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脑转移是癌症患者严重发病和死亡的原因。大多数脑转移小鼠模型因全身转移而复杂化,混淆死亡率和治疗干预结果的分析。这里介绍的是颈动脉内注射癌细胞的方案,该方案产生一致的颅内肿瘤和最小的全身性肿瘤。
脑转移是癌症患者严重发病和死亡的原因。转移性疾病的关键方面,例如复杂的神经微环境和基质细胞相互作用,不能完全通过 体外 测定复制;因此,动物模型对于研究和理解治疗干预的效果至关重要。然而,大多数脑肿瘤异种移植方法在时间框架和肿瘤负荷方面不能一致地产生脑转移。通过心内注射癌细胞产生的脑转移模型可导致意外的颅外肿瘤负荷,并导致非脑转移发病率和死亡率。虽然颅内注射癌细胞可以限制颅外肿瘤的形成,但它有几个注意事项,例如注射的细胞经常在注射部位形成单一的肿瘤肿块,高软脑膜受累,以及在针刺穿透过程中脑血管系统受损。该协议描述了由颈内动脉注射产生的脑转移的小鼠模型。该方法在没有其他器官参与的情况下持续产生颅内肿瘤,从而能够评估脑转移的治疗剂。
脑转移是一种普遍的恶性肿瘤,预后非常差1,2。脑转移患者的护理标准是多模式的,包括神经外科、全脑放疗和/或立体定向放射外科手术,具体取决于患者的一般健康状况、颅外疾病负担以及脑部肿瘤的数量和位置3,4。最多 3 个颅内病变的患者适合手术切除或立体定向放射外科手术,而建议有多个病变的患者进行全脑放疗,以避免手术相关感染和水肿的风险5.然而,全脑放疗会对放射敏感的大脑结构造成损害,导致生活质量下降6。
全身治疗是治疗多发病变患者的非侵入性替代和合乎逻辑的方法7。然而,由于长期以来认为全身治疗疗效不佳,因为通过血流被动递送细胞毒性药物无法在没有不安全毒性风险的情况下达到大脑中的治疗水平,因此较少考虑8。随着最近美国食品和药物管理局(FDA)批准的全身治疗(图卡替尼联合曲妥珠单抗和卡培他滨用于转移性HER2+乳腺癌脑转移)9,10,11,12以及治疗指南的更新,包括考虑脑转移患者的全身治疗选择,这种范式开始改变13,14。
在这种情况下,分子靶向治疗,免疫疗法和替代药物递送系统(例如靶向纳米药物载体)领域的发展可以潜在地克服脑转移治疗的挑战15,16,17,18。此外,还正在研究通过脑肿瘤屏障透化来改善药物递送的化学和机械方法19,20。为了研究和优化这些方法以适应目的,使用临床前模型至关重要,这些模型不仅反映了脑转移的复杂生理学,而且还允许对颅内药物反应进行客观分析。
从广义上讲,目前模拟体内脑转移的方法涉及心内(左心室),静脉内(通常是尾静脉),颅内或颈内(颈总动脉)注射小鼠的癌细胞21,22,23,24,25,26,27.除了肿瘤植入策略外,通过去除肿瘤抑制基因或激活癌基因触发肿瘤形成的基因工程小鼠模型可用于肿瘤建模。然而,据报道,只有少数基因工程小鼠模型产生继发性肿瘤,甚至更少可靠地产生脑转移瘤28,29,30。
植入方法,如心内(左心室)和静脉注射(通常是尾静脉)模仿癌症的全身播散。这些模型通常在多个器官(例如,脑、肺、肝、肾、脾脏)中产生病变,这取决于在循环"首次通过"期间捕获大多数肿瘤细胞的毛细血管床31。然而,不一致的脑植入率将需要更多的动物才能达到所需统计功效的样本量。通过这些心内和静脉注射方法 最终 在大脑中建立的肿瘤细胞数量是可变的。因此,脑转移肿瘤负荷可能因动物而异,进展的差异可能使标准化实验时间表和结果解释成为一项挑战。颅外肿瘤负荷可导致非脑转移死亡,使这些模型不适合评估颅内疗效。已经使用人工克隆选择过程建立了脑-热带细胞系以减少颅外建立,但摄取速率不一致,并且克隆选择过程可以降低通常在人类肿瘤中发现的异质性32。
脑特异性植入方法,如颅内和颈内注射,可实现更一致和有效的脑转移建模。在颅内方法33中,癌细胞通常被注射到额叶大脑皮层中,其产生快速且可重复的肿瘤生长,全身受累低。虽然该手术耐受性良好,死亡率低33,但需要注意的是,这是一种相对粗糙的方法,可迅速在大脑中引入(局部)细胞推注,并且不能模拟早期脑转移发病机制。针头会破坏脑组织脉管系统,然后引起局部炎症5,34。根据经验,在拔针过程中,肿瘤细胞注射有反流的趋势,导致软脑膜受累。或者,颈内方法将细胞输送到颈总动脉中,脑微脉管系统作为遇到的第一个毛细血管床,模拟循环、外渗和定植的存活率24。与其他人一致25,我们使用这种方法的经验发现,由于癌细胞通过颈外动脉 无意 中递送到这些组织中的毛细血管床,它可能导致面部肿瘤(未发表的数据)。通过在颈总动脉注射之前首先结扎颈外动脉可以预防面部肿瘤(图1)。在本文的其余部分,这种方法被称为"颈内动脉注射"。根据经验,颈内动脉注射方法始终如一地产生脑转移,全身性事件很少,并且已成功生成不同原发性癌症(例如黑色素瘤、乳腺癌和肺癌)的脑转移模型(图 1)。缺点是它在技术上具有挑战性、耗时、侵入性强,并且需要仔细优化细胞数量和监测时间表。总之,颅内和颈内动脉注射方法都产生了适合评估对脑肿瘤相关生存益处的治疗影响的小鼠模型。
该协议描述了颈内动脉注射方法,以产生几乎没有全身参与的脑转移小鼠模型,因此适用于药物分布和实验疗法疗效的临床前评估。
图1:脑转移的颈内动脉注射方案示意图。 颈内动脉注射与颈外动脉结扎可以可靠地产生来自各种原发性癌症的脑转移模型。在该协议中,三个结扎放置在颈动脉上(图中注释为L1-L3)。 请点击此处查看此图的大图。
所有研究均在昆士兰大学动物伦理委员会(UQCCR/186/19)和澳大利亚科学动物护理和使用守则的指导方针下进行。
1.注射用癌细胞的制备
注意:在这项研究中,使用了人乳腺癌细胞系BT-474(BT474)。BT474在完全生长培养基中培养,该培养基含有补充有10%胎牛血清和1%胰岛素的RPMI 1640培养基。将细胞保持在37°C的培养箱中,空气中有5%的二氧化碳。通过卫星串联重复检测35鉴定细胞系,确认报告蛋白(例如荧光素酶)的表达(如果有),并检查支原体感染。
2.为该程序准备鼠标
注意:在这项研究中,使用了4-5周龄的雌性NOD scid小鼠。在手术前3天向小鼠引入软饮食恢复食物(例如,减肥凝胶,水凝胶,捣碎的小鼠食物),以鼓励手术后进食。
3.颈内注射
注意:在该实验中,使用31 G输液插管和脚激活注射器驱动器设置来促进注射过程(补充图1)。此设置是可选的,用户可以使用 31 G 胰岛素注射器并跳过步骤 3.11 和 3.12。为了准备输液插管,使用两对缝合夹将针头部分与31 G针头的注射器接头部分拉动并分离。接下来,将针头部分连接到长度约为 10 cm 的细输液管的一端。
4. 注射后恢复
颈总动脉注射联合或不联合颈外动脉结扎术的比较
当通过颈总动脉 注射 癌细胞而不首先结扎颈外动脉24时,在77.8%的移植小鼠中发现了面部肿瘤(n = 7/9动物)。面部肿瘤的一个例子如 补充图3所示。本协议中描述的方法通过在颈总动脉之前结扎颈外动脉来防止意外的面部转移。
为了比较这两种方法,将凝集素注射到有或没有颈外动脉结扎的扑杀小鼠的颈总动脉中。然后,对面部组织和大脑进行固定、处理,并在荧光显微镜下观察。当颈外动脉结扎时,在脸颊组织中的免疫荧光分析中观察到凝集素减少(图2A-B)。结果还表明,颈外动脉结扎术不影响大脑递送,因为凝集素可以在接受颈总动脉注射和颈外动脉结扎的小鼠的脑组织中观察到(图2C-D)。因此,这个额外的步骤可以将癌细胞通过颈内动脉输送到大脑中,同时最大限度地减少对面部组织的播种。
图2:有和没有颈外动脉结扎的颈内移植物递送。将凝集素(绿色)输送到颈总动脉的小鼠右颊肌肉(A,B)和大脑(C,D)的荧光成像,无论是(A,C)还是没有(B,D)颈外结扎。脸颊和大脑以20倍和5倍放大倍率成像,比例尺分别代表50和200μm。细胞核(蓝色)用DAPI染色。请点击此处查看此图的大图。
生物发光监测
本研究使用HER2扩增的乳腺癌细胞系BT474进行基因改造以表达荧光素酶,通过施用荧光素并进行 体内 生物发光成像来每周监测肿瘤进展。在这个BT474脑转移模型中,可以从颈动脉内注射后的第5周观察到生物发光信号,并且随着时间的推移逐渐增加强度(图3)。
图3:生物发光信号的生物发光监测和定量。 从第 0 周到第 7 周的代表性每周生物发光图像显示来自头部的强度增加。该图显示了小鼠生物发光信号的量化。数据是标准误差 (n = 4) ±平均值。请点击此处查看此图的大图。
磁共振成像 (MRI)
在第 2、5 和 8 周使用 T2 加权 MRI 对脑转移动物模型进行成像,以评估颅内肿瘤进展。从第 5 周到第 8 周,可以观察到具有异质信号强度的区域,表明颅内肿瘤伴有复杂的液体灌注,可能来自肿瘤脉管系统中断(图 4A)。脑转移模型中的血脑屏障被破坏,类似于临床脑转移。使用钆对比度增强,然后进行T1加权MRI序列进行评估。肿瘤区域内的钆浓度随着钆从血液循环泄漏到肿瘤组织中而增加。这可以通过代表T1弛豫时间缩短的黑暗区域来说明(图4B)。获得的数据可用于将药物获取与血脑屏障通透性相关联。此外,通过使用3D Slicer图像分析软件进行体积分割,可以得出颅内肿瘤体积和表面积(图4C)。这可以绘制在与时间的关系图上,以跟踪脑肿瘤的生长。
图 4:使用磁共振成像表征脑转移动物 模型。 (A) 第 1、5 和 8 周模型的 T2 加权横向、冠状和矢状扫描。在第 5 周,矢状视图(红色箭头)上可以看到一个微弱的斑块状区域,到 8 周时进展为高信号和异质区域。(B)动态对比增强T1加权MRI显示注射钆对比增强(CE)剂前后的脑肿瘤(红色区域)。深色区域表明钆渗漏和摄取。(C)使用3D Slicer图像分析软件对冠状面,横向面和矢状面上可视化的肿瘤进行注释和分割,以得出颅内肿瘤体积。 请点击此处查看此图的大图。
PET/MR成像用于确定纳米医学的生物分布
通过增强的通透性和保留效果 ,破坏 的血脑屏障和渗漏的肿瘤脉管系统的组合促进了纳米级疗法的被动摄取和积累36,37。由于BT474脑转移模型过度表达HER2,因此使用正电子发射断层扫描/磁共振(PET / MR)成像进行了锆-89标记的HER2靶向纳米药物的大脑摄取(图5)。在一组BT474 BM小鼠中,肿瘤区域内检测到的纳米药物高于未受累脑区域,证实了脑转移瘤中纳米药物的积累。
图 5:BT474 脑转移小鼠中锆-89 标记的 HER2 靶向纳米药物 (89Zr-HER2-NM) 的代表性 PET/MR 图像。 (A)左图描绘了T2重量MRI(冠状视图),显示脑肿瘤(红色区域)和未受累的大脑(蓝色区域)。两个相邻的图像描绘了与PET叠加叠加的MRI图像(日冕和横向视图)。彩色PET覆盖显示,与未受累区域(蓝色/绿色)相比,肿瘤区域对纳米药物(白色,红色,黄色)的摄取更高。(B)该图说明了相对于未受累脑的脑肿瘤中PET信号强度和纳米药物摄取(每克注射剂量,ID / g)的增加(n = 12)。请点击此处查看此图的大图。
BM模型的生存和身体状况
BT474脑转移模型在注射后中位数存活了9周(图6)。随着脑转移的进展,动物开始减轻高达20%的体重,然后需要安乐死(在第6-9周之间)。在晚期脑转移瘤中,常见的表现包括皱皮和凸起和圆顶颅骨。这些动物通常不活动,蜷缩在一起,并且在运动技能和力量方面表现出功能缺陷。
图6:BT474脑转移小鼠模型的Kaplan Meier曲线。 中位生存期为注射后9周(n = 18)。 请点击此处查看此图的大图。
组织学
安乐死后,动物被灌注4%多聚甲醛溶液以保留脑组织学结构40。随后,对大脑和其他器官进行处理,切片并用苏木精和伊红(H&E)染色。在这个脑转移模型中,肿瘤是单侧定位的,与颈动脉注射的一侧相匹配(图7A)。BT474肿瘤主要表现为固体孤立肿块,在某些情况下几乎涉及大脑半球的一半(图7B)。经常观察到空隙的口袋,由坏死细胞组成(图7C)。一些动物中也存在较小的生长物(图7E)。免疫组织化学染色显示BT474脑转移表达强烈的HER2和HER3,表明该模型适用于HER2和HER3靶向治疗(图7F)。
图7:BT474脑转移模型的脑组织学。 (A)BT474 BM小鼠的代表性脑切片;彩色框标记了放大的感兴趣区域。比例尺= 2毫米。 (B)包含大量上皮样细胞的实体瘤。(C)空间内的坏死细胞。(D)肿瘤-脑界面(E)称为微转移的小生长。(B-E 比例尺 = 200 μm)。(F)免疫组织化学图像显示HER2和HER3阳性以及匹配的苏木精和伊红(H&E)。比例尺 = 100 μm。 请点击此处查看此图的大图。
全身性受累
在其他器官的组织切片中未观察到肿瘤(图8)。这一发现与生物发光数据一致,其中生物发光仅从动物的头部检测到。总之,结果表明该模型与未检测到的全身性肿瘤相关。
图8:其他器官的组织学。 筛查的器官中没有明显的肿瘤受累:骨、肝、肾、胰腺、肺、心脏、脾脏、肠道和卵巢。比例尺 = 100 μm。 请点击此处查看此图的大图。
补充图1:用于颈内动脉注射的套管注射器。请点击此处下载此文件。
补充图2:颈内动脉注射过程的快照。 补充 表 1 中提供了图像说明。 请点击此处下载此文件。
补充图3: T2加权MRI显示右侧面部组织中有一个大的肌内肿瘤 (红色轮廓)。H&E染色组织切片显示密集堆积的肿瘤细胞。比例尺 = 2 毫米(中心)和 100 微米(右)。 请点击此处下载此文件。
补充表1:补充图2中颈内动脉注射的分步说明。请点击此处下载此文件。
脑转移是癌细胞从原发部位扩散到大脑的复杂过程。有不同的动物模型可以反映这个多步骤过程的某些阶段,并且设计临床前转移研究有生理和实际考虑41,42。大多数已发表的研究调查使用纳米药物进行脑转移治疗的研究都使用了心内43,44和颅内45,46,47,48,49模型。通过颈动脉移植癌细胞可以更好地概括转移过程和脑转移病理生物学。
然而,根据经验,常见的颈动脉注射技术导致几只动物在早期时间点出现明显的面部肿瘤。在同时患有活动性脑肿瘤和面部肿瘤的动物中,观察到面部肿瘤的大小比脑肿瘤生长得更快。这可能是由于支持肿瘤生长的血管化程度更高的微环境(补充图3)。
颈总动脉分别通过外动脉和颈动脉 向 面部区域和大脑供血。因此,与其他人25一致,通过颈总动脉 注射 癌细胞将导致在这两个区域播种。通过在颈总动脉注射之前首先结扎颈外动脉可以预防面部肿瘤。
这里描述的颈内动脉注射方法通过将癌细胞引入供应大脑的原代血管来模拟脑转移。该模型概括了循环癌细胞在大脑血管床中的倒伏,允许它们迁移并形成转移性脑生长。结果表明,颈动脉注射将癌症的播种限制在与心内注射等方法相关的其他器官。
协议有一些关键注意事项和故障排除信息。首先,细胞团块会阻塞颅内血管并引发中风。这可以通过将细胞悬液通过细胞过滤器来缓解,以确保无结块的细胞悬液。然后,将多余的液体注入大脑会导致炎症性水肿并阻碍血管偏侧化。使用小于100 μL的进样体积可以避免这种情况。 使用末端磨损的缝合线和筋膜或纤维脂肪组织的存在会阻碍颈外动脉周围的缝合线环。建议首先用镊子沿着动脉轻轻擦拭来清除筋膜或纤维脂肪组织,并通过切断缝合线的末端来去除磨损末端。最后,癌细胞系具有独特的生长速率,因此,优化注射用细胞浓度至关重要。根据经验,在分别涉及侵袭性人癌细胞系NCI-H1975和A2058的肺和黑色素瘤脑转移模型中,注射的细胞较少(100μL中的1 x 105 个细胞)以防止疾病快速进展。
该方案中最具挑战性的步骤是将针插入颈动脉并注射细胞。建议每只动物使用新针进行无菌,因为使用钝针会增加刺穿或撕裂血管的风险。还建议在手术中使用注射器驱动器,以减少注射过程中注射的初始喷射和摇晃的针头。注射器驱动器还具有使注射速率与生理血流速率相匹配的额外好处。
该协议并非没有限制。该手术对技术要求很高,尽管进行了成功的手术,但动物仍存在因侧向化失败而死于中风的风险。根据我们的经验,中风率为11.4%(n = 21/168只动物)。因此,起始样本量应考虑到这些将死于中风的动物。由于这种方法将癌细胞直接输送到大脑,因此减少了全身性肿瘤负担,因此不适合研究全身性扩散。
总之,该方案将允许生成适用于药物筛选和评估药物治疗概况的脑转移小鼠模型。
作者声明不存在利益冲突。资助者在研究的设计中没有作用;在数据的收集、分析或解释中;在手稿的撰写中,或在决定发表论文时。
这项研究由澳大利亚国家健康与医学研究委员会(NHMRC)资助,批准号为APP1162560。ML由昆士兰大学研究生研究奖学金资助。我们要感谢所有协助畜牧业和动物 体内 成像的人。我们感谢皇家布里斯班妇女医院为这项研究捐赠等分试样的锆。
Name | Company | Catalog Number | Comments |
100µm cell strainer | Corning | CLS431752 | |
30G Microlance needle | BD | 23748 | |
31G Ultra-Fine II insulin syringe | BD | 326103 | |
Angled forceps | Proscitech | T67A-SS | Fine pointed, angled without serrations, 18mm tip, length 128 mm |
Animal heat mat | |||
Antibiotic and antimycotic | ThermoFisher Scientific | 15240062 | |
Autoclave bags | |||
BT-474 (HTB-20) breast cancer cell line | ATCC | HTB-20 | |
Buprenorphine (TEMGESIC) | |||
Countess cell counter | ThermoFisher Scientific | C10227 | |
Diet-76A | ClearH2O | 72-07-5022 | |
Dissection microscope | |||
Ear puncher | |||
Electric clippers | |||
Fine angled forceps | Proscitech | DEF11063-07 | Angled 45°, Tip smooth, Tip width: 0.4 mm, Tip dimension: 0.4 x 0.3 mm, length 9cm |
Fine tubing for cannula, Tubing OD (in) 1/32, Tubing ID (in) 1/100in | Cole Parmer | EW-06419-00 | |
Foetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | 26140079 | |
Hank's Balanced Salt Solution without calcium and magnesium | ThermoFisher Scientific | 14170120 | |
Hydrogel | ClearH2O | 70-01-5022 | |
Isoflurane | |||
Kimwipes Low lint disposable wipers | Kimberly Clark- Kimwipes | Z188964 | |
Mashed mouse chow | |||
Meloxicam (METACAM) | |||
Nose cone | Fashioned out of a microfuge tube | ||
PAA ocular lubricant (Carbomer 2mg/g) | Bausch and lomb | ||
Povidone-iodine solution | Betadine | 2505692 | |
PPE (glove, mask, gown, hairnet) | |||
Retractors | Kent Scientific | SURGI-5001 | |
RPMI 1640 Media | ThermoFisher Scientific | 11875093 | |
Silk suture 13mm 5-0, P3, 45cm | Ethicon | JJ-640G | |
Sterile normal saline | ThermoFisher Scientific | TM4469 | |
Sticky tape | |||
Surgical board | A chopping board wrapped with autoclavable bag. | ||
Surgical scissors | Proscitech | T104 | Tip Dimensions (LxD): 38x7mm, Length 115mm |
Suture forcep/ Curved Brophy forceps | Proscitech | T113C | Curved, Rounded narrow 2 mm tip, with serrations, length 165 mm |
Suture needle holder (Olsen Hegar needle holder) | Proscitech | TC1322-180 | length 190 mm, ratchet clamp |
Syringe driver with foot pedal/ UMP3 Ultra micro pump | World Precision Instruments | UMP3-3 | |
T75 tissue culture flask | ThermoFisher Scientific | 156499 | |
Thread | |||
Trigene II surface disinfectant | Ceva | ||
Trypan Blue and Cell Counting Chamber Slides | ThermoFisher Scientific | C10228 | |
TrypLE Express dissociating medium | ThermoFisher Scientific | 12605010 |
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