UV/Vis-Spektroskopie

Quelle: Labor von Dr. B. Jill Venton - University of Virginia

Sichtbare Ultraviolett (UV-Vis) Spektroskopie ist eines der beliebtesten analytische Techniken, weil es sehr vielseitig und in der Lage, nahezu jedes Molekül zu erkennen ist. Mit UV-Vis-Spektroskopie die UV-Vis-Licht wird durch eine Probe bestanden und die Durchlässigkeit von Licht durch eine Probe gemessen. Aus der Transmission (T) kann die Extinktion als eine =-Log (T) berechnet werden. Ein Absorptionsspektrum erhält, die die Extinktion einer Verbindung bei unterschiedlichen Wellenlängen zeigt. Die Höhe der Extinktion bei beliebiger Wellenlänge ist aufgrund der chemischen Struktur des Moleküls.

UV-Vis einsetzbar auf qualitative Weise zu identifizieren funktionelle Gruppen oder bestätigen die Identität einer Verbindung durch den Abgleich der Absorptionsspektrum. Es kann auch in einer quantitativen Weise verwendet werden, als Konzentration des Analyten im Zusammenhang mit der Extinktion mit der Beerschen Gesetz. UV-Vis Spektroskopie wird verwendet, um die Menge an DNA oder Protein in einer Probe für die Wasseranalyse und als Detektor für viele Arten der Chromatographie zu quantifizieren. Kinetik chemischer Reaktionen durch wiederholte UV-Vis Messungen im Laufe der Zeit auch mit UV-Vis Spektroskopie gemessen. UV-Vis sind in der Regel mit einem Spektrophotometer Messungen. UV-Vis ist auch ein sehr beliebtes Detektor für andere analytische Techniken, wie Chromatographie, weil es viele Verbindungen zu erkennen.

UV-Vis ist normalerweise nicht die empfindlichsten Spektroskopie-Technik, weil über einen kurzen Pfadlänge nicht viel Licht absorbiert wird. Ndere Spektroskopie wie Fluoreszenz haben höheren Empfindlichkeit, aber sie sind nicht als allgemein anwendbar, wie die meisten Moleküle nicht fluoreszierende. UV-Vis hat eine ähnliche Empfindlichkeit mit anderen Extinktion Messungen, wie Infrarot-Spektroskopie.

UV-Vis wird oft eine allgemeine Technik bezeichnet, da die meisten Moleküle im UV-Vis Wellenlängenbereich absorbieren werden. Die UV reicht von 100 – 400 nm und sichtbaren Spektralbereich von 400 bis 700 nm. Bereich von 100 – 200 nm nennt man die Tiefe UV. Lichtquellen sind schwieriger, für diesen Bereich zu finden, damit sie nicht routinemäßig für UV-Vis-Messungen verwendet wird. Typische UV-Vis-Spektrometer verwenden eine Deuteriumlampe für UV, produziert von 170 – 375 nm und einer Wolfram-Glühlampe für sichtbar, das Licht, der Licht von 350 – 2.500 nm produziert.

Wenn ein Photon ein Molekül trifft und wird absorbiert, wird das Molekül in ein aufgeregter energetischen Zustand gefördert. UV-sichtbares Licht hat genügend Energie, Elektronen zu einem höheren elektronischen Zustand aus dem höchsten besetzten molekularen Orbital (HOMO), dem niedrigsten unbesetzten molekularen Orbital (LUMO) zu fördern. Die Energiedifferenz zwischen dem HOMO und dem LUMO ist die Bandlücke genannt. In der Regel werden diese orbitale Verklebung und Anti-Bindung bezeichnet. Die Energie des Photons muss die Bandlücke für das Photon absorbiert werden exakt übereinstimmen. Moleküle mit unterschiedliche chemische Strukturen haben also unterschiedliche Energie Bandlücke und unterschiedlichen Absorptionsspektren. Die am häufigsten verwendeten Übergänge, die im UV-Vis-Bereich fallen sind π-π * und n - π *. PI-orbitale entstehen durch Doppelbindungen und n-orbitale sind für nicht-Bindung Elektronen. PI-Stern sind Anti-Verklebung Pi-orbitale. Somit ist die beste UV-Vis-Absorption von Molekülen, die Doppelbindungen enthalten. PI-orbitale neben einander, die miteinander verbunden sind, Konjugation genannt, in der Regel erhöht. Sigma-σ * Übergänge, verbunden mit einzelnen Anleihen sind höhere Energie und fallen im tiefen UV, so sind sie weniger nützlich für den routinemäßigen Einsatz. Das Aussehen der breiten Bändern oder Schultern auf die UV-Vis-Struktur ist aufgrund der zahlreichen Schwingungs- und Rotations Staaten eines Moleküls, die Energie der Bandlücke des etwas anderen Energien zu trennen führen.

Für Moleküle mit Absorption im sichtbaren Bereich erscheint die Verbindungen oft gefärbt. Ein weit verbreiteter Irrtum ist jedoch, dass die Wellenlänge des Peak Absorption (λ_Max.) für eine Verbindung die Farbe ist, wie, die es erscheint. Eine Verbindung, die rote erscheint muss nicht viel Absorption im roten Bereich des Spektrums. Stattdessen ist die λ_Max. für eine Verbindung, die rote sieht grün. Die Farbe eines Stoffes entsteht, weil die Wellenlängen des Lichts werden selektiv durch die Probe übertragen, und so sie nicht absorbiert sind. Ein Farbrad ist hilfreich bei der Bestimmung, welche Farbe eine Verbindung aufnehmen wird und welche Reichweite die λ_Max. sein wird, da die Farbe direkt auf das Rad von der beobachteten Farbe ist die Farbe, die am meisten absorbiert wird.

Aufnahme folgt Biergesetzes, A = εbC wo ε ist die molare Dämpfung Koeffizient b Weglänge und ist C ist die Konzentration. Der Molaren Dämpfung Koeffizient ist charakteristisch für eine einzelne Verbindung, bei einer bestimmten Wellenlänge absorbieren und diese Eigenschaft ist aufgrund von funktionellen Gruppen, Konjugation usw.. Wenn eine Verbindung keine hohe Dämpfung Koeffizientenhaben, könnte es mit einer passenden Gruppe um seine Absorption zu erhöhen gekennzeichnet werden. Weglänge in der Regel bezieht sich auf die Größe der die Küvette und ist 1 cm im standard Spektralphotometer.

UV-Vis wird auf eine Vielzahl von Instrumenten, von traditionellen Spektralphotometer, mehr moderne Platte Leser durchgeführt. Die Absorption Wellenlänge muss gewählt werden, entweder über einen Filter oder ein Monochromator. Ein Monochromator ist ein Gerät, das die Wellenlängen des Lichts räumlich trennt und legt dann einen Austrittsspalt wo befindet sich die gewünschte Wellenlänge des Lichts. Monochromatoren können gescannt werden, um eine ganze Absorptionsspektrum bieten. Alternativ ein Diodenarray Instrument ermöglicht alle Farben des Lichts durch die Probe übertragen werden, dann das Licht ist in verschiedenen Wellenlängen räumlich getrennt und mit Photodioden nachgewiesen. Dioden-Array-Geräte vollste Spektren schneller sammeln, aber sind etwas komplizierter und teurer.

1. kalibrieren Sie das Spektrometer

1. Schalten Sie die UV-Vis-Spektrometer und lassen Sie die Lampen zum Aufwärmen für einen angemessenen Zeitraum (ca. 20 min) um sie zu stabilisieren.
2. Füllen Sie eine Küvette mit dem Lösungsmittel für die Probe und stellen Sie sicher, dass außen sauber ist. Dies wird als eine leere dienen und helfen, leichte Verluste durch Streuung und Absorption durch das Lösungsmittel entfallen.
3. Legen Sie die Küvette in das Spektrometer. Achten Sie darauf, die Küvette richtig auszurichten, so oft die Küvette hat zwei Seiten, die sind für Handhabung (kann genutet) gedacht und sollen nicht durch Licht.
4. Nehmen Sie eine Lesung für den Rohling. Die Extinktion sollte minimal sein, aber Extinktion sollten künftige Proben abgezogen werden. Einige Instrumente könnten die leere Daten speichern und die Subtraktion automatisch durchführen.

2. führen Sie ein Absorptionsspektrum

1. Füllen Sie die Küvette mit der Probe. Um sicherzustellen, dass die Übertragung quantitativ ist, spülen Sie die Küvette zweimal mit der Probe und dann etwa ¾ voll zu füllen. Stellen Sie sicher, dass außen sauber von Fingerabdrücken usw. ist.
2. Legen Sie die Küvette in das Spektrometer in die richtige Richtung.
3. Decken Sie die Küvette um jede Umgebungslicht zu verhindern.
4. Sammeln Sie ein Absorptionsspektrum dadurch, dass das Instrument, um durch verschiedene Wellenlängen zu scannen und die Extinktion zu sammeln. Der Wellenlängenbereich eingestellt werden, mit Informationen über die spezifischen Probe, aber eine Reihe von 200 – 800 nm ist standard. Ein Diodenarray Instrument ist in der Lage, eine gesamte Absorptionsspektrum in einem Durchlauf zu sammeln.
5. Bestimmen Sie aus den gesammelten Absorptionsspektrum, das Absorption Maximum (λ_Max.). Die Sammlung von Spektren in λ_Max.eine Schätzung der Fehler zu wiederholen.
6. Um eine Kalibrierungskurve zu machen, sammeln Sie die UV-Vis-Spektrum einer Vielzahl von unterschiedlichen Konzentration Proben. Spektrometer sind oft im linearen Bereich beschränkt und werden nicht in der Lage, einen Extinktion-Wert größer als 1,5 zu messen. Wenn die Extinktion-Werte für die Stichprobe außerhalb des Instruments linearen Bereich sind, Verdünnen der Probe um die Werte innerhalb des linearen Bereichs zu erhalten.

(3) Kinetik Experimente mit UV-Vis Spektroskopie

1. UV-Vis kann für Kinetik Experimente verwendet werden, durch die Änderung der Extinktion im Laufe der Zeit zu untersuchen. Für ein Experiment Kinetik eine erste Meßwert der Probe.
2. Fügen Sie schnell das Reagenz um die chemische Reaktion zu starten.
3. Rühren sie gut um mit der Probe zu mischen. Wenn eine kleine Menge hinzugefügt wird, könnte dies in eine Küvette erfolgen. Alternativ mischen Sie das Reagenz mit Probe und gießen Sie schnell etwas in eine Küvette für eine Messung.
4. Die Extinktion bei der λ_Max. für den Analyten von Interesse im Laufe der Zeit zu messen. Wenn das Reagenz wird Messung verwenden (d. h. Absorption steigt da gibt es weniger Reagenz aufnehmen), dann der Zerfall der Ordnung der Reaktion zeigen wird.
5. Machen Sie mit Hilfe einer Eichkurve, ein Grundstück von Analyten Konzentrationszeit Vs, Umwandlung den Extinktion Wert in Konzentration. Von dort kann dieses Diagramm mit entsprechenden Gleichungen fit sein, um die Reaktion Rate Konstanten bestimmen.

UV-Vis kann verwendet werden, um ein Spektrum von farbigen Verbindungen zu erhalten. In Figur 1Azeigt das Absorptionsspektrum von einem blauen Farbstoff. Der Hintergrund zeigt die Farben des Lichtes im sichtbaren Spektrum. Die blaue Farbe hat ein λ_Max. Extinktion in Orange/rot. Abbildung 1 b zeigt ein Spektrum an einen roten Farbstoff, mit λ_Max. im Grünen.

Kinetik kann von einem Grundstück von Extinktion bei einer Wellenlänge im Laufe der Zeit gemessen werden. Abbildung 2 zeigt ein Grundstück von der Absorption von einem blauen Farbstoff (630 nm) wie es mit Bleichmittel reagiert.

Abbildung 1: UV-Vis Absorption Spektren. A. blauer Farbstoff #1 hat maximale Absorption in Orange/rot. B. rote Farbstoff #40 hat maximale Absorption im Grünen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 2: UV-Vis für Kinetik. Absorption des blauen Farbstoff #1 wie es reagiert mit Bleichmittel. Die Kurve kann mit einer exponentiellen Zerfall, zeigt erste Auftrag Kinetik passen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

UV-Vis wird in vielen chemischen Analysen verwendet. Es wird verwendet, um die Menge an Protein in einer Lösung quantitate, wie die meisten Proteine stark bei 280 absorbieren nm. Abbildung 3 zeigt ein Beispiel Spektren von Cytochrom C, hat eine hohe Absorption bei 280 und auch bei 450 wegen eine Häm-Gruppe. UV-Vis dient auch als Standardtechnik zur Quantifizierung der Menge an DNA in einer Probe, wie alle Grundlagen stark bei 260 absorbieren nm. RNA und Proteine absorbieren auch bei 260 nm, so dass die Extinktion bei anderen Wellenlängen gemessen werden kann, um Störungen zu überprüfen. Insbesondere Proteine absorbieren stark bei 280 nm, so dass das Verhältnis der Absorption bei 280/260 ein Maß für das Verhältnis von Protein DNA in einer Probe geben kann.

Die meisten einfachen Analysen messen die Extinktion einer Wellenlänge zu einem Zeitpunkt. Weitere chemische Informationen ist jedoch vorhanden, wenn Messungen bei vielen Wellenlängen gleichzeitig durchgeführt werden. Diodenarray Instrumente erfassen das Licht, das übertragen wird, das Licht in verschiedenen Farben mit einem Prisma oder holographische Gitter unterteilt, und dann Extinktion bei verschiedenen Wellenlängen auf eine lineare Anordnung von Photodioden erfasst. Der Vorteil dieser Methode ist, dass es für viele verschiedene Moleküle gleichzeitige Messung nützlich ist.

Abbildung 3. UV-Vis-Spektrum eines Proteins. Der Peak bei 280 nm ist bezeichnend für ein Protein. Der Peak bei 450 ist aufgrund der Absorption der Häm-Gruppe im Cytochrom C.