Modifizierte Roller Schlauch Methode genau lokalisierte und sich wiederholende intermittierende Bildgebung während langfristige Kultur Gehirnscheiben im geschlossenen System

Hier ist eine modifizierte Roller Schlauch Methode zur Kultivierung und intermittierende hochauflösende Bildgebung des Gehirns Nagetier Scheiben über viele Wochen mit präzisen Neupositionierung auf komplexeste Deckgläsern. Neuronalen Lebensfähigkeit und Slice Morphologie sind gut gepflegt. Anwendungen dieses komplett geschlossenes System mit Viren für Zelltyp spezifische Ausdruck stehen zur Verfügung.

Kultivierte Nagetier Gehirnscheiben eignen sich für die Erforschung der zellulären und molekularen Verhaltens der Neuronen und Glia in einer Umgebung, die viele ihrer normalen in-Vivo -Interaktionen unterhält. Scheiben aus unterschiedlichsten transgene Mauslinien oder Verwendung von viralen Vektoren für Ausdruck von Eindringmittel tagged Proteinen oder Reporter in Wildtyp Gehirnscheiben gewonnen ermöglichen hochauflösende Bildgebung durch Fluoreszenz-Mikroskopie. Obwohl verschiedene Methoden entwickelt worden sind, für imaging Gehirnscheiben kombiniert Stück Kultur mit der Fähigkeit zu führen hat sich wiederholende hochauflösende Bildgebung bestimmter Zellen in live Scheiben über längere Zeit Probleme aufgeworfen. Dies gilt insbesondere, wenn virale Vektoren für Expression exogene Proteine verwendet werden, da dies am besten geschieht in einem geschlossenen System zum Schutz der Nutzer und Kreuzkontamination zu verhindern. Einfache Änderungen an der Walze Rohr Gehirn Stück Kultur-Methode, die für sich wiederholende hochauflösende Bildgebung von Scheiben über viele Wochen in einem geschlossenen System zu ermöglichen, werden gemeldet. Kultivierung der Scheiben auf komplexeste Deckgläsern erlaubt die Verwendung von treuhändische Markierungen schnell und genau die Bühne, um das gleiche Feld im Laufe der Zeit vor und nach verschiedenen Behandlungen Bild neu positionieren. Beispiele sind für den Einsatz dieser Methode kombiniert mit spezifischen neuronalen Färbung und Ausdruck, Änderungen in der hippocampal Stück Architektur zu beobachten, viral-vermittelte neuronale Ausdruck von fluoreszierenden Proteinen und die Entwicklung von Cofilin Pathologie dargestellt, die zuvor im Hippocampus der Alzheimer-Krankheit (AD) in Reaktion auf die Scheibe Behandlung mit Oligomere von Amyloid-β (Aβ) Peptid beobachtet wurde.

Primärkultur dissoziierten Neuronen aus Regionen des Gehirns Nagetier ist, ein wichtiges Instrument, die von den Forschern verwendet, um Antworten auf pathologisch beobachten reizen beteiligt. Solche Studien haben jedoch den Nachteil Neuronen nur 2D und ohne ihre Glia Support-System zu betrachten. Darüber hinaus unmöglich, es sei denn unter Bedingungen mit sehr hoher Dichte (640 Neuronen/mm² oder etwa 16 % der Fläche) in dem sie angebaut, zufällige Auswuchs von einem Dendriten und Axon für mehr als eine kurze Strecke von den Zellkörper, hippocampal folgen neuronalen Lebensfähigkeit sinkt über 4 Wochen deutlich¹, Begrenzung der Verwendung von dissoziierten Kulturen für erweiterte Studien von altersbedingten Krankheiten. Die Kultivierung von Scheiben aus Nagetier Gehirn vorbereitet, ist eine attraktive Option, die diese Grenzen überwindet durch die Aufrechterhaltung einer organisierten Zellarchitektur und Lebensfähigkeit für Wochen oder Monate. Bedingungen für die Aufrechterhaltung von vielen verschiedener Regionen Nagetier Gehirn im Stück Kultur wurden beschrieben².

Zwei wichtige Methoden sind am meisten benutzt für langfristige Kultur Gehirnscheiben: Kultivierung auf Membranen in der Luft-Flüssigkeit-Schnittstelle³ oder Kultivierung auf Deckgläsern in versiegelten Röhren um in einem Roller-Inkubator Belüftung⁴zu drehen durfte. Scheiben-kultivierte auf Membranen können direkt mit hochauflösender Fluoreszenz-Mikroskopie mit einem aufrechten Mikroskop und Wasser eintauchen Ziele⁵abgebildet. Alternativ wurden Scheiben kultiviert auf Membranen in Glasschalen unten gute Auflösung von dendritischen Dornen mit einer inversen Mikroskop⁶erreicht übertragen. Jedoch sind beide Methoden von imaging-Scheiben auf Membranen angebaut offene Systeme, die mittlere Änderungen erfordern und oft Antimykotika und/oder Antibiotika zur Verhinderung oder Reduzierung der Verschmutzung^5,6. Scheiben auf einer Membran an der Luft-Medium-Schnittstelle pflegen ausgezeichnete Morphologie und überleben, aber Rückkehr zur genauen Standorte während der sich wiederholenden Bildgebung bei hoher Vergrößerung ist extrem schwierig, es sei denn, das Experiment nur kleine Gruppen von Zellen folgt mit dem Ausdruck eines fluoreszierenden Markers. Obwohl Scheiben gewachsen auf Membranen mit viral-vermittelten Expression von transgenen^{5,6 verwendet wurden}, können biologische Sicherheit Protokolle erfordern eine geschlossene Kultursystem eingesetzt werden, für bestimmte virale Vektoren, die für verwendet werden mit dem Ausdruck Eindringmittel getaggt Proteine und Reporter der Zellphysiologie. Darüber hinaus erfordern eintauchen Ziele Dekontamination zwischen Proben, die in Kultur⁵folgen werden. Eine wichtige Anwendung der Membran Schnittstelle Kulturen verbindet hochauflösende Bildgebung mit Elektrophysiologie bei Mal Punkte⁷.

Die Walze Rohr Methode mit Deckgläsern in das Kunststoffrohr lässt keine Elektrophysiologie oder hochauflösende Bildgebung ohne das Deckglas. So wurde diese Methode in den meisten Fällen zu Langzeitstudien angewendet in der Post-Fixierung Beobachtungen⁸vorgenommen wurden. Hier beschrieben, ist eine Methode, die nutzt die Walze Rohr Kultur Technik aber auf gebohrt-Out Röhren mit Scheiben auf Deckgläsern, die wiederholt können, so lange wie die Kulturen abgebildet werden sind gepflegt. Das geschlossene System erfordert keine mittlere Änderung für die Bildgebung und nutzt komplexeste Deckgläsern treuhändische Marken bieten, die es ermöglichen, imaging bei hoher Vergrößerung, nach Tagen oder Wochen, die präzise Felder vorher abgebildet.

Wir wenden diese Methode, um Änderungen im Nagetier Hippocampus, einer wichtigen Hirnregion beteiligt, Gedächtnis und lernen zu untersuchen. Nagetiere-Hippocampus ist oft untersucht, als Modell für pathologische oder altersbedingten Veränderungen, die während der Entwicklung der kognitiven Beeinträchtigung⁹, wie n. Chr. auftreten beobachtet. Unsere Methode eignet sich besonders gut für pathologische Veränderungen zu studieren, die innerhalb einer einzigen Scheibe zu im Laufe der Zeit als Reaktion auf Veränderungen der Umwelt, wie z. B. Anstieg der Aβ-Peptide entwickeln, die ist charakteristisch für AD⁸. Eine Pathologie mit menschlichen und Nagetier AD Gehirn verbunden ist das Vorhandensein von Cofilin-Aktin-Aggregate und Stangen, die letztere mit Bündel von Fäden in denen Cofilin und Aktin sind in einem 1:1 Molverhältnis^{10,11, 12}. Stäbe in festen Scheiben des Ratte Hippocampus nach Aβ-Behandlung, sowie in eine live Nagetier Gehirn-Scheibe mit dem Ausdruck Cofilin-GFP Hypoxie⁸ausgesetzt eingehalten worden, und sie können zu der synaptischen Dysfunktion gesehen in AD und Schlaganfall. Hier verwenden wir diese neue Methode der Kultivierung der zeitlichen Verlauf und Verteilung in Scheiben zum Ausdruck gebrachten exogene Chimären fluoreszierende Proteine durch verschiedene Viren eingeführt. Wir nutzen dann die neuronale Konkretisierung von Cofilin Reporter Konstrukt, die Entwicklung von Cofilin Stab und aggregierte Pathologie in hippocampal Scheiben in Reaktion auf die Behandlung mit löslichen Aβ Oligomere (Aβ_o) verfolgen.

Verwendung von Tieren folgt genehmigten Zucht und Verwendung von Tieren-Protokolle, die konform zu den Animal Care und verwenden Richtlinien der Colorado State University.

Hinweis: Das folgende Protokoll beschreibt die Vorbereitung und Kultur für die langfristige Inkubation und intermittierende Bildgebung des Hippokampus Scheiben. Eine einzige hippocampale Scheibe mit einem speziell präparierten komplexeste Deckgläschen mit einem Plasma Klumpen verbunden ist, und dann die Deckgläsern auf der flachen Seite des gebohrt-Out Tuchwelle, die in einem Roller-Inkubator beibehalten wird versiegelt. Plasma-Klumpen sind mit Plasmin vor Virusinfektion für fluoreszierende Protein-Expression und hochauflösende Bildgebung aufgelöst. Ein Fluoreszenzfarbstoff neuronaler vitaler wird verwendet, um Bild-Neuronen innerhalb der Scheiben.

1. Vorbereitung der Roller Tube Rack

1. Verwendung der Vorlage in Abbildung 1A gezeigt gedruckt auf die Größe, die auf der Skala angezeigt. Mit einem Nagel Punsch (groß genug für einen feinen Spitze Marker) kleine Löcher in der Vorlage zentriert auf den Löchern.
2. Legen Sie die Vorlage auf der Unterseite der 15 cm Gewebe Kulturschale (nominalen Durchmesser von 14 cm) und markieren Sie die Position der Löcher. Wiederholen Sie diesen Vorgang auf einen zweiten Teller geben.
3. Bohrungen Sie mit Bohrern, konzipiert für den Einsatz auf Kunststoff sechs 1,5 cm Durchmesser auf jedes Gericht in einer hexagonalen Anordnung (4,8 cm Mitte-Mitte) mit Bohrungsmittelpunkte 2,5 cm vom Rand der Schale. Bohren Sie drei Löcher (3 mm im Durchmesser) 12 mm von der Kante, die äquidistant zwischen zwei der größeren Löcher wie in Abbildung 1Aplatziert werden.
4. Mit den Böden der einzelnen Gerichte einander gegenüber, legen Sie eine 2,5 Zoll lange Maschinenschraube (3/16 Zoll Durchmesser) mit Unterlegscheibe durch eines der kleinen Löcher, gefolgt von einer zweiten flache Unterlegscheibe, ein Stück aus Polyethylen Schläuche (Spacer, 4,7 cm), eine weitere flache Unterlegscheibe , das zweite Gewebekultur-Gericht, eine weitere flache Unterlegscheibe, eine Sicherungsscheibe und einer Mutter.
5. Wiederholen Sie Schritt 1.4 auf die anderen beiden Maschinenschrauben und nur lose anziehen, bis alle Maschine Schrauben vorhanden sind. Dann die Muttern fest anziehen.
6. Arbeiten die Ösen (5/16 Zoll dick, 5/8 Zoll Durchmesser) in die Löcher der unteren Schale, die endgültige Tuchwelle Rack zu erhalten (Abbildung 1B; mit zwei Röhren im Ort gezeigt). Legen Sie einen Aufkleber, auf jedes Rack mit einer eindeutigen Nummer.

2. Vorbereitung des Roller-Röhren und Deckgläsern

1. Herstellung der Spannvorrichtung für Bohrung in Walze Röhren
   1. Bohren Sie ein Loch von 1,5 cm 8 cm tief in der Mitte Seite von einem 2 x 4 x 5,5 Zoll Holzblock in einem Winkel so, dass die flache Seite der Walze wird Rohr werden fast parallel mit dem Block beim Einfügen (Abb. 2A).
   2. Vergrößern Sie das Loch mit einer Rundfeile Holz sowohl erweitern und verjüngen das Loch um Rohr Einfügung zu ermöglichen (Walze Rohre sind etwas größer im Durchmesser in der Nähe von GAP-Ende) (Abbildung 2B).
   3. Eine Bohrung 1,5 cm Durchmesser vertikal, 5,5 cm von der Seite des Blocks, und mittig über dem seitlichen Loch (Abbildung 2C).
   4. Wenn die seitlichen Loch genug konisch ist, legen Sie eine Tuchwelle, die gekennzeichnet ist, an der gewünschten Stelle zu zentrieren Sie das Loch für den Slice und positionieren das Rohr so, dass die markierte Stelle zentriert ist in die senkrechte Bohrung 1,5 cm.
   5. Entfernen Sie den Schlauch und Messen Sie den Abstand vom Punkt bis zum Ende des Rohres. Markieren Sie diesen Abstand von der Mitte des Lochs in der Spannvorrichtung und legen Sie einen Nagel bieten einen Stopp, um das Rohr zum Bohren (Pfeil in Abbildung 2C) richtig zu positionieren.
   6. Verwenden Sie eine Metallsäge bündig mit der Oberfläche der Holzklotz zum Schutz vor Verletzungen den Nagel abzuschneiden.
   7. Fügen Sie Federklemmen auf der Unterseite der Jig, wenn gibt es eine Bohrmaschine mit Slots, die es sein lassen (Abbildung 2D schwarzen Pfeil) verankert. Andernfalls verwenden Sie C-Klemmen, halten Sie die Schablone fest auf die Bohrmaschine.
2. Mit Hilfe der Schablone beschriebenen zu halten und eine flache doppelseitige 11 cm Kunststoff Kultur Röhre mit der flachen Seite nach oben (Abb. 2A) zu positionieren, Bohren Sie ein Loch mit 6 mm Durchmesser mit dem Zentrum 1,0 cm über dem Boden und zwischen den Seiten des Rohres zentriert.
   Hinweis: Ein Bohrer für Plastik entwickelt sollte verwendet werden.
3. Mit einem schwenkbaren Entgrat-Tool, glätten Sie die Kanten des Loches (Abb. 2E) und 4 Rillen auf der Innenseite machen Kante der Bohrung (Abbildung 2E, inset) Erleichterung der Trockenlegung des Lochs während der Rotation.
4. Stanzen Sie mit einem 12 mm Loch, schneiden Sie 12 mm Durchmesser Scheiben aus ungiftigen Doppel doppelseitigen Klebstoff Silizium Gummiplatten. Mit einem standard ein Papier Locher (6 mm Durchmesser), ein Loch in der Mitte jeder Scheibe machen.
5. Spülen Sie die gebohrte Rohre mit 70 % Ethanol, Luft trocknen in einem biologischen Sicherheitsschrank und die Rohre und die gestanzten selbstklebenden Scheiben für 40 Minuten unter der UV-Lampe (30 W bei durchschnittlichen Abstand von 70 cm) in der biologischen Sicherheitsschrank zu sterilisieren.
6. Positionieren Sie die Rohre und Platten nach 20 min damit alle Sichtflächen sterilisiert werden. Unter sterilen Bedingungen das weiße von einem selbstklebende CD/DVD sichern ziehen Sie ab und bringen Sie der Silikon-Kautschuk an der Außenseite eines Rohres, Ausrichten der Löcher (Abbildung 2F an).
   Vorsicht: Zur Vermeidung von UV-Exposition tragen Sie Augenschutz und schließen Sie den Schrank vor dem Einschalten der UV-Lampe.
7. 12 mm Durchmesser Foto-(100 Mitte nummeriert 1 mm Quadrate) deutsche Glasdeckgläser zu reinigen. Halten Sie die Deckgläsern vorsichtig mit einer Pinzette und Tauchen Sie ein in absoluten Ethanol, gefolgt von Wasser, gefolgt von absoluten Ethanol wieder, und schließlich tauchen Sie die Deckgläsern in eine Flamme zu verbrennen das Ethanol. Lassen Sie Deckgläsern abkühlen.
8. Halten Sie die Deckgläsern mit Zangen, Tauchen Sie in 2 % 3-Aminopropyltriethoxysilane in Aceton für 10 S. Spülen Deckgläsern mit Reinstwasser und an der Luft trocknen.
9. Die Deckgläsern auf steriles Filterpapier innerhalb einer biologischen Sicherheit Kabinett und schalten Sie das UV Licht. Jede Seite des Deckgläsern 20 min aussetzen.
   Vorsicht: Zur Vermeidung von UV-Exposition tragen Sie Augenschutz und schließen Sie den Schrank vor dem Einschalten der UV-Lampe.

(3) hippocampal Slice-Vorbereitung

1. Bereiten Sie vor Beginn der Dissektion Hälften des zweischneidiges Rasierklingen für die Gewebe-Chopper. Falten Sie die Messer längs sorgfältig mit den Fingern und snap in zwei Hälften.
2. Spülen Sie die Klinge-Hälften mit Aceton mit einem Wattestäbchen zu reinigen, gefolgt von Spülen in absoluten Ethanol und lufttrocknend.

(4) Beschichtung Scheiben

1. Gewonnene Scheiben stellen Sie 2 µL Huhn Plasma auf die Mitte der komplexeste Seite des vorbereiteten Deckglas. Verbreiten Sie das Plasma leicht um eine 3-4 mm Durchmesser vor Ort zu erreichen.
   Hinweis: Die komplexeste Seite ist die Oberseite des Deckglases durch eine Dissektion Mikroskop betrachtet, so dass die Zahlen korrekt ausgerichtet sind.
2. 1 Gehirn-Scheibe mit einem sterilen schmal-Tip-Spatel (Abb. 4A) auf der Plasma-Spot (Abbildung 4B) übertragen. Verwenden Sie geschlossene Zange weiterhin die Scheibe an der Spitze der Spachtel beim Anheben der Scheibe aus GBSS/Glukose.
3. Berühren Sie den Spatel in das Plasma vor Ort auf dem Deckglas und mit geschlossenen Zangen, drücken Sie die Scheibe auf das Deckglas.
4. Mix 2,5 µL des Plasmas mit 2,5 µL Thrombin in einem separaten Rohr. Platzieren Sie schnell 2,5 µL dieser Mischung über und rund um die Scheibe und Pipettieren oben und unten leicht um zu mischen (Abbildung 4B).
   Hinweis: Das Plasma wird innerhalb von 10-15 s, Blutgerinnung, so dass dies schnell erfolgen muss. Wenn Slice Haftung ein Problem ist, mischen Sie 5 µL Plasma mit 5 µL Thrombin und verwenden Sie 4-5 µL auf der Scheibe, entfernen Sie einige nach dem Mischen, so dass die Scheibe flach auf das Deckglas liegt.
5. Entfernen Sie die klare Kunststoffabdeckung exponierten seitens der Silikon-Kautschukkleber zuvor angebracht, um eine Tuchwelle und das Deckglas mit Gehirn-Scheibe auf den Klebstoff ausrichten der Scheibe in der Bohrung (Abb. 4C).
6. Um die Haftung zu gewährleisten, gelten Sie weichen, gleichmäßigen Druck auf das Deckglas mit dem Daumen durch das Deckglas gleichmäßig nach unten drücken und halten es für ca. 1 min während der Übertragung auf die biologischen Sicherheitsschrank.
7. Fügen Sie in einer biologischen Sicherheitsschrank 0,8 mL Kulturmedium für komplette Neurobasal A (Table of Materials hinzu) jedes Rohr (Abbildung 4D).
8. Fließt ein 5 % CO₂95 % Luft-Gemisch durch eine sterile Baumwolle eingesteckt Pasteurpipette sicher von einer Schelle gehalten. Spülen Sie die Tuchwelle mit dem Gasgemisch und Röhrchen Sie rasch die, wie es um die Pipette entzogen wird.
9. Beschriften Sie die Rohre mit der Slice-Nummer und rack-Reihe. Legen Sie Röhren einbauen möchten Walze, sicherzustellen, dass sie geometrisch ausgeglichen sind. Gibt es eine ungerade Anzahl von Rohren, fügen Sie Röhren, auszugleichen hinzu.
10. Legen Sie die Regale in einem 35 ° C Walze Inkubator mit Walzen drehen der Walze am Rack über 10-13 RPH (Abbildung 4E). Um das Medium in den Boden der Röhrchen zu halten, Neigung des Inkubators zurück ca. 5° durch die Erhöhung seiner Front auf einem Brett.
11. Geben Sie den Slice und Rohr auf eine Tabelle, die verwendet wird, um alle Informationen der Slice-Behandlungen und Beobachtungstagen aufzuzeichnen.
12. Auf ca. 6. Tag in Kultur, 1 µL (0,002 U) aktive Plasmin hinzufügen jedes Rohr.
13. Nachdem die Klumpen vollständig auflösen (in der Regel innerhalb weniger Stunden), das Medium zu entfernen und ersetzen es durch frisches Medium ohne Plasmin. Falls erforderlich, Scheiben können über Nacht mit Plasmin inkubiert und das Medium gewechselt am nächsten Tag.
14. Scheiben sind in der Regel für mindestens 7 bis 10 Tage vor Gebrauch in Experimenten inkubiert. Aspirieren Sie Medium und am Tag 3 oder 4, am 7. Tag und alle 7 Tage danach wieder zu ersetzen.

5. Vorbereitung des viralen Vektoren für Transgene Ausdruck

Hinweis: Ausdruck von transgenen in Neuronen des Slice Kulturen wird entweder mithilfe von Gehirnen von gentechnisch Nagetiere oder durch die Einführung des Transgens durch eine Infektion mit rekombinanten Replikation mangelhaft Viren erreicht.Adenoviren (AV), Adeno-assoziierten Viren (AAV) und rekombinanten Lentivirus Vektoren haben alle für den Ausdruck der verschiedenen fluoreszierenden Proteins Chimären in Hirnschnitten in unseren Kulturen hippocampal Scheibe aufgebraucht.

1. Bereiten Sie Replikation mangelhaft AV für das Ausdrücken der RNS des Interesses nach Methoden an anderer Stelle beschrieben^13,14. Titer die Viren für infektiöse U/mL durch die serielle Verdünnungsmethode mit einem Antikörper zu einem viral exprimierten Protein als¹⁴beschrieben. Zur Beobachtung Cofilin Aggregate und Cofilin-Aktin Stab Bildung Cofilin-R21Q-mRFP cDNA (Plasmid #51279)¹⁶nutzen.
   Hinweis: Der synapsin 1 Projektträger ist eine ausgezeichnete Wahl für neuronale Konkretisierung¹⁵, während der Zytomegalievirus Projektträger nützlich ist für hohe Expression Ebenen in vielen Zelle Arten¹³fahren.
2. Bereiten Sie AAV durch Co-Transfektion von Transfer Plasmid enthält das gen des Interesses und ein Rep/GAP-Plasmid, mit oder ohne einen Helfer-Plasmid in HEK293 Verpackungszellen, die die virale E1-Gens, wie zuvor beschrieben^17,18liefern vor.
   Hinweis: Rekombinanter AAV kann auch für gezielte Einfügung in die Host Zelle Genom¹⁹erfolgen. Für die Übertragung Plasmid verwenden wir menschliche Cofilin 1 mit einem C-terminalen mRFP1 Fluoreszenz Protein-Tag (Plasmid #50856) in ein synapsin Promotor-haltigen AAV Plasmid flussabwärts von Kalzium Sensor GCaMP5G²⁰kloniert. Ein Stück DNA Kodierung der P2A selbst anhaftenden Peptidsequenz wird mittels PCR zwischen GCaMP5G und Cofilin-RFP während der Vorbereitung des Plasmids Transfer zum Ausdruck der beiden Proteine aus einer einzigen AAV Transcript²¹eingefügt.
3. Bereiten Sie rekombinante Lentivirus Vektoren durch Co-Transfektion von Transfer-Plasmid enthält das Gen oder die cDNA von Interesse und Integration Signalen, zusammen mit einem dritten Generation Lentivirus Verpackung Mischung, die die virale Gag, Pol, Rev und Vsv-g Gene auf teilt drei separate Plasmide^22,23.
4. Verwenden Sie für den Transfer-Plasmid einen einzigen Schritt Klonen System²⁴ zusammenzubauen Wirbeltiere Förderer und Cofilin-R21Q-mRFP cDNA (von Plasmid #51279) in pLKO.1-GLP (Plasmid #30323), mit der Wirbeltiere Projektträger und Cofilin-R21Q-mRFP ersetzen die hPGK Projektträger und GFP cDNA, beziehungsweise.
5. Transfizieren Sie das endgültige Plasmid in HEK293T Zellen durch Calcium-Phosphat als zuvor beschriebenen²³.
6. Sammeln Sie Medium aus vier 10 cm-Gerichte zu, konzentrieren Sie, 500 µL mit 150K-Cutoff zentrifugale Konzentratoren und speichern Sie die endgültige Lentivirus bei-80 ° C in kleinen Aliquote nach dem schnellen Einfrieren in flüssigem Stickstoff. Tauen Sie einen aliquoten nur einmal für Zellen zu infizieren.
7. Bestimmen Sie empirisch, dass die Lautstärke der einzelnen Virustypen bereit, die den Grad des Ausdrucks durch die Einrichtung einer Anzahl von unterschiedlichen Slice Kulturen, den Ausdruck der transgene nach Infektion mit verschiedenen Mengen des Virus zu folgen gewünscht zu erreichen.
   Hinweis: In der Regel wird 1-10 µL des Virus pro Scheibe verwendet.

6. Scheibe Behandlungen

1. Scheiben mit Virus infiziert
   1. Arbeiten in einer biologischen Sicherheitsschrank für Virus Arbeit bei der biologischen Sicherheitsstufe für den Vektor zugelassen, mischen Sie ein Aliquot des Virus (in der Regel 1-10 µL) mit 0,8 mL komplette Medium.
   2. Aspirieren Sie das Medium von der Scheibe mit einem sterilen Pasteurpipette in eine Sammlung-Falle, die Bleichmittel enthalten. Eine sekundäre Falle wird immer zwischen die erste Falle und die Vakuumquelle verwendet.
   3. Ersetzen Sie dieses Medium mit der Virus-haltigen aliquoten oben vorbereitet, Kultur-Rohre zu einem Rack zurück und legen Sie in den Inkubator.
   4. Entfernen Sie nach 2-5 Tagen Inkubation die Scheiben mit Virus im biologischen Sicherheitsschrank den Virus-haltigen Mittel mit einem sterilen Transferpipette und legen Sie es in eine Flasche mit genehmigten antivirale Vermittler um das Virus zu töten.
2. Färbung von Neuronen mit lebenswichtigen Farbstoff
   1. Bereiten Sie vor und speichern Sie Aliquote neuronalen vital Fluoreszenzfarbstoff²⁵ durch schnelle Einfrieren 4 µL Aliquots in flüssigem Stickstoff bei einer Konzentration von 100 µM speichern Sie diese bei-20 ° C. Nicht Frost/Tau des Farbstoffs mehr als einmal.
   2. Beschriften Sie Neuronen für die Visualisierung von Fluoreszenz-Mikroskopie, Tauwetter ein Aliquot des neuronalen vital Farbstoffs und verdünnen bis 4 mL in kompletten Neurobasal Medium (letzte Farbstoff Konzentration beträgt 100 nM).
   3. Entfernen Sie das Medium aus Scheiben durch Absaugen (oder mit einer Pipette übertragen, wenn das Medium Virus enthält) und ersetzen Sie es mit 0,8 mL 100 nM neuronalen vital Farbstoff-haltigem Medium. Die Scheiben auf den Roller-Apparat in den Inkubator zurück.
   4. Nach Inkubation der Scheiben für 2 h, Aspirieren der Farbstoff-haltigen Medium und ersetzen Sie es mit 0,8 mL frisches komplette Medium in einer biologischen Sicherheitsschrank.
      Hinweis: Kennzeichnung von Neuronen in Scheiben mit lebenswichtigen Farbstoff erfordert mehrere Stunden Inkubation. Die ersten Bilder sind in der Regel 24 h nach der Farbstoff Behandlung genommen. Obwohl Neuronen speziell gekennzeichnet sind, gibt es Hintergrundfluoreszenz, die über 2-3 Tage abnimmt, besser neuronale Bildgebung zu geben. Intensität der lebenswichtigen Färbung lehnt nach 72 h.
   5. Um Änderungen in der Morphologie der Scheibe im Laufe der Zeit zu folgen, müssen Sie die Scheiben alle 7 Tage.

7. Scheibe Imaging

1. Scheiben auf einem inversen Mikroskop ansehen Für die hellsten Fluoreszenz-Bildgebung bei 24 h vor Bildgebung, Austausch von Kulturmedium mit kompletten Neurobasal A Medium ohne das Phenol Red-pH-Indikator.
   Hinweis: Für Experimente hier berichtet, sind Scheiben auf eine invertierte Spinning Disk konfokale Fluoreszenzmikroskop ausgestattet mit einer linearen codiert angesehen x, y-Bühne mit Piezo-Z-Steuerung und eine sensible hochauflösende digitale Kamera.
2. Übertragen Sie das Rohr mit der Slice-Kultur, aus der Walze Rohr Vorrichtung, die maßgeschneiderte Rohrhalter (Abb. 5A), abgebildet werden erteilte im Stadium-Adapter (Abb. 5B), das Deckglas senkrecht zu halten Das Ziel und die Scheibe in der gleichen Orientierung während sich wiederholende imaging Sessions über lange Zeiträume zu erhalten.
3. Schieben Sie den Schieberegler auf der Bühne-Adapter fest gegen das Rohr, das Rohr in Position (Abb. 5B) zu halten.

Um festzustellen, wie genau so Markierungen können genutzt werden, um die gleichen Zellen in den gleichen Bereichen im Laufe der Zeit Reimaging, untersuchten wir Scheiben auf komplexeste Deckgläsern(Abbildung 6)angebaut. Neuronen wurden visualisiert durch Färbung mit einem vital-Farbstoff (100 nM für 2 h; nicht-neuronalen Zellen keine Flecken), die verschwindet aus Neuronen im Laufe der Zeit ohne Schädigung der Zellen-²⁵. Wir ermittelten eine treuhändische Mark in eine einzelne Planquadrat (Abbildung 6A, B), eine Region von entscheidender Bedeutung Farbstoff-markierten Neuronen 24 h nach Kennzeichnung gefunden erfasst die x und y Positionen aus die treuhändische Markierung (Abb. 6B) versetzt und gesammelt, verwenden ein 60 X Ziel konfokale Bild Stapel dieser Region, die Bildgebung an 4 aufeinander folgenden Tagen zu wiederholen. Die maximale Projektion von Bildern aus einem 30 µm Bildstapel an der gleichen Stelle getroffen werden (Abbildung 6C-F) angezeigt. Obwohl einige morphologischen Veränderungen innerhalb der Region über 4 Tage auftreten, können die identischen Zellen (von denen einige gekennzeichnet sind) im Laufe der Zeit verfolgt werden. Der Fluoreszenzintensität der lebenswichtigen Färbung sank im Laufe der Zeit aber Neuronen waren noch eindeutig identifizierbare 4 Tage nach der Kennzeichnung. Obwohl die meisten der neuronalen vital Farbstoff Fluoreszenz war diffus im Zytoplasma, einige punctata Färbung wurde immer beobachtet, die immer mehr bemerkbar als Hintergrundinformation Fluoreszenz abgelehnt. In ungesunden Scheiben wurde eine punktförmige Anfärbung von nicht-neuronalen Zellen auch als Scheiben verschlechtert beobachtet. Diese Ergebnisse zeigen, dass identifizierte Zellen in Scheiben wiederholt abgebildet werden können, mithilfe von treuhändische Marken um zu finden.

Zeitabhängige Veränderungen in neuronalen Organisation und Rentabilität innerhalb Scheiben während langfristige Kultur untersuchen, folgten wir die gleichen Scheiben über 5 Wochen Etikettierung mit neuronalen vital Fluoreszenzfarbstoff einmal pro Woche 24 h vor der Bildgebung. Mehrfache Umläufe der Färbung mit diesem lebenswichtigen Farbstoff über mehrere Wochen erhöhte Ansammlung der Aggregate. Neuronen im frisch vergoldeten Slices, die noch im Plasma Klumpen waren mit Farbstoff geladen wurden und an einem Tag in Vitro (1 DIV) abgebildet. Die gleichen Scheiben wurden noch einmal pro Woche für 5 Wochen abgebildet. Bilder aus einer einzigen Scheibe mit einem Objektiv 4 X gewonnen werden (Abb. 7A-E) angezeigt. Die pyramidale Zellschichten der CA und DG Regionen sind hell beschriftet, wenn Sie gereizt bei 488 nm und Fluoreszenz Emission gemessen an > 620 nm. Über einen Zeitraum von 5 Wochen der Beobachtung 19 Scheiben, drei Scheiben löste sich das Deckglas und zwei andere verloren ihre typische Morphologie und undurchsichtig, wurde ein Hinweis auf ihren Tod. So eine Überlebensrate von ca. 70 % für Experimente betrachtet werden, und zusätzliche Scheiben bereit, eine angemessene Anzahl für die Analyse zu gewährleisten. Scheiben wurden bei einer Nenndicke Einstellung auf das Gewebe Chopper von 300 µm vorbereitet. Nach 5 Wochen in Kultur haben wir die Scheibendicke von bildgebenden neuronalen vital Farbstoff gefärbt Scheiben aus dem Deckglas, durch die Scheibe mit einem 40 X Öl Ziel auf einer drehenden Scheibe confocal Mikroskop gemessen. Verlust des Fokus von Neuronen ereignete sich um durchschnittlich 257 nm (n = 5 Scheiben mit mehreren Standorten pro Stück verwendet), zeigen, dass sehr wenig Ausdünnung des Slice aus der Zeit der Beschichtung stattgefunden hätte. Wir konnten nicht genau messen die Scheibendicke von Fluoreszenz-Mikroskopie zum Zeitpunkt der Beschichtung, weil der lebenswichtige Farbstoff in das Plasma Gerinnsel gefangen diffuse Fluoreszenz macht es schwierig gab, genau die Position zu messen an der Verlust des Fokus aufgetreten ist. 3D-Bilder von Neuronen in Scheiben sind jedoch leicht in Scheiben erhalten, nachdem das Plasma Gerinnsel entfernt ist. Der 21 DIV-Scheibe, gezeigt bei kleiner Vergrößerung in Abbildung 7F, war 3 Tage nach dem Laden mit der neuronalen vital Farbstoff mit einem 60 X-Ziel auf einem confocal Mikroskop (1 µm Schritten) abgebildet. Ein 3D-Bild 60 µm entstand aus den fokalen Ebenen (Abbildung 7G). Neuronen und deren Neuriten Prozesse, die mit dem lebenswichtigen Farbstoff gekennzeichnet sind können in 3D verfolgt werden. Morphologie und 3D-Struktur der Scheiben waren gepflegte über mindestens 3 Monate, und die längste Zeit dienten in der aktuellen Studie.

Größere Änderungen in der Morphologie der eine zuvor gesicherte Position kam es auch in einigen Scheiben, was darauf hindeutet, dass Bewegung der Scheibe auf dem Deckglas stattfinden kann. Sicherlich, über längeren Abständen zwischen Bildgebung wurde es schwieriger mit Sicherheit wissen, dass die Zellen im Feld abgebildet wird identisch mit den vorherigen imaging Sessions zu beobachten waren. So zeigen maximale Projektion von Bildern der konfokalen Stapel von lebenswichtigen Farbstoff-markierten Scheiben erwarb an der gleichen Stelle mit dem Ziel, 60 X in wöchentlichen Abständen von 4 Wochen (Abbildung 8), neuronalen Lebensfähigkeit gut gepflegt ist, aber es ist schwierig, ein bestimmtes Neuron im Laufe der Zeit zu identifizieren, wenn Bilder mit lange Zeitintervalle zwischen den Sitzungen erhalten werden. Vermutlich wäre das Muster der Zellen mit mehreren Fluorophore beschriftet mehr leicht zu erkennen, wie Zellen in lokalisierten Gruppen beim durch Scrollen durch ein Bildstapel zu beobachten sind.

Um den Nutzen der verschiedenen viralen Vektoren für die Einführung von exogenen Gene in Neuronen des Hippokampus Scheiben zu beurteilen, vergleichen wir Slice Infektiosität mit AV, AAV und rekombinante Lentivirale Vektoren, jeweils verschiedene fluoreszierende Tags zum Ausdruck zu bringen oder mit verschiedenen Promotoren auf Laufwerk Ausdruck. AV (2 x 10⁷ infektiösen U/Slice) mit dem Ausdruck Cofilin-mRFP hinter eine starke, nicht-Zelle spezifische CMV Promoter wurde verwendet, um eine Maus hippocampal Scheibe zu infizieren, die kultivierten 9 Wochen auf Deckgläsern gewesen war. Ausdruck von Cofilin-mRFP fand im ganzen Stück auf 5 Tage nach der Infektion, mit Ausdruck am intensivsten an der Peripherie der Scheibe als mit einem 4 X Objektiv (Abbildung 9A) beobachtet. Zellen innerhalb der Scheibe mit dem Ausdruck Cofilin-mRFP wurden auch mit einer 20 X Objektiv (Abbildung 9B) mit einigen hellen punctata Färbung beobachtet und auch Ausdruck in Neuronen und nicht-neuronalen Zellen diffundieren. Nach 17 Wochen in Kultur (8 Wochen nach der Infektion) bildeten sich spontane Cofilin-Stäbe in einigen Zellen vermutlich angetrieben durch Überexpression von Wildtyp Cofilin-mRFP (Abbildung 9C)^26,27.

Wir haben auch gezeigt, dass AAV (10¹⁰ Partikel) könnte für die Expression in Scheiben verwendet werden.Bilder von Scheiben 9 Wochen in Kultur mit AAV, in dem bestimmte neuronale synapsin Förderer GCaMP5 Cofilin mRFP mit einem selbst anhaftenden P2A Peptidsequenz Ausdruck in der Linker die übersetzten funkionalen²¹, fuhr infiziert wurden erfassten 8 Wochen nach der Infektion (17 Wochen in Kultur). In Neuronen, die Ausdruck der GCaMP5 und Cofilin-mRFP bildeten einige Cofilin Stangen/Aggregate (Abbildung 9D-F). Die Fluoreszenzintensität der Stangen/Aggregate war so stark, dass sehr wenig Fluoreszenz von einem diffusen Cofilin-mRFP ohne vollständige Sättigung beobachtet werden konnte und blühenden Cofilin Fluoreszenz Bild der Stangen. Spontane Cofilin Stäbe erscheinen in Neuronen in denen Wildtyp Cofilin-fluoreszierende Protein Chimären haben wurden stark exprimierten^26,27, sowie in Neuronen¹⁰betonte. Basierend auf der Titer von Adenovirus, die auf der Grundlage der Infektiosität¹⁴ und Partikelzahlen verwendet zur Bestimmung der AAV-Titer bestimmt werden, etwa 100 bis 500 fache höhere Partikelanzahl des AAV sind erforderlich, um etwa die gleiche Infektiosität / Ausdruck in Scheiben, die im Vergleich zu AV

Um rekombinante Lentivirus-vermittelten Expression von fluoreszierenden Proteinen in Scheiben zu folgen, wurden Scheiben 6 DIV mit 1, 3, 10 und 30 µL-Aliquots der rekombinanten Lentivirus für neuronale Konkretisierung (Wirbeltiere Promotor) von Cofilin-R21Q-mRFP infiziert, als ein live Cell imaging-Sonde für Cofilin-Aktin Stab Bildung¹⁶entwickelt. Scheiben wurden mit neuronalen vital Farbstoff auf 11 DIV beschriftet und abgebildet in bestimmten Regionen für den Farbstoff und Cofilin-R21Q-mRFP Ausdruck auf 12 und 14 DIV. Die Scheibe mit den 30 µL Aliquote des Virus infiziert überlebte nicht für die Bildgebung aber dreifacher Scheiben behandelt mit die anderen Bänden der Virus zeigte einen dosisabhängige Ausdruck des mRFP. Abbildung 10 zeigt Bilder von Scheiben mit 1 µL und 10 µL Lentivirus bei 6 bis 8 Tage nach der Infektion infiziert. Mehreren Regionen von zwei verschiedenen Scheiben wurden für Co Färbung der Neuronen mit den lebenswichtigen Farbstoff und mRFP Ausdruck quantifiziert. Für Scheiben mit 1 µL Lentivirus infiziert ausgedrückt etwa 28 % der Neuronen mRFP auf 6 Tage nach der Infektion, von 8 Tage nach der Infektion auf 85 % erhöht. Für Scheiben mit 10 µL Lentivirus infiziert ausgedrückt etwa 58 % der Neuronen mRFP auf 6 Tage nach der Infektion, auf 86 % von 8 Tage nach der Infektion erhöhen. So war die Lentivirus 1 µL ausreicht, um weit verbreitete Scheibe Infektiosität und neuronale Ausdruck von 8 Tage nach der Infektion.

Um zu demonstrieren, dass diese Kultursystem nützlich bei folgenden Entwicklung von Cofilin Pathologie, Scheiben mit Lentivirus für den Ausdruck von Cofilin-R21Q-mRFP in Neuronen infiziert blieben unbehandelt oder behandelt mit verschiedenen Konzentrationen (1 µM, 333 nM und 100 nM) des synthetischen menschlichen Aβ-Protein, das Inkubation Form Oligomere²⁸unterzogen hatte. Ergebnisse aus früheren Studien gezeigt, dass synthetische Aβ-_o Cofilin-Aktin Stäbe in bis zu 25 % der dissoziierten hippocampal Neuronen^29,30,31zu induzieren. Alle drei Scheiben mit 1 µM-Konzentration von Aβ behandelt kam locker aus dem Deckglas in den ersten 24 h, während alle Fahrzeug Scheiben (Kontrolle) und diejenigen mit der 333 behandelt nM und 100 nM-Konzentrationen von Aβ überlebt für die zwei Wochen, die folgten waren. Die gleichen zellulären Regionen (CA1, CA3 und DG) in einer Scheibe mit 100 nM Aβ_o behandelt wurden abgebildet (60 X Objektiv) über mehrere Tage. Kontrolle-Scheiben, die auf 6 DIV mit Lentivirus für den Ausdruck von Wirbeltiere angetrieben cofilinR21Q-mRFP infiziert waren hatte diffusen zellulären mRFP Ausdruck von 15 DIV (Abbildung 11A). Scheiben, 100 nM Aβ_o bei 14 DIV ausgesetzt und bei 15 DIV abgebildet hat gezeigt, dass die Verteilung von Cofilin-R21Q-mRFP punctata, erscheinen in beiden Stab förmige Strukturen und Aggregate (Abbildung 11B) wurde. Diese Strukturen wurden noch deutlicher 6 Tage nach der Aβ-Behandlung (Abbildung 11C, die das gleiche Feld von Zellen als Abbildung 11Bist). An vielen Orten reich an Neuriten wo neuronale Zelle Somas (Abbildung 11D) fehlen, entwickelt punctata und stabförmige Arrays von cofilinR21Q-mRFP (Pfeile in Abbildung 11C), ähnlich wie bei der Verteilung von Cofilin-Aktin Stangen berichtete zuvor innerhalb Neuriten von Aβ-behandelten Neuronen in Kultur^29,30,31. Also, diese neue Methode zur Kultivierung und hippocampale Scheiben beobachten erlaubt Benutzern, bestimmen die langfristige Lebensfähigkeit von Zellen in denen Cofilin aggregiert und Stangen Form und die Reversibilität der Pathologie in verschiedenen Stadien der Entwicklung, und leicht Dosis-Wirkungs-Messungen auf Reagenzien, die blockieren oder umgekehrt die Bildung von Cofilin Pathologie in eine weitere in-Vivo-wie zelluläre Organisation.

Abbildung 1: Vorbereitung der Walze Rohr Rack. (A) Vorlage für die Kennzeichnung von Positionen für das Bohren, die 15 cm Gewebekultur Gericht Böden. Wenn die Abbildung auf die Größe des Maßstabs gezeigt gedruckt wird, können Sie Ausschneiden und verwendet zur Kennzeichnung von Positionen in der Kulturschale 15 cm zum Bohren von Löchern, die gezeigt werden. (B) abgeschlossen Walze Rohr Rack mit zwei Röhren eingesetzt. Jedes Rack ist auf einem Aufkleber gut sichtbar auf der Oberseite des Racks nummeriert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 2 : Vorbereitung der Walze Kultur Röhren. (A) Vorderansicht von der Tuchwelle in einer Spannvorrichtung auf einer Bohrmaschine zum Bohren 6 mm Loch in das Rohr eingesetzt. Gestrichelte Linie zeigt die Position des flachen doppelseitige Tuchwelle in der Vorrichtung. (B) Ende Aussicht auf der Vorrichtung mit der Röhre eingefügt und Bohrer über Loch ausgerichtet. (C) Draufsicht auf das Loch in der Spannvorrichtung für, Walze Röhren mit einem 6 mm Bohrer bohren.Weißer Pfeil zeigt die Position des Cut-off Nagels als Anschlag für die Positionierung der Rohre eingelegt, und schwarze Doppellinien sind für wenig ausrichten. (D) Frühjahr Clips (schwarzer Pfeil) auf Jig unten sicher installiert es in Position zu beim Bohren von halten Rohren. (E) nach dem Bohren Sie das Loch, die Kanten mit einem Entgraten Werkzeug geglättet sind und Rillen auf der inneren Seite des Loches (Einschub zeigt das Loch durch eine Dissektion Mikroskop betrachtet) geschnitten, mittlere ablassen aus dem Loch während der Drehung der Röhre zu verbessern. (F) Kultur Rohr mit dem Loch ausgerichtet, ein Loch in die Silikon-Kautschukkleber, an die das Deckglas angefügt werden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 3: Vorbereitung der hippocampalen Gehirnscheiben. Fotos, die mit einer Dissektion Mikroskop zeigt: (A) intakten Mäusegehirn. Position der Kürzungen Vorderhirn und Kleinhirn zu entfernen sind als blau gestrichelte Linien dargestellt. (B) nach der Entfernung des Vorderhirns und Kleinhirn. (C) Stück des Gehirns von B ist 90 ° mit Seitzahnbereich (in Richtung des Kleinhirns) nach oben gekippt. Positionieren das Stück an der Seite des Tellers hilft mit der Entfernung des Zwischenhirns (blau gestrichelte Kreis), Weg von den übrigen Hippocampus, Thalamus und Hypothalamus gehänselt werden kann. Zwei Einschnitte mit der Zange (blau gestrichelt) erlauben das Reststück mit dem Hippocampus aus beiden Hemisphären, flach zu verbreiten. (D) das abgeflachte Gehirn Stück zeigt das Blutgefäß, die entlang der hippocampalen Fissur (blauer Pfeil). Dieses Gewebe wird auf Kunststoff-Folie gelegt und auf der Gewebe-Chopper für das Schneiden in die Richtung der gestrichelten Linie übertragen. (E) in Scheiben geschnitten Gewebe zeigt etwas mehr als die Hälfte den Hippocampus nach GBSS/Glucose zurückgegeben werden. (F) endgültige Dissektion des Hippocampus und Reinigung der Scheiben nicht hippocampal Material zu entfernen. (G) mehrere schwimmende Scheiben nach der Endreinigung. (H) vergrößerte Foto eines einzelnen Segments für Transfer zum Deckglas. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 4 : Galvanik und Inkubation Scheiben. (A) A Maus hippocampal Slice aus der Kulturschale an der Spitze einer Spachtel mit der Spitze der Zange helfen es frei von der Lösung entfernt. (B) die Scheibe liegt flach in der Mitte des einen komplexeste und 12 mm Deckglas auf 2 µL Huhn Plasma behandelt und eine weitere 2,5 µL einer 1:1 Plasma/Thrombin-Mischung wird hinzugefügt, um ein Blutgerinnsel zu generieren. (C) Nachdem das Gerinnsel festgelegt ist (ca. 1-2 min.), die Abdeckung ist aus Silikon Kautschuk Klebstoff Kreis auf eine Tuchwelle entfernt und das Deckglas befindet sich mit den Klumpen zentriert in das Loch; dann das Deckglas ist im Ort mit dem Daumen gedrückt und in Position für ca. 1 min. (D) Add 0,8 mL komplette Kulturmedium gehalten. (E) Roller Schlauch Halter innerhalb einer großen Walze Inkubator mit vorne angehoben, um 5° halten das Medium an der Unterseite der Rohre zu kippen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 5: Rohr Rollenhalter und Bühne Platte Inkubator. (A) Schlauchhalter, die das Rohr positioniert, dass das Deckglas beibehalten wird in Position für die Bildgebung. (B) Rohrhalter montiert in einem Mikroskop-Bühne-Adapterplatte. Schieberegler auf der Seite halten Sie das Röhrchen sicher für die Bildgebung. (C) Bühne Adapter mit Schlauch Halter und Side Panels mit Heizung-Streifen mit einem thermoelektrischen Temperatur-Controller verbunden hinzugefügt. Sobald Röhren montiert und aufgestellt sind, kann eine massive Decke zum Feld hinzugefügt werden, zur Aufrechterhaltung der Temperatur während der Bildgebung. Orangefarbene Kabel wird das Thermoelement. Plant Design und Aufbau der Bühne Adapter und Heizung sind erhältlich bei: https://vpr.colostate.edu/min/custom-machining/roller-tube-holder/.  Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 6 : Mit treuhändische Marken für sich wiederholende Darstellung der gleichen Zellen. (A) Hippocampal Slice auf komplexeste Deckglas (1 mm Quadrate) mit Subiculum entfaltet (Tail) mit 4 x Objektiv und hellen Bereich Beleuchtung betrachtet. Krümmung der Kunststoff Tuchwelle hilft ein Schrägbeleuchtung erstellen, die die Visualisierung des Gitters erhöht. Das Feld zeigt die Position und Größe von 60 X Feldinhalten. (B) ein Blick auf die gleichen Scheibe mit 20 X Zielsetzung für die treuhändische Mark als die Spitze des unteren Rands der 4 vom Platz 34 zu finden. Die y und X-Offsets werden angezeigt, die Mitte der gewünschten Box für höhere Vergrößerung confocal Imaging reproduzierbar zu finden. (C–F) Eine Scheibe mit neuronalen vital Farbstoff, 13 DIV abgebildet war, eine 60 X Objektiv und ein 30 µm Projektionsbild an 4 aufeinander folgenden Tagen (14-17 DIV) gekennzeichnet. Identische Neuronen wurden jeden Tag abgebildet. Ein anderes Symbol kennzeichnet die Position des Kerns in jedem der drei Neuronen. Sie werden leichter durch Scrollen durch Bild-Stacks als ihre 3D-Position Änderungen leicht identifiziert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 7 : Imaging Neuronen in Scheiben mit einem neuronalen vital Farbstoff. (A) neuronale vital Farbstoff gefärbt Slice im Plasma Gerinnsel 24 h nach Beschichtung mit 4 X Objektiv genommen. Farbstoff (100 nM) wurde hinzugefügt, wenn die Scheibe wurde zuerst in der Röhre Rollenhalter und 2 h später ausgewaschen.Subiculum ist um den Hippocampus in das Gerinnsel gewellt. (B–E) Nach Auflösung der Gerinnsel durch Plasmin am 6 DIV hinzugefügt wurde die Scheibe 5 Mal mit dem lebenswichtigen Farbstoff 24 h im Voraus Bildgebung in wöchentlichen Abständen neu geladen. Die gezeigten Bilder wurden gesammelt, 8, 21, 28 und 35 DIV (B–E, beziehungsweise). (F) Hippocampal Scheibe für 3 Wochen kultiviert und befleckt mit neuronalen vital Farbstoff 24 h im Voraus Bildgebung mit 4 X Objektiv. (G) konfokale Stapel von Bildern auf die gleiche Scheibe wie in F zeigt eine 3D-Ansicht des 61 Flugzeuge in regelmäßigen Abständen 1 µm genommen. Neuronale vital Farbstoff Etiketten deutlich Neuriten und Zellkörper, aber es ist aus dem Zellkern ausgeschlossen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 8 : Sich wiederholende imaging von Neuronen an einem einzigen Ort des Segments über 4 Wochen. Maximale Projektion von Bildern von 30 µm konfokale Bild Stacks im gleichen Bereich der Zellen (durch Positionierung) von vital Farbstoff-markierten Scheiben genommen 12, 20, 30 und 40 DIV (A–D, beziehungsweise). Es ist schwierig, einzelne Zellen wiederholt über längere Zeiträume in Projektion von Bildern zu identifizieren. Aber auch über diese langen Zeiträume Identifikation der gleichen Zellen ist oft möglich, indem Sie einen Bildlauf durch die Bild-Stacks oder 3D-Bilder erstellen, kann gedreht werden, so wie in Abbildung 7G. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 9 : Viral-vermittelten Expression und Bildgebung von fluoreszierenden Proteinen. (A) Hippocampal Scheibe für 9 Wochen kultiviert und mit Adenoviren für den Ausdruck von Cofilin-mRFP hinter Förderer CMV infiziert. Ausdruck fand in der gesamten Scheibe an 5 Tage nach der Infektion aber Fluoreszenz war hellsten in der Nähe der Slice-Peripherie. (B) dasselbe Segment zeigte Ausdruck in Zellen tiefer in die Scheibe mit 20 X Objektiv betrachtet. Bild ist eine Projektion von einem Stapel von 20 Bildern 2 µm voneinander beabstandet. (C) dasselbe Segment wurde nach 17 Wochen in Kultur (8 Wochen nach der Infektion) untersucht und Cofilin mRFP wurde im Stab förmige Aggregate beobachtet, wie in diesem Projektionsbild von einem 70 µm Stapel von 23 Bildern, 3 µm auseinander, gesehen mit einem 40 X Objektiv aufgenommen. (D–F) Maus hippocampal Scheibe 9 Wochen in Kultur mit ein Ausdruck einer GCaMP5 - AAV infiziert (P2A) - Cofilin - mRFP hinter synapsin Förderer. Fluoreszenz war nach 10 Tagen in roten und grünen Kanal sichtbar. Ein einziges Flugzeug Bild der Scheibe zeigt der Expression von (D) GCaMP5, Kalzium sensibler Reporter, (E), viele Cofilin-haltigen Stäbe und (F) ein Overlay-Bild. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 10 : Ausdruck von Cofilin-R21Q-mRFP angetrieben von einem synapsin Förderer in Neuronen infiziert mit rekombinanten Lentivirale Vektoren. Erkennung eines schwache Fluoreszenz-Signals wird zuerst durch über 3 bis 4 Tage nach der Infektion mit 10 µL des Virus beobachtet und von 5 bis 6 Tage, (E) nutzbar wird, wie in diesen Bildern erworben mit einem 60 X Ziel gesehen. Obwohl es dauert länger, das gleiche Maß an Ausdruck mit 1 µL des Virus zu erreichen, indem 8 Tage nach der Infektion ein ähnlicher hoher Anteil an Neuronen (vital Farbstoff beschriftet) wurden zum Ausdruck Cofilin-R21Q-mRFP. Nur 27 % der Neuronen waren positiv für mRFP Fluoreszenz bei 6 Tage nach der Infektion mit 1 µL (A, B), aber dies auf 85 % (C, D) 8 Tage ausgeweitet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 11 : Aβ Oligomer-induzierte Cofilin Pathologie in Maus hippocampal Scheiben. Alle Bilder als 30 µm Bild stacks mit einer 60 X Objektiv und als maximale Projektion von Bildern angezeigt werden. Scheiben mit Cofilin-R21Q-mRFP infiziert waren, bei 6 DIV. (A) 15 DIV Scheibe behandelt auf 14 DIV mit Fahrzeug (DMSO/Schinken F12 Mittel zur Erzeugung von Aβ-_o). (B) Scheibe 15 DIV mit 100 nM Aβ_obehandelt. (C) dasselbe Feld wie in B an 20 DIV genommen und in (D) als Overlay mit neuronalen vital Farbstoff Label angezeigt. Pfeile zeigen die lineare Anordnungen von Cofilin Aggregate und Stangen in der Region des Segments die Neuriten aber paar Zellkörper enthält. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Die hier beschriebene Methode der Walze-Röhre ermöglicht langfristige Kultivierung und hochauflösende live Imaging von geschnittenen Hirngewebe. Ein großes Problem mit der Slice-Technik wie hier ist bei der Montage und Wartung von Scheiben. Deckglas Beschichtungen, die Slice-Adhäsion, unterstützen fördern Slice Ausdünnung durch die Stärkung der Auswuchs Neuriten und Wanderung von Zellen aus der Scheibe; wir vermieden die Verwendung dieser Substrate. Das Einfügen von Aminogruppen auf das Glas durch Behandlung mit 3-Aminopropyltriethoxysilane verbessert die Einhaltung der Scheiben, aber zu wenig oder zu viel Huhn Plasma auf das Deckglas kann auch Probleme festhalten führt zum Verlust der Scheibe. Das Volumen der Plasma benötigt für gute Haftung richtet sich nach der Größe des kultivierten Gehirn Slices und somit ist größer für Ratte hippocampal Scheiben, die in Bereich als Maus Gehirnscheiben etwa 4 mal größer sind. Wenn zuviel Plasma unter der Scheibe gerinnt, Zelladhäsion auf das Deckglas ist beeinträchtigt und Behandlung mit Plasmin löst die Scheibe, so dass es entweder Position ändert oder vollständig löst. Jedoch führen zu wenig Plasma in das Gerinnsel zu Slice Verlust in den ersten Tagen der Rotation im Inkubator. In einem kürzlich durchgeführten Experiment mit 39 Scheiben drei waren verloren, aber einige von diesen verlorenen kann von Slice-Schäden, die während der Sliceprozess geführt haben. Dennoch bereiten wir in der Regel etwa 50 % mehr Scheiben als die geschätzte Zahl für das Experiment benötigt. Die zweithäufigste Ursache für Probleme der Kultur ist eine Undichtigkeit des Mediums auf das Deckglas Siegel. Dieses Problem verschlechtert sich, wenn Deckgläsern nicht fest in Position für mindestens 1 min gehalten werden nach ihnen mit dem Siegel anbringen. Wärme aus dem Daumen Druck am ehesten angewendet hilft die Haftung abzuschließen. Leckage, die auftritt, wird oft durch kleine Luftkanäle unter dem Deckglas, die mit einer Dissektion Mikroskop beobachtet werden können. Diese verschwinden in der Regel auf die Verwendung längerer Daumendruck. Verlust von etwa 2 % der Kulturen durch langsame Leckage zu rechnen und somit es wird empfohlen, 10 Tage nach dem Einrichten der Kulturen vor Virusinfektionen zu warten. Übermäßige Daumendruck, kann vor allem, wenn ungleichmäßig über das Deckglas produziert auch das Deckglas zu knacken. Wenn Bruch ein Problem darstellt, könnte drücken die Rohre sich flach auf eine Gummiunterlage Maus erwärmt in einem Inkubator helfen, um noch mehr Druck auf das Deckglas zu bieten.

Zuvor beschriebenen Methoden für Gehirn Stück Kultur auf Membranen an der Grenzfläche Luft-Flüssigkeit (offenes System) oder einem Glas Deckgläschen innerhalb einer versiegelten Kunststoff-Rohr (geschlossenes System) sind sehr effektiv für das langfristige Überleben der Scheibe, aber jede Methode hat seine Stärken und stärken und Schwächen. Slice-Kulturen auf Membranen an der Luft flüssigen Schnittstelle sind vorteilhaft für die kombinierte elektrophysiologische Studien mit Immersion Ziele für hochauflösende Bildgebung⁷, aber haben Nachteile in Bezug auf die Suche nach genauen Bereich von Zellen für Reinstallation über Zeit und potenzielle Benutzer Strahlenexposition und objektiven Kontamination bei viral-vermittelten Genexpression. Einsatz von Viren für den Ausdruck von transgenen ist sicherer und leichter in einem geschlossenen System durchgeführt wo Verunreinigung des Mikroskops Ziele kein Problem. Unsere modifizierte Walze Rohr Methode gibt Zugang des Segments für hochauflösende Bildgebung, obwohl es nicht für elektrophysiologische Untersuchungen zugänglich ist.

Slice Kulturbedingungen für viele Regionen der Nager Gehirn²festgelegt, aber hier wir nur Hippocampus zu nutzen, denn es eines der am häufigsten untersuchten Hirnregionen ist und Veränderungen im Hippocampus von großem Interesse in Studien von sind kognitive Beeinträchtigung. Die pyramidenförmige Zellschichten der CA und DG Regionen pflegen ihre Organisation über mehrere Wochen in Kultur und morphologisch leicht beobachtet werden können. Wir haben eine neu entwickelte fluoreszierende neuronalen Lebensfähigkeit Marker²⁵, verwertet die Fluoreszenzeigenschaften hat, die lassen Sie es zur Überwachung der neuronalen Lebensfähigkeit und Organisation im Hippokampus Scheiben über Zeiträume von Tagen bis Monaten aber auch kompatibel mit dem Einsatz von vielen anderen fluoreszierende Proteine und Reporter. Obwohl nicht optimal für Neuro-Fluoreszenz²⁵, können wir an NeuO bei 488 nm und Maßnahme Emission bei begeistern > 617 nm. Treuhändische Markierungen auf die komplexeste Deckgläsern half die gleichen Zellen wiederholt über viele Tage der Kultur zu finden und erlaubt uns, Bild identisch Regionen der Scheiben über viele Wochen. Praktisch aufgetreten keine erhebliche Ausdünnung der Scheiben auf die veränderten Glasdeckgläser 5 Wochen in der Kultur, die längste Zeitpunkt wofür wir Slice Dickenmessung erhalten.

AV, AAV und rekombinanten Lentivirus Vektoren eignen sich gut für exogene Gene in Scheiben zum Ausdruck zu bringen. Lentivirus mit einem neuronalen spezifischen Promotor eignet sich besonders für den Erhalt der Ausdruck in einem sehr hohen Prozentsatz (> 85 %) von Neuronen innerhalb 8 Tage nach der Infektion. Darüber hinaus zeigen wir, dass die Cofilin-Aktin Stab Pathologie im Zusammenhang mit Entwicklung von kognitiven Defiziten in menschlichen AD^10,11 und Aβ überexprimierenden Maus AD Modelle³² Stück Kulturen behandelt mit überwacht werden können relativ niedrigen Konzentrationen (100 nM) des synthetischen menschlichen Aβ-_o. Unser Ziel ist, dass zukünftige Anwendungen dieser Methode Charakterisierung neuen Therapeutika enthalten um umzukehren Cofilin-Aktin Stab Pathologie und/oder richtige dendritischen Spine-Anomalien, die in vielen neurologischen Störungen³³auftreten.