. ברצף amplicon של 16S rRNAגן, Firmicutes בדגימות מטופל (כל קהילה) תואם רק 8.0 ו19.0% מהרצפים (טבלה 1). לעומת זאת, לאחר הטיפול Firmicutes ייצג 90.6% ו83.9% מהמדגם מועשר endospore. שתי הזמנות הגדולות של יוצרי endospore Firmicutes, Bacilliales וClostridiales, היו מועשרים בשיטה, בניגוד לפקודות כמו היעדר Lactobacilliales שFirmicutes יוצרי endospore שאינו. על מנת להוכיח כי השיטה מתאימה במיוחד להעשרת endospores האמיתי, קבוצות אחרות מסוגלים לייצר מבנים כמו נבג-נותחו גם. בהתאם לכך, את התדר של Actinobacteria, כחוליות וMyxococcales ירד לאחר הטיפול לlyse תאים. היעילות של הטיפול הייתה גם הפגינה באמצעות תרבויות טהורות. הכנת endospore (&gt; 95 endospores%) של Paenibacillus alvei, Bacillus subtilis ו megaterium Bacillus </em&gt;, כמו גם תרבות תא וגטטיבי של Escherichia coli, טופלו כמתואר בפרוטוקול לתמוגה של תאי צמח. כל התרבויות אז הודגרו במרק מזין על 37 מעלות צלזיוס וצמיחה נמדדה באמצעות צפיפות אופטית באורך גל של 600 ננומטר. צמיחה נצפתה לתרבויות endospore תוך צמיחה לא נצפתה במטופלי א תרבות coli, מוכיחה כי תאים של צמח הם בלתי הפיך פגומים (איור 2). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53411/53411fig1.jpg" /> סקירת איור 1. של ההליך ניסיוני. הליך המשמש להעשרת חיידקי יוצרי endospore בדגימות סביבתיות. ניתן להשמיט את הצעד של הפרדת תאים וendospores מהמטריצה ​​הסביבתית בהתאם לסוג של מדגם (כלומר, דגימת מים). בדמות השיטות במורד הזרם להחיל על קור שבריר מועשר הנבגspond למיצוי DNA ורצף תפוקה גבוה. ניתן להחליף את הפעולות הבאות על ידי culturing. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53411/53411fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53411/53411fig2.jpg" /> איור 2. אימות של הטיפול בתרבויות טהורות. עקומות גדילה אימות הצמיחה של חיידקי יוצרי endospore מהשעיה של endospores של Bacillus subtilis, megaterium Bacillus, וPaenibacillus alvei ותרבית תאים של Escherichia coli שטופלה בשיטה לתמוגה של תאים. טופל = ○. שלא טופל = ●. ברים שגיאה משלוש תרבויות עצמאיות. צמיחה של תרבויות שליטה וצמיחה מחדש של תרבויות טופלו נמדדה צפיפות אופטית באורך גל של 600 ננומטר. נתון זה כבר מחדש מודפס וROM Wunderlin et al. 2014 עם רשות. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53411/53411fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <table fo:keep-together.within-page="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:129px;"></td><td style="width:80px;"> משקעי 1 </td><td style="width:80px;"></td><td style="width:80px;"> משקעים 2 </td><td style="width:80px;"></td></tr><tr height="38"><td height="38" style="height:39px;"></td><td style="width:80px;"> קהילה כולה </td><td style="width:80px;"> מועשר endospore </td><td style="width:80px;"> קהילה כולה </td><td style="width:80px;"> מועשר endospore </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> Firmicutes </td><td> 8.0 </td><td> 90.6 </td><td> 19.0 </td><td>83.9 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> חיידקים </td><td> 0.5 </td><td> 10.0 </td><td> 5.7 </td><td> 15.1 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> קלוסטרידיאה.את </td><td> 7.4 </td><td> 76.9 </td><td> 12.5 </td><td> 63.2 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> Actinobacteria </td><td> 2.4 </td><td> 1.0 </td><td> 4.4 </td><td> 2.1 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> כחוליות </td><td> 1.1 </td><td> 0.1 </td><td> 0.7 </td><td> 0.1 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> Myxococcales </td><td> 0.7 </td><td> 0.0 </td><td> 0.2 </td><td> 0.0 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> חיידקים אחרים </td><td> 87.8 </td><td> 8.3 </td><td> 75.7 </td><td> 13.9 </td></tr></tbody></table> &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; טבלת 1. שפע של endospores וקבוצות חיידקי יוצרי נבגים אחרות. שכיחות יחסית של Firmicutes (endospore-מעצבים) וקבוצות חיידקים אחרות לייצר מבנים כמו נבג-בשתי דגימות משקעים המתאימים לכל (ללא טיפול) ומועשר endospore קהילות (שטופלו).

Watch this Scientific Journal Video about Physical Isolation of Endospores from Environmental Samples by Targeted Lysis of Vegetative Cells at JoVE.com

Physical Isolation of Endospores from Environmental Samples by Targeted Lysis of Vegetative Cells

A method to single out bacterial endospores from complex microbial communities was developed to perform tailored culture or molecular studies of this group of bacteria.

בידוד פיזי של Endospores מדגימות סביבתיות על ידי תמוגה ממוקדת של תאים גטטיבי

Endospore formation is a survival strategy found among some bacteria from the phylum Firmicutes. During endospore formation, these bacteria enter a ...

physical-isolation-endospores-from-environmental-samples-targeted

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Environment

14.1K Views.  Macquarie University. A method to single out bacterial endospores from complex microbial communities was developed to perform tailored culture or molecular studies of this group of bacteria.

Video: Physical Isolation of Endospores from Environmental Samples by Targeted Lysis of Vegetative Cells

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. I. Collection of Virus Samples

EPA Method 1615 was developed with a goal of providing a standard method for measuring enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. The standardized sampling component of the method concentrates viruses that may be present in water by passage of a minimum specified volume of water through an electropositive cartridge filter. The minimum specified volumes for surface and finished/ground water are 300 L and 1,500 L, respectively. A major method limitation is the tendency for the filters to clog before meeting the sample volume requirement. Studies using two different, but equivalent, cartridge filter options showed that filter clogging was a problem with 10% of the samples with one of the filter types compared to 6% with the other filter type. Clogging tends to increase with turbidity, but cannot be predicted based on turbidity measurements only. From a cost standpoint one of the filter options is preferable over the other, but the water quality and experience with the water system to be sampled should be taken into consideration in making filter selections.

EPA Method 1615 uses an electropositive filter to concentrate enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. This manuscript describes the procedure for collecting samples for Method 1615 analyses.

EPA שיטת המדידה של 1615. Enterovirus ומופע norovirus במים על ידי תרבות וRT-qPCR. I. איסוף דגימות וירוסים

EPA Method 1615 was developed with a goal of providing a standard method for measuring enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. ...

Physical, Chemical and Biological Characterization of Six Biochars Produced for the Remediation of Contaminated Sites

The physical and chemical properties of biochar vary based on feedstock sources and production conditions, making it possible to engineer biochars with specific functions (e.g. carbon sequestration, soil quality improvements, or contaminant sorption). In 2013, the International Biochar Initiative (IBI) made publically available their Standardized Product Definition and Product Testing Guidelines (Version 1.1) which set standards for physical and chemical characteristics for biochar. Six biochars made from three different feedstocks and at two temperatures were analyzed for characteristics related to their use as a soil amendment. The protocol describes analyses of the feedstocks and biochars and includes: cation exchange capacity (CEC), specific surface area (SSA), organic carbon (OC) and moisture percentage, pH, particle size distribution, and proximate and ultimate analysis. Also described in the protocol are the analyses of the feedstocks and biochars for contaminants including polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs), polychlorinated biphenyls (PCBs), metals and mercury as well as nutrients (phosphorous, nitrite and nitrate and ammonium as nitrogen). The protocol also includes the biological testing procedures, earthworm avoidance and germination assays. Based on the quality assurance / quality control (QA/QC) results of blanks, duplicates, standards and reference materials, all methods were determined adequate for use with biochar and feedstock materials. All biochars and feedstocks were well within the criterion set by the IBI and there were little differences among biochars, except in the case of the biochar produced from construction waste materials. This biochar (referred to as Old biochar) was determined to have elevated levels of arsenic, chromium, copper, and lead, and failed the earthworm avoidance and germination assays. Based on these results, Old biochar would not be appropriate for use as a soil amendment for carbon sequestration, substrate quality improvements or remediation.

Biochar is a carbon-rich material used as a soil amendment with the ability to sustainably sequester carbon, improve substrate quality and sorb contaminants. This protocol describes the 17 analytical methods used for the characterization of biochar, which is required prior to large scale implementation of these amendments in the environment.

פיזי, כימי וביולוגי אפיון Biochars שש הופק עבור התיקון של אתרים מזוהמים

The physical and chemical properties of biochar vary based on feedstock sources and production conditions, making it possible to engineer biochars with ...

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. Part III. Virus Detection by RT-qPCR

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a standardized method for use in multiple analytical laboratories during monitoring period 3 of the Unregulated Contaminant Monitoring Rule. Herein we present the protocol for extraction of viral ribonucleic acid (RNA) from water sample concentrates and for quantitatively measuring enterovirus and norovirus concentrations using reverse transcription-quantitative PCR (RT-qPCR). Virus concentrations for the molecular assay are calculated in terms of genomic copies of viral RNA per liter based upon a standard curve. The method uses a number of quality controls to increase data quality and to reduce interlaboratory and intralaboratory variation. The method has been evaluated by examining virus recovery from ground and reagent grade waters seeded with poliovirus type 3 and murine norovirus as a surrogate for human noroviruses. Mean poliovirus recoveries were 20% in groundwaters and 44% in reagent grade water. Mean murine norovirus recoveries with the RT-qPCR assay were 30% in groundwaters and 4% in reagent grade water.

Here we present a procedure to quantify enterovirus and norovirus in environmental and drinking waters using reverse transcription-quantitative PCR. Mean virus recovery from groundwater with this standardized procedure from EPA Method 1615 was 20% for poliovirus and 30% for murine norovirus.

EPA שיטת המדידה של 1615. Enterovirus ומופע norovirus במים על ידי תרבות וRT-qPCR. חלק שלישי. איתור וירוסים על ידי RT-qPCR

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a ...

Automated Gel Size Selection to Improve the Quality of Next-generation Sequencing Libraries Prepared from Environmental Water Samples

Next-generation sequencing of environmental samples can be challenging because of the variable DNA quantity and quality in these samples. High quality DNA libraries are needed for optimal results from next-generation sequencing. Environmental samples such as water may have low quality and quantities of DNA as well as contaminants that co-precipitate with DNA. The mechanical and enzymatic processes involved in extraction and library preparation may further damage the DNA. Gel size selection enables purification and recovery of DNA fragments of a defined size for sequencing applications. Nevertheless, this task is one of the most time-consuming steps in the DNA library preparation workflow. The protocol described here enables complete automation of agarose gel loading, electrophoretic analysis, and recovery of targeted DNA fragments. 
In this study, we describe a high-throughput approach to prepare high quality DNA libraries from freshwater samples that can be applied also to other environmental samples. We used an indirect approach to concentrate bacterial cells from environmental freshwater samples; DNA was extracted using a commercially available DNA extraction kit, and DNA libraries were prepared using a commercial transposon-based protocol. DNA fragments of 500 to 800 bp were gel size selected using Ranger Technology, an automated electrophoresis workstation. Sequencing of the size-selected DNA libraries demonstrated significant improvements to read length and quality of the sequencing reads.

This manuscript describes an automated gel size selection approach for purifying DNA fragments for next-generation sequencing. The Ranger Technology provides complete automation of the entire process of agarose gel loading, electrophoretic analysis, and recovery of targeted DNA fragments allowing for high-throughput and high quality next-generation sequencing libraries.

בחירת גודל האוטומטי ג&#39;ל כדי לשפר את האיכות של ספריות רצף הדור הבא הוכן מדגימות סביבתיות מים

Next-generation sequencing of environmental samples can be challenging because of the variable DNA quantity and quality in these samples. High quality DNA ...

Removal of Trace Elements by Cupric Oxide Nanoparticles from Uranium In Situ Recovery Bleed Water and Its Effect on Cell Viability

In situ recovery (ISR) is the predominant method of uranium extraction in the United States. During ISR, uranium is leached from an ore body and extracted through ion exchange. The resultant production bleed water (PBW) contains contaminants such as arsenic and other heavy metals. Samples of PBW from an active ISR uranium facility were treated with cupric oxide nanoparticles (CuO-NPs). CuO-NP treatment of PBW reduced priority contaminants, including arsenic, selenium, uranium, and vanadium. Untreated and CuO-NP treated PBW was used as the liquid component of the cell growth media and changes in viability were determined by the MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) assay in human embryonic kidney (HEK 293) and human hepatocellular carcinoma (Hep G2) cells. CuO-NP treatment was associated with improved HEK and HEP cell viability. Limitations of this method include dilution of the PBW by growth media components and during osmolality adjustment as well as necessary pH adjustment. This method is limited in its wider context due to dilution effects and changes in the pH of the PBW which is traditionally slightly acidic&#160;however; this method could have a broader use assessing CuO-NP treatment in more neutral waters.

Removal of Trace Elements by Cupric Oxide Nanoparticles from Uranium In Situ Recovery Bleed Water and Its Effect on Cell Viability

Production bleed water (PBW) was treated with cupric oxide nanoparticles (CuO-NPs) and cellular toxicity was assessed in cultured human cells. The goal of this protocol was to integrate the native environmental sample into a cell culture format assessing the changes in toxicity due to CuO-NP treatment.

הסרת יסודות קורט ידי Cupric תחמוצת חלקיקים מאורניום<em&gt; באתר</em&gt; שחזור Bleed מים והשפעתה על כדאיויות תא

In situ recovery (ISR) is the predominant method of uranium extraction in the United States. During ISR, uranium is leached from an ore body and extracted ...

Preparation and Testing of Impedance-based Fluidic Biochips with RTgill-W1 Cells for Rapid Evaluation of Drinking Water Samples for Toxicity

This manuscript describes how to prepare fluidic biochips with Rainbow trout gill epithelial (RTgill-W1) cells for use in a field portable water toxicity sensor. A monolayer of RTgill-W1 cells forms on the sensing electrodes enclosed within the biochips. The biochips are then used for testing in a field portable electric cell-substrate impedance sensing (ECIS) device designed for rapid toxicity testing of drinking water. The manuscript further describes how to run a toxicity test using the prepared biochips. A control water sample and the test water sample are mixed with pre-measured powdered media and injected into separate channels of the biochip. Impedance readings from the sensing electrodes in each of the biochip channels are measured and compared by an automated statistical software program. The screen on the ECIS instrument will indicate either "Contamination Detected" or "No Contamination Detected" within an hour of sample injection. Advantages are ease of use and rapid response to a broad spectrum of inorganic and organic chemicals at concentrations that are relevant to human health concerns, as well as the long-term stability of stored biochips in a ready state for testing. Limitations are the requirement for cold storage of the biochips and limited sensitivity to cholinesterase-inhibiting pesticides. Applications for this toxicity detector are for rapid field-portable testing of drinking water supplies by Army Preventative Medicine personnel or for use at municipal water treatment facilities.

This manuscript describes how to prepare fluidic biochips with Rainbow trout gill epithelial cells for use in a field portable electric cell-substrate impedance sensor. The protocol for running a rapid drinking water toxicity test with the sensor is also described.

הכנה ובדיקה של עכבה מבוססי biochips fluidic עם תאים RTgill-W1 טוב ההערכה המהירה של שתייה דגימות מים עבור רעילות

This manuscript describes how to prepare fluidic biochips with Rainbow trout gill epithelial (RTgill-W1) cells for use in a field portable water toxicity ...

A Bending Test for Determining the Atterberg Plastic Limit in Soils

The thread rolling test is the most commonly used method to determine the plastic limit (PL) in soils. It has been widely criticized, because a considerable subjective judgment from the operator that carries out the test is involved during its performance, which may affect the final result significantly. Different alternative methods have been put forward, but they cannot compete with the standard rolling test in speed, simplicity and cost.
In an earlier study by the authors, a simple method with a simple device to determine the PL was presented (the &#34;thread bending test&#34; or simply &#34;bending test&#34;); this method allowed the PL to be obtained with minimal operator interference. In the present paper a version of the original bending test is shown. The experimental basis is the same as the original bending test: soil threads which are 3 mm in diameter and 52 mm long are bent until they start to crack, so that both the bending produced and its related moisture content are determined. However, this new version enables the calculation of PL from an equation, so it is not necessary to plot any curve or straight line to obtain this parameter and, in fact, the PL can be achieved with only one experimental point (but two experimental points are recommended).
The PL results obtained with this new version are very similar to those obtained through the original bending test and the standard rolling test by a highly experienced operator. Only in particular cases of high plasticity cohesive soils, there is a greater difference in the result. Despite this, the bending test works very well for all types of soil, both cohesive and very low plasticity soils, where the latter are the most difficult to test via the standard thread rolling method.

The traditional standardized test for determining the plastic limit in soils is performed by hand, and the result varies depending on the operator. An alternative method based on bending measurements is presented in this study. This allows the plastic limit to be obtained with a clear and objective criterion.

מבחן כיפוף לקביעת מגבלת פלסטיק Atterberg בקרקעות

The thread rolling test is the most commonly used method to determine the plastic limit (PL) in soils. It has been widely criticized, because a ...

Use of a Filter Cartridge for Filtration of Water Samples and Extraction of Environmental DNA

Recent studies demonstrated the use of environmental DNA (eDNA) from fishes to be appropriate as a non-invasive monitoring tool. Most of these studies employed disk fiber filters to collect eDNA from water samples, although a number of microbial studies in aquatic environments have employed filter cartridges, because the cartridge has the advantage of accommodating large water volumes and of overall ease of use. Here we provide a protocol for filtration of water samples using the filter cartridge and extraction of eDNA from the filter without having to cut open the housing. The main portions of this protocol consists of 1) filtration of water samples (water volumes &#8804;4 L or &gt;4 L); (2) extraction of DNA on the filter using a roller shaker placed in a preheated incubator; and (3) purification of DNA using a commercial kit. With the use of this and previously-used protocols, we perform metabarcoding analysis of eDNA taken from a huge aquarium tank (7,500 m3) with known species composition, and show the number of detected species per library from the two protocols as the representative results. This protocol has been developed for metabarcoding eDNA from fishes, but is also applicable to eDNA from other organisms.

We describe a protocol for filtration of water samples with a filter cartridge and extraction of environmental DNA (eDNA) without having to cut open the housing to remove the filter. This protocol is developed for metabarcoding eDNA from fishes, but is also applicable to eDNA from other organisms.

שימוש במחסנית סינון עבור הסינון של מי דוגמאות הפקת DNA הסביבה

Recent studies demonstrated the use of environmental DNA (eDNA) from fishes to be appropriate as a non-invasive monitoring tool. Most of these studies ...

Dispersion of Nanomaterials in Aqueous Media: Towards Protocol Optimization

The sonication process is commonly used for de-agglomerating and dispersing nanomaterials in aqueous based media, necessary to improve homogeneity and stability of the suspension. In this study, a systematic step-wise approach is carried out to identify optimal sonication conditions in order to achieve a stable dispersion. This approach has been adopted and shown to be suitable for several nanomaterials (cerium oxide, zinc oxide, and carbon nanotubes) dispersed in deionized (DI) water. However, with any change in either the nanomaterial type or dispersing medium, there needs to be optimization of the basic protocol by adjusting various factors such as sonication time, power, and sonicator type as well as temperature rise during the process. The approach records the dispersion process in detail. This is necessary to identify the time points as well as other above-mentioned conditions during the sonication process in which there may be undesirable changes, such as damage to the particle surface thus affecting surface properties. Our goal is to offer a harmonized approach that can control the quality of the final, produced dispersion. Such a guideline is instrumental in ensuring dispersion quality repeatability in the nanoscience community, particularly in the field of nanotoxicology.

Here, we present a step-wise protocol for the dispersion of nanomaterials in aqueous media with real-time characterization to identify the optimal sonication conditions, intensity, and duration for improved stability and uniformity of nanoparticle dispersions without impacting the sample integrity.

פיזור של ננו בתקשורת מימית: לקראת פרוטוקול אופטימיזציה

The sonication process is commonly used for de-agglomerating and dispersing nanomaterials in aqueous based media, necessary to improve homogeneity and ...

Isolation of Mandibular Gland Reservoir Contents from Bornean 'Exploding Ants' (Formicidae) for Volatilome Analysis by GC-MS and MetaboliteDetector

The aim of this manuscript is to present a protocol describing the metabolomic analysis of Bornean &#39;exploding ants&#39; belonging to the Colobopsis cylindrica (COCY) group. For this purpose, the model species C. explodens is used. Ants belonging to the minor worker caste possess distinctive hypertrophied mandibular glands (MGs). In territorial combat, they use the viscous contents of their enlarged mandibular gland reservoirs (MGRs) to kill rival arthropods in characteristic suicidal &#39;explosions&#39; by voluntary rupture of the gastral integument (autothysis). We show the dissection of worker ants of this species for the isolation of the gastral portion of the wax-like MGR contents as well as listing the necessary steps required for solvent-extraction of the therein contained volatile compounds with subsequent gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) analysis and putative identification of metabolites contained in the extract. The dissection procedure is performed under cooled conditions and without the use of any dissection buffer solution to minimize the changes in the chemical composition of the MGR contents. After solvent-based extraction of volatile metabolites contained therein, the necessary steps for analyzing the samples via liquid-injection-GC-MS are presented. Lastly, data processing and putative metabolite identification with the use of the open-source software MetaboliteDetector is shown. With this approach, the profiling and identification of volatile metabolites in MGRs of ants belonging to the COCY group via GC-MS and the MetaboliteDetector software become possible.

Isolation of Mandibular Gland Reservoir Contents from Bornean 'Exploding Ants' Formicidae for Volatilome Analysis by GC-MS and MetaboliteDetector

Minor workers of the ant species Colobopsis explodens are dissected to isolate the wax-like content stored in their hypertrophied mandibular gland reservoirs for subsequent solvent-extraction and analysis by gas chromatography-mass spectrometry. The&#160;annotation and identification of volatile constituents using the open-source software MetaboliteDetector is also described.

בידוד של בלוטת Mandibular תוכן המאגר של אפור פרווה "פיצוץ של הנמלים (Formicidae) לניתוח Volatilome על ידי GC-MS ו- MetaboliteDetector

The aim of this manuscript is to present a protocol describing the metabolomic analysis of Bornean &#39;exploding ants&#39; belonging to the Colobopsis ...