Kapillarelektrophorese (CE)

Quelle: Labor von Dr. B. Jill Venton - University of Virginia

Kapillarelektrophorese (CE) ist eine Trennung Technik, die Moleküle in einem elektrischen Feld je nach Größe und Ladung trennt. CE erfolgt in einer kleinen Glasröhre genannt eine Kapillare, die mit einer Elektrolytlösung gefüllt ist. Analyten sind aufgrund von Unterschieden bei der elektrophoretischen Mobilität, getrennt mit Ladung, solvent Viskosität und Größe variiert. Traditionelle Elektrophorese in den Gelen beschränkt sich in der Höhe von Spannung, die angewendet werden kann, weil Joule Heizung Auswirkungen das Gel und die Trennung zu ruinieren. Kapillaren haben ein große Oberfläche Bereich-zu-Volumen-Verhältnis und damit entstehende Wärme besser. Daher die Spannungen beantragt eine Kapillarelektrophorese-Experiment sind recht groß, oft 10.000 – 20.000 V.

Kapillarelektrophorese eignet sich für Hochleistungs-Trennungen. Im Vergleich zu Flüssigchromatographie, sind CE Trennungen oft schneller und effizienter. Jedoch funktioniert Kapillarelektrophorese am besten, um geladene Moleküle zu trennen, die ist keine Einschränkung der Flüssigkeitschromatographie. CE hat eine höhere Gipfel Kapazität als Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC), d. h. die Trennungen sind effizienter und mehr Peaks detektiert werden. Die Instrumentierung kann sehr einfach sein. Allerdings HPLC ist vielseitiger und viele stationäre und mobile Phasen wurden für verschiedene Arten von Molekülen.

Kapillarelektrophorese trennt Moleküle aufgrund ihrer elektrophoretischen Mobilitäten. Ein Molekül elektrophoretische Mobilität hängt seine Ladung und wieviel es angezogen oder abgestoßen durch die Spannung sowie die kraftschlüssige Widerstandskraft, die Bewegung widersteht. Reibung ist proportional zum Radius des Moleküls. So basiert die elektrophoretische Mobilität auf Größe und Ladung. Die Geschwindigkeit reist ein geladenes Molekül ab einer Kapillare ist das Produkt seine elektrophoretische Mobilität und angewandten elektrischen Feldes. Höhere Spannungen führen deshalb zu schnelleren Geschwindigkeiten und schnellere Trennungen.

Die meisten Kapillarelektrophorese Instrumente werden mit der negativen Spannung am Detektor Ende und die positive Spannung am Eingang eingerichtet. Dies bedeutet, dass positiv geladene Moleküle in Richtung der Kathode am Ende, wandern während negativ geladene Moleküle anders migrieren. Alle Moleküle sind jedoch am Detektor gesehen, da gibt es eine Masse Flüssigkeitsströmung Elektroosmotischer Fluss genannt. Die Migrationsreihenfolge ist daher positiv geladen, neutral und dann negativ geladene Moleküle.

Elektroosmotischer Fluss entsteht durch Anlegen einer hohen Spannung an ein kleines Glas Kapillare mit einer Salzlösung gefüllt. Die positiv geladenen Ionen in die Salzlösung bilden einen double-Layer mit den negativ geladenen Silanol-Gruppen an den Wänden des Glases. Wenn eine negative Spannung bis zum Ende der Kapillare angewendet wird, zieht es die Kationen aus der double-Layer, die auch die Lösung, um es durch Reibungskräfte zieht. Diese Art der Strömung ist Stecker geformt und führt zu weniger Band-Erweiterung als die parabolisch geformten Fluss Stecker der HPLC.

Neutrale Moleküle, die alle mit der gleichen Rate wie den Elektroosmotischer Fluss fließen. Jedoch kann eine Pseudo-stationäre Phase auf die geführten Puffer Form Micellen, die Moleküle in die und aus der partition können hinzugefügt werden. Eine typische Pseudo-stationäre Phase ist Natrium Dodecylsulfate. Die Micellen sind auf der Außenseite negativ geladen, so sie eine elektrophoretische Mobilität, haben d. h. die Zeit in der Micelle die Migration der Zeit bestimmt. Diese Form der Kapillarelektrophorese nennt man Mizellen elektrokinetischen Chromatographie (MEKC).

Erkennung in CE ist ähnlich wie für HPLC. UV-Vis ist allgemein und benötigt keine Kennzeichnung, solange das Molekül eine Doppelbindung hat. Die Extinktion hängt jedoch die Weglänge, die für eine 50-µm-Kapillare klein ist. Eine Blase Zelle oder Z-Zelle wird die Pfadlänge zunehmen. Laserinduzierte Fluoreszenz ist ein empfindlicher Nachweisverfahren. Ein Laser ist durch ein Fenster in die Kapillare und Fluoreszenz des Produkts gemessen glänzte. Während Fluoreszenz sehr hohen Empfindlichkeit bietet, bedarf es in der Regel Moleküle gekennzeichnet werden, weil die meisten nicht fluoreszierend. Elektrochemische Detektion und Elektrospray Massenspektrometrie Erkennung sind an Popularität gewinnt. Das Problem mit einem dieser Detektoren ist, dass die hohe Spannung aus der Trennung zu Boden vor den Nachweis gebracht werden muss, Elektrochemie und Elektrospray das Anlegen einer Spannung erfordert sowie die CE-Spannung kann stören. Neue Methoden der Entkoppelung der CE-Spannung, mit Elektroden Strom oder ein kleiner Riss in der Kapillare abtropfen lassen überwinden diese Herausforderungen.

(1) CE Instrumentierung Setup

1. Das CE-Gerät und den Computer einschalten. Computersoftware, schalten Sie die Lichtquelle für UV-Analyse, zum Aufwärmen zu können. Einige Software hat einen Indikator, wenn die Lampe betriebsbereit ist (Lampe-Symbol dreht sich Farbe).
2. Machen Sie eine Methoden-Datei. Legen Sie die wichtigen Parameter für die Ausführung der CE. In dieser Analyse sind die Temperaturen der Patrone und Sample Speicherung 35 ° C. Die Wellenlänge für UV-Detektion ist 214 nm.
3. Schreiben Sie ein Zeitprogramm. Das Programm besteht im Allgemeinen aus Spülen Schritte (zum Reinigen der Kapillare vor der Analyse), Injektion Schritte, und dann ein Elektrophorese-Schritt. Führen Sie für den Spülgang Schritt 2 Spülungen 1 min. mit 20 Psi Druck. Die erste Spülung ist mit NaOH, die hilft, sicherzustellen, dass die Silanol-Gruppen an der Kapillare Wand deprotonierten sind. Die zweite Spülung ist mit laufen Puffer (0,025 M Borat Puffer hier) um sicherzustellen, dass die Kapillare links mit Puffer equilibriert ist.
4. Für die Injektion dient Druck Injektion bei 0,5 Bar für 5 s.
5. Die Bedingungen sind für den Schritt Elektrophorese Trennung Spannung: 20 kV, Zeit: 5 min, normale Polarität. Für jeden Schritt auch geben Sie an, welche Vial ist der Einlass und die Fläschchen der Steckdose ist. Speichern Sie die Methoden-Datei, nachdem alle Parameter eingegeben werden.

2. Vorbereitung der Standards und Soda Proben

1. 500 ppm Stammlösungen von Aspartam, Koffein und Benzoesäure im Wasser zu machen. 50 mL, mit einem volumetrischen Kolben zu machen.
2. Machen Sie eine standard-Lösung von 150 ppm Aspartam, 150 ppm Koffein und 100 ppm Benzoesäure in einem volumetrischen 10-mL-Kolben.
3. Machen Sie standard Koffein Lösungen von 50 ppm, 100 ppm und 150 ppm 200 ppm in eine volumetrische 10-mL-Fläschchen.

3. führen Sie die Proben auf die CE

1. Legen Sie die Fläschchen mit Normen oder Soda Proben in den Probe-Fläschchen-Halter. Achten Sie darauf, notieren Sie sich die Probe im Steckplatz befindet. Zwei Schlitze haben die Borat Puffer und der 0,1 M NaOH Spüllösung laufen.
2. In der Datei Methode ist Eingang, der die ersten Probenfläschchen slot.
3. Einen einzigen Lauf, und achten Sie auf die Eingabe der Dateninformationen das Programm erwerben Anfragen.
4. Weiterhin Daten, ändern der Eingabe Fläschchen für jede Probe zu erwerben. Führen Sie die Kombination Standard, 3 Konzentrationen von Koffein und eine Pepsi und Diät-Pepsi Probe.
5. Legen Sie das Ziel in das Instrument und wählen Sie das geeignete Instrument.
6. Analysieren Sie die Daten auf dem Computer. Berechnung der Peakflächen und Overlay-Standards und realen Proben, um Spitzen zu identifizieren. Machen Sie eine Eichkurve für die Koffein-Daten.

Electropherograms gesammelt für Diät Pepsi und Pepsi Proben sind in den Abbildungen 1 und 2, bzw. gezeigt. Die drei Zinnen für Koffein, Aspartam und Benzoesäure Diät Pepsi eingehalten werden und haben ähnliche Zugzeiten als Maßstab. Für reguläre Pepsi ist der Koffein-Gipfel vorhanden, aber nicht die Aspartam und Benzoesäure Gipfel. Die CE-Analyse ist schnell, wie die Zugzeiten nur 3 – 4 Minuten sind.

Die Eichkurve für Koffein ist in Abbildung 3dargestellt. Diese Kurve kann verwendet werden, um die Konzentration von Koffein in jeder Probe zu berechnen.

Abbildung 1: CE-Analyse der Diet Pepsi. Die roten sind Koffein, Aspartam und Benzoesäure. Die schwarze ist eine Diät Pepsi Probe. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 2: CE-Analyse von Pepsi. Die schwarze ist eine Pepsi-Probe während die rote eine Probe von Koffein, Aspartam und Benzoesäure. Es gibt kein Aspartam oder Benzoesäure, unter Angabe der Soda ist keine Diät. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 3. Koffein-Kalibrierung-Grundstück mit CE. Ein Grundstück für Koffein-Standards gemessen mit CE-Bereich Vs Spitzenkonzentration. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Kapillarelektrophorese wird für viele Spezialität Trennungen verwendet. Beispielsweise ist es in der pharmazeutischen Industrie für Qualitätsprüfung, um sicherzustellen, dass keine Nebenprodukte oder Interferents verwendet. CE ist besonders nützlich für Drogen mit einer grundlegenden Aminogruppe zu trennen, da die Wände der Kapillaren mit einem sauren pH-Wert neutral erfolgen können und somit das Medikament nicht Sie sich an der Kapillare halten wird.

Ein CE-Modus wurde auch zur Sequenz des menschlichen Genoms und DNA zu trennen. Dieser Modus der CE ist Kapillar Gelelektrophorese und für diese Trennungen ist ein Polymer in der CE-Kapillare injiziert. Das Polymer gibt eine zusätzliche Art der Trennung abhängig von der Größe, wie die kleineren Fragmente durch das Gel schneller reisen können. Dies nennt man Siebung, und zusammen mit der elektrophoretischen Trennung hat es 1 Basenpaar-Auflösung für DNA-Analysen.