量化环境微生物和病毒使用 qPCR

1.样品采集

1. 收集土壤使用螺旋或铲到确定的深度。如果收集从根际土壤，只收集击中过剩泥土掉根和所需的土壤刮进收集桶内 7 毫米植物根系周围土壤。
2. 将无菌尔根瓶放入浸根棍子。举行结束的坚持，以及收集水淹没瓶。将瓶子放入冰冷却器。
3. 将样品转移到实验室。

2.核酸提取

1. 为了孤立的微生物从采集的样品，提取它们的 DNA 或 RNA，请参阅朱庇特科学教育视频上社区核酸提取。

3.反向转录

1. 如果被测定的遗传物质是 RNA，它必须用于生成互补 DNA (cDNA) 通过逆转录聚合酶链反应之前。有关详细信息，请参阅朱庇特科学教育视频 RT-pcr 技术。

4.设置 qPCR

1. 检索存储在-20 ° C 的试剂和解冻他们在冰上或在室温内清洁罩。在此示例中使用的试剂包括 qPCR 反应混合 （取决于 qPCR 机使用; 包含 DNA 聚合酶），正向和反向引物和 TaqMan 探针。具体被列举的有机体的序列设计引物和探针序列。请参阅当前文学找到感兴趣的序列。在此示例中，将使用罗氏光循环 480 探针混合试剂系统。辣椒轻斑驳病毒将水样中列举。^1，2见表 1为引物和探针序列。
2. 解冻在室温中提取 DNA （c) 从样品和阳性对照 DNA （组成的有机体特定序列克隆到细菌质粒）。
3. 准备类似于 96 孔板 qPCR 板 96 单元格表格模板。标签将加载到板反应的每个单元格。包括为每个样品和标准一式三份，以及阳性对照和阴性对照，如无 DNA 反应的反应。
4. 计算所需的反应"主组合"，其中包括所有是不变的反应，根据制造商的说明与文学之间的试剂的试剂卷。准备所有样品加上控件，和额外的 10%，占移液错误一式三份反应足够主的混合。示例主控形状混合配方，请参阅表 2。
5. 工作内清洁的罩，一旦所有试剂完全解冻都后，将计算出的金额，每个试剂的添加到 1.5 毫升低绑定离心管来创建主组合。涡和简要 minicentrifuge 之前添加的每个试剂。更改每个试剂，防止污染，确保正确的浓度之间的移液器提示。已添加所有的试剂后，涡和 minicentrifuge 管与主的组合，以确保同质性。
6. 整除的主掺入每个选定好在 96 孔板 PCR 板相应的卷数。
7. 将 （c) DNA 样本、 质粒阳性对照和阴性对照 （分子级水） 适当的卷添加到指定的井。
8. 一旦添加了所有样品和控件，用密封铝箔封口板。使用密封工具推从下面箔出空气，防止产生泡沫。仔细地撕下铝箔的边缘。
9. 离心机离心机与板持有者收集混合物每口井底部密封的 96 孔板。请确保使用配重板以确保离心机将旋转时适当的平衡。脉冲离心机达 1000 rpm，然后让离心机慢慢停止没有刹车。

5.qPCR 操作

1. 放入 qPCR 机密封的 96 孔板。确保这台机器指示它是准备好开始。
2. 按照 qPCR 机说明正确输入所有信息所需的软件，然后设置 qPCR 的机器来运行。
3. 机器完成运行后，软件将能够使用阳性对照已知的浓度来计算每个反应的基因的数量。然后可以计算的原始样品中的病毒数量，基于稀释、 过滤、 浓度、 放大或执行获取 DNA 样本的提取工艺。

试剂	序列 （5' → 3'）	卷 (μ L 嗯)	最后混凝土
向前的底漆	GAGTGGTTTGACCTTAACGTTTGA	2.25	900 毫微米
反向引	TTGTCGGTTGCAATGCAAGT	2.25	900 毫微米
探头	FAM-CCTACCGAAGCAAATG-BHQ1	1.0	200 毫微米

表 1。示例引物和探针序列检测辣椒轻斑驳病毒。

试剂	卷 (μ L 嗯)	井数	主混音音量 (μ L)
LC 480 混合	12.5	26	325
分子的 H2O	4.5		117
向前的底漆	2.25		58.5
反向引	2.25		58.5
探头	1.0		26
总计	22.5		585

表 2。个别反应和主混合试剂卷。