Method Article
Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung und Spaltung von Maus Medulloblastom Gewebe und anschließende allogene der Tumorzellen in immunsupprimierten Empfängermäuse um sekundäre Medulloblastom einzuleiten.
Medulloblastom ist der häufigste pädiatrische Tumor des Nervensystems. Eine große Anzahl von Tierversuchen hat am Kleinhirn Granulat Neuron Vorstufen (CGNPs) als Zell-of-Origin für Medulloblastom 1-4 ausgerichtet. Allerdings deuten die vielfältigen klinischen Präsentationen Medulloblastom Subtypen bei menschlichen Patienten (knotige, desmoplastischen, klassische und große Zelle / anaplastischen), und die Tatsache, dass Medulloblastom in einer Untergruppe von menschlichen Patienten, die keine ektopische Expression von CGNP Marker 5 ist gefunden, dass die zellulären und molekularen Ursachen der Medulloblastom sind komplexer und weit davon entfernt, vollständig entschlüsselt. Daher ist es wichtig, festzustellen, ob es eine Alternative gibt Medulloblastom Tumorzelle-of-Origin auf dem Zelltyp-spezifische therapeutische Modalität entwickelt werden können basiert. Zu diesem Zweck wird intrakraniellen orthotopen Allotransplantaten von genetisch markierten Tumorzellen Arten durch nachträgliche Analysen der sekundären Entwicklung von Tumoren in Empfängern gefolgt ermöglichen die Bestimmung der zellulären Herkunft der Tumor-initiierende Zellen. Hier beschreiben wir die experimentelle Protokoll für intrakranielle orthotopen Allotransplantaten von Medulloblastom Zellen aus primären Tumorgewebe, und dieses Verfahren kann auch zur Transplantation von Zellen aus etablierten Zelllinien verwendet werden.
1. Micro-Dissektion der tumortragenden Kleinhirn und Dissoziation von Tumorgewebe
2. Narkoseverfahren für die Empfängermäuse
Für den chirurgischen Eingriff, ist eine Desinfektion Bereich für Nager Operation für die Dauer des Verfahrens benötigt werden. Im Idealfall richten Sie eine lange Bank mit getrennten, aber benachbarten Gebieten für tierische Vorbereitung, OP-Feld und Tier Erholung. OP-Handschuhe, nicht Untersuchungshandschuhe sind für die Operation erforderlich. Aseptische Technik ist, indem behandschuhten Hände oberhalb der Taille gehalten und nur verwendet, um sterile Objekte aus einem trockenen und sterilen Oberfläche zu behandeln.
3. Intrakranielle Pfropfung der Tumorzellen
4. Repräsentative Ergebnisse
Sekundäre Medulloblastome in Empfängermäuse entwickelt hoch ähnelten denen der primären Tumore. Die cerebella tragenden sekundären Tumoren waren oft vergrößert, amorph mit ektopischen Blutgefäße sichtbar, wenn sie als Ganzes-Halterungen angesehen. Immunhistochemische Analysen der sekundären Tumorgewebe ergab, dass die Tumorzellen stark proliferative sind, äußern starke SmoM2-YFP und Marker der Kleinhirn Granulat Neuron Vorstufen wie Math1 und Pax6. Wenn dissoziiert und kultiviert mit berichtete Methoden ("Isolation, Anreicherung und Pflege von Medulloblastom Stammzellen", JoVE in press), die sekundäre Medulloblastom Tumorzellen rasch erweitert werden kann, zum Ausdruck mehrere Stammzell-Marker sind klonogenen und kann weiter zu initiieren Tumorbildung bei transplantierten in zusätzliche immunsupprimierten Empfängern.
Abbildung 1. Typische ganzen-mount und Schnitte eines sekundären Medulloblastom Gewebe
Ein typisches Beispiel für sekundäre Medulloblastom Gewebe entwickelt 26 Tage nach der Injektion von 5x10 5 primären Tumorzellen. Hämatoxylin Färbung zeigt den typischen zellulären Morphologie Medulloblastom, darunter hohe nukleare / Plasma-Relation und Kernpolymorphie. Diese sekundären Tumorzellen sind hoch proliferative wie Ki67 Ausdruck angegeben und sie auch kräftig ausdrücken membranöse SmoM2-YFP.
Abbildung 2. Sekundäre Medulloblastom-Zellen können kultiviert und erweitert werden in vitro
Mit dem Protokoll für die primäre Maustaste Medulloblastom-Zellen ("Isolation, Anreicherung und Pflege von Medulloblastom Stammzellen", JoVE in press) beschrieben, können diese sekundären Medulloblastom-Zellen kultiviert und erweitert werden für mehrere Passagen. Das Bild zeigt den gleichen repräsentativen Tumorkoloniebildung bei 4 Tage und 14 Tage kultiviert. Die kultivierten Tumorzellen sind bipolar, mit wenig Zytoplasma und oft strahlen aus einem dichten Kern der zellulären insgesamt verlängert. Sie zeigen nicht das Wachstum Kontakt Hemmung. Die kleinen runden Zellen sind rote Blutkörperchen.
Mehrere kritische Faktoren für eine erfolgreiche Medulloblastom Zelle Allotransplantaten, dass die Erträge sekundäre Tumorbildung sind wie folgt zu gewährleisten: Erstens, verwenden Sie nur 50% Accutase für Gewebedissoziation und nicht über-digest das Gewebe als verlängerte Enzymbehandlung führt zu einer signifikanten Reduktion der Lebensfähigkeit der Zellen. Nutzen Sie auch nur die 1 mL Größe Pipetman als kleinere Tipps auch erzeugen kann körperliche Schäden an der dissoziierten Zellen. Es ist schön, eine Mischung aus Einzelzellen und kleine Aggregate für Allotransplantaten haben. Zweitens, mischen und ins Gleichgewicht der Tumorzelle Lösung jedes Mal vor dem Laden des Hamilton-Spritze. Verwenden Sie nicht mehr als 4 ul für jede Injektion als ein größeres Volumen zu viel intrakraniellen Druck und Widerstand erzeugen würde. Schließlich ist es wichtig, eine zusätzliche 2 Minuten warten, damit der injizierten Lösung in den Kleinhirn-Gewebe nach jeder Injektion zu zerstreuen.
Die hier beschriebenen Verfahren erlauben die Bestimmung von genetisch markierten Zell-Typ (en), zu initiieren und zu verbreiten Tumoren. Dieses Protokoll gilt auch für Situationen, in denen die Zellen injiziert werden nicht abgeleitet werden direkt aus primärem Tumorgewebe, sondern von etablierten kultivierten Zelllinien. Man kann die entsprechende Anzahl von Zellen entweder durch Verdau und / oder wiederholtes Pipettieren vorzubereiten, und beginnen Sie mit Schritt 2 dieses Protokolls. Deshalb können wir auch testen Sie die Funktionen der Kandidatengene und die hemmende Wirkung von chemischen Verbindungen mit einer in vivo Tumor-Wachstum Anzeige.
Diese Studie wurde durch Zuschüsse der Vanderbilt-Ingram Cancer Center Support Grant (P30 CA068485), der Hirntumor bei Kindern Foundation und den National Institutes of Health (NS042205) unterstützt.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Neurobasal medium | Invitrogen | 21103049 | |
hEGF | Invitrogen | PHG0311 | 25ng/ml |
bFGF | Invitrogen | PHG0023 | 25ng/ml |
N2 | Invitrogen | 17502048 | 1X |
B27(-RA) | Invitrogen | 12587010 | 1X |
Accutase | Invitrogen | A1110501 | 50% |
Glutamine | Invitrogen | 25030081 | 2mM |
Stereotaxic instrument | Stoelting Co. | 51730 | |
Foredom flexible shaft drill, hang-up style | Stoelting Co. | 58650 | |
Large probe holder | Stoelting Co. | 51633 | |
10 μL syringe, 26 ga., bevel tip | Stoelting Co. | 51105 | |
Drill bit .75mm | Stoelting Co. | 51455-3 |
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