环境样品使用 RT-PCR RNA 分析

1.样品采集: 土壤样品

1. 发现通过 GPS、 坐标或看到的样品位置。
2. 对于随机取样，选择去普查的微生物栖息地范围内的随机点。断面采样收集从点沿一条直线，例如，毗邻的河床。网格样品取自点按固定时间间隔，有系统地和可用于映射未知或变量的区域中的微生物群落。
3. 在 3-6 英寸 （7.5-15 厘米） 内采样深度提供访问是附近，而不是在根际 （土壤直接受植物的根和他们相关的微生物的狭窄区域） 的最丰富的微生物活动。
4. 若要收集土壤样本，推和手螺旋扭到地面到预定的深度。
5. 电梯的螺旋。土壤是在螺旋的空心茎内发现的。
6. 刮进土壤收集袋底部螺旋的土壤。一定不能触摸或污染土壤。
7. 袋子上贴上正确的位置、 名称、 日期和时间。
8. 在实验室里，通过一个 2 毫米筛子来删除任何砾石和岩石土壤。
9. 分析土壤水分含量的土壤的一部分。有关此步骤的详细信息，请参阅朱庇特科学教育视频对土壤水分。

2.样品采集: 水样本

1. 发现通过 GPS、 坐标或看到的样品位置。
2. 收集存储瓶里的水。水的体积收集记录;如果定量测定样品中的微生物，然后可以基于收集的体积确定微生物浓度。
3. 立即测试实验 （温度、 ph 值、 电导率、 盐度、 氮和磷含量等） 所需的任何参数水使用适当的电子探针。
4. 入加冰冷却器包含水样品瓶的地方。将冷却器转移到实验室。

3.RNA 提取

1. 收集和集中微生物从环境样品，请参阅向朱庇特科学教育视频社区核酸提取。
2. 病毒使用按照制造商的说明商业提取工具包中提取 RNA。
3. 简单地说，首先将样品混合与裂解缓冲液含有酒精，然后加进自旋列的样品。
4. 离心机在大约 12,000 x g，丢弃通气列。添加到列的洗涤缓冲液和再次离心。
5. 核糖核酸酶无水添加列和离心机为 30 s 洗脱 RNA 进入无菌 1.5 毫升低附着力微量离心管。

4.反转录-聚合酶链反应

1. 从-20 ° C 冰箱中检索以下试剂: dNTP，集中 （如，10 x） 反向转录缓冲区，引物 （在此示例中，随机引物）。解冻这些冰上或在室温内清洁的罩，并保持他们一次解冻的冰上。也检索的逆转录酶和核糖核酸酶抑制剂，然后放在冰上。
2. 计算所需，使"主组合"相结合的全部试剂常数之间每个反应的试剂卷 （样品反应见表 1 ）。准备足够掌握组合每个样品为阳性对照 （使用已知的成绩单模板） 和消极的控制 （例如，没有逆转录酶，与只有水作为模板，等等） 的反应。在卷中包含额外的 10%。
3. 组装的主混合 1.5 毫升低附着力微量离心管中。这最小化试剂分子到管的塑料墙的绑定。
4. 当试剂解冻时，则将计算的卷添加到微量离心管。轻轻地涡和离心前增加每个管。请确保更改吸液管之间添加每个试剂，防止污染。
5. 所有试剂后已添加，涡和离心机的主的组合，以确保均匀的混合物。试剂把存储在-20 ° c。
6. 准备和标记 8 管 PCR 条，指定一个管每个样本或控制的反应。
7. 分装主掺入每个管等体积。然后，添加反应特定组件，如 RNA 提取物。
8. 安全地到 PCR 地带，带盖，离心机在 minicentrifuge 带管接头，以确保所有液体都收集底部的每个管 (图 2)。
9. 在热循环仪上安全地地方 PCR 地带。按下，确保管。
10. 设置热循环仪以运行该程序适合正在使用 RT （样本协议见表 2 ）。该程序完成后，管将包含然后可以遭受 PCR 扩增的基因产品。有关详细信息，请参阅在定量 pcr 的朱庇特科学教育视频。直到使用存储 cDNA 在-20 ° C。

图 2。上限的 8 管板条内含主混合和提取物。

试剂	每个 1 反应 (μ L) 卷
10 x RT 缓冲区	2.0
25 x dNTPs	0.8
10 x 随机引物	2.0
Multiscribe	1.0
核糖核酸酶抑制剂	1.0
分子级 H2O	3.2
总容积	10

表 1。RT 主混合成分。

第 1 步	第 2 步	第 3 步	第 4 步
25 ° C，10 分钟	37 ° C，120 分钟	85 ° C，5 分钟	4 ° C ∞

表 2。RT 反应热循环仪程序。