Method Article
Dieses Protokoll ermöglicht die Visualisierung der Genexpression in embryonalen Astyanax Cavefish. Dieser Ansatz wurde mit dem Ziel der Maximierung der gen-Expression-Signal, bei gleichzeitiger Minimierung der unspezifischen Hintergrundfärbung entwickelt.
In den letzten Jahren wurde eine Entwurf Genom für die blinde mexikanischen Cavefish (Astyanax Mexicanus) freigegeben, enthüllt die Sequenz Identitäten für Tausende von Genen. Frühere Forschung in diesem aufstrebenden Modellsystem aktiviert auf umfassende genomweite Untersuchungen, die zahlreiche quantitative Trait Loci (QTL) verbunden mit verschiedenen Höhle verbundenen Phänotypen identifiziert haben. Die Möglichkeit, Gene von Interesse, die erbliche Grundlage für phänotypische Veränderung verbinden bleibt jedoch eine große Herausforderung dar. Eine Technik, die tieferes Verständnis für die Rolle der Entwicklung in der Troglomorphic Evolution erleichtern kann, ist vollständig-hängen in-situ-Hybridisierung. Diese Technik kann implementiert werden, um direkt vergleichen Genexpression zwischen Höhle und Oberfläche Wohnformen, Anwärter Gene zugrunde liegenden etablierten QTL, Gene Interesse von Next Generation Sequencing Studien zu identifizieren oder entwickeln andere Entdeckung-basierte Ansätze. In diesem Bericht stellen wir ein einfaches Protokoll, unterstützt durch eine flexible Checkliste, die für den Einsatz auch außerhalb des Studiensystems der vorgestellten weit angepasst werden kann. Es ist zu hoffen, dass dieses Protokoll für die Astyanax Gemeinschaft und darüber hinaus als eine umfassende Ressource dienen kann.
In-situ Hybridisierung ist eine gängige Methode zur Färbung von festen Gewebe um gen-Expression-Muster1zu visualisieren. Diese Technik ist seit Jahren in anderen traditionellen2 und nicht-traditionellen3 -Modellsysteme, für eine Vielzahl von biologischen Studien durchgeführt. Allerdings sind mehrere Schritte und Reagenzien notwendig, um dieses Verfahren erfolgreich durchführen. Für Forscher, die diese Technik noch nie durchgeführt haben, kann es aufgrund der vielen Schritte einschüchternd sein, den Prozess zu initiieren. Weiter, die langwierige Natur dieses Verfahren eignet sich für technische Fehler, die schwierig sein können, um zu beheben.
Das übergeordnete Ziel dieses Artikels ist es, eine einfache und unkomplizierte Methode vorstellen, die diese Hybridisierung-Technik für ein breites Publikum zugänglich machen wird. Um die Einführung von Fehlern zu reduzieren, stellen wir eine einfache Lösung, die liefert hochwertige gen Ausdruck Färbung und unspezifische Hintergrundsignal minimiert. Dieses Verfahren ist ähnlich wie andere Ansätze, die in traditionellen Modellsysteme wie Danio Rerio4entwickelt. Wir wollen hier, sorgfältige Umsetzung der einzelnen Schritte anhand einer herunterladbaren Checkliste (ergänzende Datei 1), sorgfältige Durchführung des Protokolls zu fördern. Die Begründung hierfür ist Organisation durch die vielen Schritte in diesem Verfahren zu erleichtern. Dieser Artikel eignet sich für Forscher interessiert bei der Durchführung von in-situ Hybridisierung vollständig-hängen bei der Entwicklung von Embryonen, aber noch nicht das Verfahren durchgeführt. Der Vorteil des gewählten Ansatzes für Astyanax Forscher ist, dass es getestet wurde und in Cavefish und Oberfläche Fisch verwandelt, wodurch vergleichende Expressionsanalysen bewährt. Die vorgestellte Methode kann durch Forscher in Studien über Astyanax und anderen Systemen verwendet werden.
Alle hier beschriebene Methoden wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) von der University of Cincinnati (Protokoll Nr. 10-01-21-01) genehmigt.
1. Fixierung
(2) Dehydratation
3. Tag 1: Rehydratation
4. Tag 1: Verdauung und Fixierung
5. Tag 1: Prehybridization
6. Tag 2: Hybridisierung
7. Tag 3: Vorbereitung der Lösung
8. Tag 3: Sonde entfernen
9. Tag 3: Sperrung
10. Tag 4: MABT Spülungen
11. Tag 5: Sonde Visualisierung
12. Abbildung
In diesem Bericht stellen wir einen einfachen und unkomplizierten Ansatz zur Kennzeichnung von embryonalen Astyanax Exemplare für qualitativ hochwertige gen Expressionsanalyse durchführen. Diese Technik kann in vier oder fünf Tagen durchgeführt werden, und jeder wesentlichen Schritt im Verfahren ist in eine farbcodierte Flussdiagramm (Abbildung 1) vertreten. Einmal abgeschlossen, sollte gebeizt Embryonen ein dunkles Lila chromatische Label in Geweben, die mit dem Ausdruck des Gens von Interesse hegen. Wir haben dieses Protokoll in Pachón Cavefish (Abbildung 2A–B, E) und Oberfläche (Abbildung 2–D, F) Fischembryonen erfolgreich umgesetzt.
Die Cavefish Embryonen wurden für zwei Transkriptionsfaktoren das Label frühen Neuralleiste Gewebe, Sox9 und Tfap2a5,6gebeizt. Embryonen, die mit der Bezeichnung für Sox9 Ausdruck zeigen klare Kennzeichnung in den Entwicklungsländern Branchial Bögen und Brustflosse (gelbe Pfeilspitzen, Abb. 2A). Beachten Sie, dass die Färbung ist praktisch nicht vorhanden in der Dottersack oder den entwickelnden Somiten an der Flanke (Abbildung 2A). Ebenso ist Tfap2a Ausdruck zeigt sich in die Teile der Entwicklung Kopf, sowie frühe Migration Neuralleiste Zellen (Abb. 2 b, Pfeilspitze entlang der dorsalen Flanke des Embryos). Der dritte vertretende gen präsentiert für Cavefish Embryonen ist Phf20a, eine Markierung von Osteoblasten Differenzierung7. Beachten Sie die positive Färbung in den Teilen des somitic Mesoderm und hinteren Kopf, die dazu bestimmt sind, zu Knochengewebe (Abbildung 2E, Pfeilspitzen) führen.
In Oberfläche Fischembryonen sondiert wir für die Gene CXCR, Adcyap1aund Sox10. CXCR kodiert einen G-Protein-Membrane-springen-Rezeptor, der CXC-Chemokine8bindet. Positive Kennzeichnung ist in abgelegenen Regionen des Kopfes sowie Flanke (Abbildung 2F, Pfeilspitzen) und ein paar einzelne Zellen über den Dottersack. Gen Adenylat-Cyclase-aktivierende Polypeptid, Adcyap1a, drückt sich in Regionen des zentralen Nervensystems, einschließlich Hypophyse Zellen. Beachten Sie die hochspezifischen Ausdruck in gekoppelten, bilaterale Gruppen von Zellen auf der dorsalen Aspekt des Embryos; sowie eine größere Region der Mittellinie Ausdruck (Abbildung 2, Pfeilspitzen). Schließlich präsentieren wir der Expression von Sox10, einen Transkriptionsfaktor Etiketten frühen Neuralleiste und Oligodendrozyt Zellen10. Hochspezifische positive Färbung zeigt sich als eine frühe Marker der Neuralleiste auf der linken und rechten Seiten des dorsalen Embryos (Abb. 2D, Pfeilspitzen).
Wir präsentieren jede der zwei Arten der verwirrende Fragen, die auftreten können, andere Forscher. Die erste Ausgabe, die man in regelmäßigen Abständen trifft ist punktförmige Flecken von nicht-spezifische Kennzeichnung. Diese Flecken können als Niederschlag aus der endgültigen MABT Spülungen oder den AP-Puffer während der Färbung Reaktionen auftreten. Ein Beispiel für diese unspezifische Bezeichnung ist offensichtlich auf dem Dottersack des Embryos Oberfläche Fisch gebeizt für Ausdruck der Pnp4a. Dieses Gen kodiert ein Enzym (Purin-Nukleosid-Phosphorylase), die Produktion von schillernden Pigmentierung11erleichtert. Dieses Gen zeigt sich zuerst im dritten Auge und die Schwimmblase. Die punktförmige Flecken beobachtet in einigen Oberfläche Proben (Abbildung 3A) schieden durch häufige Waschungen und Ersatz des AP-Puffer + NBT/BCIP in der Endphase des Protokolls (Abb. 3 b). Ein zweites Thema, bei dem man in regelmäßigen Abständen auftritt ist die diffuse, weitgehend unspezifische Expression von Genen, die ansonsten eine unterschiedliche Expressionsmuster produzieren würde. Ein Beispiel ist das Gen BMP4, erscheint als ein weitgehend diffusen Muster mit niedrigem Chromogen in der Probe (Abbildung 3). In solchen Fällen wir in der Regel eine andere Region des Gens zu identifizieren, in einen Vektor verstärken und führen eine neue Sonde-Synthese (siehe zusätzliche Datei-6). Das Beispiel einer Kontrolle (keine Sonde) Probe (Abbildung 3D) erfolgt um die diffuse und unspezifische Natur unserer gescheiterten BMP4 -Sonde zu illustrieren.
Abbildung 1: ein einfaches Flussdiagramm für die gesamte-Mount in-situ Hybridisierung. Dieses Flussdiagramm nutzt Farbcodierung veranschaulichen die wichtigsten Schritte der in-situ Hybridisierung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Repräsentative Färbung für sechs Gene, mit Höhle und Oberfläche Morphen von Astyanax. (A) Abbildung zeigt die spezifische Färbung (gelbe Pfeile) des Sox9 auf der rechts lateralen Seite der ein 72 h nach Befruchtung (hpf) Pachón Cavefish (45 X). (B) spezifische Färbung, für Tfap2a offensichtlich auf der rechts lateralen Seite eine 36er ist hpf Pachón Cavefish (45 X). (C) bilaterale und Mittellinie Färbung (gelbe Pfeilspitzen) des Adcyap1a sind in der dorsalen Region 72 hpf Oberfläche Fisch (100 X) gekennzeichnet. (D) Färbung des Sox10 in den Geweben der Neuralleiste 24 hpf Oberfläche Fisch (100 X). (E) Phf20a zeigt ein schwaches, aber klar, Muster der Ausdruck in der dorsalen Region ein 24 hpf Pachón Cavefish (100 X). (F) die Cytokin Rezeptor, CXCR, drückt sich in unterschiedlichen Regionen von der rechts lateralen Seite 24 hpf Oberfläche Fisch (100 X). Skala-bars in A, B, E, F = 0,5 mm; skalieren, Bars in C, D = 2,5 mm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: repräsentative Beispiele für Sub-optimale Ergebnisse für die gesamte-Mount in-situ Hybridisierung. (A) spezifische Färbung zeigt sich neben unspezifischen Niederschlag und/oder Trümmer (roter Pfeil) auf der rechten lateralen Seite des einen 72 hpf Pachón Cavefish (100 X). (B) der gleichen Sonde visualisiert in A, Darstellung der gleichen Färbung ohne Niederschlag oder Hintergrund in einem 72 Muster hpf Pachón Cavefish (100 X). (C) der rechten seitlichen Flanke eine 72 hpf Pachón Cavefish zeigt diffuse, unspezifische Färbung für BMP4 bei 45 X Vergrößerung. (D) A 72 hpf Pachón Cavefish dieses Protokolls, ohne Zusatz von Sonde (45 X) unterzogen. Skalieren von Balken = 0,5 mm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Aufgrund der Anfälligkeit der RNA zu einer Verschlechterung betrifft einer der wichtigsten Schritte im Protokoll die sterile Synthese der RNA-Sonde. Jedoch wenn eine Sonde sorgfältig erzeugt wird und gute Ergebnisse liefert, kann es in folgenden befleckenden Reaktionen wiederverwendet werden. Ein zweiter wichtiger Schritt ist die sorgfältige Herstellung der alle Reagenzien im gesamten Protokoll. Da dieses Protokoll mehrere Tage und viele kleine Schritte umfasst, ist es wichtig, dass alle Reagenzien genau produziert und steril aufbewahrt. Darüber hinaus ist es grundlegend wichtig, dass die Ermittler vorsichtig Track der einzelnen Schritte im Protokoll hält. Wir haben festgestellt, dass die bereitgestellte Prüfliste mit folgenden Schritten in gewährleisten genaue und präzise Fertigstellung der einzelnen Aspekte dieses Protokolls sehr nützlich sein kann.
Wir verändern nicht oft das Protokoll, die, das wir hier vorgestellt. Jedoch können Ermittler Sonde Inkubationen bei unterschiedlichen Temperaturen als die vorgeschlagen durchführen (z.B. 70 ° C). Leichte Veränderungen in der Hybridisierung Temperaturen beeinträchtigt die Bindung der RNA-Sonden, und daher sucht die optimale Hybridisierung Temperatur kann positiv beeinflussen die Qualität der Färbung. In Bezug auf Fehlersuche, empfehlen wir andere Forscher, die Checkliste zur Verfügung gestellt, mit diesem Artikel (ergänzende Datei 1) zu nutzen. Die Aufrechterhaltung vorsichtig Records ist ein notwendiger erster Schritt bei der Sicherstellung hoher Qualität zu beflecken. Eine zweite kleine Änderung wird vorgeschlagen, die endgültige Färbung Reaktion ohne Schaukeln durchzuführen ist (z. B. ohne Platzierung auf einer Plattform Shaker oder Nutator). Der Grund dafür ist, dass wir in regelmäßigen Abständen die Produktion von Niederschlag, beachten Sie, die vermutlich aus der AP-Pufferlösung entsteht. Dieser Niederschlag in der Regel eine dunkle Farbe overstains und punctata (unspezifische) Hintergrund auf die gefärbten Gewebe schafft. Um die Produktion von diesem Niederschlag zu minimieren, bereiten wir sterilisiert AP Puffer kurz vor jeder Reaktion. Weiter, nachdem NBT und BCIP in den Puffer hinzugefügt wurden, ersetzen wir es mit frischen Puffer und NBT/BCIP jede Stunde, bis die Färbung Reaktion abgeschlossen ist.
Eine Beschränkung auf die vorgestellte Methode ist, dass ein chromatische Fleck für gen-Ausdruck-Visualisierung verwendet wurde. Dieser Ansatz werden von uns bevorzugt, da es kostengünstig ist und nur Lichtmikroskopie erfordert zu visualisieren. Wenn man bei der Bewertung von quantitativen Unterschiede interessiert waren, empfehlen wir, dass sie eine fluoreszierende Färbung Reaktion verwenden. Semi-Quantifizierung, wird z. B. durch Vergleich der relativen fluoreszierende Einheiten des Ausdrucks zwischen Experimente damit.
Protokolle für die in-situ Hybridisierung sind weit verbreitet auf der Web-12,13, sowie in wissenschaftlichen Publikationen erhältlich. Das Protokoll, das wir präsentieren wurde speziell für unsere Modellsystem, Astyanax Mexicanusentwickelt. Wir haben dieses Protokoll verwendet, um Flecken auf den Ausdruck von mehreren Dutzend Gene, und das Gefühl, dass sie konsequent qualitativ hochwertige Ergebnisse liefert. Ein wesentlicher Vorteil dieses Protokolls ist die schrittweise Checkliste von Elementen, die den Prüfer für mehrere Aufgaben gleichzeitig präzise Fertigstellung der einzelnen Schritte dieses Protokolls zu ermöglichen. Wir hoffen, dass dieses Protokoll als eine hilfreiche Ressource für andere Forscher auf dem Gebiet und darüber hinaus dient, und erwarten, dass diese allgemeine Labortechnik zukünftige Entdeckungen Verknüpfung Genotyp, Phänotyp in die blinde mexikanischen Cavefish unterstützen wird.
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Die Autoren möchte Mitglieder des Brutto-Labors für die hilfreichen Kommentare auf diesem Manuskript danken. Wir wollen vier Schülerinnen und Schüler zu würdigen, die dieses Protokoll während Sommerpraktika in 2017 und 2018, darunter Christine Cao, Michael Warden, Aki Li und David Nwankwo genutzt. HL wurde im Sommer 2017 durch ein UC-Biologie-STEM-Stipendium unterstützt. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse von der National Science Foundation (DEB-1457630, JBG), National Institute of Dental und Craniofacial Forschung (NIH; DE025033, JBG).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
10 mL Serological Pipette | VWR | 89130-888 | |
1000 mL Filtration Unit | VWR | 89220-698 | |
15 mL Conical | VWR-Greiner | 82050-278 | |
25 mL Serological Pipette | VWR | 89130-890 | |
250 mL Filtration Unit | VWR | 89220-694 | |
5 mL Serological Pipette | VWR | 89130-886 | |
50 mL Conical | VWR-Falcon | 21008-940 | |
500 mL Filtration Unit | VWR | 89220-696 | |
Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments | Sigma-Roche | 11093274910 | |
BCIP | Sigma-Aldrich | B8503-1G | 1 g |
Blocking Solution | Sigma-Roche | 11 096 176 001 | 50 g |
Citric Acid | Fisher Scientific | A104-500 | 500 g |
DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7) | Sigma-Roche | 11175025910 | |
Eppendorf Tubes | VWR | 20170-577 | |
Ethanol | Fisher-Decon | 04-355-223 | 1 Gal |
Formamide | Thermo Fisher Scientific | 17899 | 100 mL |
Glass dram vials | VWR | 66011-041 | 1 Dr |
Glass Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-8A | |
HCl | Thermal-ScientificPharmco-AAPER | 284000ACS | 500 mL |
Heparin | Sigma | H3393-25KU | |
Magnesium Chloride-crystalline | Fisher Scientific | M33-500 | 500 g |
Maleic Acid | Sigma | M0375-100g | 100g |
Methanol | Fisher Scientific | A452-4 | 4L |
Molecular-grade Water (RNase-free) | VWR | 7732-18-5 | 500 mL |
NaCl | Fisher Scientific | S271-3 | 3 kg |
NaOH pellets | Fisher Scientific | S318-500 | 500 g |
NBT Substrate powder | ThermoFisher Scientific | 34035 | 1 g |
Normal Goat Serum | Fisher-Invitrogen | 31873 | |
Nutating Mixer | VWR | 82007-202 | |
Paraformaldehyde | Sigma | 158127-500g | 500 g |
PBS 10x | Fisher Scientific | BP399-20 | 20L |
Proteinase K (200mg/10ml) | Qiagen | 19133 | 10 mL |
Plastic Pipettes | VWR-Samco | 14670-147 | |
RNAse | Sigma | R2020-250mL | 250 mL |
Shaking Water Bath 12 L | VWR | 10128-126 | 12 L |
Standard Analog Shaker | VWR | 89032-092 | |
Tris | Sigma Millipore-OmniPur | 9210-500GM | 500 g |
tRNA Yeast | Fisher-Invitrogen | 15401011 | 25 mg |
Tween 20 | Sigma | P9416-50mL | 50 mL |
Vortex-Genie 2 | Fisher Scientific-Scientific Industries, Inc | 50-728-002 | |
Lithium Chloride (LiCl) | Sigma-Aldrich | 203637-10G | 10 g |
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