聚合酶链反应与凝胶电泳检测环境微生物

1.样品采集

1. 收集土壤使用螺旋或铲到确定的深度。如果从根际 （土围和受植物的根和他们相关的微生物的狭窄区域） 收集土壤，只有直接从收集的植物根部周围打在土壤上进收集桶。
2. 通过按住浸胶棒末端浸入水无菌塑料瓶收集水样本。

2.核酸提取及制备

1. 收集样本，微生物和病毒和提取他们的 DNA 和 RNA。有关详细信息，请参阅朱庇特科学教育视频社区核酸提取。
2. 存储在标记的微量离心管中提取的 DNA。如果 DNA 需要存储一夜之间或更长的时间，冻结它在-20 ° C，和解冻在室温时准备好使用管。
3. 如果遗传物质进行分析是 RNA （不论是否的 RNA 病毒，基因组的细胞生物转录的 RNA），对此示例将创建互补 DNA (cDNA) 然后再进行 PCR 执行反转录 (RT)。有关详细信息，请参阅朱庇特科学教育视频 RT-pcr 技术。

3.聚合酶链反应

1. 在冰上放置 PCR 酶 （例如， Taq聚合酶） 和内指定的"干净"罩在室温下解冻的其他试剂 （PCR 缓冲、 dNTPs、 引物）。酶储存在-20 ° C，但永远不会冻结。它对温度很敏感，并因此必须保持冷静和其暴露于环境温度最小化
2. 计算所需，使"主组合"是恒所有反应 (表 1) 之间的所有试剂的每个试剂的体积。请确保占阳性 （例如，已知含有目标区域模板） 和阴性 （例如，没有模板） 控件在计算中的。到最后一卷占移液错误添加额外的 10%。底漆卷取决于特定的生物; 测定方法引用已发表的文献为适当的值。
3. 使用低绑定微量离心管，最小化试剂分子在塑料墙上的附着力，添加每个试剂组装主混合计算的卷。轻轻地涡和离心机在添加之前的每个试剂。一旦主人混合制备，涡混合，通过离心收集
4. 准备 8 管聚合酶链反应带。指定每个样本，包括阳性和阴性对照管
5. 每个管带分赐适当体积的聚合酶链反应混合物
6. 加入适当体积的 DNA 模板从样品，以及积极的模板 5 μ L 和 5 μ L 的分子级水作为阴性对照，各自的 PCR 管。
7. 盖安全 8 管地带和离心机使用 minicentrifuge 的几秒钟
8. 在热循环仪 8 管地带的地方
9. 设置适当的 PCR 程序，在热循环仪上运行。典型的程序包括以下内容
   1. 3 分钟，94 ℃ 变性。
   2. 30 — — 40 周期的放大: 变性 30 94 ° c s，℃ 退火处理底漆特定 （通常之间 50 – 60 ° C) 为 30 s 和延伸，在 30 72 ° C s / 500 bp。
   3. 最后一次延长在 72 ° C 为 7-10 分钟。

4.琼脂糖凝胶制备

1. 基于所需的凝胶体积和凝胶浓度 (表 2)，称出适量的琼脂糖粉放入 125 毫升锥形瓶。
2. 将适当体积的凝胶运行缓冲区添加进瓶子里，和用手旋瓶。
3. 热缓冲-琼脂糖混合在 1 分钟的高功率的微波炉。
4. 从微波删除烧瓶和手工旋流，以确保所有琼脂糖亦随之解散。如果琼脂糖已不完全溶解，重复微波 30-s 增量。
5. 紧紧地保护上瓶帽之后, 冷却至 50 ° C 的旋转流动的冷水下。
6. 使用指定的 EtBr 吸吮琼脂糖混合物中加入 1 μ L 的溴化乙锭 (EtBr)。EtBr 是一种染料，结合双链核酸和荧光橙色时用 UV 光照亮。请注意，EtBr 是潜在的致癌物质，所以必须佩戴个人防护装备 （护目镜，大褂，EtBr 防手套）。
7. 倒到电泳凝胶铸造纸盒熔凝胶。请确保没有气泡被困在琼脂糖。将一把梳子放入凝胶和牢固地夹紧。等待大约 20-30 分钟凝胶固化。
8. 一旦这种凝胶具有凝固，拔出梳子仔细而不会导致任何眼泪凝胶中。梳子在凝胶用于加载样品中创建井。

5.凝胶电泳

1. 将凝固的琼脂糖凝胶放入电泳室。
2. 添加适当的运行缓冲区进入会议厅，直到凝胶几乎被淹没。
3. 在一块石蜡，吸管加载染料精矿的斑点。此外包括适当的范围内为 PCR 产物的预期大小 DNA 梯。或者，使用一套新的微量离心管，一个用于每个样本。
4. 一旦完成了 PCR，从热循环仪，检索那 8 管地带和简要离心收集任何凝析油。将 DNA 产品适当的卷添加到加载染料和移液管向上和向下，混合。例如，2 µ L 的 10 x 加载染料与 8 µ L 样品给 10 微升，染在 1 x 最后体积的混合。
5. 移液管样每个染料样品混合物的指定在琼脂糖凝胶，小心不要刺破井井。
6. 将电极连接到电泳室。DNA 是带负电荷的离子，所以它"跑"向正极。因此，将正面电极连接到另一侧的分庭，加载井的位置。将电源设置为电压适当缓冲系统和大小的凝胶分庭，并将其设置为运行。小气泡应可见移动向两边分庭如果电泳正确进行。
7. 一旦染料前面已足够先进下凝胶，关闭电源。仔细地运输到紫外或视觉成像仪凝胶并开启 UV 光可视化在凝胶上的 DNA 条带。
8. 分析带大小和在凝胶上的立场。比较于积极的控件，以确定是否有感兴趣的有机体的 DNA 样品 (图 1) 中样品的乐队位置。

组件	每管卷 (μ L)	5 管卷 (μ L)	最终浓度
10 倍于 Ex Taq缓冲区	5.0	25	1 x
2.5 毫米 dNTPs	4.0	20	0.2 m m
向前的底漆 *	2.0	10	400 毫微米
反向引物 *	2.0	10	400 毫微米
分子的 H2O	31.75	158.75	-
Taq ex	0.25	1.25	2.5 U
聚合酶链反应混合物	45	225

表 1。聚合酶链反应试剂卷掌握混合。* 底漆卷异生物测定。调整音量的分子级水，使最后一卷 45 μ L。卷的其他组件应该不会发生变化。

推荐的 %的琼脂糖	最佳分辨率，线性 DNA 片段 （碱基对）
0.5	1,000-30,000
0.7	800-12,000
1.0	500 10,000
1.2	400-7,000
1.5	200-3,000
2.0	50-2,00

表 2。DNA 片段大小范围由不同的琼脂糖凝胶百分比以最佳方式解决。