Herstellung einer dezellularisierten Milzmatrix aus Ratten

Die dezellularisierte Milzmatrix (DSM) bietet vielversprechende Anwendungen im Bereich des Tissue Engineering in der Leber. Dieses Protokoll beschreibt das Verfahren zur Vorbereitung des DSM von Ratten, das die Entnahme von Rattenmilz, ihre Dezellularisierung durch Perfusion und die Bewertung des resultierenden DSM zur Bestätigung seiner Eigenschaften umfasst.

Die Lebertransplantation ist die primäre Behandlung von Lebererkrankungen im Endstadium. Der Mangel und die unzureichende Qualität der Spenderorgane machen jedoch die Entwicklung alternativer Therapien erforderlich. Biokünstliche Lebern (BALs), die eine dezellularisierte Lebermatrix (DLM) verwenden, haben sich als vielversprechende Lösungen herausgestellt. Die Beschaffung geeigneter DLMs bleibt jedoch eine Herausforderung. Die Verwendung einer dezellularisierten Milzmatrix (DSM) wurde als Grundlage für BALs erforscht und bietet eine leicht verfügbare Alternative. In dieser Studie wurde die Milz von Ratten unter Verwendung einer Kombination aus Gefrier-Auftau-Zyklen und Perfusion mit Dezellularisierungsreagenzien entnommen und dezellularisiert. Das Protokoll bewahrte die Mikrostrukturen und Komponenten der extrazellulären Matrix (ECM) innerhalb des DSM. Der vollständige Dezellularisierungsprozess dauerte ca. 11 h, was zu einer intakten EZM innerhalb des DSM führte. Die histologische Analyse bestätigte die Entfernung zellulärer Komponenten unter Beibehaltung der Struktur und Zusammensetzung der EZM. Das vorgestellte Protokoll bietet eine umfassende Methode zur Gewinnung von DSM und bietet potenzielle Anwendungen im Bereich des Lebergewebe-Engineerings und der Zelltherapie. Diese Erkenntnisse tragen zur Entwicklung alternativer Ansätze für die Behandlung von Lebererkrankungen im Endstadium bei.

Die Lebertransplantation ist nach wie vor die einzige definitive Behandlung für Lebererkrankungen im Endstadium ^1,2,3. Der kritische Mangel und die abnehmende Qualität von Spenderorganen haben jedoch den Bedarf an alternativen Behandlungen erhöht⁴. Im Bereich der regenerativen Medizin haben sich biokünstliche Lebern (BALs), die eine dezellularisierte Lebermatrix (DLM) verwenden, als vielversprechende Lösungen erwiesen ^5,6,7. Die DLM bewahrt die ursprüngliche Leberstruktur, einschließlich ihres komplizierten mikrovaskulären Netzwerks und der Komponenten der EZM, und bietet ein Gerüst für die Erstellung transplantierbarer BALs, die möglicherweise Lebererkrankungen lindern könnten.

Trotz des Versprechens steht die Einführung dieser Technologie vor Herausforderungen, insbesondere bei der Beschaffung geeigneter DLMs. Vom Menschen stammende DLMs sind knapp, während solche aus tierischen Quellen das Risiko der Übertragung von Krankheiten und der Immunabstoßung bergen. In einem innovativen Ansatz haben wir in unserer Forschung die Verwendung einer dezellularisierten Milzmatrix (DSM) als Grundlage für die BALs 8,9,10,11 untersucht. Milz ist in verschiedenen medizinischen Situationen leichter verfügbar, z. B. bei portaler Hypertonie, traumatischer Ruptur, idiopathischer thrombozytopenischer Purpura und Spende nach dem Herztod. Daher ist Milz für Forschungszwecke weiter verbreitet als Leber. Patienten, die sich einer Splenektomie unterzogen haben, leiden nicht an schweren Erkrankungen, was die Entbehrlichkeit der Milz weiter bestätigt. Die Mikroumgebung der Milz, insbesondere der extrazellulären Matrix und der Sinusoide, ähnelt der der Leber. Damit ist die Milz ein geeignetes Organ für die Zelladhäsion und -proliferation in der Hepatozytentransplantationsforschung. Basierend auf diesen Erkenntnissen haben unsere bisherigen Untersuchungen gezeigt, dass DSMs vergleichbare Mikrostrukturen und Komponenten mit DLMs aufweisen und das Überleben und die Funktion von Hepatozyten, einschließlich der Albumin- und Harnstoffproduktion, unterstützen können. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass DSMs die hepatische Differenzierung von mesenchymalen Stammzellen des Knochenmarks verbessern, was zu einer verbesserten und konsistenten Funktionalität führt.

Durch den Einsatz von DSMs, die mit Heparin behandelt wurden, haben wir funktionelle BALs entwickelt, die in der Lage sind, eine wirksame kurzfristige Antikoagulation und eine partielle Leberfunktionskompensation zu demonstrieren¹¹. Folglich ist dieses dreidimensionale DSM vielversprechend für die Weiterentwicklung des Lebergewebe-Engineerings und der Zelltherapie. In dieser Arbeit stellen wir die detaillierten Methoden zur Entnahme von Rattenmilz und zur Herstellung von DSM vor, die die Mikrostrukturen und Komponenten der EZM erhalten.

Diese Studie wurde vom Ausschuss für die Ethik von Tierversuchen der Universität Xi'an Jiaotong genehmigt und in Übereinstimmung mit den Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt.

1. Milz-Entnahme

1. Verwenden Sie männliche Sprague Dawley-Ratten mit einem Gewicht von 250-280 g. Halten Sie die Ratten in Räumen mit kontrollierter Temperatur und Luftfeuchtigkeit und versorgen Sie sie nach Belieben mit Futter und Wasser, außer zum Fasten vor der Operation.
2. Injizieren Sie Buprenorphin (0,05 ml/kg) 1 h vor der Operation subkutan als Analgetikum. Betäuben Sie die Ratte durch Isofluran-Inhalation. Verwenden Sie eine Flussrate von 1,5 l/min von 5 % Isofluran für die Induktionsanästhesie in einer Plexiglasbox und halten Sie die Anästhesie mit einer Flussrate von 0,6-0,8 l/min von 2 % Isofluran durch eine Maske aufrecht. Bestätigen Sie die Tiefe der Anästhesie, indem Sie die Zehen einklemmen.
3. Verwenden Sie einen Elektrorasierer, um die Haut über den gesamten Bauch zu rasieren. Befestigen Sie die Ratte in Rückenlage auf dem Operationstisch. Injizieren Sie 2 ml heparinisierte Kochsalzlösung (1.000 U Heparin) über die Vena dorsalis des Penis, um eine systemische Antikoagulation zu erreichen. Desinfizieren Sie die rasierte Haut mit einer Povidon-Jod-Lösung und decken Sie sie mit einem sterilen Tuch ab.
4. Machen Sie mit einer chirurgischen Schere einen kreuzförmigen Schnitt im Bauchraum, legen Sie die Bauchhöhle frei, indem Sie sie mit der hämostatischen Zange dehnen, und drehen Sie die Leber in Richtung Zwerchfell. Äußere den Magen-Darm-Trakt zur rechten Seite des Bauches und bedecke ihn mit feuchter Gaze.
5. Trennen und durchtrennen Sie vorsichtig das Milzband, um den Milzhilum freizulegen.
   HINWEIS: Die Milz, die als rötliche, längliche Struktur mit einer Größe von ca. 3,0 cm x 0,6 cm x 0,6 cm erscheint, ist im linken Bauch zu erkennen.
6. Trennen und legen Sie nach und nach die Arteria hepatica communis, die Arteria gastroduodenalis und die Arteria palzica frei, indem Sie entlang des Milzhilums präparieren. Lizieren und durchtrennen Sie die Arteria gastroduodenalis und die Arteria hepatica communis, während das umgebende Gewebe schrittweise dissoziiert wird.
7. Drehen Sie die Milz zur rechten Seite, um die Bauchschlagader freizulegen. Führen Sie eine stumpfe Dissektion durch und legen Sie die Bauchaorta und den Zöliakie-Rumpf mit Wattestäbchen frei. Legen Sie eine 3-0 Seidennaht von ca. 3 cm Länge über und unter den Ästen des Zöliakiestamms und platzieren Sie eine 6-0 Seidennaht von ca. 10 cm Länge am Ast des Zöliakiestamms.
8. Ligatur der Bauchaorta unterhalb und oberhalb der Äste des Stammes coeliacus. Machen Sie einen kleinen Schnitt am arteriellen Ast. Heben Sie die 6-0-Seidennaht vorsichtig an, führen Sie einen 24-G-Venenkatheter in die Milzarterie entlang des Truncus coeliacus ein, ligatieren und sichern Sie ihn.
9. Infundieren Sie mit einer Spritzenpumpe mit einer Geschwindigkeit von 4 ml/min heparinisierte normale Kochsalzlösung (25 U/ml) mit einem Volumen von 50 mL. Gleichzeitig wird die Pfortader als Abflusskanal durchtrennt, damit die infundierte Flüssigkeit aus der Milz abfließen kann. Das Tier wird durch Ausblutung eingeschläfert.
10. Präparieren Sie vorsichtig das umgebende Gewebe der Milz, um eine Schädigung der Bauchspeicheldrüse zu vermeiden, während die wichtigsten akzessorischen Gefäße erhalten bleiben.
11. Prüfen Sie, ob die Milz undicht ist, entfernen Sie dann die Milz und die Bauchspeicheldrüse und spülen Sie sie mit normaler Kochsalzlösung aus.
    HINWEIS: Milz und Bauchspeicheldrüse von Ratten sind eng miteinander verbunden, wobei sich die Bauchspeicheldrüse um die Milzarterie wickelt. Wenn die Milz separat entfernt wird, kann es schwierig sein, zahlreiche kleine Blutgefäße zu ligieren. Bei diesem Verfahren wird die Milz zusammen mit der Bauchspeicheldrüse entfernt. Nach der Dezellularisation werden Milz und Bauchspeicheldrüse transparent und die Mikrogefäße sind sichtbar, was den Erhalt der Milz mit intakten Blutgefäßen erleichtert.
12. Füllen Sie die Milz in ein 50 mL Zentrifugenröhrchen um, das mit normaler Kochsalzlösung gefüllt ist, und lagern Sie es in einem -80 °C Gefrierschrank.
    HINWEIS: Die Milz und der Venenkatheter, die in die Milzarterie eingeführt werden, werden zusammen kryokonserviert, um eine bequeme Verbindung während der Perfusionsexperimente zu ermöglichen.

2. Milz-Dezellularisierung

1. Wiederholen Sie den Gefrier-Auftau-Zyklus 3x in einem sterilen Behälter, um die Milzzellen zu lysieren.
   HINWEIS: Der Frost-Tau-Zyklus ist eine physikalische Methode, die für die Entzellularisierung von Gerüsten verwendet wird. Das Milzgewebe wird über Nacht zum Einfrieren in einen -80 °C-Gefrierschrank gelegt, dann aus der Tieftemperaturumgebung genommen und zum Auftauen in ein Wasserbad mit Raumtemperatur oder 37 °C gelegt. Dieser Einfrier- und Auftauvorgang wird 3-6 Mal wiederholt, was die Zellmembranen stört und zur Zelllyse führt.
2. Richten Sie ein Perfusionssystem innerhalb einer Reinbank ein, das aus einer Peristaltikpumpe, einem 2-Liter-Reservoir, einem Silikonschlauch mit einem Innendurchmesser von 2,4 mm und einer Blasenfalle besteht (Abbildung 1).
3. Füllen Sie das Perfusionssystem mit deionisiertem Wasser (ddH₂O) und lassen Sie es 10 min lang laufen.
4. Füllen Sie die geerntete Milz vorsichtig in den mit ddH₂O gefüllten Behälter um.
5. Verbinden Sie den Silikonschlauch mit dem Venenkatheter, der in die Milzarterie eingeführt wurde.
6. Beginnen Sie die Perfusion mit ddH₂O mit einer Rate von 2 mL/min für 30 min.
7. Die Perfusion mit ddH₂O mit einer Geschwindigkeit von 4 ml/min für 30 min fortsetzen.
8. Perfusion mit 0,1% (w/v) SDS-Lösung für 4 h.
9. Perfusion mit 1% (v/v) Triton X-100 Lösung für 2 h.
10. Perfundieren Sie 4 Stunden lang mit PBS mit einer Geschwindigkeit von 4 ml/min, um das DSM zu waschen.
    HINWEIS: Verwendung der Peristaltikpumpe für die unidirektionale Perfusion aller Flüssigkeiten.
11. Nachdem die Perfusion abgeschlossen ist, ligatieren und durchtrennen Sie die Gefäßäste zwischen Bauchspeicheldrüse und Milz und entfernen Sie dann die Bauchspeicheldrüse. Lagern Sie das DSM in einem sauberen und verschlossenen 50-ml-Zentrifugenröhrchen, das in PBS mit 10 % Penicillin-Streptomycin bei -20 °C getränkt ist, bis es für zukünftige Experimente verwendet werden kann.

Dieses Protokoll verwendete eine Kombination aus wiederholten Gefrier-Tau-Zyklen und Perfusion mit Dezellularisierungsreagenzien für die Dezellularisierung der Milz von Ratten. Die vollständige Dezellularisation der Milz wurde in ca. 11 h erreicht (Abbildung 2A). Während des Dezellularisierungsprozesses wechselte die Farbe der Milz allmählich von tiefrot zu einem gesprenkelten, hellen Rot und schließlich zu einem weißen, durchscheinenden Aussehen (Abbildung 2B). Die Gesamtmorphologie blieb relativ intakt, mit sichtbaren Gefäßstrukturen (Abbildung 2B).

Die Hämatoxylin-Eosin-Färbung bestätigte die Entfernung zellulärer Komponenten und zeigte eine intakte EZM innerhalb des DSM. Dies steht in krassem Gegensatz zur nativen Milz, wie in Abbildung 3A dargestellt, wo Zellkerne und zytoplasmatische Elemente sichtbar sind. Das Fehlen von Zellen wurde durch die Färbung von 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) und die Messung der Rest-DNA (DSM: 10,1 ± 4 ng/mg Trockengewicht, native Milz: 6.200 ± 300 ng/mg Trockengewicht) weiter bestätigt. Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen zeigten die ultrastrukturelle Charakterisierung des DSM, die nach vollständiger Entfernung von Lymphozyten aus der Milz eine Wabenstruktur zeigte (Abbildung 3C). Dies deutet darauf hin, dass durch die Dezellularisierung der Milz die Ultrastruktur und Architektur der normalen Milz erhalten blieb. Für eine umfassendere Bewertung der entscheidenden EZM-Proteine, die im DSM vorhanden sind, wurden Masson-Trichrom (Abbildung 3B) und Immunfluoreszenzfärbung eingesetzt. Insbesondere wurden Kollagen I (Abbildung 3D) und Fibronektin (Abbildung 3E) für die Analyse ins Visier genommen. Die Ergebnisse zeigten, dass sowohl strukturelle als auch Basalmembrankomponenten der ECM ähnlich wie bei der nativen Milz erhalten blieben.

Abbildung 1: Der Versuchsaufbau. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2: Der Arbeitsablauf der Dezellularisierung und der groben morphologischen Veränderungen. (A) Der Arbeitsablauf bei der Vorbereitung der dezellularisierten Milzmatrix. Die vollständige Dezellularisierung der Milz wurde in ca. 11 h erreicht. (B) Grobe morphologische Veränderungen der Milz während der Erstellung des DSM. Während dieses Prozesses ging die Farbe der Milz allmählich von tiefrot zu einem gesprenkelten, hellen Rot und schließlich zu einem weißen, durchscheinenden Aussehen über. (B) 1. Nach wiederholten Gefrier-Tau-Zyklen und vor der Dezellularisierung. 2. Nach dem Spülen mit entionisiertem Wasser für 1 h. 3. Nach Perfusion mit SDS für 4 h. 4. Nach 2 Stunden Perfusion mit Triton. Abkürzungen: DSM = dezellularisierte Milzmatrix; SDS = Natriumdodecylsulfat; PBS = phosphatgepufferte Kochsalzlösung; PS = Penicillin-Streptomycin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Morphologische Beobachtungen der dezellularisierten Milzmatrix. (A) H&E-Färbung; (B) Masson-Trichrom-Färbung; c) SEM; (D,E) Immunfluoreszenzfärbung von Kollagen I und Fibronektin; (F) DAPI-Färbung. Maßstabsleisten = 50 μm (A, B, D-F), 5 μm (C). Abkürzungen: DSM = dezellularisierte Milzmatrix; H&E = Hämatoxylin-Eosin; REM = Rasterelektronenmikroskopie; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindol. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Die BALs stellen einen wirksamen Ansatz für die Behandlung von Lebererkrankungen im Endstadium dar, insbesondere in Fällen, in denen eine Lebertransplantation durch den derzeitigen Mangel an Spenderorganen behindert^{wird 6}. Eine vielversprechende Option zur Erstellung von BALs ist die Verwendung von DLM, bei der die natürliche EZM und die Gefäßstruktur der nativen Leber erhalten bleiben. Die Knappheit von DLM beim Menschen und die potenziellen Infektions- und Immunogenitätsrisiken, die mit tierischer DLM verbunden sind, stellen jedoch erhebliche Einschränkungen dar. Um dieser Herausforderung zu begegnen, schlagen wir eine neuartige Strategie vor, bei der eine dezellularisierte Milzmatrix (DSM) als alternatives Gerüst für die BALs 8,9,10,11 verwendet wird. Milz ist in verschiedenen klinischen Szenarien leichter zugänglich und weist ähnliche Eigenschaften wie die Leber auf. In dieser Arbeit stellen wir detaillierte Methoden zur Entnahme von Rattenmilz und zur Herstellung von DSM vor, die die Mikrostrukturen und Komponenten der EZM erhalten.

Eine ideale Dezellularisierungsmethode würde zelluläre Komponenten entfernen, während die ursprüngliche Struktur, Zusammensetzung und mechanischen Eigenschaften der EZM erhalten bleiben 12,13,14. Dezellularisierungsmethoden umfassen physikalische, chemische und enzymatische Behandlungen, die jeweils ihre unterschiedlichen Vor- und Nachteile aufweisen¹⁵. Während diese Methoden zelluläre Komponenten teilweise entfernen können, können sie auch die Zusammensetzung, Struktur und Funktionalität der verbleibenden EZM beeinträchtigen. Die Qualität der Dezellularisierung kann durch Variationen der Zelldichte, der Matrixdicke und der Gewebemorphologie über verschiedene Gewebequellen hinweg beeinflusst werden.

Bis heute gibt es keinen Goldstandard für den Dezellularisierungsprozess. In der Regel ist die einfache Anwendung einer dieser Methoden unzureichend, um nachteilige Auswirkungen auf die EZM zu minimieren und die Entfernung des zellulären Inhalts zu maximieren. Folglich hängt der effektivste Ansatz von den Gewebeeigenschaften ab, was eine Kombination dieser Methoden erforderlich macht. In dieser Studie verwendeten wir ein Protokoll, das physikalische Methoden (Gefrier-Tau-Zyklen und Perfusion) mit chemischen Methoden (SDS und TritonX-100) kombinierte, um die Milz von Ratten zu dezellularisieren.

Die Frost-Tau-Zyklen fördern die Zelllyse und die schnelle Ablösung der Zellen von der EZM¹⁶. Gleichzeitig erhöht die Perfusion durch das native Gefäßsystem die Dezellularisierungseffizienz signifikant und bewahrt das ursprüngliche Gefäßnetzwerk¹⁷. Natriumdodecylsulfat (SDS), das als ionisches Detergens fungiert, löst sowohl Zell- als auch Kernmembranen kompetent auf, was zu einer umfassenderen Entfernung von zytoplasmatischen und nuklearen Bestandteilen führt. Dieser Prozess führt jedoch auch zu einer Schädigung der EZM-Ultrastruktur aufgrund der Erschöpfung von Glykosaminoglykanen (GAGs) und Kollagen.

Erhöhte SDS-Konzentrationen korrelierten mit einem verminderten Rest-DNA-Gehalt und einer verringerten mechanischen Festigkeit innerhalb des EZM-Gerüsts. Umgekehrt bewahrten niedrigere SDS-Konzentrationen eine größere Menge an Kollagen und induzierten eine geringere Denaturierung von EZM-Proteinen. Im Gegensatz dazu unterbricht Triton X-100, das als nichtionisches Detergens dient, effektiv die Lipid-Lipid-, Lipid-Protein- und DNA-Protein-Wechselwirkungen und bietet einen milderen Ansatz für die Auflösung der Zellmembran. Dennoch erweist es sich als unzureichend für die vollständige Entfernung von Zellkernen und DNA. Daher muss es mit niedrigen Konzentrationen von SDS und physikalischen Behandlungen kombiniert werden, um die vollständige Entfernung der zellulären Komponenten zu gewährleisten und gleichzeitig die ursprüngliche Struktur, Zusammensetzung und Leistung der EZM zu erhalten. Es ist wichtig zu beachten, dass Reinigungsmittelrückstände eine gewisse Zytotoxizität aufweisen können, so dass nach der Behandlung ein Spülen mit sterilem PBS oder destilliertem Wasser vor der Lagerung erforderlich ist.

Eine Einschränkung dieses Protokolls ist das Fehlen einer Quantifizierung für Rest-SDS und Triton X-100. Diese Entscheidung basiert sowohl auf den Erfahrungen unseres Teams als auch auf bestätigenden Berichten, die darauf hindeuten, dass eine 4-stündige PBS-Wäsche ausreicht, um diese Substanzen effektiv zu entfernen. Darüber hinaus haben unsere früheren Zellkulturexperimente mit diesem Protokoll keine Anzeichen von Zytotoxizität gezeigt. Um die Kosten des Protokolls zu minimieren, wurde bewusst auf die Quantifizierung von Detergenzienresten verzichtet.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses Protokoll eine praktikable Methode zur Herstellung von DSMs darstellt, die Effizienz, Stabilität und minimale Invasivität demonstriert. Die mit diesem Protokoll erstellten DSMs behalten die inhärente Architektur, Zusammensetzung und das natürliche Gefäßnetzwerk der Milz bei. Darüber hinaus bietet es ein Gerüst für die Zellimplantation und dreidimensionale dynamische Kultur und schafft damit eine Grundlage für weiterführende Untersuchungen in der Tissue-Engineering-Leber.

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte deklariert.

Diese Arbeit wurde unterstützt von der National Natural Science Foundation of China (82000624), dem Natural Science Basic Research Program von Shaanxi (2022JQ-899 & 2021JM-268), dem Shaanxi Province Innovation Capability Support Program (2023KJXX-030), dem Shaanxi Province Key R&D Plan University Joint Project-Key Project (2021GXLH-Z-047), der Institutional Foundation of The First Affiliated Hospital of Xi'an Jiaotong University (2021HL-42 & 2021HL-21).