تصنيع مصفوفة الطحال منزوعة الخلايا المشتقة من الفئران

تحمل مصفوفة الطحال منزوعة الخلايا (DSM) تطبيقات واعدة في مجال هندسة أنسجة الكبد. يحدد هذا البروتوكول إجراءات تحضير DSM للفئران ، والتي تشمل حصاد طحال الفئران ، وإزالة الخلايا منها من خلال التروية ، وتقييم DSM الناتج لتأكيد خصائصه.

زراعة الكبد هي العلاج الأساسي لمرض الكبد في المرحلة النهائية. ومع ذلك ، فإن النقص وعدم كفاية جودة الأعضاء المانحة يستلزمان تطوير علاجات بديلة. ظهرت الكبد الاصطناعي الحيوي (BALs) باستخدام مصفوفة الكبد المنزوعة الخلايا (DLM) كحلول واعدة. ومع ذلك ، لا يزال الحصول على DLMs المناسبة يمثل تحديا. تم استكشاف استخدام مصفوفة الطحال منزوعة الخلايا (DSM) كأساس ل BALs ، مما يوفر بديلا متاحا بسهولة. في هذه الدراسة ، تم حصاد طحال الفئران وإزالة الخلايا باستخدام مزيج من دورات التجميد والذوبان والتروية مع كواشف إزالة الخلايا. حافظ البروتوكول على البنى المجهرية ومكونات المصفوفة خارج الخلية (ECM) داخل DSM. استغرقت عملية إزالة الخلايا الكاملة حوالي 11 ساعة ، مما أدى إلى وجود ECM سليم داخل DSM. أكد التحليل النسيجي إزالة المكونات الخلوية مع الاحتفاظ بهيكل ECM وتكوينه. يوفر البروتوكول المقدم طريقة شاملة للحصول على DSM ، ويقدم تطبيقات محتملة في هندسة أنسجة الكبد والعلاج بالخلايا. تساهم هذه النتائج في تطوير مناهج بديلة لعلاج مرض الكبد في المرحلة النهائية.

لا يزال زرع الكبد هو العلاج النهائي الوحيد لمرض الكبد في المرحلة النهائية^1،2،3. ومع ذلك ، فإن النقص الحاد وانخفاض جودة الأعضاء المانحة قد زاد من الحاجة إلى علاجات بديلة⁴. في مجال الطب التجديدي ، ظهرت الكبد الاصطناعي الحيوي (BALs) باستخدام مصفوفة الكبد المنزوعة الخلايا (DLM) كحلول واعدة^5،6،7. يحافظ DLM على بنية الكبد الأصلية ، بما في ذلك شبكة الأوعية الدموية الدقيقة المعقدة ومكونات ECM ، مما يوفر سقالة لإنشاء BALs قابلة للزرع يمكن أن تخفف من أمراض الكبد.

على الرغم من الوعد ، فإن اعتماد هذه التكنولوجيا يواجه تحديات ، لا سيما في الحصول على DLMs المناسبة. هناك نقص في DLMs المشتقة من الإنسان ، في حين أن تلك من مصادر حيوانية تحمل مخاطر انتقال المرض والرفض المناعي. في نهج مبتكر ، استكشف بحثنا استخدام مصفوفة الطحال منزوعة الخلايا (DSM) كأساس ل BALs^8،9،10،11. يتوفر الطحال بسهولة أكبر في حالات طبية مختلفة ، مثل ارتفاع ضغط الدم البابي ، والتمزق الرضحي ، ورفرية نقص الصفيحات مجهول السبب ، والتبرع بعد الموت القلبي. لذلك ، الطحال متاح على نطاق أوسع من الكبد لأغراض البحث. المرضى الذين خضعوا لاستئصال الطحال لا يعانون من حالات قاسية ، مما يؤكد بشكل أكبر إمكانية الاستغناء عن الطحال. البيئة المكروية للطحال ، وخاصة المصفوفة خارج الخلية والجيوب الأنفية ، تشبه تلك الموجودة في الكبد. هذا يجعل الطحال عضوا مناسبا لالتصاق الخلايا وانتشارها في أبحاث زراعة خلايا الكبد. بناء على هذه النتائج ، أظهرت تحقيقاتنا السابقة أن DSMs تشترك في الهياكل المجهرية والمكونات المماثلة مع DLMs ويمكن أن تدعم بقاء ووظيفة خلايا الكبد ، بما في ذلك إنتاج الألبومين واليوريا. علاوة على ذلك ، فقد ثبت أن DSMs تعزز التمايز الكبدي للخلايا الجذعية الوسيطة لنخاع العظم ، مما يؤدي إلى تحسين الوظائف واتساقها.

من خلال استخدام DSMs المعالجة بالهيبارين ، قمنا بتصميم BALs وظيفية قادرة على إظهار منع تخثر الدم الفعال على المدى القصير والتعويض الجزئي لوظائف الكبد¹¹. وبالتالي ، فإن هذا الدليل التشخيصي والإحصائي للاضطرابات النفسية ثلاثي الأبعاد يحمل وعدا كبيرا للنهوض بهندسة أنسجة الكبد والعلاج بالخلايا. في هذا العمل ، نقدم الطرق التفصيلية لحصاد طحال الفئران وإعداد DSM التي تحافظ على الهياكل المجهرية ومكونات ECM.

تمت الموافقة على هذه الدراسة من قبل لجنة أخلاقيات التجارب على بجامعة Xi'an Jiaotong وتم إجراؤها وفقا للمبادئ التوجيهية لرعاية واستخدام المختبر.

1. حصاد الطحال

1. استخدام الفئران الذكور Sprague Dawley التي تزن 250-280 جم. إيواء الفئران في غرف ذات درجة حرارة ورطوبة يتم التحكم فيها ، وتزويدهم بالطعام والماء حسب الطلب ، باستثناء الصيام قبل الجراحة.
2. حقن البوبرينورفين تحت الجلد (0.05 مل / كجم) كمسكن لمدة 1 ساعة قبل العملية. تخدير الفئران عن طريق استنشاق الأيزوفلوران. استخدم معدل تدفق 1.5 لتر / دقيقة من 5٪ إيزوفلوران للتخدير التعريفي في صندوق زجاج شبكي وحافظ على التخدير بمعدل تدفق 0.6-0.8 لتر / دقيقة من 2٪ إيزوفلوران من خلال قناع. تأكيد عمق التخدير عن طريق الضغط على أصابع القدم.
3. استخدم ماكينة حلاقة كهربائية لحلق الجلد على كامل البطن. تأمين الفئران في وضع ضعيف على طاولة الجراحة. حقن 2 مل من محلول ملحي هيبارين (1000 وحدة من الهيبارين) عبر الوريد الظهري للقضيب لتحقيق منع تخثر الدم الجهازي. تطهير الجلد المحلوق بمحلول بوفيدون اليود وتغطيته بقطعة قماش معقمة.
4. قم بعمل شق صليبي باستخدام مقص جراحي في البطن ، وكشف تجويف البطن عن طريق التمدد بالملقط المرقئ ، واقلب الكبد نحو الحجاب الحاجز. قم بإخراج الجهاز الهضمي من الجانب الأيمن من البطن وقم بتغطيته بشاش رطب.
5. افصل بعناية وقطع الرباط الطحال المعدي لفضح الطحال.
   ملاحظة: يمكن التعرف على الطحال ، الذي يظهر كهيكل ممدود محمر ، بحجم 3.0 سم × 0.6 سم × 0.6 سم تقريبا ، في البطن الأيسر.
6. افصل تدريجيا وكشف الشريان الكبدي المشترك والشريان المعدي الاثني عشر والشريان الطحال عن طريق التشريح على طول الهيلوم الطحالي. ربط وقطع الشريان المعدي المعوي والشريان الكبدي المشترك مع فصل الأنسجة المحيطة تدريجيا.
7. اقلب الطحال نحو الجانب الأيمن لكشف الشريان الأورطي البطني. أداء تشريح حادة بلطف وفضح الشريان الأورطي البطني والجذع الاضطرابات الهضمية باستخدام مسحات القطن. ضع خيطا حريريا 3-0 ، طوله حوالي 3 سم ، أعلى وأسفل فروع جذع الاضطرابات الهضمية ، وضع خياطة حريرية 6-0 ، طولها حوالي 10 سم ، عند فرع جذع الاضطرابات الهضمية.
8. رباط الشريان الأورطي البطني أسفل وفوق فروع الجذع الاضطرابات الهضمية. قم بعمل شق صغير في الفرع الشرياني. ارفع الخيط الحريري 6-0 برفق ، وأدخل قسطرة وريدية 24 جراما في الشريان الطحال على طول الجذع البطني ، وقم بتثبيته وتثبيته.
9. باستخدام مضخة حقنة بمعدل 4 مل / دقيقة ، قم بضخ محلول ملحي طبيعي هيبارين (25 وحدة / مل) بحجم 50 مل. في الوقت نفسه ، قم بقطع الوريد البابي كقناة تدفق للسماح للسائل المملوء بالتدفق من الطحال. يتم القتل الرحيم للحيوان عن طريق الاستنزاف.
10. تشريح الأنسجة المحيطة بالطحال بعناية ، وتجنب تلف البنكرياس ، مع الحفاظ على الأوعية الملحقة الرئيسية.
11. تحقق من وجود أي تسرب حول الطحال ، ثم قم بإزالة الطحال والبنكرياس وشطفهما في محلول ملحي طبيعي.
    ملاحظة: يرتبط الطحال والبنكرياس من الفئران ارتباطا وثيقا ، مع التفاف البنكرياس حول الشريان الطحالي. إذا تمت إزالة الطحال بشكل منفصل ، فقد يكون من الصعب ربط العديد من الأوعية الدموية الصغيرة. في هذا الإجراء ، تتم إزالة الطحال مع البنكرياس. بعد إزالة الخلايا ، يصبح الطحال والبنكرياس شفافين وتكون الأوعية الدموية الدقيقة مرئية ، مما يسهل الحفاظ على الطحال بأوعية دموية سليمة.
12. انقل الطحال إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل مملوء بمحلول ملحي عادي وقم بتخزينه في مجمد -80 درجة مئوية.
    ملاحظة: سيتم حفظ الطحال والقسطرة الوريدية التي يتم إدخالها في الشريان الطحال معا للتوصيل المريح أثناء تجارب التروية.

2. إزالة الخلايا من الطحال

1. كرر دورة التجميد والذوبان 3x في وعاء معقم لتحلل خلايا الطحال.
   ملاحظة: دورة التجميد والذوبان هي طريقة فيزيائية تستخدم لإزالة الخلايا من السقالة. يتم وضع أنسجة الطحال في الفريزر -80 درجة مئوية طوال الليل للتجميد ، ثم إزالتها من بيئة درجة الحرارة المنخفضة ووضعها في درجة حرارة الغرفة أو حمام مائي 37 درجة مئوية للذوبان. تتكرر عملية التجميد والذوبان هذه 3-6 مرات ، مما يعطل أغشية الخلايا ويؤدي إلى تحلل الخلايا.
2. قم بإعداد نظام نضح داخل مقعد نظيف يتكون من مضخة تمعجية وخزان سعة 2 لتر وأنبوب سيليكون بقطر داخلي 2.4 مم ومصيدة فقاعات (الشكل 1).
3. املأ نظام التروية بالماء منزوع الأيونات (ddH₂O) واستمر في تشغيله لمدة 10 دقائق.
4. انقل الطحال المحصود بعناية إلى الحاوية المملوءة ddH₂O.
5. قم بتوصيل أنبوب السيليكون بالقسطرة الوريدية التي تم إدخالها في الشريان الطحالي.
6. ابدأ التروية ب ddH₂O بمعدل 2 مل / دقيقة لمدة 30 دقيقة.
7. استمر في التروية باستخدام ddH₂O بمعدل 4 مل / دقيقة لمدة 30 دقيقة.
8. Perfuse مع 0.1٪ (وزن / حجم) حل SDS لمدة 4 ساعات.
9. Perfuse مع 1٪ (v / v) محلول Triton X-100 لمدة 2 ساعة.
10. قم بالإعلاء باستخدام برنامج تلفزيوني بمعدل 4 مل / دقيقة لمدة 4 ساعات لغسل DSM.
    ملاحظة: استخدام المضخة التمعجية للتروية أحادية الاتجاه لجميع السوائل.
11. بعد اكتمال التروية ، قم بربط وعبور فروع الأوعية الدموية بين البنكرياس والطحال ، ثم قم بإزالة البنكرياس. قم بتخزين DSM في أنبوب طرد مركزي نظيف ومختوم سعة 50 مل منقوع في برنامج تلفزيوني يحتوي على 10٪ بنسلين-ستربتومايسين عند -20 درجة مئوية حتى يصبح جاهزا للاستخدام في التجارب المستقبلية.

استخدم هذا البروتوكول مزيجا من دورات التجميد والذوبان المتكررة والتروية مع كواشف إزالة الخلايا لإزالة الخلايا من طحال الفئران. تم تحقيق إزالة الخلايا الكاملة للطحال في حوالي 11 ساعة (الشكل 2 أ). طوال عملية إزالة الخلايا ، انتقل لون الطحال تدريجيا من الأحمر الغامق إلى الأحمر الفاتح المرقش ، وفي النهاية ، مظهر أبيض شفاف (الشكل 2 ب). ظل التشكل العام سليما نسبيا ، مع وجود هياكل وعائية مرئية (الشكل 2 ب).

أكد تلطيخ الهيماتوكسيلين-يوزين إزالة المكونات الخلوية ، وكشف عن ECM سليمة داخل DSM. وهذا يتناقض بشكل صارخ مع الطحال الأصلي، كما هو موضح في الشكل 3 أ، حيث تكون النوى الخلوية والعناصر السيتوبلازمية مرئية. تم تأكيد عدم وجود خلايا بشكل أكبر من خلال تلطيخ 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) وقياس الحمض النووي المتبقي (DSM: 10.1 ± 4 نانوغرام / مجم بالوزن الجاف ، الطحال الأصلي: 6,200 ± 300 نانوغرام / مجم بالوزن الجاف). كشفت الصور المجهرية الإلكترونية الماسحة عن التوصيف الهيكلي لل DSM ، والذي أظهر بنية قرص العسل بعد الإزالة الكاملة للخلايا الليمفاوية من الطحال (الشكل 3C). هذا يشير إلى أن إزالة الخلايا من الطحال حافظت على البنية التحتية للطحال الطبيعي والهندسة المعمارية. لإجراء تقييم أكثر شمولا لبروتينات ECM الحاسمة الموجودة داخل DSM ، تم استخدام Masson trichrome (الشكل 3B) وتلطيخ التألق المناعي. على وجه التحديد ، تم استهداف الكولاجين I (الشكل 3D) والفبرونيكتين (الشكل 3E) للتحليل. أشارت النتائج إلى أنه تم الاحتفاظ بكل من مكونات الغشاء الهيكلي والسفلي ل ECM بشكل مشابه للطحال الأصلي.

الشكل 1: الإعداد التجريبي. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 2: سير عمل إزالة الخلايا والتغيرات المورفولوجية الإجمالية. (أ) سير عمل تحضير مصفوفة الطحال منزوعة الخلايا. تم تحقيق إزالة الخلايا الكاملة للطحال في حوالي 11 ساعة. (ب) التغيرات المورفولوجية الإجمالية للطحال أثناء تحضير DSM. خلال هذه العملية ، انتقل لون الطحال تدريجيا من الأحمر الغامق إلى الأحمر الفاتح المرقش ، وفي النهاية ، مظهر أبيض شفاف. (ب) 1. بعد دورات التجميد والذوبان المتكررة وقبل إزالة الخلايا. 2. بعد الشطف بالماء منزوع الأيونات لمدة 1 ساعة. 3. بعد التروية مع SDS لمدة 4 ساعات 4. بعد التروية مع تريتون لمدة 2 ساعة. الاختصارات: DSM = مصفوفة الطحال decellularized. SDS = كبريتات دوديسيل الصوديوم ؛ PBS = محلول ملحي مخزن بالفوسفات ؛ PS = البنسلين الستربتومايسين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: الملاحظات المورفولوجية لمصفوفة الطحال منزوعة الخلايا. (أ) تلطيخ H& E ؛ (ب) تلطيخ ماسون ثلاثي الألوان؛ (ج) SEM ؛ (د، ه) تلطيخ المناعي للكولاجين الأول والفبرونيكتين ؛ (و) تلطيخ DAPI. قضبان المقياس = 50 ميكرومتر (A ، B ، D-F) ، 5 ميكرومتر (C). الاختصارات: DSM = مصفوفة الطحال decellularized. H&E = الهيماتوكسيلين-يوزين. SEM = المجهر الإلكتروني الماسح ؛ DAPI = 4 '، 6-دياميدينو -2-فينيليندول. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تمثل BALs نهجا فعالا لعلاج أمراض الكبد في المرحلة النهائية ، لا سيما في الحالات التي يعوق فيها زرع الكبد النقص الحالي في الأعضاء المانحة⁶. خيار واعد لإنشاء BALs هو استخدام DLM ، الذي يحافظ على ECM الطبيعي للكبد الأصلي وهيكل الأوعية الدموية. ومع ذلك ، فإن ندرة DLM البشري والمخاطر المحتملة للعدوى والمناعة المرتبطة ب DLM الحيوانية تشكل قيودا كبيرة. لمواجهة هذا التحدي ، نقترح استراتيجية جديدة تتضمن استخدام مصفوفة الطحال منزوعة الخلايا (DSM) كسقالة بديلة ل BALs^8،9،10،11. يمكن الوصول إلى الطحال بسهولة أكبر في سيناريوهات سريرية مختلفة ويظهر خصائص مماثلة للكبد. في هذا العمل ، نقدم طرقا مفصلة لحصاد طحال الفئران وإعداد DSM التي تحافظ على الهياكل المجهرية ومكونات ECM.

ستؤدي طريقة إزالة الخلايا المثالية إلى إزالة المكونات الخلوية مع الحفاظ على الهيكل الأصلي والتكوين والخصائص الميكانيكية ل ECM^12،13،14. تشمل طرق إزالة الخلايا العلاجات الفيزيائية والكيميائية والأنزيمية ، ولكل منها مزاياها وعيوبها^{المميزة 15}. في حين أن هذه الطرق يمكن أن تزيل المكونات الخلوية جزئيا ، إلا أنها قد تضر أيضا بتكوين وهيكل ووظائف ECM المتبقية. يمكن أن تتأثر جودة إزالة الخلايا بالاختلافات في كثافة الخلية وسمك المصفوفة ومورفولوجيا الأنسجة عبر مصادر الأنسجة المختلفة.

حتى الآن ، لا يوجد معيار ذهبي لعملية إزالة الخلايا. عادة ما يكون مجرد استخدام أي من هذه الطرق غير كاف لتقليل الآثار الضارة على ECM وزيادة إزالة المحتوى الخلوي. وبالتالي ، فإن النهج الأكثر فعالية يعتمد على خصائص الأنسجة ، مما يستلزم مزيجا من هذه الأساليب. في هذه الدراسة ، استخدمنا بروتوكولا يجمع بين الطرق الفيزيائية (دورات التجميد والذوبان والتروية) مع الطرق الكيميائية (SDS و TritonX-100) لإزالة الخلايا من طحال الفئران.

تعزز دورات التجميد والذوبان تحلل الخلايا والانفصال السريع للخلايا عن ECM¹⁶. في الوقت نفسه ، يعزز التروية من خلال الأوعية الدموية الأصلية بشكل كبير كفاءة إزالة الخلايا ويحافظ على شبكة الأوعية الدموية الأصلية¹⁷. تعمل كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) ، التي تعمل كمنظف أيوني ، على إذابة كل من الأغشية الخلوية والنووية ببراعة ، مما يؤدي إلى إزالة أكثر شمولا للمكونات السيتوبلازمية والنووية. ومع ذلك ، فإن هذه العملية تلحق الضرر أيضا بالبنية التحتية ECM بسبب استنفاد الجليكوزامينوجليكان (GAGs) والكولاجين.

ترتبط التركيزات المرتفعة من SDS بانخفاض محتوى الحمض النووي المتبقي وانخفاض القوة الميكانيكية داخل سقالة ECM. على العكس من ذلك ، حافظت التركيزات المنخفضة من SDS على كمية أكبر من الكولاجين وتسببت في تمسخ أقل لبروتينات ECM. في المقابل ، يعمل Triton X-100 ، الذي يعمل كمنظف غير أيوني ، بشكل فعال على تعطيل تفاعلات الدهون والدهون والبروتين الدهني والبروتين الدهني وبروتين الحمض النووي ، مما يوفر نهجا أكثر اعتدالا لإذابة غشاء الخلية. ومع ذلك ، فإنه يثبت أنه غير كاف للإزالة الكاملة لنوى الخلية والحمض النووي. لذلك ، يجب دمجه مع تركيزات منخفضة من SDS والعلاجات الفيزيائية لضمان الإزالة الكاملة للمكونات الخلوية مع الحفاظ على الهيكل الأصلي والتكوين والأداء ل ECM. من المهم ملاحظة أن المنظفات المتبقية يمكن أن يكون لها سمية خلوية معينة ، لذا فإن الشطف بعد المعالجة باستخدام برنامج تلفزيوني معقم أو ماء مقطر ضروري قبل التخزين.

أحد قيود هذا البروتوكول هو عدم وجود تقدير كمي ل SDS المتبقية و Triton X-100. يتم إبلاغ هذا القرار من خلال كل من خبرة فريقنا والتقارير المؤيدة ، والتي تشير إلى أن غسل PBS لمدة 4 ساعات يكفي لإزالة هذه المواد بشكل فعال. علاوة على ذلك ، لم تظهر تجاربنا السابقة لزراعة الخلايا التي تستخدم هذا البروتوكول أي علامات على السمية الخلوية. لتقليل نفقات البروتوكول ، تم اتخاذ خيار متعمد للتخلي عن القياس الكمي للمنظفات المتبقية.

في الختام ، يقدم هذا البروتوكول طريقة مجدية لإعداد DSMs ، مما يدل على الكفاءة والاستقرار والحد الأدنى من الغزو. تحافظ DSMs التي تم إعدادها باستخدام هذا البروتوكول على بنية الطحال المتأصلة وتكوينه وشبكة الأوعية الدموية الطبيعية. علاوة على ذلك ، فإنه يوفر سقالة لزرع الخلايا والثقافة الديناميكية ثلاثية الأبعاد ، وبالتالي إنشاء أساس لتطوير التحقيقات في الكبد المصمم للأنسجة.

ولم يعلن صاحبا البلاغ عن أي تضارب في المصالح.

تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (82000624) ، وبرنامج البحوث الأساسية للعلوم الطبيعية في شنشي (2022JQ-899 و 2021JM-268) ، وبرنامج دعم القدرة على الابتكار في مقاطعة شنشي (2023KJXX-030) ، والمشروع المشترك لجامعة خطة البحث والتطوير الرئيسية لمقاطعة شنشي - المشروع الرئيسي (2021GXLH-Z-047) ، والتأسيس المؤسسي لأول مستشفى تابع لجامعة شيان جياوتونغ (2021HL-42 و 2021HL-21).