前体小鼠膈肌三方突触细胞特异性钙信号的影像学研究

在这里, 我们提出了一个协议, 以图像钙信号在个别细胞类型的人群在小鼠神经肌肉连接。

细胞在组织中的电活动可以通过电生理技术进行监测, 但通常仅限于对单个细胞的分析。由于细胞质中的细胞内钙 (Ca^{2 +}) 的增加往往是由于电活动, 或对无数其他刺激的反应, 这一过程可以监测的影像, 加载与荧光钙敏感染料。 然而, 由于这些染料被组织内的所有细胞类型占去, 很难在整个组织内的单个细胞类型中想象这种反应。相比之下, 基因编码的钙指标 (GECIs) 可以用单个细胞类型和荧光来表达, 以响应胞内 ca^{2 +}的增加, 从而允许在整个人群中的 ca^{2 +}信号的成像单个单元格类型。在这里, 我们应用 GECIs GCaMP3/6 的小鼠神经肌肉连接, 一个三方突触之间的运动神经元, 骨骼肌, 和终端/perisynaptic 雪旺细胞。我们展示了这种技术在经典的活体组织制剂中的效用。使用光学分光器, 我们执行动态 Ca^{2 +}信号的双波长成像和神经肌肉连接的静态标签 (NMJ) 的方法, 可以很容易地适应监测两个细胞特定的 GECI 或基因编码的电压指标 (GEVI) 同时进行。最后, 我们讨论了用于捕捉荧光强度空间图的例程。这些光学、转基因和分析技术可以用来研究 NMJ 中不同细胞亚群在多种环境下的生物活性。

NMJ 像所有的突触一样, 由三元素组成: 一个突触前终端, 从神经元, 突触后神经元/效应细胞, perisynaptic 胶质细胞^1,2。虽然突触传输的基本方面在这个突触³首先被证明, 这个过程的许多方面仍然不明, 部分由于这个突触的不同的细胞元素表达相同的分子。例如, 由脊椎动物 NMJ 的运动神经元共同释放的嘌呤腺嘌呤核苷酸 ATP 和乙酰胆碱的受体, 由肌肉、雪旺细胞和运动神经元表达, 从而使任何这些物质施加的功能效应 (例如, 发射机释放或反应, 肌肉力量世代)⁴。此外, 虽然 NMJ 的三方成分比较简单, 例如, 中枢神经系统中的神经元通常呈现多个突触输入, 无论是运动神经元、肌细胞还是雪旺细胞因刺激而变化关于它们的内在异质性 (如胚胎衍生、纤维亚型、形态学) 尚不清楚。为了解决这些问题, 在一个突触元素中同时跟踪许多细胞的反应, 以及在其他任何一个单独的元素中同时跟踪这种反应是有利的。使用化学染料来测量钙信号的常规策略不能达到这两个目标, 因为沐浴应用染料在应用到组织后被多种细胞类型所占, intracellularly 载染料只能用于可视化单个或小的细胞群。在这里, 利用转基因小鼠表达 GECIs 设计来测量细胞特定的钙信号, 连同具体的成像和软件工具⁵, 我们展示了这两个总体目标的第一个, 并讨论如何添加新的转基因工具将有助于实现第二个目标。这项技术将是有用的任何人感兴趣的跟踪钙动力学或其他细胞信号事件可观测到通过基因编码的光学传感器在多个细胞群体的同时。

畜牧和实验是按照国家卫生研究院的指导, 为实验室动物的护理和使用和 IACUC 在内华达大学。

1. 转基因小鼠横膈膜和膈神经的制备

1. 购买转基因小鼠和寡核苷酸引物对这些小鼠进行基因型。
   注: 这些小鼠的 "信息" 页面上都列出了引物。
   1. 饲养一只3至6月大的老鼠, 表达一份适当的转基因/敲入的GCaMP3/6等位基因的副本, 并与同一年龄的第二只老鼠表达条件 GCaMP3/的一或两份副本. 6个等位基因和零拷贝的综合动力基因。
   2. 基因型的幼崽和标记的那些有创有和条件 GCaMP3/6 等位基因-这些将从此被称为双转基因小鼠 (例如, Myf5-Cre,条件 GCaMP3)⁶。
      注意: 这样, 所有的数据都将从老鼠身上得到, 这些小鼠表达了一份有条件的 GCaMP3/6 等位基因。这是特别重要的, 当添加其他突变小鼠 (如, 挖空) 这些十字架。
2. 当双转基因小鼠是适当年龄 (如产后0或 5 [P0 或 P5] 或成人), 弄死小鼠斩首他们与剪刀 (对小鼠比 P10) 或放置在异氟醚吸入室-当他们是不再用一把钳子捏尾巴, 他们已经准备好牺牲了。
3. 用剪刀把动物斩首。
4. 横断面横跨整个动物刚好在肝脏之下和在心脏和肺之上与虹膜剪刀。
5. 解剖远离肝脏, 心脏和肺部, 小心保持一个长度的膈神经, 足够长的时间被吸引到吸入电极 (即, 1-2 厘米)。
   注意: 左膈神经可以被识别为一个白色的组织, 进入左膈内侧部分。在取出肺部时不能剪掉。右膈神经在一条筋膜内运行, 也含有上腔静脉, 比腔静脉更薄、更白。在一起, 他们都穿透右内侧隔膜。
6. 进一步去除胸腔和脊椎柱, 除了在隔膜周围的薄脊。
7. 将隔膜和膈神经样本放置在离心管中, 克雷布斯1µg/毫升 594-αBTX, 在黑暗中10分钟。
   注: 这种浓度的 594-αBTX 标签乙酰胆碱受体 (AChRs) 不阻断其功能 (个人观察)。

2. 肌肉动作电位的刺激和记录

1. 使用 minutien 针, 固定膜片, 固定在一个6厘米的盘子涂上硅胶介电凝胶, 并填补了〜8毫升的含氧克雷布斯溶液, 并把它放到显微镜阶段。灌注膜片与更多克雷布斯-响铃解答 (8 毫升/分钟) 为30分钟。
   注: 这冲洗未绑定的594αBTX, 以及 equilibrates 后, 解剖组织。
2. 根据所建立的方法制作吸电极⁷。
   1. 在4X 放大倍数, 使用机器人, 移动吸入电极在左膈神经和应用吸入通过拉出5毫升注射器的枪管连接到连接到吸入电极的导管。
      注: 当成功地吸入电极时, 膈神经绷紧。打开刺激器, 通过翻转手动开关1x 来刺激膈神经。
   2. 确保膜片与1赫兹刺激的合同, 通过视觉检查它与 brightfield 照明。如果没有, 调整电压旋钮, 逐步实现 supramaximal 脉冲, 这可以通过视觉检查肌肉收缩。如果仍然不可见, 用注射器吹出神经, 并尝试通过吸入来再次吸引它。
3. 关闭灌注和添加肌肉特异的肌球蛋白抑制剂 BHC⁶或电压门控钠通道拮抗剂µ-芋螺毒素⁸最终浓度100µM。
   1. 为使100µM BHC, 吸管4µL 200 毫米股票在亚砜和 predilute 它在1毫升克雷布斯响铃解答。
   2. 从盘子中取出1毫升的克雷布斯溶液。
   3. 添加 prediluted BHC, 到菜。
      注: 此 predilution 有助于防止未经稀释的亚砜在 GCaMP3-expressing 细胞中的非瞬态荧光反应诱导。
   4. 等待30分钟, 然后, 打开新的克雷布斯解决方案的灌注另一个 20-30 分钟。
4. 准备录音电极。
   1. 戴着手套, 将一个直径 (外径) 为1毫米的硼硅酸盐 filamented 玻璃和 0.4 mm 的内径 (ID) 放入微拉拔器中, 并拧紧刻度盘以将其夹紧到位。关上拉拔门。
   2. 使用 P-97 拉出器, 程序如下设置: 热 900, 拉 120, 速度在 75, 时间在 250, 压力在 500, 并没有额外的循环。
      注意: 电阻 (R) 是使用放大器的软件控制来测量的: 数据采集软件通过解决公式 V = IR 来确认电阻。软件控制器通过电极传递已知电流 (I) (通常为 1 nA), 并测量电压 (V) 的变化, 从而使我们能够解决 R。
   3. 对于胚胎隔膜, 确保阻力接近 60 MΩ, 并为较旧的隔膜, 10-20 MΩ。加载记录电极与3米氯化钾。
5. 在10X 的放大倍数下, 将电极降低为肌肉, 使用第二机器人在舞台的另一侧作为刺激电极。
6. 使用电生理数据采集软件, 等到静止膜电位从0到-65 mV 或以下的变化。
7. 刺激1赫兹和验证肌肉动作电位的存在, 检查一个巨大的潜力, 显示适度超调 (电位上升超过 0 mv, 当它开始在-65 mv 或以下)。不要把刺激工件与动作电位混淆。
   注: 在持续时间 (~ 5 毫秒) 中, 电位明显长于刺激工件。

3. 样品的荧光成像

1. 在20X 放大, 找到在肌肉中心的终板带, 寻找 594-αBTX–labeled NMJs 下绿色/黄色光激发 (550 nm)。切换到蓝光激发 (470 nm) 到图像 Ca^{2 +}反应的肌肉, 运动神经元, 或雪旺细胞。
2. 如果需要, 设置带通滤波器的图像分配器和双波长成像的分色单刃滤波器。
3. 为了计算 GCaMP3/6-expressing 组织所展示的最大荧光 (Fmax), 将12µL 3 米氯化钾 (氯化钾) 添加到隔膜制剂⁶中。
   1. 在查阅表格栏上的亮度条上进行实验, 将其设置为 GCaMP3/6-expressing 组织以20X 倍的比例显示饱和度的 110%, 而不 binning 以应对氯化钾。
4. 每秒记录20帧, 以不错过任何快速事件。
5. 刺激与1四十五年代 20-40 赫兹神经刺激通过提供一列冲动使用吸入电极或增加药理激动剂由巴恩应用或通过灌注和收集动态荧光 Ca^{2 +}反应在一个细胞子类型连同静态的594αBTX NMJ 信号。
   注: 如果组织特异性的红或远红色 GECI 或 GEVI 小鼠可在 NMJ 使用, 它们可以用来收集两个动态信号, 反映两个不同的细胞元素在 NMJ。
6. 当成像或电生理实验完成, 因为预期的结果已经达到, 灌注水通过灌注线和吸水 2x-3x 通过吸入电极, 以确保盐不建立起来。

4. 通过荧光强度标准偏差图 (SD_iu16) 对数据进行出口和分析

1. 记录作为16位 TIFF 栈记录的图像序列, 并将其加载到所需的图像数据分析系统中进行分析。
2. 在软件的8d 文件菜单中, 选择感兴趣的图像堆栈, 然后单击加载。
   1. 一旦视频加载, 扫描通过时间来识别一个没有细胞荧光活动的部分。
      注意: 此区域将用于创建背景示例。
   2. 按住Shift并单击以在标识为背景示例区域的区域中绘制 "感兴趣区域" (ROI) 框。
   3. 创建框后, 按空格键生成背景活动更改的情节。
   4. 右键单击跟踪并选择 "分类 " 选项以显示将ROI 转储为文本的选项, 以便将跟踪作为 xy 坐标文本文件。
3. 向后移动到感兴趣的视频, 再次扫描以确定感兴趣活动发生的时间区域。
   1. 使用鼠标中键, 在黄色时间框中选择此时间区域。
   2. 右键单击视频并选择堆栈 OPS , 然后统计映射选项5。
      注意: 这将在左窗口中生成标准偏差映射 (SD 映射)。
   3. 点击 SD 地图, 然后按下]键19x 应用适当的颜色热图。
   4. 右键单击 SD 地图, 然后选择STM 加载和保存, 这将显示将stm 保存为 tiff的选项以保存 sd 映射。
   5. 然后, 按[键19x 以返回灰度色图。
   6. 按C , 然后D来提出密度映射工具。使用鼠标左键和鼠标中心键, 调整阈值, 包括 SD 图中显示的所有荧光活动。
   7. 按C键关闭密度工具, 同时保持阈值设置。
   8. 右键单击 SD 地图, 然后选择STM 粒子, 然后找到 PTCLS。
      注意: 这将识别单个细胞表达荧光活动。
   9. 再次右键单击 SD 映射, 然后选择 "创建粒子 ROIs"。
      注意: 这将叠加所选单元格的原始视频感兴趣。
   10. 在按住Shift的同时, 右键单击原始视频中任何一个已识别的粒子 ROIs。
   11. 选择 roi标记并在 ROI 中度量 Int。
       注意: 这将为感兴趣的视频中每个确定的 ROI 生成单个荧光活动图。通过右键单击其中任一项并选择 "分类", 然后将ROI 作为文本转储, 可以节省这些内容。
4. 有关这些操作基础的详细逻辑, 请参阅源代码文件⁹。

一些荧光强度变化的例子, 介导的增加细胞内钙^{2 +}在定义的细胞类型的 NMJ, 显示了这种方法的效用。这些结果显示为空间荧光强度图, 它提供了响应细胞的位置, 以及它们的响应强度, 从而使人们能够评估多少细胞反应, 以及每个细胞对特定刺激。例如, 如图 1所示, 我们在 P7 Wnt1-Cre的膜片 NMJs 上拍摄了一个终端/perisynaptic 许旺细胞 (TPSCs) 中的 Ca^{2 +}响应的视频;条件 GCaMP3表达小鼠对膈神经刺激的反应, 并通过空间荧光强度图确定应答细胞的亚群。这些荧光强度的地图作为热图和颜色编码被提出根据火颜色查寻桌 (火查找表)。我们记录了这些视频, 并没有分裂的图像, 同时查看在隔膜中间的α BTX 标记 AChRs 的簇 (视频 1和2), 一种方法, 可以很容易地适应捕捉动态 GECI 或 GEVI两种不同的细胞类型的反应, 前提是它们各自呈现非重叠的激发和发射光谱。

在图 2中, 我们对 P4 Myf5-Cre 的膜片进行了相同的神经刺激实验; 有条件的 GCaMP3表达小鼠, 并在肌肉细胞中成像 Ca^{2 +}反应。有趣的是, 当我们使用的肌球蛋白阻滞剂 BHC 或骨骼肌特定电压门控钠通道 (Na_v1.4) 拦截µ-芋螺毒素(图 2A和视频 3或图 2B和视频 4, 分别), 我们可视化的 ca^{2 +}瞬变, 旅行全长的肌肉纤维, 代表行动潜力, 并介导的 ca^{2 +}从肌网, 或仅仅是终板带的长度, 代表终板电位和介导的胞外 Ca^{2 +}通过 AChR.In 的涌入除了用空间荧光强度图识别应答细胞的亚群 (SD 图), 如图 1所示, 我们还测量了变化在荧光随着时间在这些肌肉细胞的人口与时空 (ST) 地图。每个实验都代表不同的细胞类型, 不同的年龄, 不同的治疗 (神经刺激与神经刺激在不同的药物存在) 和不同类型的分析 (空间与时空荧光强度图)。这些数字也说明了转基因 GCaMP 小鼠最有用的特征之一, 即重复刺激和图像相同样本的能力, 因此, 测试不同治疗条件的效果。

图 1: 活性诱导的雪旺细胞 Ca^{2 +} P7 Wnt1-Cre膈肌和膈神经反应的测定条件 GCaMP3小鼠.(左) 平均荧光强度图像, 显示在神经刺激 (Prestim) 前的雪旺细胞沿膈神经分支和神经肌肉交界 (NMJ) 的荧光背景水平。从神经刺激后获得的荧光值中减去该背景荧光值。权利16位荧光强度单位 (SDiu₁₆) 的标准偏差的空间地图在三十年代的赫兹的膈神经刺激 (传感地图或 SD 地图) 后产生的 Ca^{2 +}响应显示了一个强大的响应在终端/perisynaptic 雪旺细胞 (TPSCs) 在 NMJ。火查找表热图在 SDiu₁₆和鳞片酒吧在微米。面板B E中的所有图像的放大倍数与面板A中的相同。(左) 同一膜片上标有594共轭α bungarotoxin (α BTX), 它结合和标签乙酰胆碱受体 (AChRs), 并以绿/黄光激发来识别 NMJ。权利这个面板显示了同一膜片的 brightfield 图像, 显示了一个细胞内记录电极 (箭头) 的尖端, 它可以引导到一个 NMJ, 基于α BTX 标记。(C) 通过将空间强度图中的各个区域划分为粒子 (左), 可以评估单个细胞或细胞组的 Ca^{2 +}瞬态特征 (例如, 强度、刺激后的发作、持续时间),将它们表示为感兴趣的颜色区域 (ROIs), 并且 (D) 随着时间的推移绘制它们的强度。(E) 此面板显示双波长图像的 GCaMP3-mediated 荧光 Ca^{2 +}反应和594α标记 NMJs 在同一隔膜使用双子图像分配器后, 神经刺激。请单击此处查看此图的较大版本.

视频 1: 无图像分裂活动诱导的雪旺细胞 Ca 电影^{2 +}P7 中的响应, 详见图 1传奇.请单击此处查看此视频。(右键单击可下载.

视频 2: 电影与活动诱导的雪旺细胞 Ca 图像分裂^{2 +}答复和 594-α BTX 标记 AChRs 在 P7, 详细描述在图 1传奇.请单击此处查看此视频。(右键单击可下载.

图 2: 测定活动诱发的肌细胞 Ca^{2 +} P4 Myf5-Cre膈肌反应;条件 GCaMP3小鼠.(A) (左) 烟人权咨询理事会簇的中央定位板带的膜片上标有594α BTX。中东^{2 +}瞬态强度 (SD 图) 的空间图, 三十年代后产生的 40 Hz 的膈神经刺激 BHC 存在的肌球蛋白抑制剂, 显示了整个地区的所有隔膜肌细胞的反应。权利相比之下, 在相同的刺激后, 从同一隔膜产生的 SD 地图, 但在 Na_v1.4 拮抗剂µ-芋螺毒素 (µ CTX) 的存在下, 在所有隔膜肌细胞的内侧区域有一个空间上受限的反应,对应于人权咨询理事会聚类富集终板带。火查找表热图在 SDiu₁₆和鳞片酒吧在微米。(B) 这个小组显示了在一段时间内 (x轴) 的肌肉细胞 (y轴) 中, 长时间 (ST 映射) 的 Ca^{2 +}瞬态强度的时空图。刻度条以秒为单位。请单击此处查看此图的较大版本.

视频 3: 活动诱发肌肉细胞的电影^{2 +}反应在肌球蛋白阻滞剂的存在 BHC 在 P4, 如详细描述在图 2A传奇.请单击此处查看此视频。(右键单击可下载.

视频 4: 活动诱发肌肉细胞的电影^{2 +}反应在存在 Na_v1.4 拮抗剂µ-芋螺毒素在 P4, 详细描述在图 2B传奇.请单击此处查看此视频。(右键单击可下载.

在这里, 我们提供了一些例子, 以测量 GECI 表达小鼠完整的神经肌肉组织中的特定细胞的 Ca^{2 +}反应。为了成功地进行这些实验, 在解剖过程中不应损伤膈神经。要在雪旺细胞中以低功率或大功率 (即20X 或 60X) 图像 Ca^{2 +}响应, 必须使用 BHC 或µ-芋螺毒素来阻止移动。对于在肌肉细胞中的 Ca^{2 +}反应的低功率成像, 有可能在没有这些药物的情况下测量它们, 从而允许同时获得肌肉钙^{2 +}瞬变强度和肌肉长度变化在高频神经刺激⁶。在同一样品上进行多项实验时, 必须将每一个都分离至少15分钟, 在这段时间内可以灌注样品。这些步骤允许重复成像的刺激诱导 Ca^{2 +}反应从同一领域的相同的样本, 至少 3-5 小时。这也是关键的 predilute 药物溶解在亚砜, 如 BHC 所述, 因为亚砜直接应用于 GCaMP 表达组织诱导不可逆转的, 刺激无关的荧光反应。

我们发现, 由于不明原因, Wnt1-Cre;conditionalGCaMP3/6小鼠在 P15 P20 后未表现出神经刺激或激动剂诱导的雪旺细胞的钙^{2 +}反应。然而, Sox10-Cre;有条件的 GCaMP3/6老鼠继续表现这些反应至少晚于 P56, 最古老的年龄, 我们已经检查。相比之下, Myf5-conditional GCaMP3/6小鼠表现出的反应是一年, 最古老的年龄检查。

虽然 GECI 表达小鼠提供了独特的机会, 成像 Ca^{2 +}反应在整个群体的细胞的特定亚型, 有一些限制, 如无法执行比例成像, 从而提取定量 Ca^{2 +}测量。还有限制的深度的组织, 这些反应可以成像使用 widefield 荧光显微镜 (即, 而不是使用共焦或多光子显微镜)。因此, 虽然隔膜的薄度适合于这里提出的技术的应用, 捕捉细胞特定的 Ca^{2 +}反应在细胞类型的 NMJ 在其他肌肉更厚可能需要亚解剖或其他种类的荧光显微镜。

这些基因和光学工具在以前的 Ca^{2 +}成像技术上表现出显著的进步, 只有在一个细胞类型中只有多个细胞类型或几个单独的细胞才能被成像。另一个好处是, ca^{2 +}响应可以 repeatably 成像长时间从相同的细胞使用 GECI 小鼠, 而这是不容易使用传统的化学 Ca^{2 +}结合荧光染料。最后, 使用图像拆分器, 我们在一个细胞类型 (雪旺细胞) 和一个固定的标签在第二个 (肌肉细胞) 中执行双波长成像的动态信号, 从而显示如何评估多细胞特定的钙或电压反应 (例如, 一个雪旺细胞的驱动鼠标交叉到一个有条件的 GCaMP 鼠标, 如所报告, 交叉到一个转基因独立的老鼠表达肌肉细胞特异的 GECI 或 GEVI 与非重叠荧光激发/发射谱¹⁰, 将允许同时跟踪动态 Ca^{2 +}和/或电压变化的雪旺和肌肉细胞)。这些工具可以帮助评估一个细胞类型对特定刺激的反应, 如嘌呤 ATP 或其击穿产物腺苷, 是直接或间接介导的, 直接影响到另一种细胞类型在 NMJ。

这些研究的主要目的是评估细胞亚型对神经刺激的时空 Ca^{2 +}反应模式, 但实现这一目标的技术可以被部署到其他目的。例如, 它们可用于分析在某些拮抗剂或某些突变体的存在下的 Ca^{2 +}反应, 如在特定动物模型的运动神经元疾病, 肌肉萎缩症, 或夏科牙齿疾病, 以分析ca^{2 +}响应特定的激动剂, 以评估受体表达, 评估 ca^{2 +}响应功能在细胞亚型中的异质性, 以刺激, 或比较 ca^{2 +}响应的细胞亚型与其他功能这种类型的反应 (electrophysiologically 记录的肌肉终板或动作电位, 光学成像肌肉缩短, 力传感器记录的肌肉张力等) 或其他参数 (例如,后特别神经/肌肉雪旺细胞形态学或分子表达的免疫组化评价)。这些研究表明, 细胞特异的 GECI 或 GEVI 小鼠如何能够被用来照亮由基因识别的, 细胞特定的输入所组成的突触的广泛的生理过程。

作者没有什么可透露的。

这项工作得到了来自国家卫生研究院 (NIH) GM103554 和 GM110767 (东华三院) 和来自国家研究资源5P20RR018751 和国立普通医学科学院 8P20 GM103513 (G.W.H.) 的资金的支持。