Method Article
In dieser Studie wurde eine neuartige Genexpressions- und Geneditierungsmethode, die durch Agrobacterium vermittelt wird, in Bambus entwickelt. Diese Methode verbesserte die Effizienz der Genfunktionsvalidierung bei Bambus erheblich, was erhebliche Auswirkungen auf die Beschleunigung des Prozesses der Bambuszüchtung hat.
Für Bambus wurde eine neuartige In-Planta-Gentransformationsmethode entwickelt, die zeit- und arbeitsintensive Kallusinduktions- und Regenerationsprozesse vermeidet. Diese Methode beinhaltet die Agrobacterium-vermittelte Genexpression durch Verwundung und Vakuum für Bambussetzlinge. Es wurde erfolgreich die Expression von exogenen Genen wie dem RUBY-Reporter und dem Cas9-Gen in Bambusblättern nachgewiesen. Die höchste Transformationseffizienz für die Akkumulation von Betalain in RUBY-Sämlingen wurde mit dem Stamm GV3101 mit einem Prozentsatz von 85,2 % nach der Infektion erreicht. Obwohl sich die fremde DNA nicht in das Bambusgenom integrierte, war die Methode effizient bei der Expression der exogenen Gene. Darüber hinaus wurde mit dieser Methode auch ein Gen-Editing-System mit einem nativen Reporter entwickelt, aus dem eine durch das editierte Bambus-Violaxanthin-De-Epoxidase-Gen (PeVDE) erzeugte in Bambusblättern eine In-situ-Mutante mit einer Mutationsrate von 17,33 % erzeugte. Die Mutation von PeVDE führte zu verringerten nicht-photochemischen Quenching-Werten (NPQ) unter starkem Licht, die mit einem Fluorometer genau nachgewiesen werden können. Dies macht den editierten PeVDE zu einem potentiellen nativen Reporter sowohl für exogene als auch für endogene Gene in Bambus. Mit dem Reporter von PeVDE wurde ein Cinnamoyl-CoA-Reduktase-Gen mit einer Mutationsrate von 8,3% erfolgreich editiert. Durch diese Operation wird der Prozess der Gewebekultur oder der Kallusinduktion vermieden, was für die Expression exogener Gene und die endogene Geneditierung in Bambus schnell und effizient ist. Diese Methode kann die Effizienz der Überprüfung der Genfunktion verbessern und dazu beitragen, die molekularen Mechanismen wichtiger Stoffwechselwege in Bambus aufzudecken.
Die Untersuchung der Genfunktion in Bambus ist vielversprechend für das fortgeschrittene Verständnis von Bambus und die Erschließung seines Potenzials für genetische Modifikationen. Ein effektiver Weg hierfür kann durch den Prozess der Agrobacterium-vermittelten Infektion in Bambusblättern erreicht werden, bei dem das T-DNA-Fragment, das exogene Gene enthält, in die Zellen eingebracht wird, was anschließend zur Expression der Gene in den Blattzellen führt.
Bambus ist ein wertvoller und nachwachsender Rohstoff mit einem breiten Anwendungsspektrum in Fertigung, Kunst und Forschung. Bambus besitzt hervorragende Holzeigenschaften wie hohe mechanische Festigkeit, Zähigkeit, mäßige Steifigkeit und Flexibilität1, die heute in einer Vielzahl von Haushalts- und Industrieartikeln weit verbreitet sind, darunter Zahnbürsten, Strohhalme, Knöpfe, Einweggeschirr, unterirdische Rohrleitungen und Kühlturmfüller für die thermische Stromerzeugung. Daher spielt die Bambuszüchtung eine entscheidende Rolle bei der Gewinnung von Bambussorten mit hervorragenden Holzeigenschaften, um Kunststoffe zu ersetzen und den Kunststoffverbrauch zu reduzieren, die Umwelt zu schützen und den Klimawandel zu bekämpfen sowie einen erheblichen wirtschaftlichen Wert zu generieren.
Die traditionelle Bambuszüchtung steht jedoch aufgrund der langen vegetativen Wachstumsphase und der unsicheren Blütezeit vor Herausforderungen. Obwohl molekulare Züchtungstechniken entwickelt und auf die Bambuszüchtung angewendet wurden, ist der Prozess der Bambus-Gentransformation aufgrund der Kallusinduktions- und Regenerationsprozesse zeitaufwändig, arbeitsintensiv und kompliziert 2,3,4,5. Eine stabile genetische Transformation erfordert oft Agrobacterium-vermittelte Methoden, die Gewebekulturprozesse wie Kallusinduktion und Regeneration beinhalten. Bambus hat jedoch eine geringe Fähigkeit zur Kallusregeneration, was die Anwendung einer stabilen genetischen Transformation in Bambus stark einschränkt. Nachdem Agrobacterium Pflanzenzellen infiziert hat, dringt das T-DNA-Fragment in die Pflanzenzellen ein, wobei die Mehrheit der T-DNA-Fragmente nicht in die Zellen integriert bleibt, was zu einer vorübergehenden Expression führt. Nur ein kleiner Teil der T-DNA-Fragmente integriert sich zufällig in sein Chromosom, was zu einer stabilen Expression führt. Die transienten Expressionsniveaus zeigen eine Akkumulationskurve, die für jedes Gen, das aus einer von Agrobacterium gelieferten T-DNA exprimiert wird, variieren kann. In den meisten Fällen treten die höchsten Expressionsniveaus 3-4 Tage nach der Infiltration auf und nehmen nach 5-6 Tagen schnell ab 6,7. Frühere Studien haben gezeigt, dass mehr als 1/3 der Mutationen in geneditierten Pflanzen, die ohne Selektionsdruck für Resistenz erhalten wurden, auf die vorübergehende Expression von CRISPR/Cas9 zurückzuführen sind, während die restlichen weniger als 2/3 auf eine stabile Expression nach der DNA-Integration in das Genom zurückzuführensind 8. Dies deutet darauf hin, dass die Integration von T-DNA in das Pflanzengenom für die Genomierung nicht notwendig ist. Darüber hinaus hemmt der Selektionsdruck für Resistenzen das Wachstum nicht-transgener Zellen signifikant, was sich direkt auf den Regenerationsprozess infizierter Explantate auswirkt. Daher ist es möglich, durch die Verwendung einer transienten Expression ohne Selektionsdruck für Resistenz in Bambus eine nicht-integrierte Expression exogener Gene zu erreichen und die Genfunktion direkt in pflanzlichen Organen zu untersuchen. Somit kann eine einfache und zeitsparende Methode zur exogenen Genexpression und -editierung in Bambus9 entwickelt werden.
Die entwickelte exogene Genexpressions- und Geneditierungsmethode zeichnet sich durch ihre Einfachheit, Kosteneffizienz und den Verzicht auf teure Geräte oder komplexe Verfahren aus9. Bei dieser Methode wurde das endogene Violaxanthin-De-Epoxidase-Gen (PeVDE) aus Bambus als Reporter für die exogene Genexpression ohne Selektionsdruck verwendet. Dies liegt daran, dass das editierte PeVDE in Bambusblättern die Lichtschutzfähigkeit bei starkem Licht reduziert und eine Abnahme des nicht-photochemischen Quenching-Wertes (NPQ) zeigt, der durch Chlorophyll-Fluoreszenz-Bildgebung nachgewiesen werden kann. Um die Wirksamkeit dieser Methode zu demonstrieren, wurde ein weiteres endogenes Bambusgen, das Cinnamoyl-CoA-Reduktase-Gen (PeCCR5)9, mit diesem System ausgeschaltet und erfolgreich Mutanten dieses Gens erzeugt. Diese Technik kann für die funktionelle Charakterisierung von Genen verwendet werden, die Funktionen in Bambusblättern haben. Durch die vorübergehende Überexpression dieser Gene in Bambusblättern können ihre Expressionsniveaus erhöht werden, oder durch Gen-Editierung kann ihre Expression reduziert werden, was die Untersuchung von nachgeschalteten Genexpressionsniveaus, Blattphänotypen und Produktinhalten ermöglicht. Dies bietet einen effizienteren und praktikableren Ansatz für die Erforschung von Genfunktionen in Bambus. Diese Technik kann auf die funktionelle Charakterisierung von Genen angewendet werden, die in Bambusblättern funktionieren. Durch die vorübergehende Überexpression dieser Gene in Bambusblättern können ihre Expressionsniveaus erhöht werden, oder durch Gen-Editierung kann ihre Expression reduziert werden, was die Untersuchung von nachgeschalteten Genexpressionsniveaus, Blattphänotypen und Produktinhalten ermöglicht. Darüber hinaus ist es wichtig zu beachten, dass aufgrund der umfangreichen Polyploidisierung die Mehrheit der kommerziell wichtigen Gene in Bambusgenomen in mehreren Kopien vorhanden ist, was zu genetischer Redundanz führt. Dies stellt eine Herausforderung für die Durchführung der Multiplex-Genom-Editierung in Bambus dar. Vor der Anwendung stabiler genetischer Transformations- oder Geneditierungstechniken ist es entscheidend, Genfunktionen schnell zu validieren. Bei der Lösung des Problems der Mehrfachkopien besteht ein Ansatz darin, Transkriptomexpressionsprofile zu analysieren, um Gene zu identifizieren, die in bestimmten Stadien aktiv exprimiert werden. Darüber hinaus ermöglicht das Targeting der konservierten funktionellen Domänen dieser Genkopien das Design gemeinsamer Zielsequenzen oder den Einbau mehrerer Zielstellen in denselben CRISPR/Cas9-Vektor, was den gleichzeitigen Knockout dieser Gene ermöglicht. Dies bietet einen effizienteren und praktikableren Ansatz für die Erforschung von Genfunktionen in Bambus.
1. Vorbereitung von Bambussetzlingen
2. Herstellung von Plasmiden und Agrobacterium
3. Agrobacterium-vermittelt im Planta-Transformationssystem
4. Design von Single Guide RNAs (sgRNAs) für die Geneditierung
5. Primer-Design und PCR
6. DNA-Extraktion, Endonuklease-Enzymverdau und Sequenzierung
7. Messung der Chlorophyllfluoreszenz von NPQ-Werten in Blättern
Agrobacterium-vermittelt in der planta-Genexpression in Bambusblättern
Es hat sich gezeigt, dass das RUBY-Reportergen bei der Visualisierung der transienten Genexpression wirksam ist, da es in der Lage ist, leuchtend rotes Betalain aus Tyrosin10 zu produzieren. In dieser Studie wurde die Agrobacterium-vermittelte Transformation genutzt, um das exogene Ruby-Gen vorübergehend in Bambusblättern zu exprimieren (Abbildung 1). Am 3. Tag nach der Infektion wurde bei den unreifen gefalteten Blättern eine rote Färbung beobachtet, die am 5. Tag nach der Entfaltung der Blätter lebhafter wurde (blaues Dreieck, Abbildung 1C). Diese Ergebnisse zeigen, dass Agrobacterium erfolgreich die Expression des exogenen Ruby-Gens in Bambusblättern vermittelt hat und dass eine Betalainsynthese stattgefunden hat.
Darüber hinaus wurden vier Stämme von Agrobacterium (AGL1, LBA4404, EHA105 und GV3101) verglichen und es wurde festgestellt, dass der GV3101-Stamm die signifikanteste Betalain-Akkumulation in infizierten Bambusblättern verursachte, wobei der höchste Prozentsatz von 85,2 % der Keimlinge Betalain nach der Infektion akkumulierte, gefolgt von AGL1 (76,9 %) und dann EHA105 (49,1 %) und LBA4404 (31,3 %; Abbildung 1D). Dies deutet darauf hin, dass GV3101 die am besten geeignete Sorte für diesen Zweck ist. Es wurde eine High-Fidelity-PCR durchgeführt, um festzustellen, ob sich das Agrobacterium-vermittelte T-DNA-Fragment in das Bambuschromosom integriert hatte. Nach 40 PCR-Zyklen wurden keine Banden des Ruby-Gens nachgewiesen, was darauf hindeutet, dass das T-DNA-Fragment nicht oder nur in einer so geringen Anzahl integriert war, dass es nicht nachgewiesen werden konnte. Diese Ergebnisse schließen daraus, dass diese Genexpression vorübergehend ist.
Insgesamt zeigen diese Ergebnisse die Machbarkeit der Agrobacterium-vermittelten transienten Genexpression in planta in Bambus unter Verwendung des RUBY-Reportergens . Die rote Betalain-Farbe erwies sich jedoch als instabil und verschwand nach 3 Monaten der Infektion, was darauf hindeutet, dass das transiente Expressionssystem für die Langzeitbeobachtung nicht stabil ist.
In planta Gen-Editierung des Bambus-Violaxanthin-De-Epoxidase-Gens (PeVDE)
Die Agrobacterium-vermittelte Genexpression in planta ist eine transiente Methode der Genexpression in Bambus. Um zu untersuchen, ob ein transientes CRISPR/Cas9-System eine Gen-Editierung in Bambusblättern erreichen kann, wurde das Schlüsselenzym im Xanthophyll-Zyklus von Bambus, die Violaxanthin-De-Epoxidase (PeVDE), als Ziel für die Versuchs-Geneditierung ausgewählt. Single guide RNAs (sgRNAs) wurden auf dem ersten Exon des PeVDE-Gens (sgRNA-1) entworfen, das Restriktionsstellen des AltersI stromaufwärts des Protospacer-Nachbarmotivs (PAM) enthält, um die Validierung der Geneditierung zu erleichtern (Abbildung 2A).
Das CRISPR/Cas9-Konstrukt, das sgRNA-1 trägt, wurde in Agrobacterium transfiziert, um Bambusblätter zu transformieren. Nach 5-tägiger Infektion des Agrobakteriums, das die CRISPR/Cas9-Konstrukte enthält, die sgRNA-1 tragen, wurden die Bambuskeimlinge einer Hochlichtbehandlung unterzogen und anschließend ein Chlorophyll-Fluoreszenzparameter-Nachweis durchgeführt. Es wurden bestimmte Bereiche der Blattspreiten gefunden, die niedrigere nicht-photochemische Quenching-Werte (NPQ) aufwiesen (Abbildung 2B), was darauf hindeutet, dass die Lichtschutzfähigkeit dieser Bereiche unter intensivem Licht reduziert war. Da das PeVDE-Gen die Fähigkeit hat, überschüssige absorbierte Lichtenergie abzuleiten13, sind diese Bereiche mit niedrigeren NPQ-Werten wahrscheinlich die Regionen, in denen das PeVDE-Gen editiert wurde. Anschließend wurde eine Enzymverdauungs- und Sequenzierungsanalyse des PeVDE-Genfragments in diesen Bereichen der Blattspreiten durchgeführt (Abbildung 2C-D), und es wurde festgestellt, dass die Mutationsrate von sgRNA-1 17,33 % betrug, was darauf hindeutet, dass die Geneditierung in diesen Bereichen des PeVDE-Gens erfolgreich war.
Darüber hinaus wurde eine weitere sgRNA-Targeting-Stelle, sgRNA-2, die eine XbaI-Restriktionsstelle enthält, auf dem ersten Exon von PeVDE entworfen. Um die Möglichkeit einer langen Fragmentdeletion mit dualem sgRNA-Targeting zu untersuchen, wurde eine Geneditierung an beiden Zielstellen durchgeführt, was zu einer langen Fragmentdeletion führte (Abbildung 2E).
Editierte PeVDE-Mutante , die als Reporter im transienten Gen-Editing-System verwendet wird
Es wurde untersucht, ob die PeVDE-sgRNA als Reporter im transienten Geneditierungssystem dienen könnte. Das Cinnamoyl-CoA-Reduktase-Gen (PeCCR5) (Gen-ID: PH02Gene42984.t1) wurde zufällig ausgewählt, um den PeVDE-Reporter zu evaluieren . Ein sgRNA-Target für PeCCR5 wurde in seinem konservierten Motiv auf dem vierten Exon entworfen. Das CRISPR/Cas9-Konstrukt, das beide sgRNAs, PeVDE und PeCCR5, trägt, wurde in Bambusblätter umgewandelt (Abbildung 3A).
Nach einer 30-tägigen Agrobacterium-Infektion wurden die Sämlinge 20 Minuten lang mit hochintensivem Licht behandelt. Es wurde beobachtet, dass nur die Blattbereiche, die für das PeCCR5-Gen editiert wurden, keinen Einfluss auf die NPQ-Werte hatten, während die Blattbereiche, die mit sgRNAs von PeVDE und PeCCR5 transfiziert wurden, niedrigere NPQ-Werte aufwiesen (Abbildung 3B).
Anschließend wurde das PeCCR5-Fragment aus den Blattbereichen mit niedrigeren NPQ-Werten amplifiziert und sequenziert und fand mittels Tiefensequenzierung eine Mutationseffizienz von 8,3%. Daher diente der PeVDE-Reporter erfolgreich als transienter Gen-Editing-Reporter und kann zum Screening auf Gen-Editierung anderer endogener Bambus-Gene verwendet werden.
Insgesamt zeigen diese Ergebnisse die Machbarkeit der Bambus-Gen-Editierung mit CRISPR/Cas9 in Bambus.
Abbildung 1: In-planta-Expression des Ruby-Gens und der Betalain-Akkumulation in Moso-Bambusblättern. (A) Moso-Bambus-Sämlinge, die in Alufolie eingewickelt und bereit für eine Agrobacterium-Infektion sind, mit roten Dreiecken, die Positionen anzeigen, die durch eine scharfe Nadel aus einer Spritze verletzt wurden. (B) Vakuum-Infiltrationsprozess von Bambussetzlingen. (C) Betalain-Akkumulation in Bambusblättern nach 3 Tagen der Infektion, beobachtet durch phänotypische Veränderungen. (D) Hier wurde mit vier Agrobacterium-Stämmen, AGL1, LBA4404, EHA105 und GV3101, eine RUBY-Gentransformation in Bambusblättern durchgeführt. GV3101 mit dem GFP-Konstrukt wurde als Negativkontrolle verwendet. Diese Zahl wurde von9 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: In-planta-Expression und Gen-Editierung des PeVDE-Gens in Bambusblättern . (A) Orts- und Zielsequenzinformationen der sgRNA im PeVDE-Gen . Rote Dreiecke zeigen die Positionen der Vorwärts- und Rückwärtsprimer für die Fragmentverstärkung an. (B) NPQ und Rohbildgebung von Bambusblättern nach Infektion. Die Zahlen im NPQ-Bild stellen NPQ-Werte im Monitor der Bildverarbeitungssoftware dar. (C) Elektrophorese-Ergebnisse des PeVDE-Fragments vor und nach dem Age-I-Verdau. WT bezeichnet die nicht infizierten Wildtyp-Blätter, und + und - stehen für PeVDE-Fragmente mit bzw. ohne Age-I-Verdauung. (D) Tiefensequenzierungsergebnisse des PeVDE-Fragments in Blättern mit niedrigerem NPQ-Wert. Die roten, blauen und grauen Schriftarten in den Sequenzen stellen die Zielsites, PAM bzw. Einfügungen dar. Die roten Striche zeigen gelöschte Nukleotide an. (E) Sanger-Sequenzierungsergebnisse des PeVDE-Fragments nach Editierung mit sgRNA-1 und sgRNA-2. Diese Zahl wurde von9 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: PeVDE-sgRNA als Reporter für das Screening der Gen-Editierung von PeCCR5. (A) Schematische Darstellung von CRISPR/Cas9-Konstrukten, die PeVDE- und PeCCR5-sgRNAs enthalten. (B) NPQ und Rohbilder von Bambusblättern nach Infektion mit den Konstrukten in (A). Weiße Dreiecke kennzeichnen Bereiche mit niedrigeren NPQ-Werten. Die Regenbogenfarbe stellt den Wert von NPQ/4 dar, wobei Rot dem Minimalwert und Violett 1 entspricht. (C) Die roten, blauen und grauen Schriftarten in den Sequenzen stellen die Zielseiten, PAM bzw. Einfügungen dar. Die roten Striche zeigen gelöschte Nukleotide an. Diese Zahl wurde von9 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Name des Gens | Primer-Sequenz (5'-3') | Anwendung | ||
RUBINROT | F: ATGGATCATGCGACCCTCG | Zur PCR-Amplifikation in infizierten Bambusblättern | ||
R: GTACTCGTAGAGCTGCTGCAC | ||||
PeVDE | F: TGTGGCTTCTAAAGCTCTGCAATCT | Für die Klonierung und Sequenzierung von Genen | ||
R: TGTCAATGCTACAAGTCCTGGCA | ||||
PeVDE-Target1 | F: GGCATAGCCCTCACGCAGCACCGG | Für die Entwicklung des PeVDE-sgRNA-1-Targets | ||
R: AAACCCGGTGCTGCGTGAGGGCTA | ||||
PeVDE-Target2 | F: GGCACTCCACGGTCCCAAATCTAG | Für die Entwicklung von PeVDE sgRNA-2-Targets | ||
R: AAACCTAGATTTGGGACCGTGGAG | ||||
PeCCR5-Target | F: GGCACTGGTACTGCTACGCTAAGA | Für die Entwicklung des PeCCR5 sgRNA-Targets | ||
R: AAACTCTTAGCGTAGCAGTACCAG |
Tabelle 1: Die Sequenzinformationen von Primern.
Diese Methode reduziert den Zeitaufwand im Vergleich zu herkömmlichen genetischen Transformationsmethoden, die in der Regel 1-2 Jahre dauern, erheblich und erreicht eine vorübergehende Expression exogener Gene und eine Genom-Editierung endogener Gene innerhalb von 5 Tagen. Diese Methode hat jedoch ihre Grenzen, da sie nur einen kleinen Teil der Zellen transformieren kann und die geneditierten Blätter chimärisch sind und nicht in der Lage sind, sich zu vollständigen Pflanzen zu regenerieren. Nichtsdestotrotz bietet diese in planta Genexpressions- und Gen-Editing-Technologie einen leistungsfähigen Ansatz für die funktionelle Verifizierung endogener Bambusgene.
Derzeit können die Genexpression und die Geneditierungstechnologie in planta nur in unreifen (gerollten) Blättern durchgeführt werden, nicht in reifen Blättern. Wenn sich die Blätter entfalten und vergrößern, steigt die Anzahl der geneditierten Zellen, die sich teilen, was eine Gen-Editierung in bestimmten Blattregionen ermöglicht. Die verwendete Agrobacterium-vermittelte Transformationsmethode führt jedoch nicht zu einer Insertion der exogenen T-DNA in das Bambuschromosom, was es schwierig macht, stabile Markergene in Bambuszu verwenden 6,9. Daher ist es schwierig, die genauen Standorte dieser Regionen zu bestimmen. Um dieses Problem anzugehen, wurde das PeVDE-Gen editiert, und der editierte Bereich zeigte eine verminderte Lichtschutzfähigkeit unter Starklichtbehandlung, was durch niedrigere NPQ-Werte angezeigt wird, die mit einem Chlorophyll-Fluorometer-Imaging-PAM leicht nachgewiesen werden können. So wurde PeVDE als Marker in Bambus entwickelt, um das Auftreten von exogener Genexpression und Geneditierung nachzuweisen. Aufgrund der hohen Konservierung dieses Gens über verschiedene Arten hinweg 13 kann es auch auf andere Pflanzen übertragen werden.
Durch die Ablagerung einer kutikulären Wachsschicht auf der Epidermis von Bambusblättern, gepaart mit der charakteristischen gekräuselten und eng umwickelten Morphologie unreifer Blätter, ist die Zugänglichkeit von Agrobacterium zu Blattzellen erheblich erschwert. Um die Wirksamkeit der Agrobacterium-Infektion zu verbessern, wurden physikalische Ansätze, einschließlich Wund- und Vakuuminfiltration, eingesetzt, um das Eindringen von Agrobacterium in die eingeschlossenen gekräuselten Bambusblätter zu fördern. Dieser Prozess ermöglicht eine unmittelbare Nähe zwischen Agrobacterium und den Blattzellen und erhöht so die Effizienz der genetischen Transformation. In der Zwischenzeit war dieses Gen-Editierungssystem bisher auf Bambusblätter beschränkt und kann nicht in Organen mit Fortpflanzungsfähigkeit wie Samen und Seitenknospen exprimiert werden, die an die nächste Generation vererbt werden können. Zukünftige Anwendungen der Technik werden optimiert, um eine in-planta-Genexpression und Gen-Editing-Technologie in reproduktionsfähigen Organen zu erreichen, mit dem Ziel, stabil vererbbare regenerierende Pflanzen zu erhalten.
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden Interessen haben.
Die Autoren danken dem National Key Research and Development Program of China (Grant No. 2021YFD2200502), der National Natural Science Foundation of China (Grant No. 31971736) für die finanzielle Unterstützung.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
35S::RUBY | Addgene, United States | 160908 | Plamid construct |
Agrobacterium competent cells of GV3101, EHA105,LBA4404, and AGL1 | Biomed, China | BC304-01, BC303-01, BC301-01, and BC302-01 | For Agrobacterium infection |
CTAB | Sigma-Aldrich, United States | 57-09-0 | DNA extraction |
Imaging-PAM fluorometer | Walz, Effeltrich, Germany | Detect chlorophyll fluorescence of bamboo leaves | |
ImagingWin | Walz, Effeltrich, Germany | Software for Imaging-PAM fluorometer | |
Paq CI or Aar I | NEB, United States | R0745S | Incorporate the target sequence onto the CRISPR/Cas9 vector. |
PrimeSTAR Max DNA polymerase | Takara, Japan | R045Q | For gene cloning |
T4 DNA ligase | NEB, United States | M0202V | Incorporate the target sequence onto the CRISPR/Cas9 vector. |
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