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体内显微内窥镜钙成像是一种宝贵的工具,能够实时监测自由行为动物的神经元活动。然而,将这种技术应用于杏仁核是很困难的。该协议旨在为成功瞄准小鼠的杏仁核细胞提供有用的指南。
在体内实时监测自由移动动物的神经元活动是将神经元活动与行为联系起来的关键方法之一。为此,利用基因编码的钙指标(GECIs)、微型荧光显微镜和梯度折射指数(GRIN)透镜,开发并成功应用于许多大脑结构1、2、3、4、5、6,检测神经元中的钙瞬态。这种成像技术特别强大,因为它能够长期同时对基因定义的细胞群进行长达几周的成像。虽然有用,这种成像技术不容易应用于大脑结构,位于大脑深处,如杏仁核,情感处理和关联恐惧记忆7的基本大脑结构。有几个因素使得很难将成像技术应用于杏仁核。例如,在更深的大脑区域进行成像时,运动伪影物通常更频繁地发生,因为植入大脑深处的头部安装显微镜相对不稳定。另一个问题是,横向心室位于靠近植入的 GRIN 透镜的位置,其呼吸过程中的运动可能会导致无法轻松校正的高度不规则运动伪影,从而难以形成稳定的成像视图。此外,由于杏仁核中的细胞通常处于静止或麻醉状态,因此很难在碱基板过程中找到并聚焦在杏仁核中表达GECI的目标细胞,以备日后成像之用。该协议为如何用头安装微型显微镜有效定位杏仁核中表达GECI的细胞提供了一个有用的指南,从而成功地在如此深的大脑区域进行体内钙成像。需要注意的是,此协议基于特定系统(例如 Inscopix),但不限于此系统。
钙是无处不在的第二信使,在几乎每一个细胞功能中都起着至关重要的作用。在神经元中,动作电位激发和突触输入导致细胞内自由[Ca2]9,10的快速变化。因此,跟踪钙瞬态提供了一个监测神经元活动的机会。GECIs 是一种强大的工具,可以监测 [Ca2+] 在定义的细胞群和细胞内隔间11,12。在许多不同类型的基于蛋白质的钙指标中,基于单个GFP分子13的Ca2+探针GCaMP是最优化的,因此被广泛使用GECI。通过多轮工程,已开发出12、14、15、16等多种GCAMP变型。我们使用最近开发的GCaMP之一,GCaMP7b,在此协议16。GCaMP传感器为研究一些模型生物体的神经回路功能做出了巨大贡献,如17日开发过程中的Ca2+瞬态成像、特定皮质层18的体内成像、运动任务学习19中的电路动力学测量以及与海马和杏仁核20、21中关联恐惧记忆相关的细胞合奏活性的成像。
GECI的光学成像有几个优点。基因编码使 GECIs 能够在由遗传特征或解剖连接特定模式定义的特定细胞子集中长期稳定地表达。光学成像使活体动物中数百到数千个神经元的体内慢性同步监测。一些光学成像系统已经开发出来,用于对大脑内的GECI进行体内的活体成像和分析,这些小鼠的大脑中带有头部安装的微型荧光显微镜21、23、24、25。尽管基于GECIs、GRIN镜头和头坐式微型显微镜的体内光学成像技术是研究神经回路活动和行为之间联系的有力工具,但由于将GLIN透镜瞄准杏仁核中表达GECIs的细胞而未引起运动伪影,从而严重降低了图像采集质量和寻找表达GECIs的细胞,因此将这项技术应用于杏仁核一直存在一些技术问题。该协议旨在为基板附件和 GRIN 镜头植入的外科手术提供一个有用的指南,这是成功在杏仁核体内进行光学钙成像的关键步骤。虽然此协议针对杏仁核,但此处描述的大多数程序通常适用于其他更深的大脑区域。虽然此协议基于特定系统(例如 Inscopix),但与其他替代系统很容易实现相同的目的。
所有程序均得到韩国高等科学技术研究所动物伦理委员会的批准。所有实验均按照机构动物护理和使用委员会的准则进行。
注:此协议包括六个主要步骤:病毒注射手术、GRIN 镜头植入手术、GRIN 镜头植入验证、底板附件、行为测试期间 GCaMP 信号的光学记录以及数据处理(图1A)。除手术外,还使用商业软件包(Inscopix)。
1. 立体反应手术-AAV病毒注射
注:此外科手术中使用的鼠标菌株为 C57BL6/J。动物的身体在手术过程中被无菌的窗帘覆盖,所有步骤都戴着无菌手套进行。多个手术通常不在同一天进行。但是,如果多个小鼠必须在同一天进行相同的手术,则为每只小鼠使用一套单独的自动切除手术工具和 70% 乙醇来消毒小鼠之间的手术器械。为了在手术过程中保持鼠标温暖,小鼠在固定到立体轴框架后,用定制的手术毯覆盖。
2. 立体声治疗手术-GRIN镜头植入
注:GRIN镜头植入手术是此协议中最关键的一步。由于 GRIN 镜头运动的一致缓慢速度对于成功的 GRIN 镜头植入至关重要,电动手术臂可能很有用。电动手术臂是由计算机软件控制的立体定向战术操纵器。虽然此协议中使用了电动臂,但只要镜头在植入过程中持续缓慢地移动,也可以使用其他方法。有关该设备的详细信息在 材料表中。
3. 格林镜头植入验证
注:GRIN 镜头植入的验证提供了有关植入的 GRIN 透镜是否对准 GCaMP 表达细胞的信息。基于这些信息,实验者通过排除植入目标外的 GRIN 镜头的动物,从而节省了他们的时间,从而从行为测试和数据处理等耗时流程中节省时间。在验证过程中,具有 GCaMP 表达的细胞应聚焦在录制视域中。在此步骤中使用移动家庭笼。移动家庭笼是一种专门的圆形设备,允许头部固定的小鼠在验证 GRIN 镜头植入和底板附件时自由移动腿部。将头部固定小鼠的腿放在这个装置中的空运台,使腿部能够自由移动,尽管头部是固定的。杏仁核侧核中的细胞通常处于静止或麻醉状态,因此在这些条件下很少检测到GCaMP荧光信号,这使得在G GRIN透镜植入和底板附件验证过程中很难找到表达GCaMP的细胞,有时甚至是不可能的。然而,腿部的运动往往在杏仁核侧核的细胞中产生GCaMP荧光信号,从而有助于定位显微镜。因此,移动家庭笼用于此协议。
4. 底板附件
注:底板附件步骤遵循 GRIN 镜头植入验证。底板是将显微镜安装到小鼠头部的平台。如上一节所述,本协议中使用了移动家庭笼。
5. 行为测试期间GCaMP信号的光学记录
注:根据用于光学成像、实验设计和实验室环境的系统,GCaMP信号记录过程可能非常不同。因此,在此部分中以简单的方式描述它。
6. 数据处理
注:数据处理过程因数据处理软件和用于成像实验的 GECI 而异。因此,在此部分中以简单的方式描述它。此协议使用商业数据处理软件(见 材料表)。或者,讨论部分中提到的其他开源软件也可以毫无问题地使用。此协议中使用的变量列在表 1中。
格林 镜头植入验证
在通过粘固将底板长期连接到大脑之前,GRIN 镜头植入需要经过验证。在成功植入镜片的动物中,GCaMP表达细胞和血管都清晰地观察到由显微镜客观透镜与植入的G GRIN透镜(图2A和B)之间的距离决定的焦点平面范围内。相比之下,在进行脱靶植入的动物中,在焦点平面范围内(无论是失焦的还是失视的)没有观察到GCaMP表达细胞的清晰图像。在注意力不集中的情况下,可以观察到聚焦良好的血管,但只能观察焦点平面范围内细胞的模糊图像(图2C和D)。在视线外的情况下,大多数情况下没有观察到血管,在焦点平面范围内没有检测到荧光信号(图2E)。此外,与其他情况不同,植入的 GRIN 镜头显示出明亮的边缘(图 2F)。底板附件仅在目标 GRIN 镜头植入的验证动物身上进行。
洛杉矶神经元中 GCaMP 信号的记录,以响应听觉刺激
在此协议中,向小鼠展示了4个伪多语调实例(2.8 kHz,200毫秒持续时间,25个脉冲),并且用头安装显微镜在小鼠的LA细胞中光学记录了GCaMP信号。在单侧侧杏仁核中注射AAV1-Syn-GCaMP7b-WPRE的小鼠用于成像。在成功植入 GRIN 透镜的动物中,在焦点平面范围内清楚地观察到病毒表达细胞和血管(图 3A)。在行为条件下,大约 50-150 个细胞通常在洛杉矶的视野中显示显著的荧光变化,即使没有ΔF/F 图像中显示的音调,可能是自发活跃的细胞(图 3B)。在音调演示时,只有少数单元显示由ΔF/F 图像分析( 图 3C 中的 6 个单元和图 3D中的 6 个单元)确定的 GCaMP 信号的色调特定变化。在注射AAV2/1-卡姆基奇-GFP作为对照的小鼠身上也进行了同样的手术。虽然在焦点平面范围内检测到GFP表达细胞,但根据ΔF/F图像分析(图3E 和 图3F),没有细胞显示有或没有音调的重大荧光变化。
为了对GCaMP表达和G GRIN透镜的靶向进行组织验证,在荧光显微镜下检查死后大脑的冠状部分(图4A和图4B)。DAPI染色用于确认完整的细胞和没有组织损伤的迹象,由于格林镜头周围的脑组织炎症(图4C)。
图1:洛杉矶体内显微内窥镜钙成像立体法手术的示意图工作流程和图表(A)洛杉矶体内显微内窥镜钙成像的示意图工作流程。(B)显示病毒注射和 GRIN 镜头植入手术颅骨切除部位的二维坐标的微观图片。两个头骨螺丝和镜头形成一个等边三角形。(C)病毒注射部位与植入的 GRIN 透镜之间的相对位置图,以及计算"值 A"的示意图解释。(D)手术最后阶段从头骨表面到头板的水泥层的横截面。树脂牙水泥应覆盖螺丝壁和植入的 GRIN 透镜。丙烯酸水泥应用于树脂牙科水泥上。头板附着在水泥层上。石蜡薄膜覆盖植入的 GRIN 透镜表面,并保护其免受灰尘的覆盖。可拆卸环氧树脂可防止石蜡薄膜分离。请点击这里查看此数字的较大版本。
图2:底板附着后磨镜头植入和水泥层配置的验证。(A) 成功植入 GRIN 镜头的动物的代表性内窥镜快照图像。清楚地观察到GCaMP表达细胞和血管。 (B) 植入的 GRIN 镜头表面的快照图像,来自成功植入 GRIN 镜头的动物。 (C) 具有代表性的内窥镜快照图像,来自无焦 GRIN 镜头植入的动物。 (D) 植入的 GRIN 镜头表面的快照图像,来自无焦 GRIN 镜头植入的动物。在注意力不集中的情况下,血管有时被清楚地观察到,但只对焦点平面范围内的细胞模糊图像。 (E) 具有代表性的内窥镜快照图像,来自植入视线的动物 GRIN 镜头。在视线外的情况下,大多数情况下不观察到血管,在焦点平面范围内也未检测到荧光信号。 (F) 植入的 GRIN 镜头表面的快照图像,来自植入视图的动物 GRIN 镜头。与其他情况不同,在这种情况下可以观察到明亮的边缘。 (G) 基板附件的水泥层配置。底板和车头板由丙烯酸水泥连接。底板和 GRIN 镜头之间应有一个未填充丙烯酸水泥的空间。 请点击这里查看此数字的较大版本。
图3:洛杉矶神经元中GCaMP信号的记录。(A 到 C) 从注射 AAV1-Syn-GCaMP7b-WPRE 的鼠标获得的数据。 (A) 行为测试期间具有代表性的内窥镜快照图像。GCaMP7b表达细胞和血管在焦点平面范围内被清楚地观察到。 (B) 显示Δ F/F 信号 的代表性快照图像。白线表示在行为测试期间在感兴趣区域显示显著荧光变化的细胞。比例尺条 = 50μm. (C) 最大强度投影图像。总共 6 个单元格显示 GCaMP 信号的色调特定变化。比例尺条 = 50μm. (D) 代表 Δ音响应细胞的 F/F 痕迹。每种颜色对应于面板 (C) 中颜色相同的每个单元格。 (E 和 F) 从注射 AAV2/1-卡姆基奇-GFP 的鼠标获得的数据。(E) 行为测试期间具有代表性的内窥镜快照图像。在焦点平面范围内清楚地检测到GFP表达细胞。 (F) 显示Δ F/F 信号 的代表性快照图像。缩放栏 = 50μm。 请单击此处查看此数字的较大版本。
图4:对G GRIN镜头位置和GCaMP7b表达的实证验证。(A) 在洛杉矶显示 GCaMP7b 表情的代表性日冕部分图像。比例尺条 = 200μm. (B) 放大图像。比例尺条 = 50μm. (C) 荧光微观图像,显示 DAPI 染色信号。缩放栏 = 200μm。 请单击此处查看此数字的较大版本。
因素 | 价值 |
空间向下采样因子 | 2 |
时间下降采样因子 | 2 |
空间过滤器:高截止 | 0.5 |
空间过滤器:低截止 | 0.005 |
运动校正:高截止 | 0.016 |
运动校正:低截止 | 0.004 |
运动校正:最大翻译 | 20 |
ΔF/F 参考框架 | 平均帧 |
PCA/ICA:块大小 | 1000 |
PCA/ICA:收敛 | 1x10^-5 |
PCA/ICA:伊卡时体重 | 0.4 |
PCA/ICA:数字 | 120 |
PCA/ICA:数字公司 | 150 |
PCA/ICA:未混合类型 | 时间 |
事件检测:衰减恒定 | 1.18 |
事件检测:阈值 | 4 |
表1:数据处理变量列表
熟练的手术技术对于在更深的大脑区域(如杏仁核)中成功实现体内光学钙成像至关重要,正如我们在这里描述的那样。因此,尽管此协议为基板附件和 GRIN 镜头植入的优化手术过程提供了指导,但关键步骤可能需要额外的优化过程。如协议部分所述,手术中的杏仁核坐标、基板附件步骤中的气流速度、钙记录中的图像采集设置(帧速率、LED功率等)和数据处理中的变量(ICA时间重量、事件最小衰变时间等)需要优化。
可以修改底板附件步骤。头板是必要的,因为它有助于修复清醒的小鼠的头在基板附件在移动家庭笼进行。但是,如果实验室没有准备移动家庭笼,异氟气麻醉系统是一种替代选择。对于这种替代方法,异氟气的浓度可能至关重要。我们观察到,在1.5%以下的异氟化小鼠的杏仁核中很少检测到GCaMP信号。相反,GCaMP信号在0.8%的异位素条件下被检测到,小鼠处于几乎清醒的状态,但在这种情况下没有实质性的头部运动。因此,这种麻醉条件允许进行底板附件,而无需使用额外的设备,如头板和移动家庭笼。
头骨螺钉、水泥、底板和显微镜的不稳定附件可导致运动伪影,可使用运动校正软件算法进行校正。横向心室的运动被认为会导致一种不规则类型的运动伪影,使用当前可用的运动校正软件无法轻松更正。这种不规则的运动神器在大多数肤浅的大脑区域,如海马和皮层中是最小的。然而,在杏仁核的光学成像过程中经常检测到它。为了克服这个问题,本协议建议将 GRIN 镜头从病毒注射部位植入 50μm 的横向侧面(图 1C),通过减少来自侧心室的潜在运动伪影物,从而极大地改善图像采集过程。虽然我们设置了50μm相对于病毒注射部位,镜头植入的目标坐标也可以设置相对于横向心室。在此协议中,我们推断,更关键的是精确定位病毒表达站点,以成功实现成像性能。因此,我们使用病毒注射坐标作为参考,以设置镜头植入的目标坐标。通过反复试验,我们建立了一个最佳条件,允许 GRIN 镜头有效地瞄准病毒表达站点,同时避免横向心室运动引起的运动文物。最终,能够有效和准确地纠正任何运动伪影物的方法将有很大的帮助,获得光学成像到更深的大脑区域在未来。
虽然带头安装微型显微镜的体内光学钙成像是一种强大的工具,并已得到优化,但在许多方面仍有改进的余地。该协议将促进旨在调查自由行为动物杏仁核中实时神经活动的研究。
提交人没有什么可透露的
这项工作得到了三星科技基金会(项目编号SSTF-BA1801-10)的资助。
Name | Company | Catalog Number | Comments |
26G needle | BD | 302002 | Surgery |
AAV1-Syn-GCaMP7b-WPRE | Addgene | 104493-AAV1 | Surgery |
AAV2/1-CaMKiiα-GFP | custom made | Surgery | |
Acrylic-Dental cement (Ortho-jet Acrylic Pink) | Lang | 1334-pink | Surgery & Baseplate Attachment |
Air flow manipulator | Neurotar | NTR000253-04 | Baseplate Attachment |
Amoxicillin | SIGMA | A8523-5G | Surgery |
Baseplate | INSCOPIX | 1050-002192 | Baseplate Attachment |
Baseplate cover | INSCOPIX | 1050-002193 | Baseplate Attachment |
Behavioral apparatus (chamber) | Coulbourn Instrument | Testcage | Behavior test |
Behavioral apparatus (software) | Coulbourn Instrument | Freeze Frame | Behavior test |
Carbon cage | Neurotar | 180mm x 70mm | Baseplate Attachment |
Carprofen | SIGMA | PHR1452-1G | Surgery |
Data processing software | INSCOPIX | INSCOPIX Data Processing Software | Baseplate Attachment & Behavior test |
Dexamethasone | SIGMA | D1756-500MG | Surgery |
Drill | Seyang | marathon-4 | Surgery |
Drill bur | ELA | US1/2, Shank104 | Surgery |
Glass needle | WPI | PG10165-4 | Surgery |
GRIN lens (INSCOPIX Proview Lens Probe) | INSCOPIX | 1050-002208 | Surgery |
Hamilton Syringe | Hamilton | 84875 | Surgery |
Head plate | Neurotar | Model 5 | Surgery |
Hex-key | INSCOPIX | 1050-004195 | Baseplate Attachment |
Laptop computer | Samsung | NT950XBV | Surgery & Baseplate Attachment |
Lens holder, Stereotaxic rod (INSCOPIX proview implant kit) | INSCOPIX | 1050-004223 | Surgery |
Microscope gripper | INSCOPIX | 1050-002199 | Baseplate Attachment |
Microscope, DAQ software, hardware | INSCOPIX | nVista 3.0 | Baseplate Attachment & Behavior test |
Mobile homecage | Neurotar | MHC V5 | Baseplate Attachment |
Moterized arm | Neurostar | Customized | Surgery |
Moterized arm software | Neurostar | Customized | Surgery |
NI board | National instrument | Behavior test | |
Removable epoxy bond | WPI | Kwik-Cast | Surgery |
Resin cement (Super-bond) | Sun medical | Super bond C&B | Surgery |
Skull screw | Stoelting | 51457 | Surgery |
Stereotaxic electrode holder | ASI | EH-600 | Surgery |
Stereotaxic frame | Stoelting | 51600 | Surgery |
Stereotaxic manipulator | Stoelting | 51600 | Baseplate Attachment |
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