Method Article
* These authors contributed equally
قدم هنا طريقة أنبوب اسطوانة معدلة لاستزراع وتصوير عالي الدقة متقطعة من الدماغ القوارض شرائح الأسابيع كثيرة مع إعادة تنظيم دقيق في كوفيرسليبس فوتوتشيد. كذلك يتم الاحتفاظ بصلاحية الخلايا العصبية ومورفولوجيا شريحة. يتم توفير تطبيقات هذا النظام مغلق تماما استخدام الفيروسات للتعبير نوع من الخلايا المحددة.
شرائح الدماغ القوارض مثقف مفيدة لدراسة سلوك الخلايا العصبية وإطلاق في بيئة التي يحتفظ العديد من تفاعلاتها طبيعية في فيفو الخلوية والجزيئية. الشرائح التي تم الحصول عليها من مجموعة متنوعة من خطوط الماوس المحورة وراثيا أو استخدام النواقل الفيروسية للتعبير عن البروتينات فلوريسسينتلي المعلمة أو الصحفيين في شرائح الدماغ نوع البرية السماح للتصوير عالي الدقة بالفحص المجهري الأسفار. على الرغم من أن قد وضعت عدة طرق لتصوير شرائح المخ، الجمع بين الثقافة شريحة مع القدرة على القيام بتصوير عالي الدقة المتكررة من خلايا معينة في شرائح حية على مدى فترات زمنية طويلة قد يطرح مشاكل. وهذا ينطبق بشكل خاص عند استخدام النواقل الفيروسية للتعبير عن البروتينات الخارجية حيث يتم ذلك أفضل في نظام مغلق حماية المستخدمين ومنع حدوث التلوث المنتقل. ويفاد بسيطة التعديلات التي أدخلت على أسلوب ثقافة شريحة الدماغ أنبوب الاسطوانة التي تسمح بتصوير عالي الدقة المتكررة لشرائح على مدى أسابيع عديدة في نظام مغلق. استزراع شرائح في كوفيرسليبس فوتوتشيد يسمح باستخدام علامات الاعتماد لسرعة ودقة تعيين موضع مرحلة الصورة الميدانية متطابقة مع مرور الوقت قبل وبعد العلاجات المختلفة. وترد أمثلة لاستخدام هذا الأسلوب جنبا إلى جنب مع تلطيخ الخلايا العصبية المحددة والتعبير لمراقبة التغييرات في بنية شريحة هيبوكامبال والفيروسية بوساطة التعبير العصبية من البروتينات الفلورية وتطوير علم الأمراض كوفيلين، سابقا الذي لوحظ في قرن آمون لمرض الزهايمر (AD) ردا على معاملة الشريحة مع ليغومرات الببتيد اميلويد-بيتا (Aβ).
الثقافة الأولية من الخلايا العصبية معزولة من مناطق الدماغ القوارض هو أداة هامة يستخدمها الباحثون لمراقبة الردود على مرضية المتورطين المحفزات. غير أن هذه الدراسات قد عيب تبحث في الخلايا العصبية في 2D فقط ودون نظام الدعم لهم الدبقية. وعلاوة على ذلك، إلا إذا نمت في ظروف كثافة عالية جداً (640 الخلايا العصبية/مم2 أو حوالي 16% من المساحة السطحية) الذي يصبح من المستحيل متابعة ثمرة عشوائية تغصن أو إكسون لأكثر من مسافة قصيرة من جهازها الخليوي، هيبوكامبال صلاحية الخلايا العصبية أكثر من 4 أسابيع انخفاضات كبيرة1، الحد من استخدام الثقافات معزولة لإجراء دراسات موسعة للأمراض المرتبطة بالسن. استزراع شرائح أعدت من الدماغ القوارض هو خيار جذاب أن يتغلب على هذه القيود من خلال الحفاظ العمارة خلية المنظمة وقدرتها على البقاء لأسابيع أو أشهر. وكانت الظروف للحفاظ على العديد من مناطق مختلفة من الدماغ القوارض في ثقافة شريحة وصف2.
اثنين من الأساليب الرئيسية تستخدم على نطاق واسع لثقافة طويلة الأجل من شرائح المخ: يسمح لتدوير في حاضنة اسطوانة توفير تهوية4استزراع على الأغشية في واجهة الهواء السائل3 أو استزراع في كوفيرسليبس في أنابيب محكمة الإغلاق. يمكن تصويرها شرائح مثقف على الأغشية مباشرة مع الفحص المجهري الفلورية العالية الاستبانة استخدام مجهر تستقيم والماء الغمر الأهداف5. بدلاً من ذلك، تم نقل شرائح مثقف في الأغشية للزجاج أسفل الأطباق التوصل إلى حل جيد للعمود الفقري الجذعية استخدام مجهر مقلوب6. ومع ذلك، كلا أساليب التصوير شرائح نمت على الأغشية هي النظم المفتوحة التي تتطلب التغييرات متوسطة، وغالباً ما تستخدم مضاد و/أو المضادات الحيوية لمنع أو الحد من تلوث5،6. الشرائح في غشاء في الواجهة الجوية المتوسطة الحفاظ على مورفولوجيا ممتازة والبقاء على قيد الحياة، ولكن العودة إلى المواقع بدقة أثناء التصوير المتكرر في تضخم عالية من الصعوبة ما لم يتابع التجربة مجموعات صغيرة فقط من الخلايا وإذ تعرب عن علامة نيون. على الرغم من أن قد استخدمت شرائح نمت على الأغشية مع التعبير الفيروسية بوساطة من المتسلسلات5،6، بروتوكولات السلامة الأحيائية قد تتطلب ستستخدم نظام ثقافة مغلقة لبعض النواقل الفيروسية التي يتم استخدامها من أجل وإذ تعرب عن فلوريسسينتلي معلم البروتينات والصحفيين لفيزيولوجيا الخلية. وعلاوة على ذلك، تتطلب أهداف الغمر إزالة التلوث بين العينات التي سيتم اتباعها في الثقافة5. تطبيق الرئيسية واحد من الغشاء واجهة الثقافات هو الجمع بين التصوير عالي الدقة مع الكهربية في وقت واحد النقاط7.
لا يسمح الأسلوب أنبوب الاسطوانة مع كوفيرسليبس داخل أنبوب بلاستيكي أي الكهربية أو تصوير عالي الدقة دون إزالة ساترة. وهكذا طبق هذا الأسلوب في أغلب الأحيان للدراسات الطويلة الأجل التي جعلت الملاحظات التثبيت بعد8. الموصوفة هنا هو طريقة التي يستخدم تقنية الثقافة أنبوب الاسطوانة ولكن المحافظة على أنابيب حفر السحب مع شرائح في كوفيرسليبس التي يمكن تصويرها متكررة لطالما الثقافات. يتطلب أي تغيير متوسطة لتصوير نظام مغلق ويستخدم كوفيرسليبس فوتويتشيد لتقديم علامات الاعتماد التي تسمح للتصوير في تضخم عالية، بعد أيام أو أسابيع، حقول محددة سبق تصويرها.
نقوم بتطبيق هذا الأسلوب لدراسة التغيرات في الحصين القوارض، منطقة الدماغ رئيسية مشاركة في الذاكرة والتعلم. وكثيراً ما يتم دراستها الحصين القوارض كنموذج للتغيرات المرضية أو المرتبطة بالسن التي لوحظت أثناء التطوير من ضعف الإدراك9، مثل تلك التي تحدث في الإعلان. أسلوبنا مناسبة خاصة لدراسة التغييرات المرضية التي تضع ضمن شريحة واحدة على مر الزمن في الاستجابة للتغيرات البيئية، مثل الزيادات في الببتيدات Aβ، التي من سمات AD8. وهو أحد الأمراض المرتبطة بالإنسان والقوارض الدماغ الإعلانية وجود المجاميع كوفيلين-أكتين وقضبان، الحزم التي تحتوي على هذا الأخير من خيوط الأكتين وكوفيلين في 1:1 نسبة مولى10،11، 12-قضبان وقد لوحظت في الشرائح الثابتة الحصين الفئران بعد العلاج Aβ، وكذلك ضمن شريحة الدماغ القوارض يعيش معربا عن التعرض لنقص8كوفيلين-بروتينات فلورية خضراء، وأنها قد تسهم في اختلال وظيفي متشابك في الإعلان والسكتة الدماغية. هنا نستخدم هذا الأسلوب الجديد في تثقيف للالتزام بالوقت بالطبع والتوزيع داخل شرائح أعرب البروتينات الفلورية تشيميريك خارجية عشر أدخلت بأنواع مختلفة من الفيروسات. ثم نستخدم تعبيراً محدداً الخلايا العصبية لبناء كوفيلين مراسل لمتابعة وضع قضيب كوفيلين وأمراض الكلي في شرائح هيبوكامبال استجابة للعلاج مع ليغومرات Aβ القابلة للذوبان (Aβس).
استخدام الحيوان يتبع تربية المعتمدة وبروتوكولات استخدام الحيوانات التي تتوافق مع "العناية بالحيوان" و "استخدام المبادئ التوجيهية من جامعة ولاية كولورادو".
ملاحظة: بروتوكول أدناه يصف طريقة إعداد والثقافة للحضانة الطويلة الأجل وتصوير متقطعة شرائح هيبوكامبال. شريحة هيبوكامبال واحدة موصولة إلى ساترة فوتوتشيد أعدت خصيصا استخدام تجلط بلازما، وثم مختومة كوفيرسليبس على الجانب المسطح من أنبوب حفر خارج الاسطوانة، التي يتم الاحتفاظ بها في حاضنة اسطوانة. يتم حل تجلط البلازما لازمين قبل العدوى الفيروسية لتعبير البروتينات الفلورية وتصوير عالي الدقة. يتم استخدام صبغة حيوية الخلايا العصبية فلورسنت الصورة في الخلايا العصبية داخل الشرائح.
1-إعداد الاسطوانة أنبوب حامل
2-إعداد أنابيب الرول وكوفيرسليبس
3. إعداد شريحة هيبوكامبال
4-طلاء الشرائح
5-إعداد النواقل الفيروسية للتعبير التحوير
ملاحظة: التعبير عن المتسلسلات في الخلايا العصبية للثقافات شريحة يتحقق أما باستخدام العقول من القوارض المهندسة وراثيا، أو عن طريق إدخال التحوير بالإصابة بفيروسات النسخ المتماثل المؤتلف ناقصة.غدية (AV)، وفيروسات الغدد المرتبطة (إف)، وناقلات lentivirus المؤتلف جميعا قد استخدمت في ثقافاتنا شريحة هيبوكامبال للتعبير عن التركيبات بروتين فلوري مختلف شرائح المخ.
6-شريحة العلاجات
7-شريحة التصوير
يمكن أن تستخدم لتحديد مدى دقة علامات الاعتماد reimage نفس الخلايا داخل نفس الحقول على مر الزمن، قمنا بدراسة الشرائح التي نمت في فوتوتشيد كوفيرسليبس (الشكل 6A). كانت تصور الخلايا العصبية بصبغة بصبغة حيوية (100 نانومتر ح 2؛ لا وصمة عار الخلايا غير العصبية)، الذي يختفي من الخلايا العصبية على مر الزمن دون إلحاق الأذى بالخلايا25. وقد حددنا الاعتماد علامة اختيار في مربع شبكة واحدة (الشكل 6أ، ب)، وجدت منطقة الخلايا العصبية الحيوية المسمى صبغ 24 ساعة بعد وضع العلامات، سجلت x وإزاحة مواقف من علامة الاعتماد (الشكل 6ب) y، وجمعها، استخدام هدفا س 60، رصات الصور [كنفوكل] لهذه المنطقة، وتكرار التصوير في 4 أيام متتالية. تظهر الصور الإسقاط الحد الأقصى من كومة صورة 30 ميكرومتر في نفس الموقع (الشكل 6ج-F). على الرغم من حدوث بعض التغيرات المورفولوجية داخل المنطقة على مدى 4 أيام، يمكن أن تتبع الخلايا متطابقة (العديد منها يتم وضع علامة) على مر الزمن. انخفضت كثافة fluorescence الصبغة الحيوية على مر الزمن ولكن الخلايا العصبية لا تزال واضحة المعالم 4 أيام بعد وضع العلامات. على الرغم من أن معظم الأسفار صبغ الحيوية العصبية منتشر داخل السيتوبلازم، بعض تلطيخ الشروريه دائماً لوحظ، التي أصبحت أكثر وضوحاً كخلفية الأسفار ورفض. شرائح غير صحية، تلطيخ الشروريه الخلايا غير العصبية لوحظ أيضا كشرائح تدهورت. وتبين هذه النتائج أن الخلايا التي تم تحديدها في شرائح يمكن تصويرها متكررة باستخدام علامات الاعتماد للعثور عليهم.
دراسة التغيرات تعتمد على الوقت في الخلايا العصبية المنظمة وقدرتها على البقاء ضمن الشرائح أثناء ثقافة طويلة الأجل، تابعنا الشرائح نفسها أكثر من 5 أسابيع، وضع العلامات مع نيون صبغ الحيوية العصبية مرة واحدة في الأسبوع 24 ساعة قبل التصوير. جولات متعددة من تلطيخ مع هذه الصبغة الحيوية على مدى عدة أسابيع زيادة تراكم المجاميع. كانت محملة بصبغ الخلايا العصبية داخل شرائح مطلي الطازجة التي كانت لا تزال في تجلط البلازما وتصويرها في يوم واحد في المختبر (الدرجة 1). تم تصويرها نفس الشرائح مرة أخرى أسبوعيا لمدة 5 أسابيع. تظهر الصور التي تم الحصول عليها من شريحة واحدة مع هدفا 4 x (الشكل 7ألف إلى هاء). طبقات الخلايا الهرمية في منطقتي CA والمديرية العامة المسماة الزاهية عندما متحمس في 488 نانومتر والأسفار الانبعاثات يقاس على > 620 نانومتر. على مدى فترة 5 أسابيع لمراقبة شرائح 19، خرج ثلاث شرائح ساترة واثنين آخرين فقدت التشكل نموذجي وأصبحت معتمة، مؤشرا على وفاتهم. وبالتالي، ينبغي النظر في معدل البقاء على قيد الحياة من حوالي 70% للتجارب، وإعداد شرائح إضافية لضمان وجود عدد كاف للتحليل. تم إعداد الشرائح في إعداد سمك اسمية على المروحية الأنسجة من 300 ميكرون. بعد 5 أسابيع في الثقافة، قمنا بقياس سمك الشريحة بتصوير الخلايا العصبية الحيوية الملطخة بصبغ شرائح من ساترة حتى عن طريق شريحة ذات هدف نفط 40 X على قرص غزل مجهر [كنفوكل]. حدث فقدان التركيز من الخلايا العصبية في متوسط 257 نانومتر (n = 5 شرائح مع مواقع متعددة تستخدم كل شريحة)، مما يدل على أن ترقق القليل جداً من الشريحة قد حدثت من وقت الطلاء. أننا يمكن أن لا قياس دقة سمك الشريحة بالفحص المجهري الأسفار وقت الطلاء لصبغ الحيوية أكمنة في تجلط البلازما أعطى منتشر الأسفار مما يجعل من الصعب قياس دقة الموقف الذي حدث فقدان التركيز. ومع ذلك، صور ثلاثية الأبعاد للخلايا العصبية داخل شرائح يتم الحصول عليها بسهولة في شرائح بعد إزالة تجلط البلازما. تم تصويرها شريحة DIV 21، سيظهر في التكبير المنخفض في الشكل 7و، مع هدف X 60 في مجهر [كنفوكل] (1 ميكرومتر الخطوات) 3 أيام بعد تحميل مع صبغ حيوية الخلايا العصبية. صورة 3D 60 ميكرومتر بنيت من الطائرات المحورية (الشكل 7ز). الخلايا العصبية وعمليات نورت المسماة بالصبغة الحيوية يمكن أن يتبع في 3D. مورفولوجيا وهيكل ثلاثي الأبعاد لشرائح عليها بشكل جيد على مدى 3 أشهر على الأقل، وكانت تستخدم في أوقات أطول في الدراسة الحالية.
تغييرات رئيسية في مورفولوجية موقفا سابقا المصورة كما حدث في بعض الشرائح، مما يوحي بأن حركة الشريحة على ساترة قد تأخذ مكان. بالتأكيد، على مدى فترات أطول بين التصوير أصبح أكثر صعوبة نعرف على وجه اليقين أن الخلايا الموجودة في الحقل يجري تصويرها كانت مماثلة لتلك التي لوحظت في دورات التصوير السابقة. وهكذا، صور الإسقاط الأقصى مكدسات [كنفوكل] من الشرائح الحيوية المسمى صبغ المكتسبة في الموقع متطابقة مع الهدف 60 x في فترات أسبوعية تمتد أربعة أسابيع (الشكل 8) تظهر أيضا المحافظة على بقاء الخلايا العصبية ولكن فإن من الصعب تحديد خلية معينة على مر الزمن عندما يتم الحصول على الصور بفترات زمنية طويلة بين الدورات. يفترض نمط الخلايا المسماة مع فلوروفوريس متعددة سيكون معترف بها بسهولة أكثر، كما الخلايا في مجموعات محلية عندما لاحظ بالتمرير من خلال رصة صور.
لتقييم فائدة النواقل الفيروسية مختلفة لإدخال الجينات الخارجية في الخلايا العصبية لشرائح هيبوكامبال، قارنا العدوى شريحة باستخدام مركبات، إف، وناقلات لينتيفيرال المؤتلف، كل الإعراب عن العلامات الفلورية مختلفة أو باستخدام مختلفة من المروجين للتعبير بالسيارة. مركبات (2 × 107 U/شريحة المعدية) معربا عن كوفيلين-مرفب وراء مروج CMV قوية، غير خلية محددة تم استخدامه لتصيب شريحة هيبوكامبال ماوس كان مثقف 9 أسابيع في كوفيرسليبس. تم العثور على التعبير عن كوفيلين-مرفب في جميع أنحاء الشريحة في العدوى بعد 5 أيام، مع التعبير الأكثر كثافة حول محيط شريحة كما لاحظ مع هدفا 4 x (الشكل 9ألف). ولوحظت أيضا مع هدف X 20 (الشكل 9ب) مع بعض تلطيخ الشروريه مشرق الخلايا ضمن شريحة معربا عن كوفيلين-مرفب ومنتشر أيضا التعبير في كل من الخلايا العصبية والخلايا غير العصبية. بعد 17 أسبوعا في الثقافة (8 أسابيع بعد العدوى)، شكلت قضبان كوفيلين عفوية في بعض الخلايا، ويفترض أن يقودها overexpression من نوع البرية26،كوفيلين-مرفب (الشكل 9ج)27.
كما أثبتنا أن إف (1010 جسيمات) يمكن أن يستخدم للتعبير في الشرائح.صور للشرائح المصابة في 9 أسابيع في الثقافة مع إف، الذي قاد مروج سينابسين محددة الخلايا العصبية التعبير عن GCaMP5-كوفيلين-مرفب مع تسلسل ببتيد P2A كليفينج ذاتيا في رابط بوليبروتين المترجمة21، تم القبض على 8 أسابيع بعد العدوى (17 أسبوعا في الثقافة). في التعبير عن GCaMP5 وكوفيلين-مرفب الخلايا العصبية، شكلت بعض قضبان كوفيلين/المجاميع (الشكل 9د-F). وكان شدة الأسفار من القضبان/المجاميع حتى قوي أنه يمكن ملاحظة الأسفار القليل جداً من كوفيلين-مرفب منتشر دون الإشباع الكامل وازدهار الصورة الفلورية كوفيلين قضبان. قضبان كوفيلين عفوية تظهر في الخلايا العصبية التي التركيبات البرية من نوع كوفيلين-فلوري البروتين قد تم الإفراط أعرب26،27، فضلا عن أكد في الخلايا العصبية10. استناداً إلى التتر إتش، التي تتحدد على أساس العدوى14 والتهم الجسيمات المستخدمة لتحديد عيار إف، حوالي 100 إلى 500 إضعاف ارتفاع إعداد الجسيمات إف هي اللازمة للحصول على تقريبا نفس العدوى/ التعبير في شرائح مقارنة بالمركبات.
اتباع المؤتلف التعبير لينتيفيروس بوساطة من البروتينات الفلورية في شرائح، شرائح كانت مصابة في الدرجة 6 مع 1، 3، 10، و 30 ميليلتر مختبرين lentivirus المؤتلف لتعبير محدد الخلايا العصبية (مروج سينابسين) كوفيلين-R21Q-مرفب، وضعت كخلية حية تصوير مسبار ل تشكيل رود كوفيلين-أكتين16. شرائح المسمى بصبغة حيوية الخلايا العصبية في الدرجة 11 وتصويرها في مناطق محددة لصبغ والتعبير كوفيلين-R21Q-مرفب على الدرجة 12 و 14 شريحة المصابين قاسمة 30 ميليلتر من الفيروسات لم ينج للتصوير ولكن ثلاث شرائح التعامل مع المجلدات الأخرى من الفيروس أظهرت تعبير تعتمد على جرعة من مرفب. يبين الشكل 10 الصور لشرائح المصابين ميليلتر 1 و 10 ميليلتر من لينتيفيروس في 6 و 8 أيام بعد الإصابة. مناطق متعددة من شرائح مختلفة اثنين كانوا كمياً لتلطيخ المشترك من الخلايا العصبية مع صبغ الحيوية والتعبير مرفب. لشرائح المصابين 1 ميليلتر من lentivirus، أعرب حوالي 28% من الخلايا العصبية مرفب في الإصابة بعد 6 أيام، زيادة بنسبة 85 في المائة خلال 8 أيام بعد الإصابة. لشرائح المصابين 10 ميليلتر من lentivirus، أعرب حوالي 58% من الخلايا العصبية مرفب في الإصابة بعد 6 أيام، زيادة 86 في المائة بحلول 8 أيام بعد الإصابة. وهكذا، 1 ميليلتر من لينتيفيروس كان كافياً لتقديم شريحة انتشار العدوى والتعبير العصبية قبل 8 أيام ما بعد الإصابة.
للبرهنة على أن هذا النظام ثقافة مفيدة في التنمية التالية من الأمراض كوفيلين، تركت شرائح المصابين لينتيفيروس للتعبير عن كوفيلين-R21Q-مرفب في الخلايا العصبية غير المعالجة أو المعالجة بتركيزات مختلفة (1 ميكرومتر، 333 شمال البحر الأبيض المتوسط، و 100 نانو متر) من البروتين الاصطناعية Aβ البشرية التي شهدتها الحضانة إلى نموذج ليغومرات28. أظهرت نتائج الدراسات السابقة أن Aβ الاصطناعيةس الحث على قضبان كوفيلين-أكتين في تصل إلى 25% من الخلايا العصبية هيبوكامبال منفصلان29،،من3031. كل ثلاث شرائح تعامل مع تركيز 1 ميكرومتر Aβ جاءت فضفاضة من ساترة في أول 24 ساعة، بينما تعامل جميع المركبات شرائح (تحكم) والذين يعالجون 333 نانومتر و 100 نانومتر تركيزات Aβ نجا لمدة أسبوعين أنها المتبعة. نفس المناطق الخلوية (CA1، CA3، والمديرية العامة لل) في شريحة تعامل مع 100 نانومتر Aβس تم تصويرها (60 x الهدف) على مدى عدة أيام. وكان شرائح التحكم التي كانت مصابة في الدرجة 6 مع لينتيفيروس للتعبير عن سينابسين مدفوعة cofilinR21Q-مرفب التعبير مرفب الخلوية منتشر بشعبة 15 (الشكل 11ألف). شرائح تتعرض إلى 100 نانومتر Aβس في 14 DIV وتصويرها في 15 DIV أظهرت أن توزيع كوفيلين-R21Q-مرفب أصبح الشروريه، التي تظهر في كل قضيب على شكل هياكل والمجاميع (الشكل 11ب). وهذه الهياكل أصبحت أكثر بروزا يوما Aβ-العلاج (الشكل 11ج، الذي هو نفس الحقل للخلايا ك رقم 11ب) 6. في العديد من الأماكن الغنية في نيوريتيس اتفاقات الخلايا العصبية فيها غائبة (الشكل 11د)، وضع صفائف cofilinR21Q-مرفب الشروريه وقضيب مثل (الأسهم في الشكل 11ج)، مماثلة لتوزيع كوفيلين-أكتين وأفادت قضبان سابقا داخل نيوريتيس Aβ تعامل الخلايا العصبية في الثقافة29،،من3031. وهكذا، هذه الطريقة الجديدة لاستزراع ومراقبة شرائح هيبوكامبال سوف تسمح للمستخدمين لتحديد استمرارية على المدى الطويل من الخلايا في شكل قضبان والمجاميع التي كوفيلين وإمكانية الرجوع لعلم الأمراض في مراحل مختلفة من التنمية، وأن بسهولة إجراء قياسات الاستجابة للجرعة على الكواشف التي يمكن منع أو عكس تشكيل الأمراض كوفيلين في أكثر في فيفو--مثل منظمة الخلوية.
رقم 1: إعداد الاسطوانة أنبوب حامل. (أ) قالب لوضع علامات على مواقع ثقب الحفر بقيعان طبق استنبات الأنسجة 15 سم. إذا كان يتم طباعة هذا الرقم لحجم شريط مقياس سيظهر، يمكن قطع ويستخدم لوسم مواقف على طبق ثقافة 15 سم لحفر ثقوب سيظهر. (ب) أكمل الاسطوانة أنبوب رف بأنبوبين إدراجها. يتم ترقيم كل رف على ملصق مرئية بسهولة على الرف العلوي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : إعداد أنابيب الثقافة الاسطوانة. عرض الجبهة (A) أنبوب الاسطوانة المدرجة في رقصة في مطبعة حفر الحفر خارج الحفرة 6 مم في الأنبوب. يظهر خط متقطع موضع الأنبوب الاسطوانة الوجهين شقة في الرقصة. نظراً للرقصة مع إدخال أنبوب نهاية (ب) وحفر بت الانحياز أكثر من ثقب. (ج) عرض أعلى من الثقب في الرقصة للحفر بأنابيب الرول بمثقاب 6 مم.السهم الأبيض يظهر موقف لوقف إنتاج المواد الانشطارية الأظافر إدراجها كمحطة لتحديد المواقع في الأنابيب، والخطوط السوداء مزدوجة للمحاذاة قليلاً. الربيع (د) مقاطع (السهم الأسود) مثبتة في أسفل الرقصة لأمن عقد في الموقف عند حفر أنابيب. (ه) بعد الحفر خارج الحفرة، الحواف هي ممهدة مع أداة deburring وهي قطع الأخاديد على الجانب الداخلي من الحفرة (يظهر اقحم الحفرة عرضها من خلال مجهر تشريح) لزيادة استنزاف المتوسطة من الثقب أثناء دوران الأنبوبة. (و) الثقافة أنبوب مع ثقب الانحياز إلى ثقب في لاصق مطاط السيليكون، الذي سيلحق ساترة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: إعداد شرائح المخ هيبوكامبال. الصور التي اتخذت مع عرض مجهر تشريح: الدماغ سليمة الماوس (A). موقف تخفيضات لإزالة فوريبرين والمخيخ تظهر كخطوط زرقاء متقطعة. (ب) بعد إزالة فوريبرين والمخيخ. (ج) قطعة من الدماغ من ب هو انقلبت 90 ° مع المنطقة الخلفية (نحو المخيخ) مواجهة. الموضع القطعة بجوار الجانب للطبق يساعد على إزالة midbrain (دائرة زرقاء متقطعة) التي يمكن أن تكون مثار بعيداً عن بقية الحصين والمهاد وتحت المهاد. تخفيضات اثنين بالملقط (خطوط زرقاء متقطعة) تسمح القطعة المتبقية المحتوية على الحصين من كلا نصفي الكرة الأرضية أن تنتشر شقة. (د) المخ مسطح قطعة عرض الأوعية الدموية تعمل على طول الشق هيبوكامبال (السهم الأزرق). هذا النسيج على الأفلام البلاستيكية ونقل إلى المروحية الأنسجة لتقطيع في اتجاه خط متقطع. (ﻫ) شرائح الأنسجة تظهر أكثر قليلاً من نصف قرن آمون بعد إعادته إلى جبس/السكر. (و) التشريح النهائي الحصين وتنظيف الشرائح لإزالة المواد غير هيبوكامبال. (ز) عائمة عدة شرائح بعد تنظيف نهائية. (ح) صور الموسع لشريحة واحدة لنقل إلى ساترة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 : شرائح الطلاء وتحضين- يتم إزالة (أ) بالماوس هيبوكامبال شريحة من الطبق الثقافة على طرف ملعقة استخدام طرف الملقط للمساعدة على رفعه حرة من الحل. (ب) الشريحة يوضع شقة في وسط فوتويتشيد ومعاملة ساترة 12 ملم على 2 ميليلتر من البلازما الدجاج وآخر ميليلتر 2.5 من خليط 1:1 بلازما/ثرومبين يضاف إلى تولد جلطة. (ج) بعد أن يتم تعيين الجلطة (حوالي 1-2 دقيقة)، تتم إزالة الغطاء من دائرة لاصقة المطاط سيليكون في أنبوب اسطوانة وهو المتمركزة في ساترة مع تجلط تركزت في الحفرة؛ ثم الضغط في المكان مع التجربة ساترة والمنعقد في الموقف لحوالي 1 دقيقة (د) إضافة 0.8 مل من إكمال الثقافة المتوسطة. الاسطوانة (ه) أنبوب أصحاب داخل حاضنة اسطوانة كبيرة مع الجبهة التي أثيرت لإمالة 5 º للحفاظ المتوسط في الجزء السفلي من الأنابيب. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
5 الرقم: حامل أنبوب الاسطوانة وحاضنة لوحة المرحلة. (أ) حامل أنبوب أن المواقف الأنبوب حيث يتم الاحتفاظ ساترة في موقف للتصوير. (ب) شنت حامل أنبوب في لوحة محول مرحلة مجهر. منزلقات على الجانب أمسك الأنبوب بشكل أمن للتصوير. (ج) مرحلة إضافة محول مع أنبوب حامل والجانب اللوحات تحتوي على شرائط التدفئة متصل بوحدة تحكم درجة حرارة حرارية. حالما يتم تحميل أنابيب والمتمركزة، يمكن إضافة أعلى صلبة إلى المربع المساعدة في الحفاظ على درجة الحرارة أثناء التصوير. السلك البرتقالي هو الرائدة الحرارية. خطط لتصميم وبناء محول المرحلة وسخان متاحة في: https://vpr.colostate.edu/min/custom-machining/roller-tube-holder/. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 6 : استخدام علامات الاعتماد للتصوير المتكرر لنفس الخلايا. (أ) هيبوكامبال شريحة في ساترة فوتوتشيد (المربعات 1 مم) مع سوبيكولوم تكشفت (الذيل) شوهدت مع 4 × إضاءة الحقل الهدف ومشرق. انحناء أنبوب الرول البلاستيك يساعد على خلق إضاءة مائلة التي يعزز تصور الشبكة. يظهر المربع موضع وحجم الحقل X 60. (ب) عرض الشريحة نفسها مع هدف 20 x لإيجاد علامة الاعتماد غيض من الجزء السفلي من 4 من ساحة 34. وترد للإزاحة y و x لتكاثر تحديد موقع مركز المربع المطلوب لأعلى التكبير [كنفوكل] التصوير. (ومنج–) شريحة المسمى بصبغة حيوية الخلايا العصبية تم تصويرها 13 DIV هدفا 60 x باستخدام وصنع صورة إسقاط 30 ميكرومتر في 4 أيام متتالية (DIV 14-17). الخلايا العصبية مماثلة تم تصويرها كل يوم. تم وضع علامة وضع النواة في كل من الخلايا العصبية الثلاثة مع رمز مختلف. يتم تعريف أكثر سهولة بالتمرير من خلال رصات الصور على تغير موقف 3D قليلاً. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 7 : تصوير الخلايا العصبية في شرائح مع صبغة حيوية الخلايا العصبية. (أ) الخلايا العصبية الحيوية صبغ ملون شريحة في تجلط البلازما أخذ 24 ساعة بعد الطلاء مع 4 X الهدف. صبغ (100 nM) وأضاف عندما الشريحة أولاً وضعها في حامل أنبوب الاسطوانة وجرفت ح 2 في وقت لاحق.سوبيكولوم هو كرة لولبية حول الحصين في الجلطة. (ب–ه) في أعقاب انحلال جلطة قبل إضافة في الدرجة 6 لازمين، كان حصرياً الشريحة 5 مرات مع صبغ الحيوية 24 ساعة قبل التصوير على فترات أسبوعية. وجمعت الصور المعروضة في 8 و 21، 28 و 35 DIV (ب–ه، على التوالي). (و) شريحة هيبوكامبال مثقف لمدة 3 أسابيع وملطخة بصبغة حيوية الخلايا العصبية 24 ساعة قبل التصوير مع 4 X الهدف. (ز) [كنفوكل] كومة من الصور على الشريحة نفسها كما هو الحال في و عرض طريقة عرض ثلاثية الأبعاد من 61 طائرات تؤخذ على 1 ميكرومتر فترات. صبغة حيوية الخلايا العصبية وضوح تسميات نيوريتيس وجسم الخلية إلا أنه مستبعد من النواة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 8 : تكرار التصوير من الخلايا العصبية في مكان واحد من الشريحة أكثر من 4 أسابيع- صور الإسقاط الحد الأقصى من 30 رصات الصور [كنفوكل] ميكرون من نفس الحقل من الخلايا (بواسطة تحديد المواقع) من الشرائح الحيوية المسمى صبغ المتخذ في 12 و 20، 30 و 40 DIV (A–د، على التوالي). من الصعب تحديد خلايا فردية متكررة على أطر زمنية أطول في صور الإسقاط. ومع ذلك، حتى على مدى فترات طويلة، وهذه غالباً ما يتوفر تحديد نفس الخلايا بالتمرير من خلال رصات الصور أو بناء الصور الثلاثية الأبعاد التي يمكن تدويرها، ومثل كما هو موضح في الشكل 7ز. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 9 : الفيروسية بوساطة التعبير والتصوير من البروتينات الفلورية. (أ) شريحة هيبوكامبال مثقف لمدة 9 أسابيع والمصابين إتش للتعبير عن كوفيلين-مرفب وراء مروج CMV. تم العثور على التعبير في جميع أنحاء الشريحة في العدوى بعد 5 أيام لكن الأسفار ألمع قرب أطراف الشريحة. وأظهر (ب) شريحة نفس التعبير في الخلايا أعمق داخل الشريحة عندما ينظر إليها مع 20 X الهدف. الصورة إسقاط من كومة من الصور 20 متباعدة عن بعضها 2 ميكرومتر. (ج) أن الشريحة نفس فحص بعد 17 أسبوعا في الثقافة (8 أسابيع بعد العدوى) ومرفب كوفيلين وقد لوحظ في قضيب على شكل مجاميع كما يتضح في هذه الصورة الإسقاط من 70 ميكرومتر كومة من الصور 23, 3 ميكرومتر وبصرف النظر، اتخذت مع 40 وهدف العاشر. (د–و) شريحة هيبوكامبال الماوس المصابين إف التعبير عن GCaMP5-في 9 أسابيع في الثقافة (P2A) مرفب-كوفيلين-خلف مروج سينابسين. الأسفار كان مرئياً في قنوات الأحمر والأخضر معا بعد 10 أيام. صورة طائرة واحدة من شريحة عرض التعبير عن GCaMP5 (د)، مراسل حساسة كالسيوم، (ه) العديد من قضبان المحتوية على كوفيلين، والصورة (و) تراكب. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 10 : التعبير عن كوفيلين-R21Q-مرفب مدفوعا بمروج سينابسين في الخلايا العصبية المصابة مع المؤتلف ناقلات لينتيفيرال. هو لاحظها أولاً عن الإصابة بعد 3-4 أيام 10 ميليلتر من الفيروسات باستخدام الكشف عن إشارة ضعيفة الأسفار وتصبح صالحة للاستعمال من 5-6 أيام، (ه) كما يتضح في هذه الصور المكتسبة مع هدف 60 x. على الرغم من أن يستغرق وقتاً أطول لتحقيق نفس مستويات التعبير مع 1 ميليلتر من الفيروس، 8 أيام ما بعد الإصابة بنسبة عالية مماثلة من الخلايا العصبية (صبغ الحيوية المسمى) كانت معربا عن كوفيلين-R21Q-مرفب. 27 في المائة فقط من الخلايا العصبية كانت إيجابية بالنسبة للأسفار مرفب في الإصابة بعد 6 أيام مع 1 ميليلتر (أو ب) ولكن هذا زيادة بنسبة 85 في المائة (ج، د) قبل 8 أيام. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 11 : Aβ الناجم عن أوليجومير كوفيلين علم الأمراض في شرائح هيبوكامبال الماوس. جميع الصور التي اتخذت ك 30 ميكرومتر الصورة مداخن ذات هدف 60 x وتظهر كصور الإسقاط كحد أقصى. شرائح كانوا مصابين كوفيلين-R21Q-مرفب في 6 شعبة تعامل شريحة DIV (A) 15 على الدرجة 14 مع مركبة (F12 [دمس]/همس الوسيلة المستخدمة لتوليد Aβس). (ب) شريحة 15 DIV تعامل مع 100 نانومتر Aβس. (ج) نفس المجال كما هو الحال في ب المتخذة في الدرجة 20 وسيظهر في (د) كتراكب مع تسمية صبغة حيوية الخلايا العصبية. تظهر الأسهم المصفوفات الخطية من المجاميع كوفيلين وقضبان في منطقة الشريحة التي تحتوي على نيوريتيس ولكن القليل من الهيئات الخلية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الاسطوانة أنبوب الأسلوب الموصوفة هنا يسمح لاستزراع طويلة الأجل وعالية الدقة تصوير حية من أنسجة المخ شرائح. مسألة رئيسية واحدة مع تقنية شريحة المطبق هنا في التركيب والصيانة لشرائح. الطلاء ساترة التي تدعم انضمام شريحة، تشجيع شريحة رقيق بتعزيز ثمرة نيوريتيس والهجرة من الخلايا خارج الشريحة؛ وبالتالي، علينا تجنب استخدام هذه ركائز. إدراج المجموعات الأمينية على الزجاج بالمعاملة مع 3-أمينوبروبيلتريثوكسيسيلاني تحسن انضمام شرائح، لكن القليل أو الكثير من البلازما الدجاج على ساترة أيضا أن يسبب مشاكل الالتزام مما يؤدي إلى فقدان شريحة. حجم البلازما اللازمة للالتصاق السليم يعتمد على حجم شريحة الدماغ مثقف، وهكذا هي أكبر بالنسبة لشرائح هيبوكامبال الفئران، التي أكبر من حوالي 4 مرات في المنطقة من شرائح المخ الماوس. إذا يتخثر الكثير البلازما تحت الشريحة، التصاق الخلية إلى ساترة البصر والمعاملة مع لازمين سوف تخفف الشريحة حيث أن تغيير موقف أو يفصل تماما. ومع ذلك، البلازما القليل جداً في الجلطة قد يؤدي إلى فقدان شريحة خلال الأيام القليلة الأولى من التناوب في الحاضنة. في تجربة الأخيرة التي تشمل شرائح 39، ثلاثة قد فقدت ولكن بعض من تلك المفقودة قد يكون ناجماً عن شريحة الأضرار التي تحدث أثناء عملية تشريح. ومع ذلك، نحن نستعد عادة حوالي 50% من حاجة إلى شرائح أكثر من العدد المقدر للتجربة. السبب الرئيسي الثاني لمشاكل الثقافة تسرب المتوسطة حول ختم ساترة. هذه المشكلة تزداد سوءا عندما كوفيرسليبس لا تعقد بشدة في موقف لمدة 1 دقيقة على الأقل بعد لصق لهم للختم. الحرارة من الإبهام المستخدمة لتطبيق الضغط على الأرجح يساعد في إتمام الالتصاق. التسرب الذي يحدث غالباً عن طريق قنوات الهواء صغيرة تحت ساترة التي يمكن ملاحظتها مجهر تشريح. وهذه عادة ما تختفي عند استخدام ضغط الإبهام طويلة. يمكن توقع فقدان حوالي 2 في المائة من الثقافات بسبب تسرب بطيء وهكذا يوصي بالانتظار 10 أيام بعد إعداد الثقافات قبل القيام بالعدوى الفيروسية. ضغط الإبهام المفرط، لا سيما إذا ما أنتج موزعة عبر ساترة، يمكن أيضا أن يسبب ساترة للقضاء. إذا كان الكسر قضية، الضغط على الأنابيب أسفل مسطحة على لوحة ماوس مطاط ارتفعت درجة حرارة في حاضنة قد تساعد على توفير الضغط حتى أكثر عبر ساترة.
سبق وصف أساليب لثقافة شريحة الدماغ على الأغشية في واجهة الهواء السائل (نظام مفتوح) أو على ساترة زجاجية داخل أنبوب بلاستيكي مختومة (نظام مغلق) فعالة جداً لبقاء شريحة على المدى الطويل، ولكن كل أسلوب على قوتها و الضعف. شريحة الثقافات على الأغشية في واجهة الهواء السائل المفيد للدراسات الكهربية المجمعة مع أهداف الغمر ل التصوير عالي الدقة7، ولكن لها عيوب فيما يتعلق بإيجاد ميدان الدقيق للخلايا ريماجينج على مر الزمن والتعرض المحتمل للمستخدم والتلوث بموضوعية عند استخدام تعبير الجينات الفيروسية بوساطة. استخدام الفيروسات للتعبير عن المتسلسلات أكثر أماناً وأسهل لأداء في نظام مغلق حيث التلوث مجهر الأهداف ليست قضية. لدينا طريقة أنبوب الاسطوانة المعدلة يعطي الوصول إلى الشريحة لتصوير عالي الدقة، على الرغم من أنها ليست قابلة للدراسات الكهربية.
وضعت شروط ثقافة شريحة للعديد من المناطق في الدماغ القوارض2، ولكن هنا نستخدم الحصين فقط لأنها إحدى مناطق الدماغ درس على نطاق واسع والتغيرات التي تحدث في قرن آمون ذات أهمية كبيرة في الدراسات ضعف الإدراك. طبقات الخلايا الهرمية في منطقتي CA والمديرية العامة الحفاظ على هذه المنظمة على مدى عدة أسابيع في الثقافة، ويمكن ملاحظة سهولة شكلياً. ونحن قد استخدمت بقاء الخلايا العصبية فلورسنت المطورة حديثا علامة25، التي لديها خصائص الأسفار التي تسمح باستخدامها لرصد سلامة الخلايا العصبية ومنظمة داخل شرائح هيبوكامبال على مدى فترات من أيام لأشهر ولكن أيضا متوافق مع استخدام العديد من الصحفيين والبروتينات الفلورية الأخرى. على الرغم من أن ليس الأمثل ل الأسفار نيو25، نحن يمكن أن تثير في نيو في 488 نانومتر وقياس الانبعاثات في > 617 شمال البحر الأبيض المتوسط. علامات الاعتماد على كوفيرسليبس فوتوتشيد ساعد في تحديد موقع الخلايا نفسها متكررة على مدى عدة أيام للثقافة وسمحت لنا بالمناطق صورة متطابقة للشرائح على مدى أسابيع عديدة. تقريبا لا ترقق الشرائح كبيرة وقعت في كوفيرسليبس الزجاج المعدلة خلال 5 أسابيع في الثقافة، النقطة وقت أطول علينا الحصول على قياسات سمك الشريحة.
مركبات، إف، وناقلات lentivirus المؤتلف تعمل جيدا للتعبير عن الجينات الخارجية في شرائح. لينتيفيروس مع أحد المروجين محددة العصبية مفيد بشكل خاص للحصول على التعبير بنسبة مئوية عالية جداً (> 85%) من الخلايا العصبية داخل 8 أيام بعد الإصابة. وعلاوة على ذلك، نعرض أن رود كوفيلين-أكتين علم الأمراض المرتبطة بالتنمية العجز الإدراكي في10،الإعلانية البشرية11 و Aβ overexpressing الماوس الإعلانية نماذج32 يمكن رصدها في الثقافات شريحة تعامل مع تركيزات منخفضة نسبيا (100 nM) للبشرية الاصطناعية Aβس. ونحن نتصور أن تشمل التطبيقات المستقبلية لهذا الأسلوب الذي يتسم به علاجات جديدة لعكس كوفيلين-أكتين رود علم الأمراض و/أو تشوهات العمود الفقري الجذعية الصحيحة التي تحدث في العديد من الاضطرابات العصبية33.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Bottoms from 15 cm culture dishes | VWR Scientific | 25384-326 | |
Phillips Head Machine Screws (#10-32) | Ace Hardware | 2.5" long and 3/16" in diameter | |
Flat Washers #10 | ACE Hardware | ||
Machine Screw Nuts (#10-32) | ACE Hardware | ||
Rubber Grommets | ACE Hardware | 5/16", thick; 5/8", hole diameter; 1.125", OD | |
Polyethylene tubing (5/16"; OD, 3/16"; ID) | ACE Hardware | Cut to 1.8" length | |
Lock Washer #10 | ACE Hardware | ||
Drill Press, 5 speed | Ace Hardware | ProTech Model 1201 | |
Nunclon Delta Flat-Sided Tubes | VWR | 62407-076 | |
Drill bits, 3 mm, 6 mm and 15 mm | Ace Hardware | Diablo freud brand | Drill bits for cutting plastic. |
Drill bits for wood, 1.5 cm and 1 mm | Ace Hardware | ||
Wood file, 1/4" round | Ace Harware | ||
Spring clips, 16 mm snap holder | Ace Hardware | ||
Swivel Head Deburring Tool, 5" | Ace Hardware | 26307 | |
Adhesive Silicone Sheet (Secure Seal) | Grace Bio-Labs | 666581 | 0.5 mm Thickness |
6 mm hole punch | Office Max | ||
12 mm hole punch | thepunchbunch.com | ||
70% Ethanol | |||
Phototeched Coverslips, 12 mm diameter | Bellco Glass, Inc. | 1916-91012 | |
Bunsen Burner | |||
Absolute Ethanol | |||
Nanopure Water | |||
3-aminopropyltriethoxylane | Sigma-Aldrich | A3648 | |
Acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | |
#5 Dumont Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | |
McIlwain Tissue Chopper | Ted Pella, Inc. | 10180 | |
Double Edge Razor Blades | Ted Pella, Inc. | 121-6 | |
Whatman Filter Paper | VWR | 28450-182 | Cut into 5.8 cm diameter circles |
Poly-chloro-trifluoro-ethylene (Aclar) | Ted Pella, Inc. | 10501-10 | Cut into 5.8 cm diameter circles |
#21 Surgical Blade | VWR Scientific | 25860-144 | |
#5 Dumont Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | |
Spatula, stainless with tapered end | VWR | 82027-518 | |
Gey's Balanced Salt Solution | Sigma-Aldrich | G9779 | |
Glucose | ThermoFisher Scientific | 15023-021 | 25% (w/v) Solution, 0.2 mm filter sterilized |
Chicken Plasma | Cocalico Biologicals | 30-0300-5L | Rehydrate in sterile water, centrifuge at 2500 x g 30 min at 4 °C, quick freeze aliquots in liquid nitrogen and store at -80 °C. |
Thrombin, Topical (Bovine) | Pfizer | Thrombin-JMI | Quick freeze aliquots in liquid nitrogen at 1,000 international units/mL in diluent provided and store at -80°C. Use at 250 units/mL. |
Cell Roller System | Bellco Biotech | SciERA | |
Roller Incubator | Forma | Model 3956 | |
N21-MAX | ThermoFisher Scientific | AR008 | |
Pen/Strep (100X) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
200 mM Glutamine | ThermoFisher Scientific | 25030081 | |
Glucose | ThermoFisher Scientific | 15023-021 | 25% (w/v) Solution, 0.2 mm filter sterilized |
Neurobasal A | ThermoFisher Scientific | 10888-022 | Complete Medium: 48 mL Neurobasal A, 1 mL N21-MAX, 0.625 mL 200 mM Glutamine, 0.180 mL 25% Glucose, 0.250 mL 100x pen/strep. |
Third generation lentivirus packaging | Life Technologies | K4975-00 | |
159 K cutoff centrifugal filters (Centricon) | EMD Millipore | ||
Lentiviral cloning system (InFusion) | Clonetech | ||
Plasmids 30323, 50856, 51279 | Addgene | ||
Neuronal cell viability dye (NeuO) | Stemcell technologies | 1801 | Thaw once and quick freeze in 4 µL aliquots. Store at -20 °C |
Inverted microscope | Olympus | IX83 | |
Microscope objectives | Olympus | air: 4X, 20; oil: 40X, 60X, | |
Spinning disc confocal system | Yokagawa | CSU22 | |
Microscope EMCCD camera | Photometrics | Cascade II | |
Linear encoded (x,y), piezo z flat top stage | ASI | ||
Microscope lasers and integration | Intelligent Imaging Innovations | ||
HEK293T cells | American Type Culture Collection | CRL-3216 | |
Human Plasmin | Sigma Aldrich | P1867 | 0.002 U/mL in 0.1% bovine serum albumin (0.2 mm filter sterilized), quick freeze in liquid nitrogen and store at -80 °C. |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved