我们开发了一种快速的 7 天工作流程，以测试肿瘤细胞对使用斑马鱼胚胎的药物的反应。由于靠近儿科肿瘤学，我们可以获得罕见的癌症样本，我们从 B 细胞前体白血病开始，但我们现在正在采用该方案来治疗儿科实体瘤，看看该检测是否也适用于临床环境。我们可以在斑马鱼胚胎中成功培养患者来源的白血病细胞，这使它们成为一种了不起的临床前模型。
然而，药代动力学可能很棘手，因为有些药物难以穿过生物屏障，因此我们确保在开始实验之前测试渗透性。我们的方法很独特，因为它阻断了先天免疫细胞分化，这有助于白血病的移植细胞更好地生存。此外，我们正在使用流式细胞术来测量 10 条宿主鱼池中移植细胞的单细胞活力和增殖。
这使我们能够获得非常精确的药物反应数据和强大的统计能力。首先，在微波炉中将 1% 琼脂糖溶解在 100 ml E3 培养基中。对于移植板，将约 20 毫升培养基倒入 10 厘米的培养皿中，填充一半。
轻轻旋转板以均匀分布液体。对于吗啉代注射板，将注射模具放在两个培养皿中的液体琼脂糖上，确保没有气泡形成。倾斜盖子盖住培养皿，并将它们置于室温下，直到琼脂糖凝固。
琼脂糖凝固后，将板倒置在 4 摄氏度的密封塑料袋中。接下来，使用拔针器从 10 厘米的毛细管中生成针头。折断针尖，以获得 10 微米的估计直径。
要注射吗啡，请将 100 个受精斑马鱼卵和最少的液体转移到先前制备的注射板中。将胚胎小心地对准板的凹槽。在单细胞阶段，将 1 纳升 50 微摩尔的 spi1 和 csf3r 吗啉混合物注射到细胞或细胞下方的卵黄袋中。
将注射的鸡蛋在 28 摄氏度下孵育过夜。第三天，为了开始去绒毛膜化，使用巴斯德移液器从培养皿中取出任何没有心跳或运动、看起来不透明或形状不规则的死胚胎。使用两个精密镊子，捏住绒毛膜以将其固定到位。
捏住镊子尖端附近，同时用第二组镊子固定胚胎。小心地将绒毛膜拉开以释放胚胎。将已拆质的胚胎在 28 摄氏度下孵育过夜。
首先，准备两个 10 厘米的培养皿，里面装满了 E3 培养基，并补充了青霉素链霉素或 E3/P/S。将培养皿在 28 摄氏度下预热 30 分钟。使用 CellTrace Violet 或 CTV 荧光细胞标记后，离心 BCP-ALL 细胞。
然后添加 PBS 以达到所需的细胞浓度并将其保存在冰上。使用微型加载器尖端将 4 μL 细胞悬液加载到移植针中。将三卡因加入装有 E3/P/S 培养基和鱼胚胎的培养皿中，以达到每升 4 克的最终浓度，以便在注射前麻醉胚胎至少两分钟。
接下来，将 15 到 20 个去绒毛膜的胚胎转移到琼脂糖包被的注射皿上，并去除多余的液体以防止胚胎滑落。将胚胎排列在注射皿上。从背尾方向以 45 度角引入针头，将大约 1， 000 个 CTV 阳性 BCP-ALL 细胞注射到心包腔中。
注射 15 到 20 个胚胎后，将它们转移到装有 E3/P/S 培养基的预热培养皿中。将移植的胚胎和非移植的对照在 28 摄氏度下孵育 1 到 3 小时。在荧光立体显微镜下，筛选胚胎以确认成功植入并确保蛋黄完整。
向 96 孔板的每个孔中加入 100 微升 E3/P/S 培养基和 0.5% DMSO。使用玻璃巴斯德移液器，用尽可能少的 E3 培养基拾取移植的胚胎。倾斜移液器，让胚胎沉到移液器吸头的底部，并使用毛细管力将其释放到孔中。
用 100 微升载体对照溶液或两倍浓缩的维奈托克溶液填充 96 孔板的 24 个孔。将胚胎在 35 摄氏度下维持 72 小时，包括未移植的胚胎作为对照。在第三天结束时，从培养箱中取出含有移植斑马鱼胚胎的 96 孔板。
使用立体显微镜筛选板以识别和选择健康的斑马鱼胚胎。将来自每种条件的 10 个宿主胚胎随机混合到 1.5 毫升微量离心管中，理想情况下每种条件产生两个试管。从每根试管中去除尽可能多的液体。
向每管中加入 500 微升不含钙和镁的 HBSS。使用 200 微升微量移液器吸头研磨，机械解离胚胎和移植细胞，上下移液约 15 次。在室温下以 350 g 离心试管 5 分钟，以沉淀组织碎片。
用 35 微米细网过滤器过滤器帽制备 FACS 管，每个条件含有 2 毫升 PBS。然后将沉淀重悬于 500 μL 酶混合物中，并在室温下孵育 15 分钟。在孵育过程中，每支试管使用相同的移液器吸头，每 5 分钟上下移液一次混合物，以避免组织损失。
将解离的细胞转移到 FACS 管的 35 微米细网过滤器过滤器盖中。将试管以 350 g 离心 5 分钟。进行流式细胞术分析以评估移植细胞的总数。
使用 CTV 和 CD19 染色的 3dpi 培养细胞开始数据分析。使用 CD19 和 CTV 创建点图，以确保信号重叠并确认双染色癌细胞的存在。接下来，使用 FSC-A 和 SSC-A 创建点图，以区分完整细胞和碎片。
然后使用完整的细胞群创建一个带有 SSC-A 和 SSC-H 的新图来识别单个细胞。使用单个细胞群创建具有 7AAD 和 Annexin V 的点图，以将细胞分为四个细胞群。打开移植斑马鱼的文件。
使用带有 CTV 和 CD19 的点图将人移植细胞与宿主细胞分开。鉴定并分离 CTV、CD19 双阳性移植细胞。复制并将针对 3dpi 培养细胞描述的相同门控策略应用于移植细胞群。
将所有 Annexin V 和 7AAD 阴性细胞群合并到一个直方图中，其中 CTV 值在 x 轴上。计算所有五个样品的几何平均值以确定增殖速率。流式细胞术数据显示，植入斑马鱼胚胎中的新鲜 BCP-ALL 单细胞在 3 天后存活率为 95.2%，比培养皿培养细胞的 61.9% 存活率高 1.5 倍。
体内和体外条件下的 CTV 荧光强度在 3 天内相似地降低，表明细胞分裂率相当。在每个池中量化 3 天后每个胚胎的完整移植物细胞，表明植入一致。
