小鼠脑脊髓样品的提取和组织透明化制备

本研究提出了一种提取和制备保留荧光信号的透明化全脑和脊髓样品的方案，以提高实验效率和数据完整性，以推进神经科学研究。

专注于中枢神经系统的神经科学研究需要对各种因素有透彻的了解，包括细胞分布、神经元连接和分子动力学。研究整个大脑和脊髓的传统方法通常包括分离、切片和扫描组织切片，然后是劳动密集型的三维图像重建过程。这种传统方法既耗时又繁琐。组织透明化和全器官成像技术的进步彻底改变了整个大脑和脊髓的分析。为了最大限度地发挥这些创新方法的潜力，必须提取和清除脑样本，同时保持它们与脊髓的连接。该协议为制备连接到脊髓的大脑样本提供了详细而系统的指南，概述了提取和清除程序。通过简化这些过程，这种方法显著提高了实验效率和数据完整性，从而促进了神经科学研究的进步，并能够对中枢神经系统的复杂性进行更全面的研究。

神经分布的准确映射和分析为中枢神经系统的结构和功能组织提供了有价值的见解，为创新的治疗策略铺平了道路，并增强了我们对神经机制的整体理解。目前，缺乏全面的视频教程来指导研究人员准备和提取连接到脊髓的脑样本并成功实现组织透明化。

有几种组织透明化方法可用：疏水性、亲水性、基于水凝胶和组织扩增透明化方法 ^1,2,3。组织清理技术广泛应用于脾脏⁴、肺⁵、腓肠肌⁶、脑⁷、脊髓⁸ 和肾脏⁹ 等器官的研究。我们的方案将详细说明如何制备连接到脊髓的全脑样品，这些样品已使用 STOCK Tg （Thy1-EGFP） MJrs/J 品系小鼠用荧光标记标记。它将提供样品提取的分步指导，并描述使用组织透明化亲水试剂盒的透明化方案。该协议可帮助研究人员掌握从脑脊髓样本提取到制备和后续扫描的整个过程。这不仅可以提高实验效率，还可以确保样本的完整性和质量，提供更准确可靠的数据来支持神经科学研究。

与传统的切片、成像和三维重建方法相比^10,11，^这里介绍的方法提供了几个关键优势，例如 （1） 增强的结构完整性：通过保持整个器官结构，这种方法降低了切片可能发生的关键信息丢失的风险¹²;（2） 全面的数据采集：使用组织透明化试剂盒可以对传统技术难以实现的细胞进行详细映射;（3） 效率和准确性：该方案简化了从样品提取到成像的整个过程，减少了免疫组织化学或染色程序所需的时间，并最大限度地减少了与切片和封片相关的错误¹³。

该方案克服了传统切片方法的局限性，这些方法通常会导致数据不完整和碎片化。通过保留完整的脑脊髓连接并利用现代组织透明化方法，该协议提供了中枢神经系统的更整体视图，这对于理解复杂的神经机制和功能至关重要。该方法的主要目的是通过制备连接到脊髓的全脑样本来实现中枢神经系统的全面成像，这些样本已用荧光神经元标志物标记。该协议旨在使用先进的解剖学方法和组织透明化技术促进神经结构和细胞分布的详细可视化。

所有动物实验均按照动物研究报告体内实验 （ARRIVE） 指南和美国国立卫生研究院实验动物护理和使用指南进行。本研究得到上海交通大学医学院附属仁济医院动物护理与使用专业委员会的批准。在这里，7-8 周龄的 STOCK Tg （Thy1-EGFP） MJrs/J 品系雄性小鼠 （C57BL/6J x CBA 来源） 用于本研究。动物是商业获得的（参见材料表）并饲养在标准笼子（22°C ± 2°C，12 h / 12 h光/暗循环，食物和水随意）。

1. 灌注

1. 使用 1 mL 注射器通过腹膜内注射 1.25% 三溴乙醇（0.02 mL/kg，参见 材料表）深度麻醉成年小鼠。通过脚趾捏反应检查麻醉深度。
2. 使用钢夹将鼠标的肢体固定在白色亚克力板上。切开小鼠两个股骨之间的皮肤，继续向上切割，直到到达横膈膜。通过隔膜打开胸部的两侧，使用剪刀和直镊子露出心脏。
3. 将 0.7 mm 输液针插入左心室。在右心耳上做一个 1-2 毫米的切口。
4. 用蠕动泵以 10 mL/min 的速率灌注含有 10 U/mL 肝素钠的 1x PBS（参见 材料表）以完全清除血液。肝脏完全变白表明清除成功。
5. 用蠕动泵以 10 mL/min 的速率灌注 50 mL 预冷的 4% PFA。监测小鼠尾巴卷曲和肌肉抽搐等体征。
   注：灌注不成功会影响后续的透明化过程。

2. 样品提取

1. 使用剪刀和镊子小心解剖整个大脑和脊髓，以避免损坏样品。
2. 使用眼科剪刀分离小鼠背部和头部的皮肤。在连接两个肢体上后缘的线与脊柱相交处切断脊柱。
3. 去除小鼠颈部和背部的肌肉和脂肪组织，露出脊柱和颅骨。使用金星剪刀从椎管下端沿脊柱和脊髓左右两侧之间的中线间隙切割。
4. 切除切断脊柱的上部和双侧，露出脊髓。重复这些步骤，直到到达大脑连接。
5. 将金星剪刀的一个刀片的尖端放在枕骨大孔和大脑之间。沿着矢状中缝线滑动和切割以打开颅骨。使用镊子取出颅骨并露出大脑。
6. 使用镊子和维纳斯剪刀从颅端去除小鼠脑脊髓组织。
   注：在后续的清扫过程中，割伤或表面损伤可能会加剧，可能导致不可预测的样品损坏。小心处理样品。
7. 在立体显微镜下使用解剖钳去除脊髓膜。
8. 使用缝合线将脑脊髓样本固定到固定板上（参见 材料表）。加入至少 20 倍样品体积的 4% PFA，并将其置于 4 °C 的振荡器上缓慢搅拌。固定过夜 16-24 小时。
   注：过度固定会导致蛋白质过度交联，从而降低透明化效率¹⁴。固定不足或延迟会导致抗原降解和组织形态破坏。
9. 丢弃 PFA 并用 1x PBS 洗涤样品 3 次。确保 PBS 的体积至少是样品体积的 10 倍，将样品完全浸没。每次洗涤持续 2 小时，在振荡器上以不低于 60 rpm 的速度搅拌以彻底去除残留的 PFA。

3. 组织清理

注意：这里使用了组织透明化试剂盒（参见 材料表）。

1. 通过将溶液 A 和溶液 B 以 9：1 的质量比混合来制备脂质去除溶液。
   注：建议脂质去除溶液的体积应大于样品体积的 20 倍。
2. 将固定的组织放入 50 mL 离心管中，加入 50 mL 脂质去除溶液。将离心管置于 37 °C 的摇床中，以 60 rpm 轻轻摇动以去除脂质。每天更换脂质去除溶液，持续 3-5 天。为了确定完成度，将离心管放在带有刻度线的灯箱上。如果黑色刻度线在样品中清晰可见且未变形，则该过程完成。
3. 将样品置于 25 °C 摇床上的 20 mL 溶液 C 中，以低于 60 rpm 的速度振荡以进行示差折光匹配。24 小时后更换溶液 C。将装有样品完全浸入溶液 C 中的培养皿放在带有刻度线的灯箱上。如果黑色刻度线在样品中清晰可见且未变形，则匹配过程完成。
   注：对于成年小鼠组织，折射率匹配通常在 2 天内完成。

4. 组织包埋

1. 在 200 mL 玻璃瓶中制备含有 147 g 溶液 C 的凝胶溶液，加入 3.0 g 琼脂糖，涡旋混合均匀，然后微波至沸腾并立即关闭微波炉。将离心管转移到 37 °C 的培养箱中，直到琼脂糖溶解。
   注：建议根据需要制备新鲜的凝胶溶液。
2. 将澄清的样品用 2 mm 深的 37 °C 凝胶溶液层嵌入模具中，并在 4 °C 冰箱中冷却 30 分钟直至半凝固。将折光率匹配的样品放入模具中，加入凝胶溶液至水平或略低于样品顶部。
3. 将模具放回 4 °C 冰箱中 2 小时。加入凝胶溶液，直到与模具表面齐平。用盖玻片盖住。在 4 °C 冰箱中加速凝固 2 小时。将包埋的样品在 4 °C 冰箱中储存过夜。尽快进行成像。

5. 扫描

1. 用镊子取下盖玻片，取出包埋的样品。将样品放入 50 mL 试管中，加入 30 mL 成像溶液以完全浸没样品。
2. 涂抹 502 胶粘剂，将样品牢固地固定在样品架上。将支架固定在成像设备上。
3. 按照说明运行扫描软件。在放大部分选择 4 倍的放大倍数。点击 校准 按钮激活校准模式。
4. 点击 预览 按钮进入预览模式。单击 Z 方向 移动按钮，将样品从样品室底部缓慢向上移动，直到生成的光片穿过样品。
5. 选择适当的激光通道和照明模式选项。选择样本的扫描路径方向。单击 Auto Scan 按钮开始捕获样本。

该方案成功地分离了 STOCK Tg （Thy1-EGFP） MJrs/J 品系雄性小鼠中与脊髓相连的整个大脑。它还使样品透明，确保荧光信号得到充分保留和捕获，提供清晰详细的图像，保持原始荧光的完整性。

图 1 显示了完整的脑脊髓，表明该协议中概述的解剖步骤是精确的。此外，组织透明化过程准确度高，生成透明标本，使复杂的神经结构可视化。此外， 图 2 显示，具有荧光信号成像的脑脊髓样品保存得非常好，提供清晰详细的图像，保留了原始荧光的完整性。 图 3 显示了 图 2 中描述的单个细胞的更高放大倍率图像。

图 1：完整的脑脊髓。 脑组织在清除之前和之后都与脊髓相连。比例尺 = 2 毫米。 请点击此处查看此图的较大版本。

图 2：三维荧光 EGFP。 该图像显示了整个大脑及其与脊髓的连接。比例尺 = 5000 μm。 请点击此处查看此图的较大版本。

图 3：高放大倍率三维荧光 EGFP。 更高放大倍率的图像，突出显示了脑脊髓样本中表达 EGFP 的单个细胞。比例尺 = 50 μm。 请点击此处查看此图的较大版本。

拟议的实验方案涉及使用大脑连接到用荧光神经示踪病毒标记的脊髓的小鼠。该协议提供了有关制备保持与脊髓连接的全脑样本的全面而详细的说明。该方案详细概述了每个步骤，确保研究人员能够精确地复制该过程。

该协议中的几个关键步骤有助于提高透明化和成像的质量。完全提取连接到脊髓的全脑样本是一项重要任务。保持大脑和脊髓的完整性对于准确追踪和后续分析至关重要。采集样品时，切口或表面损伤可能会在随后的清理过程中加剧，可能导致不可预测的损伤。为确保样品的完整性，使用材料中指定的 venus 剪刀和解剖镊子进行细致采样至关重要。用缝合线将脑脊髓样本固定在固定板上是防止浸入液体中时因重力、压力或其他因素而变形的关键步骤。

以前的研究通常只集中在大脑或脊髓⁸ 的结构和功能上。然而，中枢神经系统作为一个有凝聚力的单位发挥作用。信号从大脑向下传递，外周信号通过脊髓向上传递到更高的中枢是一个复杂的过程。获得全面的脑脊髓样本有利于研究这些信号的整合。

有几种主要的组织透明化方法可用：疏水性、亲水性、基于水凝胶和组织扩增透明化方法 ^1,2,3。基本原理和方法相同：用与成像介质的折射率匹配的其他分子代替衍射光的分子（如脂质、色素和磷酸钙）^2,15。亲水性透明化方法通常带来较少的毒性问题，并且在保留荧光蛋白和染料的信号方面更有效 ^1,2,3;但是，它们有几个缺点。它们会导致组织肿胀和体积波动，从而可能影响样品的结构完整性。使用尿素和甲酰胺等过度保湿化合物可能会导致蛋白质变性，从而影响组织的生物学相关性。此外，虽然这些方法通常简单且与荧光标记兼容，但实现较大组织的最佳透明化通常需要涉及各种化学品的复杂方案，这可能会使过程复杂化。此外，需要精确的化学混合物来调整特定的组织隔室，这增加了复杂性，需要针对特定应用进行仔细优化。

组织透明化和成像技术的进步使我们能够使用光片荧光显微镜绘制神经分布和不同细胞的体积，这些细胞要么内在表达荧光蛋白，要么用荧光标记的抗体标记¹⁶。透明化组织中多重分子检测技术的发展正在迅速发展。这些方法允许同时分析单个样品中的各种生物分析物，这对于了解复杂的生物系统（如肿瘤微环境和致密神经元网络）至关重要。此外，FISH 和 DNA 交换成像等方法有望通过 DNA 条形码和快速成像增强多重检测。高度多重蛋白质成像的未来可能在于使用核酸偶联抗体进行特异性、灵敏和多重检测，从而能够对复杂组织进行全面分析¹⁷。

总之，我们描述了一种有前途的提取和制备透明化脑脊髓样本的方法。我们的研究将帮助研究人员进行相关研究。我们的方案在 PFA 灌注小鼠中实现了组织透明。然而，最近的一份出版物报道称，科学家们发现了一种无毒染料，可以涂抹在小鼠皮肤上以暂时使其透明¹⁸.这使研究人员能够观察皮肤下的生理结构，包括血管和内脏器官。这项技术在不久的将来可能会变得更加先进，随着厚度和透明度的提高，能够对各种小鼠器官进行 体内 观察，包括中枢和周围神经系统、呼吸系统和循环系统¹⁹。

作者声明没有利益冲突。

国家自然科学基金（授予孙晓源 82101249 号和 82471204 号）。中国博士后科研基金（授予 XY Sun 的 2022M722125）。