Interne Standards

Quelle: Labor von Dr. B. Jill Venton - University of Virginia

Das Ziel vieler chemischer Analysen ist eine Quantitative Analyse, wo die Menge einer Substanz in einer Probe bestimmt. Um die Konzentration eines unbekannten aus einer Stichprobe genau zu berechnen, ist die sorgfältige Probenvorbereitung Schlüssel. Jedes Mal, wenn eine Probe verarbeitet oder übertragen wird, können einige der Probe verloren gehen. Allerdings gibt es Strategien zur Minimierung der Probenverlust. Es gibt auch Strategien zur Bewältigung der Probenverlust und noch genaue Messungen der Konzentration.

Zur Minimierung von Probenverlust ist Ideal um die Anzahl der Beispielschritte Handhabung und Übertragung zu minimieren. Beispielsweise reduziert die Massierung von einer festen Probe direkt in eine Flasche, der eine Lösung erzielt werden einen Transfer-Schritt. Wenn es notwendig, aus einer Flasche auf einen anderen übertragen und eine Verdünnung erfolgt, hilft dreifach spülen der Gläser, sicherzustellen, dass die Probe übertragen wird. Andere Strategien sind spezifischer auf die Probe. Proben, die auf Glas, wie zum Beispiel Proteine, adsorbieren könnte beispielsweise besser in Einweg-Polypropylenröhrchen gehandhabt werden. Die Rohre sind nicht hydrophil, also wenn eine kleine Menge der Probe in Wasser pipettiert werden wird, es empfiehlt sich, bereits hinzugefügt haben, das Wasser mit dem Schlauch direkt in das Lösungsmittel die Probe pipettiert werden kann. Es möglicherweise besser zu konzentrieren, anstatt eine Probe durch Verluste aus Insolubilities nach Rehydratation vollständig trocknen.

Eine weitere Quelle von Probenverlust ist durch unvollständige Probe Manipulationen. Beispielsweise wird wenn eine Derivatisierung Verfahren verwendet wird und die Derivatisierung unvollständig ist, dann der volle Betrag der Probe nicht beobachtet. Fehler wie diese sind systematische Fehler und Behebung des Problems, wie das Ändern der Derivatisierung Verfahren gelöst werden können. Eine weitere Ursache für systematische Fehler bei Messungen ist Matrix-Effekte. Diese können Messung bestimmter Stoffe und darstellende Kalibrierungen in der gleichen Matrix stören, da die Probe kann diesen Effekt reduzieren.

Quantitative Analyse wird in der Regel mit entweder extern oder intern Standards durchgeführt. Für externe Standards erfolgt eine Kalibrierkurve durch Messung unterschiedliche bekannteste Konzentration des Analyten von Interesse. Dann ist das Beispiel separat vom Standard ausgeführt. Für interne Standards ist der Standard in der gleichen Probe als der Analyten von Interesse, so dass die Messung gleichzeitig entnommen werden. In der Regel einer anderen Spezies wird hinzugefügt, dass interne Standard des internen Standards und das Verhältnis der Antwort gefordert und der Analyt wird berechnet. Die Idee ist, dass das Verhältnis der Reaktion, genannt der Responsefaktor proportional zu ihrer Konzentration. Während die Methode der Analyten von Interesse und dem internen Standard unterscheiden kann muss, sollte jede Probe-Verluste, die auftreten, nachdem der interne Standard hinzugefügt wird für beide Substanzen ähnlich und somit das Verhältnis der Antwort bleibt die gleiche. Ein besonderer Fall der Verwendung von internen Standards ist die Methode der Standardzusätzen, wo immer größere Mengen des Analyten wird der Projektmappe hinzugefügt und der Ursprungsbetrag des Analyten zurück berechnet. Interne Standards können in der Chromatographie, Elektrochemie und Spektroskopie verwendet werden.

Interner Standard ist eine Substanz, die in einen konstanten Betrag hinzugefügt, um eine Probe, leer und standard in einer Analyse. Interner Standard kann systematische und zufällige Fehler ausgleichen. Beispielsweise gibt es Instrument Schwankungen, die zufälligen Fehler bei der Messung führen, diese Schwankungen werden voraussichtlich für die internen Standards und den Analyten gleich und somit ändert sich das Verhältnis von Signalen nicht. Für systematische Fehler, wie Matrix-Effekte des Lösungsmittels solange der Effekt für den Standard und die Analyten, gleich ist, ist das Verhältnis wieder unberührt.

Der Nachteil von internen Standards ist, dass es schwer ist, einen geeigneten internen Standard zu finden. Des internen Standards muss ein Signal sein, ist der Analyt ähnlich, aber unterschiedlich genug, dass es durch das Instrument zu unterscheiden. Des internen Standards sollten auch nicht in der Probenmatrix vorhanden sein, damit die zusätzliche Standard die einzige Quelle des Standards ist. Gelegentlich ein Hauptbestandteil einer Probe, die konstante Konzentration ist einsetzbar als interner Standard anstelle einer zusätzlichen Standard, aber die Konzentration für diesen Bestandteil bekannt sein muss. Des internen Standards sollte auch nicht unterdrücken oder das Signal des Analyten verbessern.

Chromatographie ist eines der größten Fehlerquellen oft die Injektion. Wenn manuelle Injektionen verwendet werden, können Fehler in der Spritze ordnungsgemäß geladen. Bände sind in der Regel klein (~ 1 µL) so gibt es Unsicherheiten in reproduzierbar Injektion dieses kleine ein Volumen, oft ein paar Prozent relative Standardabweichung (RSD). Gaschromatographie (GC) die Probe wird in einen beheizten Port injiziert und Verdampfung von der Nadelspitze kann dazu führen, dass Abweichungen in Volumen injiziert. Auto-Sampler mit dem Fehler beim Laden von der Spritze und der Fehler bei injizierenden schnell Verdunstung im GC vermeiden helfen kann, aber des Fehlers noch 1 – 2 % RSD. Mit Chromatographie dient Peakfläche in der Regel statt Peakhöhe, wie die Gipfel breiter und kürzer mit der Zeit aber die Peakfläche konstant ist. So, für interne Standards Verhältnisse der Peakflächen in Chromatographie statt Gipfel Höhen eingesetzt.

Für eine Kalibrierung mit einem internen Standard wird ein Antwort-Faktor berechnet. Der Responsefaktor (R) ist das Verhältnis von den Gipfeln im Vergleich zu dem Verhältnis der Konzentrationen, wobei X der Analyten und IS ist, der interne Standard ist.

Für den Bereich Chromatographie (A) genutzt wird. Der Responsefaktor kann berechnet werden, aus einer Kalibrierung Handlung von einerX/a_IS Vs CX/c_IS, wo der Responsefaktor ist die Steigung und y-Achsenabschnitt ist als 0 angenommen. Sobald der Responsefaktor Standards bekannt ist, kann die Reaktion des unbekannten aus dem gemessenen Bereichsverhältnis aus dem Experiment berechnet werden.

1. richtige Probenbehandlung: Bildet eine Lösung

1. Nehmen Sie ein sauberes Becherglas und Masse die richtige Menge der Probe hinein. Notieren Sie die tatsächliche Masse verwendet. In diesem Beispiel wird eine Lösung von Adenin in einem volumetrischen Kolben für den Einsatz als interner Standard für die nächste Analyse gemacht. Die Masse von Adenin ist 100 mg. Tun nicht direkt in einem volumetrischen Kolben Masse, denn es einen langen Hals hat und die Adenin kann nicht leicht hinzugefügt oder entfernt.
2. Fügen Sie etwa 25 mL des Lösungsmittels (in diesem Fall Dimethyl Sulfoxid (DMSO)) in die Becher und lassen es rühren, sich aufzulösen. In diesem Beispiel die endgültige Lösung erfolgt in einem 50 mL volumetrischen Kolben, also nur ca. 25 mL, so dass der Becher gespült werden kann und die Lösung auf das Endvolumen hinzufügen.
3. Sobald die Solid aufgelöst hat, füllen Sie die Lösung in den volumetrischen Kolben.
4. Spülen Sie den Becher und die Stir Bar mit geringen Mengen an Lösungsmittel, ca. 10 mL und gießen Sie die Spülung in die volumetrische Flasche. Zweimal wiederholen Sie mehr. Dadurch werden korrekte Lösung zu gewährleisten.

2. Vorbereitung des einen internen Standard Kalibrierkurve

1. Bereiten Sie die gewünschten standard Proben für die Gaschromatographie Analyse. In diesem Beispiel Koffein aus Kaffee mit Acetonitril extrahiert und dann Adenin dient als interner Standard für die Messung.
2. Für die Koffein-Proben die Menge der Probe benötigt, um 1 mg/mL Probe machen abwiegen. Wenn ein volumetrische 10-mL-Fläschchen, das heißt 10 mg.
3. Wiegen Sie der Analyt in ein Becherglas, fügen Sie ein paar mL des Lösungsmittels (hier Methanol) auflösen, dann quantitativ in den volumetrischen Kolben mit 3 Spülungen übertragen.
4. Machen Sie 3 weitere Standards in ähnlicher Weise mit 0,2, 0,5 bis 2 mg/mL Koffein.
5. Genommen Sie 1 mL pro Koffein in ein Probengefäß standard.
6. Jedes Probengefäß 0,2 mL 2 mg/mL Adenin interner Standard hinzufügen.
7. Führen Sie das Gas-Chromatographie-Experiment mit jeder Koffein-Standard. Berechnen Sie dem Verhältnis der Peakflächen für Koffein Vs für jedes Chromatogramm des Standards.
8. Machen Sie ein Grundstück von der Gegend Verhältnis Vs das Konzentration-Verhältnis. Die Neigung dieser Fläche ist der Responsefaktor.

3. Vorbereitung einer echten Probe mit internem Standard für die Gaschromatographie

1. Bereiten Sie die gewünschte Probe für die Gaschromatographie-Analyse. In diesem Beispiel wird Koffein aus Kaffee mit Acetrontrile gewonnen.
2. Für die Kaffee-Probe, Masse, 2 g Kaffee in einen 100-mL-Becherglas. Notieren Sie das exakte Gewicht des Kaffees.
3. Den Becher 20 mL Acetonitril hinzufügen.
4. Lassen Sie es 20 Minuten, unter häufigem Rühren zu sitzen.
5. Filtern Sie den Kaffeesatz mit einem Filterpapier in einen Trichter.
6. Spülen Sie den Filter Papier 3 X mit kleinen Mengen von Acetonitril (5 mL).
7. Der letzte Band der das Filtrat zu messen. Es sollte etwa 35 mL.

4. führen Sie das Beispiel und berechnen die Konzentration zu

1. Nehmen Sie 1 mL der Probe Kaffee Extrakt ein und 0,2 mL des internen Standards in einer Durchstechflasche. Legen Sie das Fläschchen in Auto-Sampler-Rack.
2. Führen Sie eine GC-Analyse der Probe. Stellen Sie sicher, dass die GC-Bedingungen sind derart, dass das Koffein und Adenin zu trennen. In diesem Beispiel werden Isotherme Trennungen bei 200 ° c durchgeführt.
3. Berechnen Sie nach der Analyse die Peakfläche für den internen standard Gipfel und den Analyten-Peak. Über ihre Verhältnisse, berechnen Sie die Menge des Koffeins in der Probe.

5. Ergebnisse: GC-Analyse von Koffein mit internem Standard

1. GC-Analyse von Koffein ist in Abbildung 1dargestellt. Adenin ist als interner Standard verwendet. Das Verhältnis der Peakflächen gemessen werden und gegen das Verhältnis der Konzentrationen aufgetragen. Die Neigung des Grundstücks ist der Responsefaktor (in diesem Fall 1,8).
2. Abbildung 2 zeigt ein Chromatogramm einer Kaffee-Probe mit internem Standard Adenin. Das Verhältnis von Peak ist 1,78. Mit der Responsefaktor und bekannter Konzentration von Adenin (0,33 mg/mL), ist die Konzentration von Koffein in der unbekannten Probe berechnet 0,33 mg/mL.

Abbildung 1: Kalibrierung-Grundstück mit einem internen Standard. Eines Grundstücks die Verhältnisse Vs Konzentration Flächenverhältnisse für 3 Standardmuster von Koffein (1, 0,5 und 0,2 mg/mL) mit 0,33 mg/mL Adenin internem Standard der einzelnen hinzugefügt. Die Steigung der geraden ist 1.8, der Responsefaktor.

Abbildung 2: Chromatogramm des Kaffees mit internem Standard Adenin. Ein Grundstück von der Reaktion der FID-Detektor auf Proben. Die drei wichtigsten Gipfel sind Adenin (IS), Koffein und Palmitinsäure.

Interne Standards dienen in vielen Bereichen, einschließlich Spektroskopie und Chromatographie. Spektroskopie hilfst internen Standards korrekt für zufällige Fehler aufgrund von Änderungen in der Intensität der Lichtquelle. Wenn eine Lampe oder andere Lichtquelle Variablen Leistung hat, wirkt sich die Absorption und infolgedessen Emission einer Probe. Jedoch wird das Verhältnis von internem Standard, Analyt bleiben konstant, auch wenn die Lichtquelle nicht der Fall ist. Ein Beispiel hierfür ist Lithium (Li) als interner Standard für die Analyse von Natrium in einer Blutprobe von Flamme Spektroskopie verwenden. Li ist chemisch ähnlich wie Natrium aber nicht nativ im Blut gefunden.

Internen Standards ist für die Chromatographie oft in Gaschromatographie und Flüssigkeitschromatographie eingesetzt. Für Anwendungen mit Massenspektrometrie als Detektor kann der interne Standard eines Analyten isotopischer beschriftet werden, sodass das Molekulargewicht (MW) anders als der Analyten von Interesse sein wird. Internen Standards werden häufig in pharmazeutischen oder ökologische Analysen verwendet.