نمذجة ورم خبيث في الدماغ عن طريق حقن الشريان السباتي الداخلي للخلايا السرطانية

ورم خبيث في الدماغ هو سبب المراضة الشديدة والوفيات في مرضى السرطان. معظم نماذج الفئران ورم خبيث في الدماغ معقدة بسبب النقائل الجهازية التي تربك تحليل الوفيات ونتائج التدخل العلاجي. يظهر هنا بروتوكول للحقن السباتي الداخلي للخلايا السرطانية التي تنتج أوراما متسقة داخل الجمجمة مع الحد الأدنى من الأورام الجهازية.

ورم خبيث في الدماغ هو سبب المراضة الشديدة والوفيات في مرضى السرطان. لا يمكن تكرار الجوانب الحرجة للأمراض النقيلية ، مثل البيئة الدقيقة العصبية المعقدة وتفاعل الخلايا اللحمية ، بالكامل باستخدام المقايسات في المختبر . وبالتالي ، فإن النماذج الحيوانية ضرورية للتحقيق في آثار التدخل العلاجي وفهمها. ومع ذلك ، فإن معظم طرق التطعيم الأجنبي لأورام الدماغ لا تنتج نقائل دماغية باستمرار من حيث الإطار الزمني وعبء الورم. يمكن أن تؤدي نماذج ورم خبيث في الدماغ الناتجة عن حقن الخلايا السرطانية داخل القلب إلى عبء ورم خارج الجمجمة غير مقصود وتؤدي إلى مراضة ووفيات غير منتشرة في الدماغ. على الرغم من أن الحقن داخل الجمجمة للخلايا السرطانية يمكن أن يحد من تكوين الورم خارج الجمجمة ، إلا أنه يحتوي على العديد من المحاذير ، مثل الخلايا المحقونة التي تشكل في كثير من الأحيان كتلة ورم مفردة في موقع الحقن ، وتورط leptomeningeal عالية ، وتلف الأوعية الدموية في الدماغ أثناء اختراق الإبرة. يصف هذا البروتوكول نموذج فأر لورم خبيث في الدماغ ناتج عن حقن الشريان السباتي الداخلي. تنتج هذه الطريقة أوراما داخل الجمجمة باستمرار دون إشراك أعضاء أخرى ، مما يتيح تقييم العوامل العلاجية لورم خبيث في الدماغ.

ورم خبيث في الدماغ هو ورم خبيث سائد مرتبط بتشخيص سيء للغاية ^1,2. معيار الرعاية لمرضى ورم خبيث في الدماغ متعدد الوسائط ، ويتكون من جراحة الأعصاب والعلاج الإشعاعي للدماغ بالكامل و / أو الجراحة الإشعاعية التجسيمية اعتمادا على الحالة الصحية العامة للمرضى ، وعبء المرض خارج الجمجمة ، وعدد وموقع الأورام في الدماغ ^3,4. المرضى الذين يعانون من ما يصل إلى ثلاث آفات داخل الجمجمة مؤهلون للاستئصال الجراحي أو الجراحة الإشعاعية التجسيمية ، بينما يوصى بالعلاج الإشعاعي للدماغ بالكامل للمرضى الذين يعانون من آفات متعددة لتجنب خطر العدوى المرتبطة بالجراحة والوذمة⁵. ومع ذلك ، يمكن أن يتسبب العلاج الإشعاعي للدماغ بالكامل في إلحاق الضرر بهياكل الدماغ الحساسة للإشعاع ، مما يساهم في سوء نوعية الحياة⁶.

العلاج الجهازي هو بديل غير جراحي ونهج منطقي لعلاج المرضى الذين يعانون من آفات متعددة⁷. ومع ذلك ، فإنه أقل اعتبارا بسبب الفكرة القديمة بأن العلاجات الجهازية لها فعالية ضعيفة لأن التوصيل السلبي للأدوية السامة للخلايا عبر مجرى الدم لا يمكن أن يحقق مستويات علاجية في الدماغ دون التعرض لخطر السمية غير الآمنة⁸. بدأ هذا النموذج يتغير مع العلاج الجهازي المعتمد مؤخرا من إدارة الغذاء والدواء الأمريكية (FDA) (توكاتينيب مع تراستوزوماب وكابيسيتابين المشار إليهما لورم خبيث في الدماغ لسرطان الثدي HER2 + النقيلي)⁹،10،11،¹² والتحديث في إرشادات العلاج لتشمل النظر في خيارات العلاج الجهازية لمرضى ورم خبيث في الدماغ^13،14.

في هذا السياق ، يمكن للتطورات في مجال العلاج الجزيئي الموجه ، والعلاج المناعي ، وأنظمة توصيل الأدوية البديلة ، مثل ناقل الأدوية النانوية المستهدف ، التغلب على تحديات علاج ورم خبيث في الدماغ¹⁵،¹⁶،^17،18. بالإضافة إلى ذلك ، يتم أيضا التحقيق في الأساليب الكيميائية والميكانيكية لتحسين توصيل الدواء عن طريق اختراق حاجز ورم الدماغ^19,20. لدراسة وتحسين هذه الأساليب لتكون مناسبة للغرض ، من الأهمية بمكان استخدام النماذج قبل السريرية التي لا تعكس فقط الفسيولوجيا المعقدة لورم خبيث في الدماغ ولكن أيضا تسمح بالتحليل الموضوعي للاستجابة الدوائية داخل الجمجمة.

على نطاق واسع ، تتضمن الأساليب الحالية لنموذج ورم خبيث في الدماغ في الجسم الحي حقن الخلايا السرطانية داخل القلب (البطين الأيسر) أو الوريد (عادة الوريد الذيل) أو داخل الجمجمة أو داخل الشريان السباتي (الشريان السباتي المشترك) في الفئران²¹،^22،23،24،25،^26،27 . بصرف النظر عن استراتيجيات engraftment الورم ، فإن نماذج الفئران المعدلة وراثيا حيث يتم تشغيل تكوين الورم عن طريق إزالة الجينات المثبطة للورم أو تنشيط الجينات المسرطنة مفيدة لنمذجة الورم. ومع ذلك ، تم الإبلاغ عن عدد قليل فقط من نماذج الفئران المعدلة وراثيا لإنتاج أورام ثانوية وحتى أقل من ذلك تنتج بشكل موثوق النقائل الدماغية²⁸،^29،30.

تحاكي طرق Engraftment مثل الحقن داخل القلب (البطين الأيسر) والحقن في الوريد (عادة الوريد الذيل) الانتشار الجهازي للسرطان. تنتج هذه النماذج عادة آفات في أعضاء متعددة (مثل الدماغ والرئتين والكبد والكلى والطحال) اعتمادا على السرير الشعري الذي يحبس معظم الخلايا السرطانية أثناء "المرور الأول" في الدورة ^{الدموية31}. ومع ذلك ، فإن المعدلات غير المتسقة لنقش الدماغ ستتطلب المزيد من الحيوانات لتحقيق حجم العينة للقوة الإحصائية المطلوبة. عدد الخلايا السرطانية التي تنشأ في نهاية المطاف في الدماغ عن طريق طرق الحقن داخل القلب والوريد متغير. ومن ثم ، يمكن أن يختلف عبء ورم ورم ورم خبيث في الدماغ بين الحيوانات ويمكن أن يؤدي الاختلاف في التقدم إلى توحيد الجدول الزمني التجريبي وتفسير النتائج تحديا. يمكن أن يؤدي عبء الورم خارج الجمجمة إلى وفيات ورم خبيث غير دماغي ، مما يجعل هذه النماذج غير مناسبة لتقييم الفعالية داخل الجمجمة. تم إنشاء خطوط الخلايا المدارية للدماغ باستخدام عمليات الانتقاء النسيلي الاصطناعي لتقليل الإنشاء خارج الجمجمة ، لكن معدلات الاستيعاب كانت غير متسقة ، ويمكن لعملية الانتقاء النسيلي أن تقلل من عدم التجانس الموجود عادة في الأورام البشرية³².

تسمح طرق النقش الخاصة بالدماغ مثل الحقن داخل الجمجمة وداخل الشريان السباتي بنمذجة ورم خبيث في الدماغ أكثر اتساقا وكفاءة. في الطريقة داخل الجمجمة³³ ، يتم حقن الخلايا السرطانية عادة في القشرة الدماغية الأمامية ، والتي تولد نموا سريعا وقابلا للتكاثر مع مشاركة جهازية منخفضة. في حين أن الإجراء جيد التحمل مع انخفاض معدل الوفيات³³ ، فإن المحاذير هي أنه نهج بدائي نسبيا يقدم بسرعة بلعة (موضعية) للخلايا في الدماغ ولا يمثل التسبب المبكر في ورم خبيث في الدماغ. تدمر الإبرة الأوعية الدموية لأنسجة المخ ، مما يؤدي بعد ذلك إلى التهاب موضعي ^5,34. من التجربة ، هناك ميل لحقن الخلايا السرطانية إلى الارتجاع أثناء إزالة الإبرة ، مما يؤدي إلى تورط leptomeningeal. بدلا من ذلك ، تقوم الطريقة داخل الشريان السباتي بتوصيل الخلايا إلى الشريان السباتي المشترك مع الأوعية الدموية الدقيقة في الدماغ كأول سرير شعري يتم مواجهته ، ونمذجة البقاء على قيد الحياة في الدورة الدموية ، والتسرب ، والاستعمار²⁴. بالاتفاق مع الآخرين²⁵ ، وجدت تجربتنا مع هذه الطريقة أنه يمكن أن يؤدي إلى أورام الوجه بسبب التسليم غير المقصود للخلايا السرطانية عبر الشريان السباتي الخارجي إلى أسرة الشعيرات الدموية في هذه الأنسجة (بيانات غير منشورة). من الممكن منع أورام الوجه عن طريق ربط الشريان السباتي الخارجي أولا قبل حقن الشريان السباتي الشائع (الشكل 1). في بقية المقالة ، يشار إلى هذه الطريقة باسم "حقن الشريان السباتي الداخلي". من التجربة ، تولد طريقة حقن الشريان السباتي الداخلي باستمرار ورم خبيث في الدماغ مع عدد قليل جدا من الأحداث الجهازية وقد نجحت في توليد نماذج ورم خبيث في الدماغ لسرطانات أولية مختلفة (مثل سرطان الجلد وسرطان الثدي والرئة) (الشكل 1). العيوب هي أنها صعبة تقنيا ، وتستغرق وقتا طويلا ، وغازية ، وتتطلب تحسينا دقيقا لأرقام الخلايا وجدولا زمنيا للمراقبة. باختصار ، تنتج كل من طرق حقن الشريان السباتي داخل الجمجمة والداخلية نماذج فأر مناسبة لتقييم التأثير العلاجي على فائدة البقاء على قيد الحياة المرتبطة بورم الدماغ.

يصف هذا البروتوكول طريقة حقن الشريان السباتي الداخلي لإنتاج نموذج فأر من ورم خبيث في الدماغ دون أي مشاركة نظامية تقريبا ، وبالتالي فهو مناسب للتقييم قبل السريري لتوزيع الأدوية وفعالية العلاجات التجريبية.

الشكل 1: تمثيل تخطيطي لبروتوكول حقن الشريان السباتي الداخلي لورم خبيث في الدماغ. يمكن أن ينتج حقن الشريان السباتي الداخلي مع ربط الشريان السباتي الخارجي بشكل موثوق نموذج ورم خبيث في الدماغ من مختلف أنواع السرطان الأولية. في هذا البروتوكول ، يتم وضع ثلاثة أحرف مركبة على الشريان السباتي (مشروح ك L1-L3 في الشكل). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

أجريت جميع الدراسات ضمن المبادئ التوجيهية للجنة أخلاقيات الحيوان بجامعة كوينزلاند (UQCCR / 186/19) ، والمدونة الأسترالية لرعاية واستخدام الحيوانات لأغراض علمية.

1. تحضير الخلايا السرطانية للحقن

ملاحظة: في هذه الدراسة ، تم استخدام خط خلايا سرطان الثدي البشري ، BT-474 (BT474). تمت زراعة BT474 في وسط نمو كامل يتكون من وسط RPMI 1640 مكمل بنسبة 10٪ مصل بقري جنيني و 1٪ أنسولين. تم الاحتفاظ بالخلايا في حاضنة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون في الغلاف الجوي. مصادقة خط الخلية عن طريق الأقمار الصناعية جنبا إلى جنب يكرر الاختبار³⁵ ، وتأكيد التعبير عن بروتين المراسل (على سبيل المثال ، لوسيفيراز) إن وجد ، والتحقق من عدوى الميكوبلازما.

1. قم بزرع الخلايا السرطانية BT474 بكثافة بذر 2.0 × 10⁶ خلايا في دورق T75 باستخدام 10 مل من وسائط النمو الكاملة والثقافة (عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO₂) إلى 70٪ -80٪ قبل الحقن.
2. في يوم الحقن ، تخلص من وسائط النمو واغسل الطبقة الأحادية للخلية بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) مرتين.
3. أضف 5 مل من كاشف تفكك زراعة الخلايا قبل التسخين (انظر جدول المواد) واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق أو حتى تنفصل الخلايا. بعد 5 دقائق ، اضغط برفق على القارورة للمساعدة في انفصال الخلية.
4. أضف 5 مل من وسائط النمو الكاملة التي تحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني لإخماد نشاط كاشف التفكك.
5. أعد تعليق الخلايا برفق عن طريق السحب لتقليل كتل الخلايا.
6. انقل معلق الخلية إلى أنبوب سعة 50 مل وأجهزة طرد مركزي بسرعة 180 × جم لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
7. صب المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية في 10 مل من محلول الملح المتوازن من هانك (HBSS) بدون الكالسيوم والمغنيسيوم لتقليل تكتل الخلايا.
8. الطرد المركزي تعليق الخلية في 180 × غرام لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
9. صب المادة الطافية لإزالة كاشف المصل / التفكك المتبقي وإعادة تعليق حبيبات الخلية في 3 مل من HBSS.
10. ضع مصفاة خلايا 100 ميكرومتر على أنبوب مخروطي جديد سعة 50 مل وقم بتمرير معلق الخلية لإزالة كتل الخلايا.
    ملاحظة: تعليق خلية واحدة ضروري لتقليل انسداد الأوعية الدموية وخطر الإصابة بالسكتة الدماغية عند الحقن.
11. احسب عدد الخلايا القابلة للحياة باستخدام استبعاد Trypan Blue ومقياس الدم بالطرق القياسية.
12. قم بتخفيف معلق الخلية باستخدام HBSS إلى تركيز خلية 2.5 × 10⁶ خلايا / مل.
13. حافظ على الأنبوب أفقيا على الجليد وهز الأنبوب برفق بشكل دوري لتقليل التكتل. يمكن تخزين تعليق الخلية على الجليد لمدة أقصاها 6 ساعات.
    ملاحظة: تم إجراء التأرجح يدويا ولكن يمكن القيام بذلك أيضا باستخدام شاكر عند عدد دورات منخفض في الدقيقة.

2. تحضير الماوس لهذا الإجراء

ملاحظة: في هذه الدراسة ، 4-5 أسابيع من العمر ، تم استخدام إناث الفئران scid. قدم طعاما لاستعادة النظام الغذائي الناعم (على سبيل المثال ، جل الحمية ، هيدروجيل ، تشاو الفأر المهروس) للفئران قبل 3 أيام من الإجراء لتشجيع التغذية بعد العملية.

1. أدوات جراحية الأوتوكلاف. رش وامسح المنطقة الجراحية والمعدات بمطهر السطح ، يليه 70٪ من الإيثانول.
2. ضع حصيرة حرارية للحيوانات تحت اللوح الجراحي لمنع انخفاض حرارة الجسم. قم بتشغيل هذا قبل 30 دقيقة من الجراحة. رش وامسح لوح الجراحة بمطهر السطح متبوعا بنسبة 70٪ من الإيثانول.
3. قم بإعداد قفص إسكان نظيف ووسادة تدفئة دافئة للتعافي.
4. ارتد معدات الحماية الشخصية النظيفة (ثوب ، قناع ، شبكة شعر ، وقفازات). حافظ على العقم طوال العملية باستخدام قفازات فحص نظيفة وتقنية "نصائح الأدوات فقط".
5. تخدير الفأر بغرفة مخدرة باستخدام 5٪ إيزوفلوران مع تدفق أكسجين 2 لتر / دقيقة حتى يفقد الماوس منعكس الدواسة.
6. أخرج الحيوان من الحجرة وضعه في مخروط الأنف الذي يوفر 2٪ إيزوفلوران عند تدفق أكسجين يبلغ 2 لتر / دقيقة للإجراء الجراحي المتبقي.
7. الأذن لكمة الماوس لتحديد واستخدام كليبرز الكهربائية لحلق الفراء من منطقة الرقبة. نظف الشعر الزائد من الجلد المكشوف باستخدام شريط لاصق.
8. وزن الماوس لحساب جرعات المخدرات المخدرة والمسكنة المطلوبة. يتم تطبيق البوبرينورفين وميلوكسيكام بقدرة 50 ميكروغرام/كغ و1 ملغ/كغ على التوالي عن طريق الحقن تحت الجلد.
9. نقل الماوس إلى لوحة جراحية دافئة وتأمين مخروط الأنف مع الشريط.
10. ضع مادة تشحيم العين على العينين لمنع الجفاف.
11. قم بتأمين الماوس برفق عن طريق ربط الأسنان القاطعة العلوية أولا باستخدام خيط مثبت على لوحة الجراحة ، متبوعا بلصق الساقين الأمامية والخلفية. هذه الخطوة تمتد الجسم وتبقي الرقبة مستقيمة أثناء العملية.
12. قم بإعداد الجلد قبل الجراحة كما هو موضح أدناه.
    1. امسح الرقبة بمطهر موضعي (بوفيدون اليود) لتقليل حمل البكتيريا الدقيقة في الجلد وإزالة الشعر المتساقط. نظف من وسط الجلد ، واعمل للخارج لمنع إعادة تلوث موقع الشق. كرر العملية باستخدام 70٪ إيثانول. أداء ثلاث جولات بالتناوب من اليود والإيثانول للتطهير.
    2. وضع الستارة الجراحية على الحيوان. يتم قطع هذا وتشكيله من قطعة من منشفة ورقية معقمة أو كيس الأوتوكلاف.
13. وضع مناشف ورقية معقمة أو أكياس الأوتوكلاف للأدوات الجراحية.
14. تحقق من رد الفعل عن طريق "اختبار القرصة" لضمان التخدير الكافي قبل متابعة الإجراء.

3. حقن السباتي الداخلي

ملاحظة: في هذه التجربة ، تم استخدام قنية ضخ 31 جم وإعداد محرك حقنة يتم تنشيطه بالقدم لتسهيل إجراء الحقن (الشكل التكميلي 1). هذا الإعداد اختياري ويمكن للمستخدم استخدام حقنة الأنسولين 31 جم وتخطي الخطوتين 3.11 و 3.12. لتحضير قنية التسريب ، اسحب جزء الإبرة وافصله عن جزء تركيب المحقنة من إبرة 31 جم باستخدام زوجين من مشابك خياطة. بعد ذلك ، قم بتوصيل جزء الإبرة بأحد طرفي أنبوب التسريب الدقيق الذي يبلغ طوله حوالي 10 سم.

1. ضع مجهر التشريح فوق الماوس.
2. باستخدام المقص ، قم بعمل شق عمودي 15 مم على طول خط الوسط في منطقة الرقبة بدءا من 5 مم أسفل الفك إلى المدخل الصدري.
3. باستخدام زوجين من الملقط المائل ، قم بتقسيم الجلد والغدد اللعابية الكامنة ، وقم بتطبيق المبعدات لإبقاء القصبة الهوائية مكشوفة. ستكشف الخطوة التالية عن غمد الشريان السباتي الذي يقع بالتوازي مع القصبة الهوائية.
4. باستخدام زوجين من الملقط ذو الزاوية الدقيقة ، قم بتشريح العضلات والأنسجة الدهنية المجاورة للقصبة الهوائية بصراحة لكشف غمد الشريان السباتي الأيمن. الغمد السباتي هو الطبقة الليفية التي تغطي الشريان السباتي المشترك والوريد والعصب المبهم ، ويمكن تصور هذه الحزمة بواسطة الشريان السباتي المشترك الأحمر الفاتح. في هذه الدراسة ، تم إجراء الحقن على الشريان السباتي الأيمن.
5. قم بمسح جزء من الشريان السباتي الذيلي المشترك إلى التشعب السباتي للفافة المحيطة وفصله عن العصب المبهم والأوردة.
6. عزل ومسح التشعب السباتي (الوصلة التي تربط الشرايين السباتية الخارجية والداخلية) من الأعصاب واللفافة المحيطة. ضع ملقط ناعم تحت الشريان السباتي الخارجي وقم بتمرير خياطة حريرية (سمك 5-0) تحت الشريان. عقدة وتشديد خياطة وقطع الخط الزائد.
   ملاحظة: هذا الرباط (L1) سيمنع الحقن من المرور عبر الشريان السباتي الخارجي.
7. ضع ملقط ناعم تحت الشريان السباتي المشترك وقم بتمرير خياطة حريرية (سمك 5-0) تحت الشريان. اربط عقدة وشد الخيط في موضع قريب من موقع الحقن المقترح. قطع خياطة الزائدة وترك حوالي 10 ملم من الخط.
   ملاحظة: هذا الرباط الثاني (L2) سيحد من تدفق الدم والنزيف بعد الحقن. كما أنها تستخدم لوضع الشريان السباتي والاحتفاظ به أثناء الحقن.
8. قم بقص وترطيب شريط من المساحات (المعقمة) منخفضة الوبر التي تستخدم لمرة واحدة (انظر جدول المواد) حوالي 10 مم × 5 مم. قم بطي الشريط إلى 4 مم × 5 مم ، بسمك 2-3 مم ، وضعه تحت الشريان السباتي في موقع الحقن المقترح. هذا سوف يدعم الوعاء أثناء الحقن.
9. على منبر الشريان السباتي المشترك إلى موقع الحقن المقترح ، ضع ربطا ثالثا (L3) بعقدة فضفاضة. يتم تشديد هذا فقط بعد الحقن (في الخطوة 3.16).
10. حرك تعليق الخلية برفق وارسم 200 ميكرولتر من معلق الخلية في حقنة الأنسولين (بإبرة 31 جم).
11. قم بتحميل المحقنة في برنامج تشغيل المحقنة المتصل بدواسة القدم المنشطة.
12. قم بتوصيل قنية دقيقة بإبرة 31 جم بالمحقنة وقم بتجهيز الخط.
13. تحقق مما إذا كان الشريان السباتي في وضع جيد ومضغوط.
14. باستخدام ملقطين بزاوية دقيقة ، أحدهما يشد بلطف على نهاية الرباط الأول والآخر يحمل إبرة 31 G ، أدخل الإبرة ببطء مع شطبة في تجويف الوعاء الدموي مع الحرص على عدم ثقبها.
15. حقن ببطء 100 ميكرولتر من تعليق الخلايا (من الخطوة 1.13) في الشريان السباتي المشترك بسرعة 10 ميكرولتر / ثانية. سيؤدي ذلك إلى توصيل 2.5 × 10⁵ خلايا إلى الأوعية الدموية. يتم تصور الحقن الناجح عن طريق تطهير الدم من الأوعية الدموية السباتية.
16. ارفع الرباط السائب (L3) وشده برفق (من الخطوة 3.9) مباشرة بعد سحب الإبرة لمنع التدفق العكسي والنزيف. تقليم خياطة الزائدة.
    ملاحظة: من الطبيعي ملاحظة تدفق كمية صغيرة من الدم بعد سحب الإبرة. ومع ذلك ، يجب ألا يكون هناك أي نزيف نشط بعد شد الرباط الثالث.
17. قم بإزالة قطعة المساحات المبللة منخفضة الوبر التي تستخدم لمرة واحدة.
18. باستخدام ماصة P200 ، اشطف التجويف الجراحي مرتين باستخدام 150-200 ميكرولتر من الماء المعقم أو المالحة.
19. تحقق مرة أخرى من النزيف ، ثم قم بإزالة المبعدات.
20. أعد وضع الأنسجة الرخوة والغدد اللعابية والجلد فوق الشريان السباتي والقصبة الهوائية.
21. أغلق طبقة الجلد من الشق باستخدام حامل إبرة خياطة ، ملقط ، وخياطة حيدة 6/0 قابلة للامتصاص أو غير قابلة للامتصاص في نمط مستمر.
22. تخلص من حقنة إبرة القنية وقم بإعداد إعداد جديد للماوس التالي. سيضمن استخدام حقنة جديدة اتساق عدد الخلايا المحقونة في كل فأر.
    ملاحظة: توجد لقطات تمثيلية للإجراء في الشكل التكميلي 2. إذا تم ثقب الوعاء أو تمزيقه بواسطة الإبرة ، كما يشير إلى تسرب الحقن أو النزيف ، يعتبر الإجراء غير ناجح. بعد ذلك ، يجب سحب الإبرة ، ويجب تشديد الرباط الثالث على الفور لمنع المزيد من النزيف. إذا كان النزيف مستمرا بعد شد الخيط ، فيجب القتل الرحيم للحيوان باستخدام بنتوباربيتال.

4. التعافي بعد الحقن

1. حقن البوبرينورفين (50 ميكروغرام / كجم) وميلوكسيكام (1 مجم / كجم) عن طريق الحقن تحت الجلد لتخفيف الألم بعد الجراحة.
2. انقل الحيوان إلى قفص دافئ ونظيف للتعافي من التخدير. من الطبيعي أن يكون للحيوان نشاط ضعيف (متجمع وغير نشط أو يتحرك ببطء) بعد الاستيقاظ.
3. بعد 30-45 دقيقة ، انقل الفئران إلى منشأة احتجاز طويلة الأجل.
4. تزويد الفئران بنظام غذائي ناعم (جل الحمية ، هيدروجيل ، الهريس) لمدة أسبوع على الأقل بعد الجراحة والتحقق من الحالة البدنية يوميا مع إيلاء اهتمام خاص لعلامات السكتة الدماغية والعدوى والنزيف حول موقع الجرح.
5. بعد يومين من الجراحة ، من المعتاد أن يكون للحيوان نشاط منخفض ، وفراء خفيف تكدرت وفقد 15٪ من وزن الجسم قبل الجراحة. يتم تطبيق مسكن (ميلوكسيكام) يوميا لمدة 2-3 أيام بعد الجراحة لإدارة الألم والمساعدة في التعافي.
6. من اليوم 3 فصاعدا ، يجب أن تكون الحيوانات قد استعادت نشاطها ، وزادت في وتيرة التغذية والاستمالة ، واستعادة الوزن. القتل الرحيم للحيوانات التي تعاني من عجز مستمر في الحالة البدنية (ألم ، متجمع ، غير نشط ، فقدان الوزن) بعد 4 أيام بعد الجراحة عن طريق حقن بنتوباربيتال الصوديوم بمعدل 200 مجم / كجم عن طريق الحقن داخل الصفاق.
7. يمكن مراقبة تطور الورم وتطوره باستخدام طريقة التخدير والتصوير المفضلة مثل التصوير الحيوي أو التصوير بالرنين المغناطيسي أو التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني / التصوير بالرنين المغناطيسي. ستعتمد متطلبات وقدرة إجراء مثل هذا التصوير بطبيعته على أهداف المشروع الفردية والمرفق الذي يتم تنفيذه فيه ، واعتمادا على نوع المراسل الذي يضع علامة على خطوط الخلايا المستخدمة ، وإمكانية الوصول إلى مرافق الكيمياء الإشعاعية والتصوير النووي ذات الصلة^36,37
   ملاحظة: قد لا تستجيب بعض الحيوانات بشكل جيد وتعاني من سكتة دماغية على الرغم من نجاح الإجراء. بعد العملية ، يجب القتل الرحيم للحيوانات التي تظهر عليها أي أعراض للضائقة العصبية (تحويل الرأس والسحب إلى جانب واحد ، والسلوك الدائري ، والدحرجة ، والسحق ، وفقدان الوظيفة الحركية) على الفور.

مقارنة حقن الشريان السباتي الشائع مع أو بدون ربط الشريان السباتي الخارجي
عندما تم حقن الخلايا السرطانية عبر الشريان السباتي المشترك دون ربط الشريان السباتي الخارجي²⁴ أولا ، تم العثور على أورام الوجه في 77.8٪ من الفئران المطعمة (ن = 7/9). يوضح الشكل التكميلي 3 مثالا على ورم الوجه. الطريقة الموضحة في هذا البروتوكول تمنع ورم خبيث غير مقصود في الوجه عن طريق ربط الشريان السباتي الخارجي قبل الشريان السباتي المشترك.

لمقارنة الطريقتين ، تم حقن الليكتين في الشريان السباتي المشترك للفئران التي تم إعدامها مع أو بدون ربط الشريان السباتي الخارجي. بعد ذلك ، تم إصلاح أنسجة الوجه والدماغ ومعالجتها ومراقبتها تحت المجهر الفلوري. لوحظ انخفاض في الليكتين في تحليل التألق المناعي في أنسجة الخد عندما تم ربط الشريان السباتي الخارجي (الشكل 2 أ - ب). تظهر النتائج أيضا أن ربط الشريان السباتي الخارجي لم يؤثر على توصيل الدماغ لأنه يمكن ملاحظة الليكتين في أنسجة المخ للفئران التي خضعت لحقن الشريان السباتي الشائع مع ربط الشريان السباتي الخارجي (الشكل 2C-D). لذلك ، يمكن لهذه الخطوة الإضافية توجيه توصيل الخلايا السرطانية عبر الشريان السباتي الداخلي إلى الدماغ مع الحد الأدنى من البذر لأنسجة الوجه.

الشكل 2: توصيل الكسب غير المشروع داخل الشريان السباتي مع وبدون ربط الشريان السباتي الخارجي. التصوير الفلوري لعضلة الخد اليمنى (A ، B) وأدمغة الفئران (C ، D) مع الليكتين (الأخضر) التي يتم توصيلها إلى الشريان السباتي المشترك ، إما مع (A ، C) أو بدون ربط السباتي الخارجي (B ، D). تم تصوير الخد والدماغ عند تكبير 20x و 5x وتمثل أشرطة المقياس 50 و 200 ميكرومتر على التوالي. كانت النوى (الزرقاء) ملطخة ب DAPI. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

مراقبة التوهج الحيوي
تم استخدام خط خلايا سرطان الثدي المضخم HER2 ، BT474 ، والذي تم تعديله وراثيا للتعبير عن لوسيفيراز في هذه الدراسة للسماح بالمراقبة الأسبوعية لتطور الورم عن طريق إعطاء لوسيفيرين وإجراء التصوير الحيوي في الجسم الحي . في نموذج ورم خبيث في الدماغ BT474 ، يمكن ملاحظة إشارات التوهج الحيوي من الأسبوع 5 بعد الحقن السباتي الداخلي ونمت شدتها تدريجيا بمرور الوقت (الشكل 3).

الشكل 3: مراقبة التوهج الحيوي والقياس الكمي لإشارة التلألؤ الحيوي. صور تمثيلية أسبوعية للإضاءة الحيوية من الأسبوع 0 إلى الأسبوع 7 تظهر كثافة متزايدة ناشئة من الرأس. يوضح الرسم البياني القياس الكمي لإشارات التوهج الحيوي في الفئران. البيانات هي وسيلة ± الخطأ القياسي (ن = 4). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI)
تم تصوير النموذج الحيواني لورم خبيث في الدماغ باستخدام التصوير بالرنين المغناطيسي المرجح T2 في الأسبوع 2 و 5 و 8 لتقييم تطور الورم داخل الجمجمة. من الأسبوع 5 إلى الأسبوع 8 ، يمكن ملاحظة منطقة ذات كثافة إشارة غير متجانسة ، مما يشير إلى وجود ورم داخل الجمجمة مع تروية سائلة معقدة ، على الأرجح من الأوعية الدموية للورم المعطل (الشكل 4 أ). تعطل حاجز الدم في الدماغ في نموذج ورم خبيث في الدماغ ويشبه ورم خبيث في الدماغ السريري. تم تقييم ذلك باستخدام تعزيز تباين الجادولينيوم متبوعا بتسلسل التصوير بالرنين المغناطيسي المرجح T1. يزداد تركيز الجادولينيوم داخل منطقة الورم حيث يتسرب من الدورة الدموية إلى أنسجة الورم. يتضح ذلك من خلال المنطقة المظلمة التي تمثل تقصير وقت استرخاء T1 (الشكل 4 ب). يمكن استخدام البيانات التي تم الحصول عليها لربط وصول الدواء بنفاذية حاجز الدم في الدماغ. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن اشتقاق حجم الورم داخل الجمجمة ومساحة السطح عن طريق إجراء التجزئة الحجمية باستخدام برنامج تحليل الصور 3D Slicer (الشكل 4C). يمكن رسم ذلك على رسم بياني مقابل الوقت لتتبع نمو ورم الدماغ.

الشكل 4: توصيف نموذج حيواني لورم خبيث في الدماغ باستخدام التصوير بالرنين المغناطيسي . (أ) المسح العرضي والإكليلي والسهمي المرجح T2 للنموذج في الأسابيع 1 و 5 و 8. في الأسبوع 5 ، يمكن رؤية منطقة باهتة غير مكتملة على المنظر السهمي (السهم الأحمر) ، والتي تطورت إلى منطقة شديدة الكثافة وغير متجانسة بحلول الأسبوع 8. (ب) التصوير بالرنين المغناطيسي T1 المعزز بالتباين الديناميكي يظهر ورما في المخ (المنطقة باللون الأحمر) قبل وبعد حقن عامل تعزيز تباين الجادولينيوم (CE). تشير المناطق المظلمة إلى تسرب الجادولينيوم وامتصاصه. (ج) تم شرح الورم المرئي على المستويات الإكليلية والمستعرضة والسهمية وتجزئته باستخدام برنامج تحليل الصور 3D Slicer لاشتقاق حجم الورم داخل الجمجمة. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني / التصوير بالرنين المغناطيسي لتحديد التوزيع الحيوي للطب النانوي
يسهل الجمع بين الحاجز الدموي الدماغي المعطل والأوعية الدموية للورم المتسرب الامتصاص السلبي وتراكم العلاجات النانوية ، من خلال النفاذية المحسنة وتأثير الاحتفاظ^36,37. نظرا لأن نموذج ورم خبيث في الدماغ BT474 يبالغ في التعبير عن HER2 ، فقد تم إجراء امتصاص الدماغ للطب النانوي الذي يستهدف HER2 المسمى بالزركونيوم 89 باستخدام التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني / التصوير بالرنين المغناطيسي (PET / MR) (الشكل 5). في مجموعة من الفئران BT474 BM ، كان الطب النانوي المكتشف داخل منطقة الورم أعلى من ذلك الموجود في مناطق الدماغ غير المشاركة ، مما يؤكد تراكم الطب النانوي في نقائل الدماغ.

الشكل 5: صورة تمثيلية PET / MR للزركونيوم -89 المسمى الطب النانوي الذي يستهدف HER2 (⁸⁹Zr-HER2-NM) في فئران ورم خبيث في الدماغ BT474. (أ) الصورة اليسرى تصور التصوير بالرنين المغناطيسي T2-weight (منظر إكليلي) يظهر ورم الدماغ (المنطقة الحمراء) والدماغ غير المتورطين (المنطقة الزرقاء). تصور الصورتان المتجاورتان صور التصوير بالرنين المغناطيسي (منظر إكليلي وعرضي) متراكبة مع تراكب PET. يظهر تراكب التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني الملون أن منطقة الورم لديها امتصاص أعلى للطب النانوي (الأبيض والأحمر والأصفر) مقارنة بالمناطق غير المصابة (الأزرق / الأخضر). (ب) يوضح الرسم البياني الزيادة في شدة إشارة التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني وامتصاص الطب النانوي (الجرعة المحقونة لكل جرام ، معرف / جم) في أورام المخ بالنسبة إلى الدماغ غير المتورطة (ن = 12). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

البقاء على قيد الحياة والحالة المادية لنماذج BM
نجا نموذج ورم خبيث في الدماغ BT474 من متوسط 9 أسابيع بعد الحقن (الشكل 6). مع تقدم النقائل الدماغية ، بدأت الحيوانات تفقد ما يصل إلى 20 ٪ من وزن الجسم ، الأمر الذي يتطلب بعد ذلك القتل الرحيم (بين الأسبوع 6-9). في النقائل الدماغية في المرحلة المتأخرة ، تشمل العروض التقديمية الشائعة الفراء المكشكش والجمجمة المنتفخة والقبة. غالبا ما كانت الحيوانات غير نشطة ومتجمعة وأظهرت عجزا وظيفيا في المهارات الحركية والقوة.

الشكل 6: منحنى كابلان ماير لنموذج فأر ورم خبيث في الدماغ BT474. كان متوسط البقاء على قيد الحياة 9 أسابيع بعد الحقن (ن = 18). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

علم الأنسجة
بعد القتل الرحيم ، تم تزويد الحيوانات بمحلول بارافورمالدهيد 4٪ للحفاظ على بنية أنسجة الدماغ⁴⁰. بعد ذلك ، تمت معالجة الأدمغة والأعضاء الأخرى وتقسيمها وتلطيخها بالهيماتوكسيلين والإيوزين (H&E). في نموذج ورم خبيث في الدماغ ، تم تحديد الأورام من جانب واحد ، مطابقة لجانب الحقن السباتي (الشكل 7 أ). ظهرت أورام BT474 في الغالب ككتل انفرادية صلبة ، وفي بعض الحالات تشمل ما يقرب من نصف نصف الكرة المخية (الشكل 7 ب). لوحظت جيوب من المساحات الفارغة بشكل متكرر وتتكون من خلايا نخرية (الشكل 7 ج). كانت النواتج الأصغر موجودة أيضا في بعض الحيوانات (الشكل 7E). يظهر تلطيخ الكيمياء الهيستولوجية المناعية أن نقائل الدماغ BT474 تعبر عن HER2 و HER3 قويين ، مما يشير إلى أن هذا النموذج مناسب للعلاجات المستهدفة HER2 و HER3 (الشكل 7F).

الشكل 7: أنسجة الدماغ لنموذج ورم خبيث في الدماغ BT474. (أ) مقطع دماغي تمثيلي لفأر BT474 BM ؛ مربعات ملونة تميز مناطق الاهتمام الموسعة. شريط المقياس = 2 مم. (ب) ورم صلب يتكون من كتلة من الخلايا الظهارية. ج: الخلايا الميتة داخل الفضاء. د: السطح البيني بين الورم والدماغ (ه) النتوءات الصغيرة المعروفة باسم النقائل الدقيقة. (شريط مقياس B-E = 200 ميكرومتر). (و) صور الكيمياء الهيستولوجية المناعية التي تظهر إيجابية HER2 و HER3 وتطابق الهيماتوكسيلين واليوزين (H&E). شريط المقياس = 100 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

المشاركة المنهجية
لم يلاحظ أي أورام في أقسام الأنسجة من الأعضاء الأخرى (الشكل 8). تتفق هذه النتيجة مع بيانات التوهج الحيوي ، حيث تم اكتشاف التلألؤ الحيوي فقط من رؤوس الحيوانات. معا ، أظهرت النتائج أن هذا النموذج مرتبط بعدم وجود أورام جهازية يمكن اكتشافها.

الشكل 8: أنسجة الأعضاء الأخرى. لم يكن هناك تورط واضح للورم في الأعضاء التي تم فحصها: العظام والكبد والكلى والبنكرياس والرئة والقلب والطحال والأمعاء والمبيض. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل التكميلي 1: حقنة قنية لحقن الشريان السباتي الداخلي. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 2: لقطات لعملية حقن الشريان السباتي الداخلي. ويرد وصف الصورة في الجدول التكميلي 1. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 3: التصوير بالرنين المغناطيسي المرجح T2 يظهر ورما عضليا كبيرا في أنسجة الوجه اليمنى (محدد باللون الأحمر). يكشف قسم الأنسجة الملطخة ب H& E عن خلايا ورمية مكتظة بكثافة. شريط المقياس = 2 مم (وسط) و 100 ميكرومتر (يمين). الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الجدول التكميلي 1: وصف خطوة بخطوة لحقن الشريان السباتي الداخلي في الشكل التكميلي 2. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

ورم خبيث في الدماغ هو عملية معقدة تنتشر فيها الخلايا السرطانية من موقعها الأساسي إلى الدماغ. تتوفر نماذج حيوانية مختلفة تعكس مراحل معينة من هذه العملية متعددة الخطوات وهناك اعتبارات فسيولوجية وعملية لتصميم دراسات ورم خبيث قبل السريرية^41،42. استخدمت معظم الدراسات المنشورة التي تبحث في استخدام الطب النانوي لعلاج ورم خبيث في الدماغ نماذج داخل القلب⁴³،44 وداخل الجمجمة⁴⁵،^46،47،^48،49. قد يؤدي تطعيم الخلايا السرطانية عبر الشريان السباتي إلى تلخيص العملية النقيلية والبيولوجيا المرضية لورم خبيث في الدماغ.

ومع ذلك ، من التجربة ، أدت تقنية حقن الشريان السباتي الشائعة إلى ظهور العديد من الحيوانات بأورام كبيرة في الوجه في نقاط زمنية مبكرة. في الحيوانات التي تعاني من أورام الدماغ والوجه النشطة ، لوحظ أن أورام الوجه تنمو بسرعة أكبر في الحجم من أورام الدماغ. قد يكون هذا بسبب البيئة المكروية الأكثر وعيا التي تدعم نمو الورم (الشكل التكميلي 3).

يمد الشريان السباتي المشترك الدم إلى منطقة الوجه والدماغ عبر الشرايين الخارجية والشريان السباتي ، على التوالي. وبالتالي ، بالاتفاق مع الآخرين²⁵ ، فإن حقن الخلايا السرطانية عبر الشريان السباتي المشترك سيؤدي إلى البذر في كلا المنطقتين. من الممكن منع أورام الوجه عن طريق ربط الشريان السباتي الخارجي أولا قبل حقن الشريان السباتي المشترك.

تحاكي طريقة حقن الشريان السباتي الداخلي الموصوفة هنا ورم خبيث في الدماغ عن طريق إدخال الخلايا السرطانية في الأوعية الدموية الأولية التي تغذي الدماغ. يلخص هذا النموذج إيواء الخلايا السرطانية المنتشرة في السرير الوعائي للدماغ ، مما يسمح بانتقالها وتشكيل نمو الدماغ النقيلي. تظهر النتائج أن حقن الشريان السباتي يحد من بذر السرطان إلى الأعضاء الأخرى المرتبطة بطرق مثل الحقن داخل القلب.

هناك بعض الاعتبارات الهامة ومعلومات استكشاف الأخطاء وإصلاحها للبروتوكول. أولا ، يمكن أن تسد كتل الخلايا الأوعية الدموية داخل الجمجمة وتؤدي إلى سكتة دماغية. يمكن تخفيف ذلك عن طريق تمرير تعليق الخلية من خلال مصفاة الخلية لضمان تعليق خلوي خال من التكتل. بعد ذلك ، يمكن أن يؤدي حقن السوائل الزائدة في الدماغ إلى وذمة التهابية وإعاقة البطانة الوعائية. يمكن تجنب ذلك باستخدام حجم الحقن أقل من 100 ميكرولتر. يمكن أن يؤدي استخدام خياطة ذات نهايات مهترئة ووجود لفافة أو أنسجة ليفية إلى إعاقة حلقة الخياطة حول الشريان السباتي الخارجي. يوصى أولا بمسح اللفافة أو الأنسجة الدهنية الليفية عن طريق تطبيق حركة مسح لطيفة على طول الشريان بالملقط وإزالة نهايات الاهتراء عن طريق قطع نهاية الخيط. أخيرا ، تتمتع خطوط الخلايا السرطانية بمعدلات نمو فريدة ، وبالتالي ، من الضروري تحسين تركيز الخلايا للحقن. من التجربة ، في نماذج ورم خبيث في الرئة وسرطان الجلد في الدماغ التي تضمنت خطوط الخلايا السرطانية البشرية العدوانية NCI-H1975 و A2058 على التوالي ، تم حقن عدد أقل من الخلايا (1 × 10⁵ خلايا في 100 ميكرولتر) لمنع تطور المرض السريع.

الخطوة الأكثر تحديا في هذا البروتوكول هي إدخال إبرة في الشريان السباتي وحقن الخلايا. يوصى باستخدام إبرة جديدة لكل للعقم لأن استخدام الإبر الحادة يزيد من خطر ثقب أو تمزق الأوعية الدموية. يوصى أيضا باستخدام برنامج تشغيل حقنة لإجراء العملية لتقليل الطفرة الأولية للحقن والإبرة المهتزة أثناء الحقن. يتمتع سائق المحقنة أيضا بميزة إضافية لمطابقة معدل الحقن مع معدل تدفق الدم الفسيولوجي.

هذا البروتوكول لا يخلو من القيود. الإجراء متطلب تقنيا وهناك خطر استسلام الحيوانات للسكتة الدماغية من فشل التشكيل الجانبي على الرغم من خضوعها لإجراء ناجح. من تجربتنا ، فإن معدل السكتة الدماغية هو 11.4 ٪ (ن = 21/168 الحيوانات). ومن ثم ، يجب أن يمثل حجم عينة البداية هذه الحيوانات التي ستموت من السكتة الدماغية. نظرا لأن هذه الطريقة تنقل الخلايا السرطانية مباشرة نحو الدماغ ، فقد قللت من عبء الورم الجهازي وبالتالي فهي ليست مثالية لدراسة الانتشار الجهازي.

باختصار ، سيسمح البروتوكول بتوليد نموذج فأر ورم خبيث في الدماغ مناسب لفحص الأدوية وتقييم الملف العلاجي للأدوية.

يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب في المصالح. لم يكن للممولين أي دور في تصميم الدراسة. في جمع البيانات أو تحليلها أو تفسيرها؛ في كتابة المخطوطة ، أو في قرار نشر الورقة.

تم تمويل هذا البحث من قبل المجلس الوطني الأسترالي للصحة والبحوث الطبية (NHMRC) ، رقم المنحة APP1162560. تم تمويل ML من خلال منحة أبحاث الدراسات العليا بجامعة كوينزلاند. نود أن نشكر كل من ساعد في تربية الحيوانات والتصوير الحي للحيوانات. نشكر مستشفى بريسبان الملكي والنساء على التبرع بحصص الزركونيوم لهذه الدراسة.