酿酒酵母4-硫尿嘧啶代谢标记及新合成 mRNA 作为 RNA 聚合酶 II. 活性的一种代理

这里描述的协议是基于全基因组的定量的新合成的 mRNA 纯化的酵母细胞标记为 4-硫尿嘧啶。这种方法允许测量 mrna 合成与 mrna 衰变分离, 从而提供了 RNA 聚合酶 II 转录的精确测量。

转录组研究稳态 rna 可能忽略 rna 聚合酶 II 转录的全球缺陷。事实上, mrna 合成的全球减少被证明是通过同时减少 mrna 退化来恢复正常的稳态水平而得到补偿的。因此, 全基因组定量的 mrna 合成, 独立于 mrna 衰变, 是 RNA 聚合酶 II 转录活性的最佳直接反映。在这里, 我们讨论了一种使用非扰动代谢标记的新的 rna 在酿酒酵母(酵母) 的方法。具体来说, 细胞培养6分钟与尿嘧啶模拟, 4-硫尿嘧啶, 和标记的新转录 rna 被纯化和量化, 以确定所有个体 mRNA 的合成率。此外, 使用标记粟粟细胞作为内部标准允许比较不同的酵母菌株的 mRNA 合成。利用该协议和动态动力学模型拟合数据, 可以确定相应的 mRNA 衰减率。

细胞通过基因表达程序的动态改变对内源和外源性线索作出反应。近年来, 全基因组方法的巨大发展允许在不同的条件下对转录的准确和全面的描述。在大多数转录组研究中, 微阵列杂交或高通量测序用于从总稳态 rna 分数中量化 rna 水平。在特定的摄动下转录改变可以显示出广泛的可能的结果, 与特定基因表达变化或大范围的基因要么上升或下调。基因表达是由 rna 聚合酶和影响 rna 水平的其他过程的 rna 合成之间的微调平衡或稳态的结果。RNA 聚合酶 II 转录, 包括其三不同的阶段 (起始, 伸长, 和终止), 是高度和错综复杂的与 mRNA 处理, 细胞质出口, 翻译和降解相关。

最近的一些研究表明, mRNAs 合成和衰变是耦合机制, 并表明在量化总稳态 RNA 时, 可以忽略对突变或刺激下的转录效应。首先, 通过对 mRNA 稳态水平的分析, 对转录变化的检测始终取决于 mRNAs 半衰期。一旦引入扰动, 长期半衰期的 mRNAs 的稳态水平将比短半衰期 mRNAs 的影响要小得多。因此, RNA 合成变化的可检测性强烈偏向于短寿命转录, 而较长存活的 mRNA 种类的分析可能无法揭示转录速率的动态变化。其次, 一些报告表明, 在酵母和哺乳动物中, 在分析 mRNA 的稳态水平时, 可能会忽略转录的全球变化。这可能是由于链路 mrna 合成和退化导致 mrna 缓冲的机制。这促使开发新的协议, 以量化 mrna 合成与降解分离, 通过对新转录 mrna 的分析。近年来, 提出了几种替代方案, 包括全球运行时序 (GRO)¹和本机伸长率转录序列 (NET seq)^2、3。在这里, 我们提出的协议最初开发的哺乳动物细胞^4,5,6 , 然后适应酵母^{7,8,9,10, 11}, 这是基于 RNA 标记与巯基核苷或基础模拟, 4-thiouridine (4sU) 或 4-硫尿嘧啶 (4tU), 分别。

这种方法专门净化新转录的 rna 从细胞的 rna 是脉冲标记与4sU 几乎没有干扰细胞稳态。因此, 一旦细胞暴露在 4sU, 分子迅速小白菜植株吸, 磷酸化到4苏三磷酸盐, 并纳入 rna 被转录。一旦脉冲标记, 它是可能提取总细胞 rna (对应于稳定状态的 rna), 并随后, 4 su 标记的 rna 分数是硫醇-特别修改, 导致生物素之间的二硫键的形成和新转录的 RNA^4,5。然而, 4sU 只能由表达核苷转运体的细胞小白菜植株吸, 如人类要核苷转运 (hENT1), 防止其立即在萌芽或裂变酵母中使用。虽然可以在粟或s. 酵母中表达 hENT1, 但使用改良的碱4tU 可以实现更简便的方法, 因为酵母细胞可以占用 4tU, 而不需要核苷转运体¹⁰的表达^,11,12,13. 事实上, 4tU 的新陈代谢需要酶尿嘧啶核糖 (UPRT) 的活性。在几个有机体, 包括酵母, 但不是哺乳动物, UPRT 是一个嘧啶打捞途径, 回收尿嘧啶尿苷单磷酸的关键。

转录组研究中的一个重要偏差可以通过平行分析的不同样本之间的规范化来引入。事实上, 许多偏离因素可能影响突变体和野生型菌株转录组的比较分析: 细胞裂解的效率、RNA 提取和恢复的差异, 以及用于微阵列分析的扫描器校准差异, 等等。如上所述, 当预期全球对 RNA 聚合酶 II 转录产生影响时, 这种变化会特别误导人。以远亲相关裂变酵母粟粟为内部标准, 设计了一种精确比较不同样品间 mRNA 合成速率的优雅的平均值。为此, 在细胞裂解和 RNA 提取之前, 将固定数量的标记的粟细胞添加到s. 酵母样本中, 即野生型或突变细胞.随后,粟和s 酵母的稳态和新合成的 rna 可以通过 rt-pcr 或通过微阵列芯片或高通量测序¹⁰进行量化。将这些数据与动力学建模相结合, 可以测量发芽酵母中 mRNA 合成和衰变的绝对速率。

在本手稿的框架中, 我们将展示新转录 rna 的分析如何能够揭示辅激活因子配合物佐贺和 TFIID 在萌芽酵母^14,15, rna 聚合酶 II 转录中的全球作用^{, 16}。重要的是, 过去的研究量化了S 酵母的稳态 mRNA 水平, 并建议佐贺在有限的酵母基因上发挥主导作用, 这一组受佐贺突变的强烈影响, 但相对抗 TFIID突变^17,18,19。令人惊讶的是, 佐贺酶活性被证明对整个转录基因组起作用, 这表明在 RNA 聚合酶 II 转录中这一共同激活剂的作用更广泛。减少 RNA 聚合酶 II 在大多数表达基因的招募在佐贺或 TFIID 的灭活时观察到, 表明这些辅活化因子在大多数基因一起工作。因此, 新转录 mRNA 的定量显示, 佐贺和 TFIID 是需要的转录几乎所有基因的 RNA 聚合酶 II^14,15,16。补偿机制的实施成为一种方法, 使细胞能够应对全球 mrna 合成减少, 这是由于 mrna 退化同时全球减少而缓冲的。佐贺添加了全球影响 rna 聚合酶 ii 转录的因素列表, 如 rna Pol ii 亚基¹⁰、调解人辅激活因子复合²⁰、一般转录因子 TFIIH^21、22和间接地, mRNA 降解机械的元素^9,10,23。这种补偿性事件在佐贺突变体中普遍可见, 尽管 mrna 合成¹⁴的全球和严重减少, 但稳定状态 mRNA 水平的变化不大且有限。类似的分析也进行了BRE1删除应变, 导致完全丧失组蛋白 H2B 泛素化。有趣的是, 在缺乏 Bre1 的情况下, 可以检测到 rna 聚合酶 II 转录的温和但一致的全球影响, 这表明在酵母中新转录的 rna 的代谢标记可以检测和量化 mRNA 的广泛变化范围。合成率。

1. 佐贺亚基细胞培养和雷帕霉素耗竭

1. 对于每个S. 酵母菌株和复制, 包括野生型或控制菌株, 接种一个单一的殖民地从新鲜的盘子到5毫升的 YPD 培养基 (2% 蛋白胨, 1% 酵母提取物, 和2% 葡萄糖)。
2. 以恒定搅拌 (150 rpm) 在30摄氏度的夜间生长酵母细胞。
3. 测量 600 nm (od₆₀₀) 的光学密度, 并将培养液稀释到外径₆₀₀约0.1 在100毫升的 YPD 培养基中, 让其生长直到 OD₆₀₀约0.8。
4. 同时, 将粟细胞从新鲜的盘子中接种到50毫升的是培养基 (0.5% 酵母提取物; 250 毫克/升腺嘌呤, 组氨酸, 尿嘧啶, 亮氨酸和赖氨酸; 3% 葡萄糖), 在32摄氏度下过夜, 持续搅拌 (150rpm)。
5. 测量的 od₆₀₀的粟过夜文化和稀释的文化到 od₆₀₀约0.1 在500毫升的是中等, 让它长大, 直到 OD₆₀₀约0.8。
6. 对于每个S. 酵母锚离菌株和复制, 包括野生型或控制菌株, 接种一个单一的殖民地从新鲜的盘子到5毫升的 YPD 培养基 (2% 蛋白胨, 1% 酵母提取物, 和2% 葡萄糖)。
7. 以恒定搅拌 (150 rpm) 在30摄氏度的夜间生长细胞。
8. 第二天早上, 测量 od₆₀₀, 稀释培养到 od₆₀₀约0.1 在100毫升的 YPD 培养基, 让它生长, 直到 OD₆₀₀约0.8。
9. 从1毫克/毫升 (最终雷帕霉素浓度为1µg/毫升) 的股票溶液中添加100µL 雷帕霉素, 让细胞在30摄氏度孵育, 持续搅拌, 以使感兴趣的蛋白质有条件地从原子核中耗尽 (通常, 30 分钟是足够的)。对于控制, 使用类似的酵母培养, 但不是添加雷帕霉素, 添加等效体积的二甲基亚砜 (DMSO)。

2. 4tU粟标记 (计数)

1. 准备2米4硫尿嘧啶的新鲜溶液。一旦准备好, 保持它在室温和远离光。
   1. 准确称重64.1 毫克 4-硫尿嘧啶为每个S. 酵母培养和溶解在250µL 的二甲基甲酰胺 (DMF) 或在250µL 的 DMSO。
   2. 对于粟文化被用作穗入, 重320.5 毫克 4-硫尿嘧啶和溶解它在1250µL 的 DMSO。
2. 将 4-硫尿嘧啶溶液添加到酿酒酵母和粟培养液中, 最终浓度为 5 mM, 并在30摄氏度和32摄氏度的恒定搅拌下孵育6分钟。
3. 6分钟后, 删除每个区域性的小等分以进行细胞计数。使用自动单元格计数器或 Neubauer 室计数单元格。
4. 通过离心 (2500 x g) 收集细胞, 5 分钟, 4 摄氏度。
5. 丢弃上清液, 用冰冷 1x PBS 洗涤细胞, 再离心 (2500 x g, 4 摄氏度, 5 分钟)。
6. 计算每个粟和 s .酵母样品中的细胞总数。
7. 在5毫升冰冷的 1x PBS 中重悬细胞, 并将 粟细胞与3:1 的比例混合在一起。
8. 离心细胞 (2500 x g, 4 摄氏度, 5 分钟), 取出 PBS, 在液体 N₂中闪冻细胞, 并将样品储存在-80 摄氏度, 直至进一步使用。

3. RNA 提取和 DNase 处理

1. 在冰上解冻细胞约20–30分钟。
2. 使用酵母 rna 萃取试剂盒 (材料表) 进行 RNA 提取, 并进行一些适应。
3. 根据每个样品, 将750µL 的冰氧化锆珠倒入带套件的 1.5 mL 螺帽管中。请记住, 每管, RNA 从多达 10⁹细胞可以有效地提取。因此, 准备每个样品所需的管数。例如, 100 毫升的酿酒酵母培养 (OD₆₀₀0.8) 可以渲染大约 2 x 10 9 到 3 x 10⁹细胞, 总共总共 2.7 x 10⁹到 4 x 10⁹的细胞 (在尖峰后与第三个s. 粟单元格)。在这种情况下, 每个样品/条件/突变体/复制需要多达 3-4 个反应管。
4. 每个 1 x 10⁹细胞, 添加480µL 的裂解缓冲液提供与试剂盒, 48 µL 的 10% SDS, 和480µL phenol:chloroform:isoamyl 酒精 (25:24:1, a/v/v)。
5. 使用涡流混合器混合电池, 并将其转移到含有冷氧化锆珠的管子中。
6. 调节涡旋混频器适配器上的管, 以最大速度转动涡旋, 并跳动10分钟以裂解酵母细胞 (在室温下为4摄氏度)。或者, 在自动串珠搅拌器中进行细胞裂解。
7. 离心管在室温下 1.6万x g 5 分钟, 并仔细收集上阶段 (含 RNA 的阶段) 到新鲜的15毫升猎鹰管。通常情况下, 每管恢复的体积是围绕500–600µL。
8. 对于含有部分纯化 RNA 的15毫升管, 添加与试剂盒一起提供的结合缓冲液并彻底混合。每100µL RNA 溶液, 添加350µL 的结合缓冲液 (即, 当水相溶液体积为600µL 时, 应添加2.1 毫升的结合缓冲液)。
9. 对以前的混合物, 添加100% 乙醇和彻底混合。每100µL RNA 溶液, 添加235µL 100% 乙醇 (即, 当水相溶液体积为600µL, 加入1.41 毫升乙醇)。
10. 将步骤3.9 中的混合物的700µL 应用于收集管中组装的过滤器盒, 两者均随试剂盒一起提供。
11. 离心1分钟, 1.6万 x g。如果离心时间不足以使总体积通过过滤器, 请重复离心三十年代。
12. 丢弃流过并重复使用同一收集管。再添加700µL RNA 结合缓冲液乙醇溶液到过滤器, 再离心 1.6万 x g 1 分钟。
13. 丢弃流过, 重复步骤3.11 和 3.12, 直到 RNA 溶液完成。
14. 用700µL 洗涤液1清洗过滤器2x。通过离心 1.6万 x g收集洗涤液1分钟, 并始终保持收集管。
15. 用500µL 洗涤液2清洗过滤器2x。通过离心 1.6万 x g收集洗涤液1分钟, 并始终保持收集管。
16. 再次离心管在 1.6万 x g 1 分钟, 完全干燥过滤器。
17. 将滤芯转移至最终收集管 (RNA 适当管) 和洗脱 RNA, 50 µL DEPC 处理的无核糖核酸酶 H₂O (预热至100摄氏度)。
18. 离心1分钟, 1.6万 x g。
19. 洗脱 RNA 再次 (对同一管) 与50µL 预热的 DEPC 处理, 无核糖核酸酶 H₂o. 确保所有卷已通过过滤器;否则, 离心机的时间更长。
20. 如果使用单个样本的多个管, 请将它们全部放在一个管中。
21. 使用适当的设备量化并检查样品的纯度。
    注意: 虽然4tU 只纳入新合成的 RNA, 有可能与 DNA 的轻微污染。因此, 最好用 DNase i 来处理样品。为此, 请根据制造商的建议使用 RNA 萃取试剂盒 (材料表) 提供的试剂。

4. 新合成 RNA 的硫醇特异生物素化

1. 调整获得的 RNA 浓度3的协议, 2 毫克/毫升。等分200µg 总 RNA, 加热10分钟, 在60摄氏度, 并立即在冰上冷却2分钟。
2. 对于 RNA 等分, 按照以下顺序添加下列试剂: 600 µL DEPC 处理, 无核糖核酸酶 H₂O, 100 µL 生物素化缓冲液 (100 毫米三盐酸 [pH 7.5] 和10毫米 EDTA, 在 DEPC 处理, 无核糖核酸酶 H₂O), 200 µL生物素-HPDP 从1毫克/毫升生物素-HPDP 在 DMSO 或 DMF 的股票。
   1. 在某些情况下, 生物素 HPDP 溶液趋于沉淀, 可能是由于其在水中溶解度低。在这种情况下, 增加高达40% 的反应体积的 DMSO/DMF 的体积 (对 RNA 样本, 增加400µL DEPC 处理的 H₂O, 100 µL 生物素化缓冲液, 和400µL 的生物素-HPDP 从0.5 毫克/毫升的股票)。
3. 在室温下孵育样品, 3 小时保护光线, 柔和搅拌。
4. 孵育后, 将大约等量的氯仿添加到试管中, 用力搅拌。
5. 在 1.3万 x g旋转样品5分钟, 在4摄氏度。此步骤允许去除没有 biotinylate RNA 的过量生物素。或者, 使用锁相管 (重) 执行此步骤。为此, 在 1.3万 x g下旋下锁相管1分钟, 加入 RNA 混合物和等量氯仿, 用力混合, 并在 1.3万 x g处离心5分钟, 在4摄氏度。
6. 小心地将上一阶段转移到新的2毫升管中。
7. 添加1/10 的体积5米氯化钠和混合样品。
8. 添加相等的异丙醇体积, 彻底混合样品, 并在 1.3万 x g旋转它至少30分钟, 在4摄氏度。
9. 小心去除上清液, 加入1毫升冰冷75% 乙醇。
10. 旋转在 1.3万 x g 10 分钟, 在4摄氏度。
11. 小心地除去上清液, 快速旋转管子, 除去剩余的乙醇溶液。确保 RNA 颗粒不干燥。
12. 将 RNA 悬浮在100µL 的 DEPC 处理, 无核糖核酸酶 H₂O。

5. 使用链霉素涂层磁珠纯化全无标记 RNA 中新合成的分数

1. 在65摄氏度下加热生物素化 RNA 10 分钟, 然后在冰上冷却样品5分钟。
2. 添加100µL 链霉素涂层磁性珠子到生物素化 RNA (最终体积为200µL)。具体地说, 建议使用材料表中所示的珠子, 因为在与其他实验室进行对话后, 这些磁珠似乎更加一致和可靠。
3. 在室温下以轻微摇晃的90分钟孵育样品。
4. 将所提供的列与工具包 (材料表) 放在磁性支架中。
5. 添加900µL 的室温洗涤缓冲液 (100 毫米三盐酸 [pH 7.5], 10 毫米 EDTA, 1 M 氯化钠, 0.1% 补间 20, 在 DEPC 处理, 无核糖核酸酶 H₂O) 到列 (预运行和平衡)。
6. 将珠子/RNA 混合物 (200 µL) 涂在柱子上。
7. 收集1.5 毫升管中的流量, 并再次应用于同一磁性柱。如有必要, 请保持此流通过, 因为它表示未标记的 RNA 分数。
8. 使用不断增加的洗涤缓冲液 (600、700、800、900和1000µL) 洗涤柱5x。
9. 洗脱新合成的 RNA, 200 µL 0.1 M DTT。
10. 进行第二次洗脱, 3 分钟后, 与同等体积 0.1 M DTT。
11. 在洗脱 RNA 后, 添加0.1 卷3米显 (pH 5.2), 3 卷冰冷100% 乙醇, 2 毫克/毫升糖原 (rna 级) µL, 让 rna 沉淀过夜, 在20摄氏度。
12. 通过离心恢复 RNA (1.3万 x g 10 分钟, 在4摄氏度) 和重悬在15µL DEPC 处理, 无核糖核酸酶 H₂0。标记到总 rna 的比例预计约为 2%-4% (通常更接近低端), 呈现约2.0 µg 新合成的 rna。这个数量足以做几个 qPCR 实验, 以及微阵列/测序分析。

6. 不同馏分的 rt-pcr 验证

1. 根据制造商的说明 (材料表), 使用随机六聚体和逆转录酶的选择, 合成2µg 总 rna 或10µL 标记 rna 的 cDNA。
2. 使用标准协议 (材料表), 通过实时的 qPCR 放大 cDNA。
   注: 所有样品均应以三份, 最少两次生物复制运行。更正粟微管蛋白表达式的所有原始值。

7. 微阵列杂交

1. 根据制造商的说明, 将 RNA 样本杂交到首选芯片芯片上 (对于此特定协议, 请参阅材料表)。简要地说, 根据制造商的说明, 使用卓越的 rna 放大试剂盒 (材料表) 准备 150 ng rna 的生物素化 cRNA 靶点。杂交4毫克的碎片 cRNAs 16 h 在45摄氏度和 60 rpm 芯片芯片。
2. 使用指定的工作站和扫描仪 (材料表) 清洗、染色和扫描芯片。使用命令控制台 (AGCC, 版本 4.1.2) 从扫描的图像中提取原始数据 (CEL 强度文件)。
3. 进一步处理与表达式控制台软件版本1.4.1 的 CEL 文件, 以计算探针集信号强度, 使用基于统计的算法 MAS 5.0 与默认设置和全局缩放为规范化方法。
   注意: 每个芯片的修剪平均目标强度被任意设置为100。使用至少两个独立的生物复制进行所有实验。将原始数据规范化为粟信号, 并计算总计和新合成的 RNA 水平的折叠变化。

8. 使用现有 R 管道进行数据分析

1. 使用管道和 Bioconductor 包 (如前面描述的⁸¹⁰) 计算合成和衰减率。

当对新转录的 RNA 进行代谢标记时, 需要控制几个方面: 标记的时间和效率、峰值比例、提取协议和生物素化效果 (包括信噪比),等。其他^7,10,11, 这些条件已经广泛和有条不紊地显示。在这里, 我们主要关注通过 rt-pcr、微阵列或测序处理样品后可以进行的解释和即时分析。对不同突变菌株的分析表明, 该方法不仅能检测到 mRNA 合成的戏剧性全球减少, 而且在佐贺突变体的酵母菌株的情况下, 还可以非常温和地减少 RNA 聚合酶 II 活性对组蛋白 H2B monoubiquitination 的抑制。

我们对佐贺酶活性的分析表明, 对染色质¹⁵进行了广泛的招募, 而在佐贺突变株的稳态 mRNA 水平的分析中并没有揭示这种情况。随着 RNA 聚合酶 II 的招募在佐贺失活时受损, 我们决定分析 mRNA 合成率是否会受到全球影响。因此, 野生型或突变株的酵母菌株被暴露在4tU 的6分钟期内, 以标记新转录的 rna。在与穗状细胞 (粟) 的比例为3:1 混合后, 提取总 rna, 并根据此处提供的协议对新合成的 rna 进行生物素化和纯化, 如图 1所示的时间表。标记的 rna 从总共200µg 的 rna 纯化, 确保纯化后的产品量足以满足任何下游应用。作为在任何基因组范围分析之前的初始和系统步骤, 新合成的 RNA 纯化经 rt-pcr 验证。根据不同的参数选择基因, 包括表达水平、调控途径和对不同 RNA 聚合酶的依赖性。

为了确认本协议专门净化标记的 RNA, 我们量化了由4tU 培养的野生型细胞纯化的分数的转录水平。从未暴露于4tU 的细胞中检测到分析 rna 的背景水平微不足道 (图 2A)。新转录的 RNA 纯化通过含有内含子ACT1前 mRNA 的观察富集进一步验证 (未显示数据)。在验证样品的质量后, 我们测试了在删除SPT20时 mRNA 合成是否会受到影响, 这是已知扰乱佐贺复杂组件。正如其他人所报告的, 从spt20Δ菌株中对总 (稳态) RNA 进行的 mRNA 定量显示, 检测到的基因大多不变或轻度降低 (图 2B)。为BRE1删除的菌株也获得了类似的结果 (图 2B)。相比之下, 从spt20Δ菌株中的新转录 RNA 的分析显示, mRNA 合成的戏剧性减少三-对所有测试的基因 (图 2C)。Bre1 的丧失导致了新合成的基因 mRNA 水平的更谨慎但仍然可见的减少 (图 2C)。与佐贺和 Bre1 在 rna 聚合酶 II 转录中的作用吻合良好, Spt20 或 Bre1 的损失不影响RDN25或snR6基因的表达, 分别由 rna 聚合酶 I 和 rna 聚合酶 III 转录 (图 2C)。

然而, 突变体的结构亚基 (如SPT7或SPT20) 的菌株被删除, 显示严重的慢增长表型, 这可能说明观察到的转录改变。为了排除不需要的次生效应, 我们有条件地从原子核中耗尽 Spt7, 使用锚离S. 酵母菌株^14,24。在60分钟的雷帕霉素治疗之前, 在4tU 脉冲标记之前 (参见图 1的示意图表示), 新转录的 mRNA 水平被减少到类似的程度, 在删除应变中观察到 (图 2D和2E).因此, 这一分析证实了我们以前的结果, 并验证了这种诱导耗竭系统的协议。在时间过程分析中, 细胞被暴露在雷帕霉素的时间跨度从0到240分钟, 减少表达被证明在15分钟的接触药物后立即。更有趣的是, 稳态 mRNA 水平倾向于最初减少, 但在60分钟后恢复到正常水平, 这表明同时发生补偿机制 (图 2E)。

总之, 新合成的 RNA 的标签和定量允许揭示佐贺复杂的新的监管作用。所述的协议也可以揭示对 RNA 聚合酶 II 活性的适度影响, 并成功地应用于条件耗竭酵母菌株。

纯化后的新合成 RNA 的下游应用之一是使用微阵列杂交或测序 (4 tu) 的全基因组定量的转录。虽然高通量测序的数量、灵敏度和信息量更高, 但微阵列杂交对确定全球 mRNA 水平是否改变非常有帮助。在这种情况下, 规范化是关键, 我们在样本中添加了一个尖峰有机体, 我们旨在分析。具体来说, 我们混合了 s. 酵母细胞到s. 粟细胞的比率为 3:1, 都是以前暴露在4tU。当纯化的标记 rna 受到高通量测序时, 可以使用任何标准的库制备协议, 大多数情况下通常遵循核糖体 RNA 耗尽。通过从不同样本中添加标记的 RNA (例如,混合酵母和粟细胞, 如上文所示)²²或体外, 对来自不同样品的4个 tu seq 数据进行规范化。转录, 巯基穗-在 RNA^12,25,26,27。市面上可用的微阵列芯片包含对萌芽和裂变酵母的整个转录组的探针, 允许在一个单一实验中对两个生物体的 mRNA 进行定量。微阵列杂交是通过 rt-pcr (野生型、 spt20δ和bre1δ) 验证的全部和新合成 RNA 进行的。此外, 我们还包括不支持 monoubiquitination 组蛋白 H2B, 通过 ubiquitinable 残留点突变 (K123R) 的菌株。由于在不同的样本和复制中使用的粟细胞的比例完全相同, 因此可以线性地重新调整阵列的强度, 使总和标记的粟探针具有相同的中值强度。这种规范化, 或重新缩放, 可以使用由帕特里克克莱默实验室开发的Bioconductor包执行, 并在所有分析样品, 总和标记的分数和野生类型和变种菌株⁸并行使用。简而言之, 此管道的输入是一个 Excel 文件, 其中包含所有样本和分数的探针及其强度 (MAS5 或 RMA)。在排除探测范围之外的探测器后, 信号强度重新调整, 同时考虑到S. 粟探针的强度值。最后, 您可以将探针映射到萌芽和裂变酵母基因组, 并以包含对尖峰进行规范化的表达式值的矩阵结尾。这些值可以进一步处理 (见下一节) 或按 is 使用。在下面的例子中, 我们确定了突变体和野生型菌株之间每个转录的褶皱变化。

对稳态或新合成的 RNA 水平进行分析, 并根据其统计意义 (p值) 进行绘制 (图 3)。与其他研究一致, 当分析总 RNA 水平时, 只有少数基因的表达改变, 无论是上升或下调 (图 3A-3C)。然而, 对新转录 RNA 的分析导致了截然不同的结论。新转录的 mRNA 水平超过4000个基因被显著减少至少两个在删除SPT20, 表明佐贺对 RNA 聚合酶 II 转录在萌芽酵母中的全球积极作用 (图 3D).此外, 在bre1Δ和K123R突变体中, 结果更加谨慎: 大多数基因似乎有其表达减少, 但下调的程度和显著影响的基因数量 (300-500) 确实更有限 (图 3E和3F)。

如前所述, mRNA 的稳态或总水平由合成和衰变之间的紧密平衡决定 (图 4A)。当 RNA 聚合酶 II 转录在全球范围内受损时, 可以想象出两种情况: (i) 在全球范围内总 mRNA 水平下降, 作为对减少合成但恒定衰变的反应, 或 (II) mRNA 退化减少到相同程度, 导致在大多数不变的稳定状态 mRNA 水平。第二种情况已经报告了几个条件, 包括在佐贺或 TFIID 中断^{9、10、14、16、22}的情况下。一个称为比较动态转录组分析 (税收协定) 的过程, 基于4tU 标记和动态动力学建模, 使我们能够确定 mRNA 合成并推断每个转录^8,10的衰变率。再次, 我们利用收集的数据为前面提到的菌株 (野生型, spt20δ, bre1δ, 和K123R)。正如预期的那样, 在删除SPT20时, 我们观察到与野生型菌株相比, mRNA 合成和降解率同时下降。在这种突变菌株中, 补偿几乎是最佳的, 平均减少3.8 倍的合成, 平均减少4.1 倍的衰变 (图 4B), 佐证为什么只有有限的转录改变可以检测到总 mRNA 水平 (图 3A)。在其他两种突变菌株 (bre1Δ和K123R) 中, 也观察到了 mRNA 合成和衰变的伴随变化, 但变化范围更小, 分布更分散 (图 4C和4D)。

图 1: 使用4tU 进行 RNA 代谢标记的图解表示.新鲜准备好的4tU 被添加到培养基中, 细胞被标记为6分钟.酵母和粟细胞混合在3:1 的比率和总 RNA 提取。随后, 新合成的 RNA 是生物素化的, 可以使用链霉素涂层磁珠纯化。最后, 总 (稳态) rna 和标记新合成的 rna 可用于各种下游应用, 包括 rt-pcr 和微阵列杂交或测序。请点击这里查看这个数字的更大版本.

图 2: 分析描述了由 rt-pcr 确定的稳态和新转录 RNA 的转录变化.(A) 从被暴露或不到4tU 的野生型细胞纯化的标记 rna 分数中量化了五种不同基因的 rna 水平。接下来的两个面板显示 (B) 总计和 (C) 新合成的 RNA 定量的野生型 (WT), spt20δ和bre1δ酵母细胞的 rt-pcr。Spt7 的锚离菌株, 未经治疗或治疗与雷帕霉素60分钟, 被标记 4tU, 和 (D) 总或 (E) 新转录的 RNA 通过 rt-pcr 定量。(F) 该小组显示了 Spt7 核耗竭后稳态和新合成 mRNA 变化的时间过程分析。对于所有样本, 五 RNA 聚合酶 II 基因的 mRNA 水平通过 rt-pcr 进行量化。rna 聚合酶 I 和 rna 聚合酶 III 基因 (分别为RDN25和snR6) 被用作对照。表达式值 (三个独立实验的平均± SD) 被规范化为粟信号, 并在控制样本中设置为1。面板D F已被修改从巴普蒂斯塔等。¹⁴.请点击这里查看这个数字的更大版本.

图 3: 全基因组分析的 mRNA 水平使用总或标记的 RNA 分数.这些面板显示火山图显示 (C) 稳态 mRNA 水平的褶皱变化或 (d-F) 新合成的 mrna 水平相对于它们的意义 (p值)。在 (A和D) spt20δ、(B和E) bre1δ (log2) 中, 将每种基因的表达值与粟信号的比值计算成折变 (FC), 或 (C和F) K123R 菌株与野生型酵母中同一基因的表达值有关。对5385个基因进行了分析, 并对两种变化的阈值 (蓝点: 不止两个减少; 黄点: 两个以上的增加) 和 0.05 p值进行了考虑。面板A和D已被修改从巴普蒂斯塔等。¹⁴.请点击这里查看这个数字的更大版本.

图 4: mrna 合成和 mrna 衰变的平行变化导致 mrna 缓冲.(A) 此面板显示了 rna 合成摄动对稳态 rna 水平的结果的示意图。(b-D)这些面板显示了从总的和新合成的 RNA 的分析的 mRNA 合成和衰变率的计算。在 (B) spt20δ、(C) bre1δ和 (D) K123R 中, 确定了每个S 酵母转录的合成和衰变速率。根据衰变速率的变化, 绘制了合成速率的变化 (计算为突变体与野生型的比值的 log2)。请点击这里查看这个数字的更大版本.

虽然基因组范围的工具来分析转录的变化仍在改善, 但通过定量的 rna 的稳态水平的定量分析对转录的分析可能无法准确地反映 rna 聚合酶 II 活性的变化。事实上, mRNA 水平不仅受 RNA 合成的调控, 而且还受其成熟和降解的制约。为了测量 mrna 合成与 mrna 降解的不耦合性, 近年来开发出了不同的实验方法, 用于分析酵母和哺乳动物中的新生转录。

对新生转录进行定量的最广泛使用的协议之一是 GRO¹。虽然 GRO 的主要优势在于它能够在高分辨率和低背景下公开转录参与和活性聚合酶, 但它有两个不同的点来降低其吸引力: (i) 它在技术上具有挑战性, 需要核的分离和 (ii) 原子核的操纵给系统²⁸带来了一些扰动。另一种替代方法是 NET seq, 它依赖于在新生 rna、模板 DNA 和 RNA 聚合酶 ii. 中形成的极其稳定的三元复合物的免疫沉淀时获得的 3 ' 末端的测序。这种方法允许在基对分辨率下对新生 rna 进行表征, 并通过改性 RNA 聚合酶 II (serine-5 磷酸化) 的免疫沉淀来探索 mRNA 处理事件, 例如^2、3,29. 然而, 它提出了一些障碍, 我们强调三。首先, 抗体靶向 RNA 聚合酶 II 通常是高度特异的, 它取决于抗体效率。其次, rna 在潜伏期可能容易降解, 从而导致我们回到前一点 (效率较低的抗体可能需要更长的孵育时间, 使 rna 更容易降解)²⁹。第三, 特别是在哺乳动物中, MNase 消化和大小选择可能排除唯一序列对齐^29,30。

在这里, 我们提出了一个详细的协议, 为新合成的 RNA 的代谢标签使用4tU 在S. 酵母, 与其他可用的方法相比, 具有不同的优势。因为转录是高度敏感的扰动, 细胞应保持在最生理条件。例如, GRO 序列意味着通过将细胞/细胞核暴露在 sarkosyl 中, 转录参与 RNA 聚合酶 II。然而, sarkosyl 治疗被描述为抑制几个细胞过程¹¹。在这种情况下, 代谢标记4tU 或4sU 在描述的浓度是非扰动的, 并没有明显影响细胞稳态, 特别是在短时间的暴露。与使用转录抑制来测量 mRNA 半衰期的其他方法相反, 税收协定或 4 tu 序列和拟合与动态建模确定在不动细胞中每一个 mRNA 的降解率。因此, 一个单一的方法可以同时解决在一个特定的细胞类型的整个转录组的合成和衰变率。由于税收协定或 4 tu 采用了高度可靠的规范化方法, 即通过使用尖峰, 可以对不同的数据集进行分析和直接比较。最后, 代谢标记和新合成的 RNA 的定量是一种技术, 可以很容易地在任何分子生物学实验室实施, 因为它不需要任何特定的设备。这可能解释了这种技术的相当大的传播, 它往往被越来越多地用于探索在酵母的 RNA 生产和降解, 以及在更高的真核生物。

RNA 可以用其他核苷类似物标记在活细胞中, 即 5-溴尿苷 (ethynyluridine)^31、32或 5-(EU)^33、34。BrdU 抗体纯化的分离依赖于实验之间可能具有不同效率的抗-反--免疫。欧盟标记的 RNA 可与生物素共价结合使用单击化学导致非可逆共轭与硫醇改性相反, 可以用还原剂逆转。在哺乳动物细胞中使用了和欧盟标记来确定全基因组 rna 衰变率^31、32或评估新生 rna 合成^34,35。然而, 在S. 酿酒酵母中没有描述过。事实上, 核苷类似物的摄取需要核苷转运体的表达, 因此, 这些方法在萌芽酵母中显得不那么灵活, 而不是用4tU 标记。

4tU 标签的持续时间可以根据问题进行调整和变化。在评估酵母中的 mRNA 合成时, 6 分钟的短标记脉冲可确保新转录的 mrna 水平受到 RNA 降解的最小影响。考虑到在新加入的 rna 中, 在被改性核苷酸之前的滞后时间不到1分钟, 这6分钟的标签持续时间保证可以纯化出合理数量的新近合成的 rna。这样的协议, 由米勒等定义。¹¹, 已被用于不同的酵母突变体, 以揭示 mRNA 合成和 RNA 衰变的全球变化^{9,10,22,26,27,36}. 在4tU 的代谢脉冲追逐标签中使用了较长的标签持续时间 (3 小时), 以确定 mRNAs 中所有酵母的衰变率¹².最后, 非常短 (从1.5 分钟) 4tU 标签已被用于检查 RNA 处理动力学在萌芽和裂变酵母^13,25,37。

然而, 该方法具有一定的局限性, 如在整个协议结束时恢复的标记 RNA 的产量相对较低。在酵母中, 起始材料没有限制, 这可能是分析后生细胞时的一个问题, 特别是在体内使用此协议时。该协议的限制步骤之一是标记的 rna 池的生物素化, 其效率远未完成, 估计在标记 rna⁵中修改 1/3 4sU 残留物。它最近表明, 使用杀虫 (MTS)-生物素, 而不是生物素-HPDP, 增加了恢复 RNA³⁸的产量。然而, 根据本研究组未公布的结果和卢特考斯基和 Dölken 的结果, MTS 生物素不是完全特定于硫醇的, 导致纯化未标记的 rna, 这是特别有问题的, 当低量的标记 rna纯化³⁹。使用 4 tu/4 苏的新陈代谢标签的另一个限制是 RNA 聚合酶拉长的内在速度。RNA 聚合酶 II 的平均速度估计为大约 3.5 kb/分钟^40,41,42。因此, 在6分钟的标签, 聚合酶将有转录 15–20 kb 的能力。因此, 在用 4 tu/4 苏的短脉冲标记的实验中, 只有 3 ' 末端的新转录的 RNA 被标记, 而 5 ' 末端区域是预先存在之前添加 4 tu/4 苏。因此, 标记 rna 的纯化也丰富了预先存在的 5 ' 末端的转录, 特别是对于长转录在哺乳动物细胞。为了克服这种偏差, 在一个称为 TT seq 的精制协议中, 提取的标记 RNA 在纯化新合成的物种⁴³之前被超声碎片化。

总共, 4 tu 是一个很好的方式来处理在给定的上下文转录变化。然而, 虽然协议相当简单, 但它包含几个不同的步骤, 最终相对广泛。首先, 由于本协议从始至终处理 RNA, 因此必须满足清洁和无降解样品所需的所有要求。因此, 所有的试剂都应该是无 rna 的, 所有的材料都应该专门用来操作 RNA, 用核糖核酸酶净化解决方案彻底和定期清洁所有的物质。其次, 虽然生物素反应是高度特异性的, 但没有反应的生物素-HPDP 的过量应从样品中除去 (例如, 避免链霉素与 RNA 的非共价键结合而产生的饱和度)。第三, 如协议中所述, 强烈建议使用所示的链霉素涂层磁性珠子, 因为我们已经讨论过的几个研究小组都表示这些珠子导致较低的背景水平。第四, 应采用适当的质量和实验控制。包括从未暴露于 4 tu/4 su 的单元格派生的样本。这些样品将具有很大的价值, 以满足背景水平, 并确保在实验过程中, 没有标记 RNA 的污染不会发生。另外, 测试样品是否富含新合成 RNA 的另一个很好的替代方法是使用引物对内含基因进行 rt-pcr。引物应与两个连续外显子和内含子的 3 ' 端和 5 ' 末端互补,反之亦然。最后, 在微阵列杂交测序之前, 通过 rt-pcr 验证样品。为此, 应选择和分析不同层次的表达和调控基因。最佳的, 这应该为两个不同的 rna 片段 (稳态和新合成的 rna) 执行。

作者没有什么可透露的。

我们感谢他的支持和诉费舍尔, k. 舒马赫和 f. El Saafin 的讨论。肺结核由 ITN (PITN-GA-2013-606806, NR) 和基金会 ARC 支持。这项工作得到了法新社谜 (ANR-15-CE11-0022 SAGA2) 的资金支持。这项研究也得到了 ANR-10-LABX-0030-INRT 的支持, 法国国家基金是由法新社谜在审批 d ' 艾文莉 ANR-10-IDEX-0002-02 框架计划下管理的。