Kalibrierkurven

Quelle: Labor von Dr. B. Jill Venton - University of Virginia

Kalibrierkurven werden verwendet, um die instrumentelle Reaktion auf eines Analyten zu verstehen und vorherzusagen, die Konzentration in einer unbekannten Probe. In der Regel eine Reihe von standard-Proben sind in verschiedenen Konzentrationen mit einer Reihe gemacht, als unbekannte Sehenswürdigkeiten beinhaltet und die instrumentelle Reaktion bei jeder Konzentration wird aufgezeichnet. Für mehr Genauigkeit und den Fehler zu verstehen kann die Reaktion bei jeder Konzentration wiederholt werden, so eine Fehler Bar erreicht wird. Die Daten werden dann mit einer Funktion passen, so dass unbekannte Konzentrationen vorausgesagt werden können. In der Regel die Antwort ist linear, jedoch eine Kurve kann mit anderen Funktionen gemacht werden, solange die Funktion bekannt ist. Die Eichkurve kann verwendet werden, zur Berechnung der Nachweisgrenze und Begrenzung der Quantifizierung.

Wenn Sie Lösungen für eine Eichkurve, kann jede Lösung separat erfolgen. Jedoch kann das eine Menge des Ausgangsmaterials und zeitaufwendig sein. Eine weitere Methode zur Herstellung von vielen verschiedener Konzentrationen einer Lösung soll serielle Verdünnungen verwenden. Eine konzentrierte Probe verdünnt mit Verdünnungsreihen unten in gewissem Sinne schrittweise niedrigere Konzentrationen zu machen. Das nächste Beispiel besteht aus den vorherigen Verdünnung und der Verdünnungsfaktor oft konstant gehalten. Der Vorteil ist, dass nur eine erste Lösung erforderlich ist. Der Nachteil ist, dass etwaige Fehler in der Lösung machen — pipettieren, massing, etc. – erhalten propagiert, da weitere Lösungen hergestellt werden. Daher muss darauf geachtet werden, wenn die erste Lösung zu machen.

Kalibrierkurven lässt sich die Konzentration von einer unbekannten Probe vorherzusagen. Um ganz genau zu sein, sollte das Standardmuster in der gleichen Matrix als der unbekannten Probe ausgeführt werden. Eine Probenmatrix ist die Bestandteile der Probe außer der Analyten von Interesse, einschließlich des Lösungsmittels und alle Salze, Proteine, Metall-Ionen, etc., die in der Probe vorhanden sein könnten. In der Praxis ist die Kalibrierung Proben in der gleichen Matrix als ungewisse laufen manchmal schwierig, da der unbekannte Probe aus einer komplexen biologischer oder ökologischer sein kann. So sind viele Kalibrierungskurven in einer Probenmatrix gemacht, die eng nähert sich die echte Probe, z.B. künstliche zerebralen spinalen Flüssigkeit oder künstliche Urin, aber möglicherweise nicht genau sein. Konzentrationen der Standardkurve sollten, die in der erwarteten unbekannten Probe Halterung. Im Idealfall werden ein paar Konzentrationen oberhalb und unterhalb der erwarteten Konzentration Probe gemessen.

Viele Kalibrierkurven sind linear und passen mit der Gleichung y = Mx + b, wo m ist die Steigung und b der y-Achsenabschnitt. Jedoch nicht alle Kurven sind linear und manchmal um eine Linie zu bekommen, eine oder beide Achsen wird festgelegt auf einer logarithmischen Skala. Linearer Regression erfolgt in der Regel mit Hilfe eines Computerprogramms und die am häufigsten verwendete Methode ist, einen kleinsten Quadrate passend zu verwenden. Mit einer linearen Regressionsanalyse ist ein R-Wert² , genannt der Bestimmungskoeffizient, gegeben. Für eine einfache einzelne Regression R² ist das Quadrat des Korrelationskoeffizienten (R) und enthält Informationen darüber, wie weit die y-Werte von der vorhergesagten Linie sind. Eine perfekte Linie hätte einen R-² -Wert von 1, und die meisten R² Werte für Kalibrierkurven sind über 0,95. Wenn die Eichkurve linear ist, die Steigung ist ein Maß für die Empfindlichkeit: wieviel das Signal für eine Änderung der Konzentration ändert. Eine steilere Linie mit einer größeren Neigung zeigt eine empfindlichere Messung. Eine Eichkurve kann auch helfen den linearen Bereich, Konzentrationen festlegen, dass das Gerät eine lineare Antwort gibt. Außerhalb dieses Bereichs die Antwort kann verjüngen sich instrumentellen Gesichtspunkten und die Gleichung von der Kalibrierung kann nicht verwendet werden. Dieses bekannt als die Grenze der Linearität.

Nachweisgrenze ist der niedrigste Betrag, der vom Lärm statistisch ermittelt werden kann. In der Regel wird dies als Signal definiert, 3 Mal das Geräusch ist. Der Nachweisgrenze kann von der Piste die Kalibrierkurve berechnet und ist in der Regel definiert als LOD=3*S.D./m, wo S.D. die Standardabweichung des Rauschens ist. Der Lärm wird gemessen, indem man die Standardabweichung der Mehrfachmessung. Alternativ kann in einer Ablaufverfolgung, Lärm als die Standardabweichung der Baseline geschätzt werden. Die Grenze der Quantifizierung ist die Menge, die differenzieren zwischen Proben und ist in der Regel definiert als 10-Mal das Geräusch.

1. machen die Standards: Verdünnungsreihen

1. Machen Sie eine konzentrierte Stammlösung der Norm. Das Mittel ist in der Regel genau abgewogen, und dann quantitativ in einem volumetrischen Kolben übertragen. Fügen Sie einige Lösungsmittel hinzu, mischen Sie, so dass die Probe auflöst, dann füllen Sie in die Zeile mit dem entsprechenden Lösungsmittel.
2. Durchführen Sie Verdünnungsreihen. Nehmen eine andere volumetrischen Kolben und pipette die Höhe der Standard für die Verdünnung benötigt dann füllen Sie in die Zeile mit Lösungsmittel und mischen. Eine zehnfache Verdünnung ist in der Regel gemacht, also für eine volumetrische 10 mL-Flasche, 1 mL der vorherigen Verdünnung zugeben.
3. Weiterhin Bedarf für weitere Verdünnungen, Pipettieren von der vorherigen Lösung um es zu machen, die nächste Probe verdünnen. Für eine gute Kalibrationskurve werden mindestens 5 Konzentrationen benötigt.

2. führen Sie die Proben für die Eichkurve und das unbekannte

1. Laufen Sie die Proben mit der UV-Vis Spektralphotometer, die instrumentelle Reaktion benötigt für die Eichkurve zu bestimmen.
2. Den Meßwert mit der ersten Probe. Es ist eine gute Idee, die Proben in zufälliger Reihenfolge (d. h. nicht höchsten bis zur niedrigsten zum höchsten oder niedrigsten) laufen, für den Fall, dass systematische Fehler vorliegen. Um eine Schätzung des Rauschens zu erhalten, wiederholen Sie der Lesung zu jeder Probe 3 – 5 X.
3. Die zusätzliche standard Proben, Wiederholung der Messungen für jede Probe eine Schätzung der Lärm zu laufen. Notieren Sie die Daten später zu einem Grundstück.
4. Führen Sie die unbekannten Proben. Verwenden Sie als ähnliche Bedingungen zu den Standards wie möglich laufen. So, die Probenmatrix oder Puffer sollte identisch sein, der pH-Wert sollte identisch sein und die Konzentration sollte im Bereich der Normen ausgeführt werden.

3. machen die Kalibrierkurve

1. Erfassen Sie die Daten in eine Tabelle und verwenden Sie ein Computerprogramm, um die Daten gegen Konzentration zeichnen. Wenn mindestens dreifacher Messungen für jeden Punkt aufgenommen wurden, können Fehlerindikatoren der Standardabweichung dieser Messungen, die Fehler der einzelnen Punkte zu schätzen geplottet werden. Für einige Kurven müssen die Daten mit einer Achse als ein Protokoll zu einer Linie dargestellt werden. Die Gleichung, die die Eichkurve regelt ist im Allgemeinen vor der Zeit, bekannt ein Log-Plot verwendet wird, wenn es gibt ein Protokoll in der Gleichung.
2. Die Eichkurve zu untersuchen. Sieht es linear? Es muss einen Teil, der nicht-linearen sieht (d. h. erreicht die Grenze der instrumentalen Antwort)? Um zu überprüfen, passen alle Daten, um eine lineare Regression mit der Software. Wenn der Bestimmungskoeffizient (R²) nicht hoch ist, entfernen Sie einige der Punkte am Anfang oder Ende der Kurve, die nicht angezeigt werden, passen die Linie und die lineare Regression wieder durchführen. Es geht nicht um Punkte in der Mitte zu entfernen, nur weil sie eine großen Fehler-Bar. Entscheiden Sie aus dieser Analyse, welcher Teil der Kurve linear ist.
3. Die Ausgabe des linearen sollte eine Gleichung für die Format-y = Mx + b, wo m ist die Steigung und b der y-Achsenabschnitt. Die Einheiten für die Neigung sind die y-Achse Einheit/Konzentration, in diesem Beispiel (Abbildung 1) Absorption/μM. Für den y-Achsenabschnitt werden die y-Achse Einheiten. Es ergibt sich ein Bestimmungskoeffizient (R²). Je höher die R² je besser die Passform; eine perfekte Passform verleiht ein R² 1. Das Programm kann auch eine Schätzung des Fehlers auf die Piste und das Abfangen können.

4. Ergebnisse: Kalibrierkurve des Absorption des blauen Farbstoff #1

1. Die Eichkurve für Absorption des blauen Farbstoff #1 (bei 631 nm) wird unten (Abbildung 1) angezeigt. Die Antwort ist linear von 0 bis 10 µM. oben, dass Konzentration das Signal auf Stufe beginnt ab weil die Antwort aus den linearen Bereich der UV-Vis Spektralphotometer ist.
2. Berechnen Sie die LOD. Von der Piste die Eichkurve, die Detailgenauigkeit ist 3*S.D. (Lärm) / m. Für diese Eichkurve der Lärm wurde erreicht, indem man eine Standardabweichung von wiederholten Messungen und 0,021 war. Das LOD wäre 3*0.021/.109=0.58 µM.
3. Berechnung der LOQ. Das LOQ ist 10*S.D. (Lärm) / m. Für diese Eichkurve LOQ ist 10*0.021/.109 = 1,93 µM.
4. Berechnen Sie die Konzentration des unbekannten. Verwenden Sie die Gleichung der Linie um die Konzentration der unbekannten Probe zu berechnen. Die Eichkurve gilt nur, wenn das unbekannte in den linearen Bereich der Standardproben fällt. Wenn die Messwerte zu hoch sind, kann die Verdünnung erforderlich sein. In diesem Beispiel wurde die unbekannte Sportgetränk 1:1 verdünnt. Die Extinktion war 0,243 und dies entspricht einer Konzentration von 2,02 µM. Damit die Endkonzentration von blauer Farbstoff #1 in der in der Sport-Getränk war 4,04 µM.

Abbildung 1: Kalibrierkurven für UV-Vis Absorption des blauen Farbstoff. Links: die Absorption der verschiedenen Konzentrationen von blauen Farbstoff #1 gemessen wurde. Die Antworten einpendeln nach 10 µM bei die Extinktion über 1. Die Fehlerbalken sind durch wiederholte Messungen der gleichen Probe und Standardabweichungen. Recht: Die lineare Teil der Kalibrierkurve ist mit einer Linie fit y = 0.109 * X + 0,0286. Unbekannten Daten werden in schwarz angezeigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Kalibrierkurven sind in vielen Bereichen der analytischen Chemie, Biochemie und pharmazeutische Chemie eingesetzt. Es ist üblich, sie mit Spektroskopie, Chromatographie und Elektrochemie Messungen verwenden. Eine Eichkurve kann verwendet werden, um die Konzentration einer Umweltbelastung in einer Bodenprobe zu verstehen. Es kann verwendet werden, bestimmen die Konzentration der Neurotransmitter in einer Stichprobe von Gehirn Flüssigkeit, Vitamin in pharmazeutische Proben oder Koffein in Essen. Somit eignen sich Kalibrierungskurven in Umwelt-, Bio-, Pharma- und Lebensmittelindustrie-Science-Anwendungen. Der wichtigste Teil der Herstellung einer Kalibrationskurve ist, genaue standard Proben zu bilden, die in einer Matrix, die die Probe Mischung am nächsten kommt.

Ein Beispiel für eine Eichkurve Elektrochemie ist unten (Abbildung 2). Die Daten wurden mit einer ionenselektive Elektrode für Fluorid gesammelt. Elektrochemische Daten folgen die Nernst-Gleichung E = E⁰ + 2.03*R*T/(nF) * log C. So müssen die Konzentrationsdaten (x-Achse) auf einer logarithmischen Skala, eine Linie zu erhalten geplottet werden. Diese Eichkurve kann zur Messung der Konzentration von Fluorid in Zahnpasta oder Trinkwasser verwendet werden.

Abbildung 2: Eichkurve für eine ionenselektive Elektrode. Die Reaktion einer selektiven Fluorid-Elektrode (in mV) auf verschiedenen Konzentrationen von Fluorid aufgetragen. Die erwarteten Gleichung für die Reaktion der Elektrode ist y (in mV) =-59,2 * Log X + b bei 25 ° C. Die eigentliche Gleichung lautet y =-57,4 * Log x +56.38. Der R-² -Wert ist 0.998. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.