JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

البروتوكول هو موضح هنا يستند إلى التحديد الكمي للمركب حديثا مرناً تنقيته من خلايا الخميرة المسمى مع 4-ثيوراسيل على نطاق الجينوم. هذا الأسلوب يسمح بقياس توليف مرناً فصل من تسوس مرناً، ويوفر بالتالي، قياس دقيق للحمض النووي الريبي بوليميراز الثاني النسخ.

Abstract

قد التغاضي عن العيوب العالمي في الحمض النووي الريبي بوليميراز الثاني النسخ بالدراسات ترانسكريبتوميك تحليل الحمض النووي الريبي في حالة مستقرة. في الواقع، قد تبين الانخفاض العالمي في توليف مرناً تعويض انخفاض متزامنة في تدهور مرناً لاستعادة مستويات مستقرة العادي. ومن ثم فهو التحديد الكمي على نطاق الجينوم لتوليف مرناً، بمعزل عن اضمحلال مرناً، انعكاس مباشر أفضل من الحمض النووي الريبي بوليميراز الثاني النسخي نشاط. وهنا نناقش أسلوب استخدام غير مقاومة وسم الأيضية للكشف الوليدة في Saccharomyces cerevisiae (س. سيريفيسيا). على وجه التحديد، تستزرع الخلايا لمدة 6 دقائق مع اليوراسيل تناظرية، 4 ثيوراسيل، وتنقية الكشف حديثا يدون المسمى وكمياً لتحديد معدلات توليف جميع مرناً الفردية. وعلاوة على ذلك، باستخدام المسمى بومبي شيزوساكتشاروميسيس الخلايا كما قياسي الداخلية تسمح بمقارنة توليف مرناً في مختلف S. cerevisiae سلالات. باستخدام هذا البروتوكول وتركيب البيانات مع نموذج دينامي حركية، يمكن تحديد معدلات تسوس مرناً المناظرة.

Introduction

الخلايا تستجيب لمنبهات داخلية وخارجية، من خلال تغيير دينامية لبرنامجهم التعبير الجيني. في السنوات الأخيرة، تطورا هائلا للمنهجيات على نطاق الجينوم يسمح الوصف الدقيق والشامل للتغييرات الترنسكربيتوم في ظروف مختلفة. في معظم الدراسات ترانسكريبتوميك، تستخدم تسلسل ميكرواري التهجين أو الفائق لقياس مستويات الحمض النووي الريبي من كسر الجيش الملكي النيبالي مجموع حالة مستقرة. يمكن عرض التغييرات النسخي تحت اضطراب محددة طائفة واسعة من النتائج المحتملة، مع تغييرات التعبير جين معين أو طائفة كبيرة من الجينات حتى-أو دوونريجولاتيد. التعبير الجيني هو نتيجة لتوازن صقل — أو الحالة المستقرة – بين العمليات الأخرى التي تؤثر على مستويات الحمض النووي الريبي وتوليف الحمض النووي الريبي بالحمض النووي الريبي [بولمرس]. رنا بوليميراز الثاني النسخ، بما في ذلك على ثلاث مراحل متميزة (استهلال واستطالة والإنهاء)، يرتبط ومعقد للغاية مع تجهيز مرناً وتصدير هيولى، والترجمة، وتدهور.

عدة دراسات أجريت مؤخرا أظهرت أن توليف مرناس والانحلال إلى جانب الآليات وأظهرت أنه يمكن إغفال النسخي آثار الطفرة أو تحت المحفزات عند التحديد الكمي لمجموع الحالة المستقرة الجيش الملكي النيبالي. أولاً، الكشف عن التغيرات النسخي من خلال تحليل مستويات مستقرة مرناً دائماً يعتمد على عمر مرناس. متى يتم عرض اضطراب، مستويات مستقرة مرناس مع نصف حياة طويلة سوف تتأثر أقل بكثير من تلك التي مرناس مع نصف حياة قصيرة. ولذلك، إمكانية الكشف عن التغييرات في توليف الحمض النووي الريبي هو بقوة منحازة لصالح النصوص لم تدم طويلاً، في حين قد يفشل تحليل أطول عمرا من الأنواع مرناً للكشف عن التغيرات الدينامية في معدل النسخ. ثانيا، أظهرت عدة تقارير، كل من الخميرة والثدييات، قد تجاهل التغيرات العالمية في النسخ عند تحليل مستويات الحالة المستقرة مرناً. ومن المرجح بسبب الآليات التي تربط بين التوليف مرناً وتدهور الناتج في التخزين المؤقت مرناً. وهذا دفع تطوير بروتوكولات جديدة التحديد الكمي لتوليف مرناً فصل من تدهور، ومن خلال تحليل مرناً يدون حديثا. في السنوات الأخيرة، تم تقديم العديد من البدائل، بما في ذلك تسلسل التحضير العالمية (غرو-seq)1، ونسخة أصلية استطالة التسلسل (صافي-seq)2،3. نحن هنا، تقديم بروتوكول وضعت في البداية في خلايا الثدييات4،،من56 وتكييفها مع الخميرة7،،من89،10، ثم 11، الذي يرتكز على الحمض النووي الريبي وسم مع نوكليوزيد ثيولاتيد أو قاعدة تمثيلية، 4-ثيوريديني (4sU) أو 4-ثيوراسيل (4tU)، على التوالي.

هذا الأسلوب على وجه التحديد ينقي رنا يدون حديثا من الخلايا في الحمض النووي الريبي التي هي نبض المسمى مع 4sU مع تقريبا أي تدخل في التوازن الخلية. ومن ثم، عندما تتعرض الخلايا ل 4sU، الجزيء سرعة أوبتاكين، فوسفوريلاتيد إلى 4sU-ثلاثي الفوسفات، وأدرج في الكشف يتم نسخها. بمجرد تعديل نبض المسمى، فمن الممكن لاستخراج مجموع الجيش الملكي النيبالي الخلوية (المقابلة لمستويات مستقرة من الحمض النووي الريبي)، وفيما بعد، كسر الجيش الملكي النيبالي المسمى 4sU ثيول-على وجه التحديد، مما يؤدي إلى تشكيل رابطة ثنائي كبريتيد بين البيوتين الجيش الملكي النيبالي يدون حديثا4،5. ومع ذلك، لا يمكن 4sU أوبتاكين خلايا معربا عن نوكليوزيد الناقل، مثل الناقل نوكليوزيد اكويليبراتيفي البشرية (hENT1)، منع استخدامها الفوري في مهدها أو انشطار الخميرة. بينما واحدة يمكن التعبير عن hENT1 في بومبي س. أو . س. سيريفيسيا، نهج أسهل يمكن تحقيقه باستخدام 4tU القاعدة المعدلة، حيث يمكن أن يستغرق خلايا الخميرة 4tU، دون الحاجة إلى التعبير عن الناقل نوكليوزيد10، 11 , 12 , 13-وفي الواقع، يتطلب أيض 4tU نشاط فوسفوريبوسيلترانسفيريز اليوراسيل إنزيم (أوبرت). في الكائنات الحية عدة، بما في ذلك الخميرة ولكن ليس من الثدييات، أوبرت أمر ضروري لمسار إنقاذ بيريميدين، إعادة تدوير اليوراسيل لاردين الأدينوزين.

ويمكن إدخال انحياز هاما في الدراسات ترانسكريبتوميك بالتطبيع بين العينات المختلفة التي تم تحليلها بالتوازي. وفي الواقع، يمكن أن تؤثر على العديد من العوامل ينحرف التحليل المقارن الترنسكربيتوم المسخ والسلالات البرية من نوع: كفاءة تحلل الخلية، الاختلافات في الاستخراج، والانتعاش من الجيش الملكي النيبالي، والفروق في معايرة الماسح الضوئي لتحليلات ميكرواري ، بين أمور أخرى. كما نوقش أعلاه، يمكن أن مثل هذه الاختلافات مضللة لا سيما عندما يتوقع الآثار العالمية على الحمض النووي الريبي بوليميراز الثاني النسخ. تم تصميم وسيلة أنيقة لدقة مقارنة معدلات التوليف مرناً بين العينات المختلفة باستخدام الخميرة الأنشطار بعيد يتصل بومبي شيزوساكتشاروميسيس كمعيار داخلية. لذلك، يسمى عدد ثابت من بومبي س. يتم إضافة خلايا إلى أن العينات S. cerevisiae والخلايا البرية من نوع أو متحولة، قبل تحلل الخلية والحمض النووي الريبي استخراج10. وفي وقت لاحق، كمياً الكشف حالة ثابتة والمركبة حديثا من بومبي س. و . س. سيريفيسيا أما بواسطة RT-قبكر أو عن طريق استخدام رقائق ميكرواري أو التسلسل الفائق10. الجمع بين هذه البيانات مع النمذجة الحركية، ويمكن قياس المعدلات المطلقة لتوليف مرناً والاضمحلال في مهدها الخميرة.

في إطار هذه المخطوطة، سنوضح كيفية السماح تحليل للحمض النووي الريبي يدون حديثا للكشف عن دور عالمي لمجمعات كواكتيفاتور الملحمة وتفييد في الحمض النووي الريبي بوليميراز الثاني النسخ في مهدها الخميرة1514،، 16. الأهم من ذلك، تحدد مستويات مرناً مستقرة في S. cerevisiae الدراسات السابقة واقترح أن الملحمة يلعب دالة الغالبة على مجموعة محدودة من جينات الخميرة التي تتأثر بشدة بالطفرات في الملحمة ولكن مقاومة نسبيا تفييد الطفرات17،،من1819. من المستغرب، عرضت الأنشطة الانزيمية الملحمة العمل بشأن الجينوم كله يدون، مما يشير إلى دور أوسع لهذا المنشط المشارك في الحمض النووي الريبي بوليميراز الثاني النسخ. وقد لوحظ تناقص الحمض النووي الريبي بوليميراز الثاني التعيين في الجينات أعرب معظم لدى المنظمة من الملحمة أو تفييد، مما يوحي بأن هذه كواكتيفاتورس العمل معا في معظم الجينات. ومن ثم، التحديد الكمي مرناً يدون حديثا كشفت أن الملحمة وتفيد المطلوبة للنسخ لما يقرب من جميع الجينات بالحمض النووي الريبي بوليميراز الثاني14،،من1516. تنفيذ آليات تعويضية لتبرز بوصفها وسيلة للخلايا للتعامل مع انخفاض عالمي في توليف مرناً التي يتم تخزينها مؤقتاً نقصان عالمية متزامنة في تدهور مرناً. الملحمة ويضيف إلى قائمة العوامل وجود تأثير عالمي على الحمض النووي الريبي بوليميراز الثاني النسخ، مثل الحمض النووي الريبي بول الثاني مفارز10، مجمع كواكتيفاتور20الوسيط، العام النسخ عامل تفييه21،22 ، والعناصر غير مباشر، مرناً تدهور الآلية9،10،23. مثل هذه الأحداث التعويضية لوحظت عالمياً في ساغا المسوخ، والمحاسبة للتغييرات المتواضعة والمحدودة في مستويات مرناً مستقرة رغم انخفاض عالمي وشديدة في توليف مرناً14. كما أجريت التحاليل مماثلة في سلالة حذف BRE1 ، أدى إلى خسارة كاملة من هستون H2B أوبيكويتينيشن. من المثير للاهتمام، يمكن الكشف عن كثير أكثر اعتدالا ولكن يتفق تأثير عالمي على الحمض النووي الريبي بوليميراز الثاني النسخ في غياب Bre1، مشيراً إلى أن وسم الأيضية للجيش الملكي النيبالي يدون حديثا في الخميرة يمكن الكشف والتحديد الكمي لمجموعة واسعة من التغييرات في مرناً معدلات التوليف.

Protocol

1-خلية استزراع ونضوب ربمسن وحدة فرعية للملحمة

  1. لكل سلالة S. cerevisiae وتكرار، بما في ذلك نوع البرية أو سلالات التحكم، تطعيم مستعمرة واحدة من لوحة جديدة إلى 5 مل من YPD المتوسطة (2% ببتون واستخراج الخميرة 1% والجلوكوز 2%).
  2. تنمو خلايا S. cerevisiae بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية مع التحريض المستمر (150 لفة في الدقيقة).
  3. قياس الكثافة البصرية 600 نانومتر (OD600) وتمييع ثقافة التطوير التنظيمي600 حوالي 0.1 في 100 مل من متوسطة YPD والسماح لها بالنمو حتى OD600 حوالي 0.8.
  4. في موازاة ذلك، تطعيم مستعمرة واحدة من الخلايا بومبي س من لوحة جديدة إلى 50 مل متوسطة نعم (استخراج الخميرة 0.5%؛ 250 مغ/لتر الأدنين، الحامض الأميني، اليوراسيل، leucine، ويسين؛ الجلوكوز 3%) وتنمو الخلايا بين عشية وضحاها في 32 درجة مئوية مع التحريض المستمر (150 لفة في الدقيقة).
  5. قياس OD600 الثقافة بين عشية وضحاها بومبي س. وتمييع ثقافة التطوير التنظيمي600 حوالي 0.1 في 500 مل من المتوسطة نعم وتركها تنمو حتى OD600 حوالي 0.8.
  6. لكل سلالة المرساة بعيداً S. cerevisiae وتكرار، بما في ذلك نوع البرية أو سلالات التحكم، تطعيم مستعمرة واحدة من لوحة جديدة إلى 5 مل من YPD المتوسطة (2% ببتون واستخراج الخميرة 1% والجلوكوز 2%).
  7. تنمو الخلايا بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية مع التحريض المستمر (150 لفة في الدقيقة).
  8. في صباح اليوم التالي، قياس OD600وتمييع الثقافة إلى OD600 حوالي 0.1 في 100 مل من YPD المتوسطة والسماح لها بالنمو حتى OD600≈ 0.8.
  9. إضافة 100 ميليلتر من ربمسن إلى الثقافة من حل أسهم 1 ملغ/مل (تركيز ربمسن النهائي 1 ميكروغرام/مل) وترك الخلايا احتضان عند 30 درجة مئوية مع التحريض المستمر للوقت اللازم للبروتين من المصلحة أن تستنفد شرطيا من (نواة 30 دقيقة عادة كافية). لعنصر التحكم، استخدم ثقافة خميرة مشابهة، ولكن بدلاً من إضافة ربمسن، إضافة ما يعادل حجم ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس]).

2-4tU وسم مع بومبي س. كسبايك (العد)

  1. إعداد حل م 2 4-ثيوراسيل طازجة. وبمجرد إعداد، يبقيه في درجة حرارة الغرفة وبعيدا عن الضوء.
    1. دقة تزن 64.1 ملغ 4-ثيوراسيل لكل ثقافة S. cerevisiae وحله في 250 ميليلتر من dimethylformamide (DMF) أو في 250 ميليلتر من [دمس].
    2. لثقافة بومبي س. لاستخدامها كارتفاع في وزن 320.5 ملغ 4-ثيوراسيل وحله في 1,250 ميليلتر من [دمس].
  2. إضافة الحل 4-ثيوراسيل للثقافات S. cerevisiae و بومبي س. لتركيز نهائي من 5 مم واحتضانها لهم لمدة 6 دقائق مع التحريض المستمر على 30 درجة مئوية و 32 درجة مئوية، على التوالي.
  3. بعد 6 دقائق، إزالة قاسمة صغيرة كل ثقافة لخلية العد. عد الخلايا باستخدام عداد تلقائي خلية أو دائرة نويباور.
  4. جمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي (س 2,500 ز) لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
  5. تجاهل المادة طافية، وتغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني x 1 المثلج، ومرة أخرى للطرد المركزي (س 2,500 ز، 4 درجة مئوية، مدة 5 دقائق).
  6. حساب إجمالي عدد الخلايا في كل من العينات S. cerevisiae و بومبي س .
  7. ريسوسبيند الخلايا في 5 مل من برنامج تلفزيوني x 1 المثلج وتخلط S. cerevisiae مع خلايا بومبي س. بنسبة 3:1.
  8. الطرد المركزي الخلايا (2,500 س ز، 4 درجة مئوية، 5 دقيقة) وإزالة برنامج تلفزيوني وفلاش-تجميد الخلايا في السائل ن2وتخزين العينة في-80 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى.

3. رنا الاستخراج والمعالجة الدناز

  1. ذوبان الجليد الخلايا على الجليد لما يقرب من 20-30 دقيقة.
  2. المضي قدما في استخراج الحمض النووي الريبي استخدام مجموعة أدوات استخراج خميرة-الحمض النووي الريبي (جدول المواد) مع بعض التعديلات.
  3. كل كل عينة، صب ميليلتر 750 من المثلج الزركونيا الخرز في أنبوب 1.5 مل ملولبة المتوفرة مع هذه المجموعة. ضع في اعتبارك أن كل كل أنبوب، والجيش الملكي النيبالي من 10 إلى9 خلايا يمكن كفاءة استخراج. ومن ثم، إعداد عدد الأنابيب اللازمة لكل عينة. على سبيل المثال، يمكن أن تجعل ثقافة S. cerevisiae 100 مل (OD600≈ 0.8) حوالي 2 × 109 إلى 3 × 109 خلايا، المؤدية إلى ما مجموعة 2.7 × 109 4 × 109 خلايا في المجموع (بعد تصاعد في ثلث بومبي س. الخلايا). وفي هذه الحالة، سيلزم ما يصل إلى 3-4 رد فعل أنابيب لكل عينة/شرط/المسخ/تكرار.
  4. الواحدة كل الخلايا 1 × 109 ، إضافة ميليلتر 480 تحلل المخزن المؤقت المقدمة مع عدة وميليلتر 48 من الحزب الديمقراطي الصربي 10% ميليلتر 480 من الكحول الفينول: كلوروفورم: إيسواميل (25:24:1، v/v/v).
  5. مزيج الخلايا باستخدام خلاط دوامة ونقلها بالأنابيب التي تحتوي على حبات الزركونيا المثلج.
  6. استيعاب هذه الأنابيب على محول خلاط دوامة وإيقاف دوامة بأقصى سرعة ممكنة، وفاز لدقيقة 10 خلايا الخميرة (في غرفة في 4 درجات مئوية). بدلاً من ذلك، إجراء تحلل الخلايا في الخافق أحد حبة تلقائي.
  7. الطرد المركزي أنابيب في 16,000 س ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة وجمع بعناية في المرحلة العليا (المرحلة التي تحتوي على الحمض النووي الريبي) إلى أنبوب صقر طازجة 15 مل. عادة ما يكون حجم استرداد كل كل أنبوبة حول 500-600 ميليلتر.
  8. للأنابيب 15 مل يحتوي على الجيش الملكي النيبالي المنقي جزئيا، إضافة ربط المخزن المؤقت المقدمة مع كيت ومزيج دقيق. لكل 100 ميليلتر من حل الجيش الملكي النيبالي، إضافة 350 ميليلتر من المخزن المؤقت ملزم (أيعندما يكون حجم الحل مائي المرحلة 600 ميليلتر، مل 2.1 من المخزن المؤقت ملزم ينبغي إضافة).
  9. إلى الخليط السابق، إضافة الإيثانول 100% ومزيج دقيق. لكل 100 ميليلتر من حل الجيش الملكي النيبالي، إضافة 235 ميليلتر من الإيثانول 100 ٪ (أيعندما يكون حجم الحل مائي المرحلة 600 ميليلتر، أضف 1.41 مل إيثانول).
  10. تطبيق ميليلتر يصل إلى 700 من الخليط من الخطوة 3، 9 إلى خرطوشة تصفية تجميعها في أنبوب جمع، سواء قدمت مع عدة.
  11. أجهزة الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في س 16,000 ز. إذا كانت مدة الطرد المركزي لم يكن كافياً للحجم الإجمالي لتمريرها من خلال المرشح، كرر الطرد المركزي لمدة 30 ثانية.
  12. تجاهل-التدفق عبر وإعادة استخدام أنبوب جمع نفسه. إضافة آخر ميليلتر 700 الحل الإيثانول المخزن المؤقت ملزم الحمض النووي الريبي للتصفية والطرد المركزي مرة أخرى في 16,000 س ز لمدة 1 دقيقة.
  13. تجاهل في التدفق من خلال وكرر الخطوتين 3.11 و 3.12 حتى يتم الانتهاء من حل الجيش الملكي النيبالي.
  14. يجب غسل الفلتر 2 x مع 700 ميليلتر للغسيل الحل 1. جمع الحل الغسيل عن طريق استخدام الطرد المركزي في س 16,000 ز لمدة 1 دقيقة وتبقى دائماً على أنبوب جمع.
  15. يجب غسل الفلتر 2 x مع 500 ميليلتر للغسيل الحل 2. جمع الحل الغسيل عن طريق استخدام الطرد المركزي في س 16,000 ز لمدة 1 دقيقة وتبقى دائماً على أنبوب جمع.
  16. الطرد المركزي هذه الأنابيب مرة أخرى في س 16,000 ز لمدة 1 دقيقة ليجف تماما عامل التصفية.
  17. نقل الخرطوشة تصفية إلى أنبوب جمع النهائي (أنبوب المناسبة للحمض النووي الريبي) والوت الجيش الملكي النيبالي مع 50 ميليلتر من تعامل ديبك، خالية من رناسي ح2س (يسخن إلى 100 درجة مئوية).
  18. أجهزة الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في س 16,000 ز.
  19. الوت رنا مرة أخرى (للأنبوب نفسه) مع 50 ميليلتر مسخن تعامل ديبك، خالية من رناسي ح2o. تأكد من أن كل وحدة التخزين قد مرت من خلال عامل التصفية؛ خلاف ذلك، أجهزة الطرد المركزي لفترات أطول.
  20. إذا كان يتم استخدام أنابيب متعددة لنموذج واحد واحد، تجمع لهم جميعا في أنبوب واحد.
  21. قياس وفحص نقاء العينة باستخدام المعدات المناسبة.
    ملاحظة: في حين أدرج 4tU فقط داخل المركبة حديثا الجيش الملكي النيبالي، هناك فرصة التلوث طفيفة مع الحمض النووي. ولهذا السبب، فمن المستحسن لعلاج العينات مع الدناز دائماً أنا. لذلك، استخدام الكواشف قدمت مع مجموعة أدوات استخراج الحمض النووي الريبي (جدول المواد) عقب توصيات الشركة المصنعة.

4-بيوتينيليشن ثيول محددة من الحمض النووي الريبي المركبة حديثا

  1. ضبط تركيز الحمض النووي الريبي التي تم الحصول عليها بالمادة 3 من البروتوكول إلى 2 ملغ/مل. الكوة ميكروغرام 200 من مجموع الجيش الملكي النيبالي، الحرارة عليه لمدة 10 دقائق عند 60 درجة مئوية، والبرد فورا على الجليد لمدة 2 دقيقة.
  2. إلى قاسمة الجيش الملكي النيبالي، إضافة الكواشف المذكورة أدناه بالترتيب التالي: 600 ميليلتر من تعامل ديبك، خالية من رناسي ح2س، 100 ميليلتر من المخزن المؤقت بيوتينيليشن (100 ملم تريس-HCl [الرقم الهيدروجيني 7.5] ومم يدتا، في معاملة ديبك 10، خالية من رناسي ح2س)، و 200 ميليلتر من البيوتين-هبدب من مخزون من 1 ملغ/مل البيوتين-هبدب في [دمس] أو DMF.
    1. وفي بعض الحالات، يميل الحل البيوتين-هبدب يعجل، يرجح أن سبب في انخفاض معدلي الذوبان في الماء. في هذه الحالة، زيادة الحجم [دمس]/DMF تصل إلى 40% حجم رد فعل (لعينات الحمض النووي الريبي، إضافة 400 ميليلتر من تعامل ديبك ح2س، 100 ميليلتر من المخزن المؤقت بيوتينيليشن، و 400 ميليلتر من البيوتين-هبدب من مخزون 0.5 ملغ/مل).
  3. احتضان العينة في درجة حرارة الغرفة ومحمية من الضوء ح 3، مع التحريض لطيف.
  4. بعد التفريخ، إضافة وحدة تخزين متساوية تقريبا من كلوروفورم للأنابيب والمزيج بقوة.
  5. تدور العينة في س 13,000 ز لمدة 5 دقائق، عند 4 درجة مئوية. تسمح هذه الخطوة إزالة البيوتين الزائدة التي لم لا بيوتينيلاتي الجيش الملكي النيبالي. وبدلاً من ذلك، القيام بهذه الخطوة باستخدام أنابيب قفل المرحلة (الثقيلة). لذلك، تدور إلى أسفل الأنابيب قفل المرحلة لمدة 1 دقيقة في س 13,000 ز، إضافة خليط الحمض النووي الريبي ومبلغ مساو من كلوروفورم، مزجها بشدة، والطرد المركزي لهم في س 13,000 ز لمدة 5 دقائق، عند 4 درجة مئوية.
  6. نقل بعناية في المرحلة العليا في أنابيب 2 مل جديدة.
  7. إضافة عشر حجم 5 م كلوريد الصوديوم وتخلط العينة.
  8. إضافة وحدة تخزين متساوية من الايزوبروبانول وخلط العينة جيدا، وأنها تدور في س 13,000 ز مدة 30 دقيقة على الأقل، في 4 درجات مئوية.
  9. حذر إزالة المادة طافية وإضافة 1 مل من المثلج 75% إيثانول.
  10. تدور في 13,000 س ز لمدة 10 دقيقة، في 4 درجات مئوية.
  11. بعناية قم بإزالة المادة طافية، سريعة-تدور الأنبوب، والحل الإيثانول المتبقية. تأكد من أن بيليه الحمض النووي الريبي لا جاف.
  12. تعليق الجيش الملكي النيبالي في 100 ميليلتر ح يعامل ديبك، خالية من رناسي2o.

5-تنقية الكسر المركب حديثا من الجيش الملكي النيبالي إجمالي وغير مسمى استخدام الخرز المغناطيسي المغلفة ستريبتافيدين

  1. الحرارة بيوتينيلاتيد الحمض النووي الريبي لمدة 10 دقائق عند 65 درجة مئوية والبرد ثم العينات على الجليد لمدة 5 دقائق.
  2. إضافة 100 ميليلتر من حبات مغناطيسية المغلفة ستريبتافيدين إلى بيوتينيلاتيد الحمض النووي الريبي (في وحدة تخزين نهائي من 200 ميليلتر). على وجه التحديد، من المستحسن استخدام الخرز المشار إليها في الجدول للمواد، منذ ذلك الحين، بعد محادثات مع غيرها من المختبرات، هذه يبدو أن تكون متسقة وموثوق بها.
  3. احتضان العينة مع اهتزاز طفيف لمدة 90 دقيقة، في درجة حرارة الغرفة.
  4. ضع الأعمدة المقدمة مع kit (جدول المواد) في موقف المغناطيسية.
  5. إضافة 900 ميليلتر من درجة حرارة الغرفة العازلة الغسيل (100 ملم تريس-HCl [الرقم الهيدروجيني 7.5]، يدتا ملم 10, 1 "م كلوريد الصوديوم"، و 0.1% 20 توين، في معاملة ديبك، خالية من رناسي ح2س) إلى الأعمدة (قبل تشغيل وحجته).
  6. تطبيق مزيج الخرز/الحمض النووي الريبي (200 ميليلتر) إلى الأعمدة.
  7. جمع خلال التدفق في أنابيب 1.5 مل وتطبيقه مرة أخرى إلى نفس العمود المغناطيسية. إذا لزم الأمر، يبقى هذا التدفق من خلال كما أنه يمثل الكسر الحمض النووي الريبي غير مسمى.
  8. غسل الأعمدة 5 x مع زيادة حجم الغسيل المخزن المؤقت (600، 700، 800، 900، و 1,000 ميليلتر).
  9. الوت الجيش الملكي النيبالي المركبة حديثا مع 200 ميليلتر من 0.1 م DTT.
  10. أداء ثاني شطف، 3 دقيقة في وقت لاحق، مع زيادة في حجم تساوي 0.1 م DTT.
  11. بعد التينج الجيش الملكي النيبالي، إضافة مجلدات 0.1 من 3 م نواك (pH 5.2)، 3 مجلدات من المثلج 100 ٪ الإيثانول، و 2 ميليلتر من 20 ملغ/مل الجليكوجين (الجيش الملكي النيبالي-الصف) والسماح الحمض النووي الريبي متعجل بين عشية وضحاها، في-20 درجة مئوية.
  12. استرداد الجيش الملكي النيبالي بالطرد المركزي (13,000 س ز لمدة 10 دقيقة، عند 4 درجة مئوية) وريسوسبيند أنه في 15 ميليلتر من تعامل ديبك، خالية من رناسي ح20. نسبة الحمض النووي الريبي المسمى بالمجموع المتوقع أن حوالي 2%-4% (عادة ما تكون أكثر نحو النهاية السفلي)، تقديم حوالي 2.0 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي المركبة حديثا. هذه الكمية ما يكفي للقيام بتجارب qPCR عديدة، فضلا عن تحليلات ميكرواري/التسلسل.

6--الرايت قبكر التحقق كسور مختلفة

  1. توليف كدنا من 2 ميكروغرام من مجموع الحمض النووي الريبي أو 10 ميليلتر من الحمض النووي الريبي المسمى باستخدام هيكساميرس عشوائي والمنتسخه العكسية للاختيار، وفقا لإرشادات الشركة المصنعة (جدول المواد).
  2. تضخيم كدنا في طريق قبكر في الوقت الحقيقي باستخدام بروتوكول قياسي (جدول المواد).
    ملاحظة: يجب تشغيل جميع العينات في ثلاث نسخ من الحد أدنى من اثنان replicates البيولوجية. تصحيح جميع القيم الخام للتعبير عن بومبي س. توبولين.

7-ميكرواري التهجين

  1. هجن عينات الحمض النووي الريبي على رقائق ميكرواري المفضل وفقا لإرشادات الشركة المصنعة (لهذا البروتوكول محددة، راجع الجدول للمواد). بإيجاز، إعداد بيوتينيلاتيد أهداف كرنا من 150 نانوغرام من الجيش الملكي النيبالي باستخدام "مجموعة تضخيم الحمض النووي الريبي رئيس الوزراء" (جدول المواد)، وفقا لإرشادات الشركة المصنعة. هجن 4 ملغ كرناس مجزأة ح 16 عند 45 درجة مئوية وفي الدقيقة 60 على رقائق ميكرواري.
  2. أغسل ووصمة عار، وتفحص الرقائق باستخدام محطة المشار إليها والماسح الضوئي (جدول المواد). استخراج البيانات الخام (CEL كثافة الملفات) من الصور الممسوحة ضوئياً باستخدام وحدة التحكم بالأوامر (دول التعاون الخليجي العربي، الإصدار 4.1.2).
  3. كذلك معالجة الملفات CEL مع "وحدة التعبير" البرمجيات الإصدار 1.4.1 لحساب التحقيق تعيين كثافة إشارة، استخدام خوارزميات تستند إلى إحصاءات ماس 5.0 مع الإعدادات الافتراضية والتوسع العالمي كأسلوب التطبيع.
    ملاحظة: تم تعيين كثافة المشذبة الهدف يعني كل شريحة تعسفاً إلى 100. القيام بجميع تجارب استخدام replicates البيولوجي المستقلة اثنين على الأقل. تطبيع البيانات الخام إلى إشارة بومبي س. وحساب إضعاف التغييرات في مستويات الحمض النووي الريبي الكلي والمركب حديثا.

8-بيانات التحليل باستخدام خط أنابيب R الموجودة

  1. حساب التوليف وتسوس معدلات استخدام خط الأنابيب وحزمة R/بيوكوندوكتور متاحة للجمهور، كما هو موضح سابقا8،10.

النتائج

عند تنفيذ العلامات الاستقلابية من الحمض النووي الريبي يدون حديثا، جوانب عديدة تحتاج إلى مراقبة: الوقت والكفاءة للعلامات، وارتفاع في النسبة، بروتوكول الاستخراج، وفعالية بيوتينيليشن (بما في ذلك الإشارات إلى الضجيج نسبة)، من بين أمور أخرى. هذه الشروط على نطاق واسع ومنهجي أظهرت آخرون7،،من1011. ونحن هنا تركز أساسا على تفسير والتحليلات الفورية التي يمكن أن يؤديها مرة واحدة تم تجهيز العينات، أما بواسطة RT-قبكر، ميكرواري، أو التسلسل. تحليلات لسلالات متحولة مختلفة تثبت قوة الأسلوب للكشف ليس فقط عالمية انخفاضا كبيرا في توليف مرناً، كما هو الحال في ملحمة المسخ S. cerevisiae السلالات، ولكن أيضا انخفاض خفيف جداً من الحمض النووي الريبي بوليميراز الثاني النشاط عند قمع مونوبيكويتينيشن هيستون H2B.

واقترح تحليلاتنا الأنشطة الانزيمية الملحمة تجنيد واسعة الكروماتين15، التي لم تكشف بتحليل مستويات مرناً مستقرة في ملحمة السلالات المسخ. كما رنا بوليميراز الثاني التعيين كان البصر لدى المنظمة ساغا، قررنا أن تحليل ما إذا كانت سوف تتأثر معدلات التوليف مرناً على الصعيد العالمي. ومن ثم، البرية من نوع أو متحولة سلالات S. cerevisiae تعرضوا ل 4tU لمدة 6 دقيقة، لتسمية الكشف يدون حديثا. بعد خلط مع ارتفاع في المسمى الخلايا (س. بومبي) بنسبة 3:1، تم استخراج مجموع الجيش الملكي النيبالي، والمركبة حديثا الجيش الملكي النيبالي بيوتينيلاتيد وتنقيته ووفقا لبروتوكول المعروضة هنا، كما هو الحال في تاريخ هو مبين في الشكل 1. تم تنقية المسمى الكشف من إجمالي 200 ميكروغرام من الجيش الملكي النيبالي، ضمان أن كمية المنتج المنقي سيكون كافياً لأي تطبيق من المتلقين للمعلومات. كخطوة أولية والمنهجي قبل أي تحليل على نطاق الجينوم، التحقق من صحة تنقية الحمض النووي الريبي المركبة حديثا من الرايت qPCR. واختيرت وفقا لمعايير مختلفة، بما في ذلك على مستوى التعبير ومسارات تنظيمية، واعتماد على مختلف رنا بولمرس الجينات.

لتأكيد أن هذا البروتوكول تحديداً ينقي المسماة الجيش الملكي النيبالي، ونحن كمياً مستويات النصوص في الكسور تنقيته من البرية من نوع الخلايا التي تم مثقف مع أو بدون 4tU. تم الكشف عن مستويات الخلفية لا يعتد بها للكشف تم تحليلها من الخلايا التي لم يتعرضوا إلى 4tU (الشكل 2أ). كذلك تم التحقق من صحة تنقية الحمض النووي الريبي يدون حديثا بإثراء الملحوظة التي تحتوي على إنترون ACT1 قبل-مرناً (البيانات لا تظهر). بعد التحقق نوعية العينات، قمنا باختبار ما إذا كان مرناً التوليف سوف تتأثر عند حذف SPT20، المعروف بإعاقة عمل الجمعية الملحمة معقدة. وكما ذكرت من قبل الآخرين، كشفت الكمي مرناً يقوم على الحمض النووي الريبي (الحالة المستقرة) مجموع من سلالة Δ spt20معظمهم دون تغيير أو أقل ما يقال عن انخفاض مستويات لاختبار الجينات (الشكل 2ب). تم الحصول على نتائج مماثلة لسلالات حذف ل BRE1 (الشكل 2ب). وفي المقابل، كشف تحليل الحمض النووي الريبي يدون حديثا من سلالة Δ spt20انخفاضا كبيرا في توليف مرناً قبل ثلاثة--إلى خمسة إضعاف لكل اختبار الجينات (الشكل 2-ج). فقدان Bre1 أدى إلى انخفاض أكثر حذراً ولكن لا تزال واضحة في مستويات مرناً المركبة حديثا لدراسة الجينات (الشكل 2-ج). في اتفاق جيد مع دور الملحمة و Bre1 في الحمض النووي الريبي بوليميراز الثاني النسخ، لا يؤثر فقدان أما Spt20 أو Bre1 على التعبير للجينات، RDN25 أو snR6 ونسخها من قبل رنا بوليميراز أنا ورنا بوليميراز الثالث، على التوالي ( الشكل 2ج).

ومع ذلك، عرض سلالات حذف لمفارز الهيكلية للملحمة معقدة، مثل SPT7 أو SPT20، تعمل بطيئة النمو الشديدة التي قد تشكل التعديلات النسخي الملاحظة. لاستبعاد آثار ثانوية غير مرغوب فيها، نحن مشروط المنضب Spt7 من النواة، استخدام المرساة بعيداً S. cerevisiae سلالات14،24. عند 60 دقيقة من العلاج ربمسن، قبل النبض الوسم مع 4tU (انظر الشكل 1 لتمثيل تخطيطي)، تم تخفيض مستويات مرناً يدون حديثا بدرجة مماثلة كالتي لوحظت في سلالة الحذف (2Eالشكل 2D و ). وهكذا، هذا التحليل، أكدت نتائجنا السابقة والمصادقة على البروتوكول المتعلق بهذا النظام نفاد إيندوسيبلي. في تحليل الوقت-الدورة التدريبية، التي يتعرض فيها الخلايا إلى ربمسن لوقت يمتد من 0 إلى 240 دقيقة، يتضح انخفاض التعبير مباشرة بعد 15 دقيقة من التعرض للمخدرات. أكثر من المثير للاهتمام، ومستويات مرناً مستقرة تميل إلى التقليل من البداية لكن عادت إلى مستوياتها العادية بعد 60 دقيقة، إشارة إلى أن إليه تعويضية يأخذ مجراه في هذه الأثناء (الشكل 2ه).

بالإجمال، التسمية والتحديد الكمي للجيش الملكي النيبالي المركبة حديثا يسمح الكشف عن أدوار تنظيمية جديدة للمجمع الملحمة. بروتوكول وصف يمكن أن تكشف أيضا عن آثار معتدلة على الحمض النووي الريبي بوليميراز الثاني النشاط وتم تطبيقها بنجاح على الشرطي استنفاد سلالات الخميرة.

أحد التطبيقات النهائية للجيش الملكي النيبالي المركبة حديثا المنقي إجراء تقييم كمي على نطاق الجينوم للنصوص باستخدام ميكرواري التهجين أو التسلسل (4tU-seq). أن التسلسل الفائق أكثر الكمية وحساسة وغنية بالمعلومات، فالتهجين ميكرواري يمكن أن تكون مفيدة جداً لتحديد ما إذا كان يتم تغيير مستويات مرناً العالمية. في هذا السياق حيث يتم تطبيع المحوري، أضفنا سبايك في الكائن حي للعينة التي كنا نهدف إلى تحليل. على وجه التحديد، نحن مختلطة S. cerevisiae الخلايا إلى خلايا س بومبي في نسبة 3:1، سواء سبق التعرض ل 4tU. عندما تتعرض الكشف المنقي، المسمى بالتسلسل الفائق، يمكن استخدام أي بروتوكول إعداد المكتبة القياسية، في أغلب الأحيان بعد استنفاد الرنا الريباسي. تطبيع العلاقات بين البيانات 4tU seq من عينات مختلفة قد أنجز عن طريق إضافة أما المسمى الحمض النووي الريبي من مختلف الأنواع (أي خلط S. cerevisiae و س بومبي الخلايا أعلاه)22 أو في المختبر- نسخها، ثيولاتيد المصطلحات الخاصة في الجيش الملكي النيبالي12،25،،من2627. رقائق ميكرواري متوفرة تجارياً تحتوي على مجسات الترنسكربيتوم كله من الخميرة مهدها والانشطار، يتيح إمكانية التحديد الكمي مرناً من كل الكائنات في تجربة واحدة واحدة. هيبريديزيشنز ميكرواري أجريت مع الجيش الملكي النيبالي إجمالي والمركبة حديثا يقرها RT-قبكر كما هو مبين أعلاه (البرية من نوع و spt20Δ و bre1Δ). وبالإضافة إلى ذلك، قمنا بتضمين سلالة يدعم مونوبيكويتينيشن هستون H2B، من خلال طفرة نقطة من بقايا أوبيقويتينابلي (K123R). نظراً لأن نسبة الخلايا س بومبي على وجه التحديد نفس استخدمت في عينات مختلفة و replicates، فمن الممكن لإعادة تحجيم خطيا في الصفيف كثافة حتى أن يسبر المجموع والمسمى بومبي س. لها نفس متوسط الكثافة. هذا التطبيع، أو إعادة قياس، يمكن أن يؤديها باستخدام حزمة بيوكوندوكتور الذي وضعه المختبر لباتريك كريمر وتستخدم في نفس الوقت في جميع عينات تم تحليلها، مجموع والمسمى سلالات الكسور والبرية من نوع وطفرات8. باختصار، إدخال هذا الأنبوب ملف Excel الذي يحتوي على التحقيقات وقوتها (MAS5 أو RMA) لجميع العينات والكسور. بعد استبعاد المسابير التي خارج نطاق الكشف، يتم ترتيبها كثافة إشارة، آخذا في الاعتبار قيم الكثافة لتحقيقات بومبي س . وأخيراً، يمكنك تعيين التحقيقات إلى مهدها وانشطار الخميرة جينومات، تنتهي مع مصفوفة تحتوي على قيم التعبير تطبيع للمصطلحات الخاصة. يمكن أن تكون هذه القيم مواصلة معالجتها (انظر القسم التالي) أو استخدامها كما هو. في المثال التالي، عقدنا العزم على تغيير الحظيرة لكل نسخة بين المسخ والسلالة البرية من نوع.

التحليلات التي أجريت لكل حالة ثابتة أو حديثا توليفها من مستويات الحمض النووي الريبي ورسم مقابل أهميتها الإحصائية (p-القيمة) (الشكل 3). الاتفاق مع دراسات أخرى، عندما تم تحليل إجمالي مستويات الحمض النووي الريبي، إلا عدد قليل من الجينات كان التعبير عنها، أما أعلى أو دوونريجولاتيد (الشكل 3 ألف-3 ج). بيد أن تحليل الحمض النووي الريبي يدون حديثا أدت إلى استنتاجات مختلفة لافت للنظر. مستويات مرناً يدون حديثا من الجينات أكثر من 4,000 خفضت إلى حد كبير بالاقل مزدوج عند الحذف من SPT20، مما يشير إلى تأثير إيجابي عالمية للملحمة على الحمض النووي الريبي بوليميراز الثاني النسخ في مهدها الخمائر (الشكل 3د ). بالإضافة إلى ذلك، وفي bre1Δ وطفرات K123R ، كانت النتائج أكثر حذراً: معظم الجينات على ما يبدو التعبير عنها خفض، ولكن مدى دوونريجوليشن وعدد الجينات المتأثرة إلى حد كبير (≈ 300-500) كان في الواقع أكثر المحدودة (3E الشكل و 3F).

وكما سبق المذكورة، وحالة ثابتة أو مجموع مستويات مرناً تمليها التوازن ضيق بين التوليف والانحلال (الشكل 4أ). عند رنا بوليميراز الثاني النسخ ضعف على الصعيد العالمي، يمكن أن المصورة سيناريوهين: مستويات (ط) أما مرناً إجمالي الانخفاض على الصعيد العالمي، كاستجابة لانخفاض التوليف ولكن التدهور المستمر، أو تدهور (ثانيا) مرناً يتناقص بنفس القدر، الناتجة في الغالب دون تغيير مستويات مرناً مستقرة. وقد تم الإبلاغ عن السيناريو الثاني لعدة شروط، بما في ذلك في سياق الملحمة أو تفيد انقطاع9،10،،من1416،22. إجراء يسمى التحليل المقارن الترنسكربيتوم ديناميكية (كدتا) استناداً إلى تصنيف 4tU والنمذجة الحركية الديناميكية يسمح لنا بتحديد التوليف مرناً ويستنتج أن معدلات الاضمحلال لكل نسخة8،10. مرة أخرى، نحن استغل البيانات المجمعة للسلالات المذكورة سابقا (البرية من نوع، spt20Δ، bre1Δ، و K123R). كما هو متوقع، عند حذف SPT20، لاحظنا انخفاض متزامن في مرناً معدلات التوليف وتدهور بالمقارنة مع سلالة البرية من نوع. في هذه السلالة متحولة، التعويض الأمثل تقريبا، مع متوسط الانخفاض في توليف 3.8-fold ومتوسط الانخفاض في تسوس من 4.1-fold (الشكل 4ب)، مساندة لماذا يمكن أن تكون التغييرات النسخي محدودة فقط تم الكشف عن مجموع مستويات مرناً (الشكل 3أ). في اثنين الأخرى متحولة سلالات (bre1Δ و K123R)، لوحظت أيضا التغيرات المصاحبة في توليف مرناً والانحلال، ولكن التغييرات التي كانت على نطاق أصغر بكثير وفرَّقت أكثر (الشكل 4 و 4 د).

figure-results-10701
الشكل 1 : التمثيل التخطيطي للعلامات الأيضية للجيش الملكي النيبالي باستخدام 4tU. 4tU الطازجة إضافة إلى متوسط الثقافة والخلايا المسماة للحد الأدنى 6 Labeled S. cerevisiae وخلايا بومبي س مختلطة بنسبة 3:1 ويتم استخراج مجموع الجيش الملكي النيبالي. بعد ذلك، حديثا توليفها الجيش الملكي النيبالي هو بيوتينيلاتيد ويمكن أن تكون تنقية استخدام الخرز المغناطيسي المغلفة ستريبتافيدين. وأخيراً، مجموع الحمض النووي الريبي (الحالة المستقرة) والمسمى المركبة حديثا يمكن استخدام الحمض النووي الريبي في مجموعة متنوعة من التطبيقات المتلقين للمعلومات، بما في ذلك التهجين RT-قبكر وميكرواري أو التسلسل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

figure-results-11630
الشكل 2 : تحليل تصور التغييرات النسخي في كل حالة ثابتة، وحديثا نسخها رنا تحدده RT-قبكر- تم قياس كمية مستويات (A) الجيش الملكي النيبالي من خمس جينات مختلفة من الكسر الحمض النووي الريبي المسمى تنقيته من البرية من نوع الخلايا التي يتعرض لها أما أو عدم 4tU. إظهار فريقي التالية (ب) مجموع وتوليفها (ج) حديثا الكمي الجيش الملكي النيبالي من الرايت قبكر البرية من نوع (WT) و spt20Δ bre1Δ خلايا الخميرة. Spt7 سلالات المرساة بعيداً، غير المعالجة أو المعالجة مع ربمسن لمدة 60 دقيقة، كان يحمل 4tU، ومجموعة (د) أو (ه) نسخها حديثا من الجيش الملكي النيبالي كان كمياً ب RT-قبكر. (و) هذا الفريق يظهر الوقت بالطبع تحليل التغيرات في حالة مستقرة وحديثا توليفها مرناً عند استنفاد Spt7 النووية. لجميع العينات، تم قياس كمية مستويات مرناً لخمسة رنا بوليميراز الثاني الجينات من الرايت qPCR. رنا بوليميراز أنا ورنا بوليميراز الثالث الجينات (RDN25 و snR6، على التوالي) واستخدمت كعنصر التحكم. قيم التعبير (يعني ± SD من ثلاث تجارب مستقلة) كان تطبيع لارتفعت في بومبي س. وإشارة وتعيين إلى 1 في نموذج عنصر تحكم. تم تعديل ألواح د إف من بابتيستا et al. 14- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

figure-results-13183
الشكل 3 : التحليلات على نطاق الجينوم من مستويات مرناً باستخدام الكسور الجيش الملكي النيبالي إجمالي أو المسمى. إظهار هذه الألواح بركان مؤامرات تظهر إضعاف التغييرات في مستويات مرناً الحالة المستقرة (أ-ج) أو (د-و) حديثا توليفها مستويات مرناً بالنسبة إلى أهميتها (فالقيمه). حسبت التغييرات حظيرة (FC) ك log2 لنسبة قيمة التعبير كل الجينات بعد تطبيع إلى إشارة بومبي س. في Δ spt20(أ ود)، Δ bre1(باء و هاء)، أو ( ج وو) سلالة K123R مقابل قيمة التعبير نفس الجين في البرية من نوع S. cerevisiae. تم تحليل إجمالي للجينات 5,385، وتغيير الحدود الدنيا شقين (النقطة الزرقاء: أكثر من شقين الانخفاض؛ والأصفر النقاط: أكثر من زيادة الضعفين) و 0.05 p-تعتبر القيم. تم تعديل لوحات ألف و دال من بابتيستا et al. 14- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

figure-results-14471
الشكل 4 : موازية للتغييرات في توليف مرناً ومرناً تسوس النتائج في التخزين المؤقت مرناً. (أ) هذا الفريق يظهر تمثيل تخطيطي نتائج اضطراب توليف الحمض النووي الريبي على مستويات الحمض النووي الريبي مستقرة. (ب-د) هذه اللوحات إظهار حساب توليف مرناً وأن معدلات الاضمحلال من تحاليل الحمض النووي الريبي الكلي والمركب حديثا. وتحددت معدلات التوليف والانحلال لكل نسخة S. cerevisiae في Δ spt20(ب) و (ج) bre1Δ K123R (د). تم رسم التغييرات (محسوبة ك log2 النسبة بين المسخ والبرية من نوع) في معدلات التوليف ضد التغييرات في معدلات تسوس. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Discussion

في حين لا تزال هي تحسين الأدوات على نطاق الجينوم لتحليل التغيرات في النسخ، التحليل الوحيد من الترنسكربيتوم عن طريق التحديد الكمي لمستويات مستقرة من الحمض النووي الريبي قد لا تعكس التغييرات في الحمض النووي الريبي بوليميراز الثاني النشاط. وفي الواقع، ينظم مستويات مرناً ليس فقط بتوليف الحمض النووي الريبي ولكن أيضا بنضج وتدهور. لقياس توليف مرناً فصل من تدهور مرناً، وضعت بروتوكولات متميزة في السنوات الأخيرة لتحليل النسخ الوليدة في الخميرة والثدييات.

أحد البروتوكولات الأكثر استعمالا للتحديد الكمي للنسخ الوليدة هو غرو seq1. في حين غرو-seq الميزة الرئيسية تتمثل في قدرتها على كشف النقاب عن بوليميراز ترانسكريبتيونالي تشارك ونشطة في الخلفية منخفضة وعالية الدقة، فقد اثنين من النقاط المتميزة التي تقلل من جاذبيته: (ط) أنه يمثل تحديا من الناحية التقنية ويتطلب عزل نوى، والتلاعب نوى (الثاني) يعرض بعض الاضطرابات إلى نظام28. ثمة بديل آخر هو صافي-seq، الذي يعتمد على تسلسل 3 ' نهايات النصوص التي حصل عليها إيمونوبريسيبيتيشن المجمع الثلاثي مستقرة للغاية وشكلت بين الوليدة الجيش الملكي النيبالي، وقالب الحمض النووي، والحمض النووي الريبي بوليميراز الثاني. وهذا النهج يسمح توصيف الكشف الوليدة بدقة زوج قاعدي ويمكن استكشاف مرناً معالجة الأحداث من خلال إيمونوبريسيبيتيشن من تعديل للحمض النووي الريبي بوليميراز الثاني (الفسفرة سيرين-5، على سبيل المثال)2،3 , 29-ومع ذلك، فإنه يعرض بعض العقبات، ومن خلالها نسلط الضوء على ثلاثة. أولاً، بينما الأجسام المضادة التي تستهدف رنا بوليميراز الثاني غالباً ما تكون محددة للغاية، فإنه يعتمد على كفاءة جسم. وثانيا، الحمض النووي الريبي قد يكون عرضه للتدهور خلال فترات حضانة، مما أدى بنا إلى نقطة سابقة (أقل كفاءة من الأجسام المضادة قد تتطلب الحضانة أطول الأوقات، ترك الجيش الملكي النيبالي أكثر عرضه للتحلل)29. الثالث، ولا سيما في الثدييات، والهضم منسى واختيار حجم قد تستبعد تسلسل فريد المحاذاة29،30.

هنا قدمنا بروتوكول مفصل للعلامات الاستقلابية من الحمض النووي الريبي المركبة حديثا استخدام 4tU في S. cerevisiae يحتوي على ميزات مختلفة بالمقارنة مع النهج المتاحة الأخرى. لأن النسخ حساسة للغاية للاضطرابات، ينبغي الإبقاء على الخلايا في الظروف الفسيولوجية أكثر. على سبيل المثال، يعني seq غرو القبض على ترانسكريبتيونالي تشارك رنا بوليميراز الثاني من خلال التعرض للخلايا/النوى ساركوسيل. ومع ذلك، العلاج ساركوسيل وصفت بأنها المثبطة لعدة عمليات الخلوية11. وفي هذه الحالة، وسم الأيضية مع 4tU أو 4sU بتركيز وصف غير مقاومة ولا واضح يؤثر على التوازن الخلية، خاصة بالنسبة لفترات قصيرة من التعرض. على النقيض من الأساليب الأخرى باستخدام النسخ تثبيط لقياس مرناً التنصيف، كدتا أو 4tU seq والمناسب مع النمذجة الديناميكية يحدد معدلات التحلل من كل واحد مرناً في زنزانات دونما قلاقل. ومن ثم، يمكن في نفس الوقت معالجة أسلوب واحد واحد التوليف ومعدلات تسوس الترنسكربيتوم كله على نوع خلية محددة. منذ كدتا أو 4tU seq يستفيد من أساليب التطبيع موثوق بها للغاية، هي من خلال استخدام المصطلحات في مجموعات مختلفة من البيانات يمكن تحليلها معا ومقارنة مباشرة. وأخيراً، وسم الأيضية والتحديد الكمي للجيش الملكي النيبالي المركبة حديثا هو أسلوب الذي يمكن أن تنفذ بسهولة في أي مختبر البيولوجيا الجزيئية كما أنه لا يتطلب أي معدات خاصة. وهذا يفسر احتمال نشر كبيرة بدلاً من هذا الأسلوب، الذي يميل إلى استخدامها بصورة أكثر منهجية لاستكشاف إنتاج الحمض النووي الريبي وتدهور في الخمائر، وكذلك في أعلى حقيقيات النوى.

يمكن أن يكون المسمى الحمض النووي الريبي في الخلايا الحية باستخدام النظير نوكليوزيد،31،5-بروموريديني (BrU) هي32 أو 5-اثينيلوريديني (الاتحاد الأوروبي)33،34أخرى. عزل BrU نبض المسمى الحمض النووي الريبي يعتمد على تنقية جسم بردو المضادة التي قد يكون لها الفعالية المختلفة بين التجارب. يمكن أن يكون الحمض النووي الريبي المسمى الاتحاد الأوروبي مترافق تساهمي إلى البيوتين استخدام الكيمياء فوق مما يؤدي إلى تصريف غير قابل للعكس عكس التعديل ثيول، التي يمكن عكسها مع وكلاء الحد. BrU ووصفها الاتحاد الأوروبي قد استخدمت في خلايا الثدييات لتحديد نطاق الجينوم الحمض النووي الريبي تسوس أسعار31،32 أو لتقييم توليف الحمض النووي الريبي الوليدة34،35. ومع ذلك، لا قد وصف BrU أو الاتحاد الأوروبي وضع العلامات في S. cerevisiae. وفي الواقع، امتصاص النظير نوكليوزيد يتطلب التعبير عن الناقل نوكليوزيد، وهكذا، تظهر هذه الأساليب أقل مرونة في مهدها الخميرة من العلامات مع 4tU.

مدة وسم 4tU يمكن تكييفها ويختلف وفقا للسؤال. عند تقييم مرناً التوليف في S. cerevisiae، نبض التوسيم قصيرة من دقيقة 6 يضمن الحد الأدنى تتأثر مستويات مرناً يدون حديثا بتدهور الجيش الملكي النيبالي. وبالنظر إلى أن المدة قبل النوكليوتيدات المعدلة يمكن إدماجها في الجيش الملكي النيبالي الوليدة أقل من 1 دقيقة، أوامر هذه المدة وضع العلامات 6-مين أنه يمكن تنقية كمية معقولة من الحمض النووي الريبي المركبة حديثا. بروتوكول من هذا القبيل، حسب تعريف ميلر et al. 11، وقد استخدمت في مختلف S. cerevisiae تسوس طفرات للكشف عن التغيرات العالمية في توليف مرناً، والجيش الملكي النيبالي9،10،،من2226،27، 36-لمدة أطول من وضع العلامات (ح 3) استخدمت في مطاردة نبض ايضية وسم مع 4tU لتحديد معدلات تسوس جميع مرناس S. cerevisiae12. وأخيراً، قصيرة للغاية (من دقيقة 1.5) وسم 4tU قد استخدمت لدراسة حركية تجهيز الجيش الملكي النيبالي في مهدها وانشطار الخميرة13،25،37.

ومع ذلك، هذا الأسلوب على بعض القيود، مثل العائد المنخفض نسبيا من الحمض النووي الريبي المسمى استردادها في نهاية البروتوكول كله. بينما في الخميرة، لا توجد أية قيود في انطلاق المواد، ويمكن أن تكون هذه مشكلة عند تحليل الخلايا الاستراحة، على وجه التحديد إذا كان هذا البروتوكول كونها تستخدم فيفو. واحدة من الخطوات التي تحد من البروتوكول هو بيوتينيليشن المسماة تجمع الجيش الملكي النيبالي، الكفاءة التي بعيدة عن الاكتمال، وقدرت بتعديل واحد في ثلاثة 4sU المخلفات في الجيش الملكي النيبالي المسمى5. مؤخرا أظهرت أن استخدام ميثانيثيوسولفوناتي (MTS)-البيوتين، بدلاً من البيوتين-هبدب، يزيد العائد من الحمض النووي الريبي المستردة38. وفقا للنتائج غير منشورة من هذه المجموعة البحثية والنتائج من روتكويسكي و Dölken، النظام التجاري المتعدد الأطراف-البيوتين غير الكامل ثيول محددة، الرائدة في تنقية الحمض النووي الريبي غير مسمى، وإشكالية بصفة خاصة عند انخفاض كميات من الحمض النووي الريبي المسمى 39من المنقي. قيد آخر من العلامات الاستقلابية استخدام 4tU/4sU هو سرعة المتأصلة في أي الحمض النووي الريبي بوليميراز الغضروفي. متوسط سرعة من الحمض النووي الريبي بوليميراز الثاني قدرت بحوالي 3.5 كيلو بايت في الدقيقة40،،من4142. ومن ثم، في وسم 6 دقيقة، سيكون بوليميريز القدرة على نسخ 15 – 20 كيلو بايت. وهكذا، في تجربة مع قصيرة نبض العلامات مع 4tU/4sU، إلا 3 'في نهاية تسمية جزء من الحمض النووي الريبي يدون حديثا، بينما كانت المناطق نهاية 5' موجودة مسبقاً قبل إضافة 4tU/4sU. وهكذا، يثري تنقية الكشف المسمى أيضا موجودة مسبقاً 5 ' نهايات النصوص، خاصة بالنسبة للنصوص الطويلة كما هو الحال في خلايا الثدييات. وللتغلب على هذا التحيز، في بروتوكول المكرر يسمى ترينيداد وتوباغو-seq، مجزأة المستخرجة المسمى الحمض النووي الريبي قبل سونيكيشن قبل تنقية الأنواع المركبة حديثا43.

بالإجمال، 4tU seq طريقة ممتازة لمعالجة تغييرات النسخي في سياق معين. ومع ذلك، وفي حين البروتوكول بسيط إلى حد ما، وهو يتألف من عدة خطوات مختلفة، ويجري في نهاية المطاف واسعة نسبيا. أولاً وقبل كل شيء، حيث يعالج هذا البروتوكول الجيش الملكي النيبالي من البداية إلى النهاية، أنها إلزامية الوفاء بجميع المتطلبات اللازمة عينة نظيفة وخالية من التدهور. ومن ثم، ينبغي أن الكواشف جميع رناسي خالية، وجميع المواد التي ينبغي أن تكرس للتلاعب بالحمض النووي الريبي، تنظيف كل شيء دقيق ومنتظم مع حل تطهير رناسي. ثانيا، بينما رد فعل البيوتين محددة للغاية، يجب إزالة الفائض من البيوتين-هبدب التي لم تتحرك من العينة (لتجنب تشبع الخرز streptavidin مع البيوتين غير المنضم تساهمي للجيش الملكي النيبالي، على سبيل المثال). الثالثة، كما هو موضح في البروتوكول، ويوصي بشدة باستخدام الخرز المغناطيسي المغلفة streptavidin المشار إليها، منذ عدة بحوث المجموعات لدينا تحدث لجميع وأشارت إلى أن هذه الخرز أدى إلى انخفاض مستويات الخلفية. وينبغي استخدام الجودة المناسبة، والرابعة وضوابط تجريبية. وتشمل العينات المستمدة من الخلايا التي لم تتعرض ل 4tU/4sU. هذه العينات ستكون ذات قيمة كبيرة لمعالجة مستويات الخلفية والتأكد، خلال التجربة، لا يحدث تلوث مع الحمض النووي الريبي غير المسماة. أيضا، بديل ممتاز آخر لاختبار ما إذا كانت العينة إثراء للحمض النووي الريبي المركبة حديثا لأداء RT-قبكر استخدام كبسولة تفجير ضد جينات التي تحتوي على مقدمة. كبسولة تفجير ينبغي أن تكون مكملة ل 3 'نهاية ونهاية 5' إكسون متتاليين هما وانترون، أو العكس بالعكس. وأخيراً، قبل تسلسل ميكرواري التهجين، التحقق من صحة العينات قبل RT-قبكر. لذلك، ينبغي تحديد جينات مختلفة مع مستويات مختلفة من التعبير والتنظيم وتحليلها. على النحو الأمثل، ينبغي القيام بهذا لكسور مختلفة اثنين من الحمض النووي الريبي (الرنا الحالة المستقرة والمركبة حديثا).

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

ونحن نشكر لازلو طرة على دعمه وخامساً فيشر وشوماخر ك. ف. ش سافين لمناقشاتهم. وأيده يد زمالة ماري كوري-أي تي (بيتن-GA-2013-606806، NR-نت) و "مؤسسة قوس". وأيد هذا العمل الأموال من الوكالة الوطنية للبحث (ANR-15-CE11-0022 SAGA2). وأيد هذه الدراسة أيضا ANR-10-لابكس-0030-إينرت، صندوق الدولة الفرنسية تديره الوكالة الوطنية للبحث تحت دعفينير يشرف البرنامج الإطار ANR-10-معرض أيدكس-0002-02.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
4-ThiouracilSigma-AldrichCat# 440736
RapamycinEuromedexCat# SYN-1185
Countess II FL Automated Cell CounterThermoFisherN/A
RiboPure RNA Purification kit, yeastThermoFisherCat# AM1926
NanoDrop 2000 SpectrophotometerThermoFisherND-2000
TURBO DNA-free KitThermoFisherAM1907
EZ-Link HPDP BiotinThermoFisherCat# 21341
ThiolutinAbcamab143556
µMACS Streptavidin kitMiltenyi BiotecCat# 130-074-101
Transcriptor Reverse TranscriptaseRoche03 531 295 001
SYBR Green I MasterRoche4707516001
GeneChip Yeast Genome 2.0ThermoFisher900555
GeneChip Fluidics Station 450ThermoFisher00-0079
GeneChip Scanner 3000 7GThermoFisher00-0210

References

  1. Gardini, A. Global Run-On Sequencing (GRO-Seq). Methods in Molecular Biology. 1468, 111-120 (2017).
  2. Churchman, L. S., Weissman, J. S. Nascent transcript sequencing visualizes transcription at nucleotide resolution. Nature. 469 (7330), 368-373 (2011).
  3. Churchman, L. S., Weissman, J. S. Native elongating transcript sequencing (NET-seq). Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 4 Unit 4 11-17 (2012).
  4. Cleary, M. D., Meiering, C. D., Jan, E., Guymon, R., Boothroyd, J. C. Biosynthetic labeling of RNA with uracil phosphoribosyltransferase allows cell-specific microarray analysis of mRNA synthesis and decay. Nature Biotechnology. 23 (2), 232-237 (2005).
  5. Dolken, L., et al. High-resolution gene expression profiling for simultaneous kinetic parameter analysis of RNA synthesis and decay. RNA. 14 (9), 1959-1972 (2008).
  6. Kenzelmann, M., et al. Microarray analysis of newly synthesized RNA in cells and animals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (15), 6164-6169 (2007).
  7. Radle, B., et al. Metabolic labeling of newly transcribed RNA for high resolution gene expression profiling of RNA synthesis, processing and decay in cell culture. Journal of Visualized Experiments. (78), e50195(2013).
  8. Schwalb, B., et al. Measurement of genome-wide RNA synthesis and decay rates with Dynamic Transcriptome Analysis (DTA). Bioinformatics. 28 (6), 884-885 (2012).
  9. Sun, M., et al. Global analysis of eukaryotic mRNA degradation reveals Xrn1-dependent buffering of transcript levels. Molecular Cell. 52 (1), 52-62 (2013).
  10. Sun, M., et al. Comparative dynamic transcriptome analysis (cDTA) reveals mutual feedback between mRNA synthesis and degradation. Genome Research. 22 (7), 1350-1359 (2012).
  11. Miller, C., et al. Dynamic transcriptome analysis measures rates of mRNA synthesis and decay in yeast. Molecular Systems Biology. 7, 458(2011).
  12. Munchel, S. E., Shultzaberger, R. K., Takizawa, N., Weis, K. Dynamic profiling of mRNA turnover reveals gene-specific and system-wide regulation of mRNA decay. Molecular Biology of the Cell. 22 (15), 2787-2795 (2011).
  13. Eser, P., et al. Determinants of RNA metabolism in the Schizosaccharomyces pombe genome. Molecular Systems Biology. 12 (2), 857(2016).
  14. Baptista, T., et al. SAGA Is a General Cofactor for RNA Polymerase II Transcription. Molecular Cell. 68 (1), 130-143 (2017).
  15. Bonnet, J., et al. The SAGA coactivator complex acts on the whole transcribed genome and is required for RNA polymerase II transcription. Genes & Development. 28 (18), 1999-2012 (2014).
  16. Warfield, L., et al. Transcription of Nearly All Yeast RNA Polymerase II-Transcribed Genes Is Dependent on Transcription Factor TFIID. Molecular Cell. 68 (1), 118-129 (2017).
  17. Huisinga, K. L., Pugh, B. F. A genome-wide housekeeping role for TFIID and a highly regulated stress-related role for SAGA in Saccharomyces cerevisiae. Molecular Cell. 13 (4), 573-585 (2004).
  18. Lee, T. I., et al. Redundant roles for the TFIID and SAGA complexes in global transcription. Nature. 405 (6787), 701-704 (2000).
  19. Lenstra, T. L., et al. The specificity and topology of chromatin interaction pathways in yeast. Molecular Cell. 42 (4), 536-549 (2011).
  20. Plaschka, C., et al. Architecture of the RNA polymerase II-Mediator core initiation complex. Nature. 518 (7539), 376-380 (2015).
  21. Helenius, K., et al. Requirement of TFIIH kinase subunit Mat1 for RNA Pol II C-terminal domain Ser5 phosphorylation, transcription and mRNA turnover. Nucleic Acids Research. 39 (12), 5025-5035 (2011).
  22. Rodriguez-Molina, J. B., Tseng, S. C., Simonett, S. P., Taunton, J., Ansari, A. Z. Engineered Covalent Inactivation of TFIIH-Kinase Reveals an Elongation Checkpoint and Results in Widespread mRNA Stabilization. Molecular Cell. 63 (3), 433-444 (2016).
  23. Haimovich, G., et al. Gene expression is circular: factors for mRNA degradation also foster mRNA synthesis. Cell. 153 (5), 1000-1011 (2013).
  24. Haruki, H., Nishikawa, J., Laemmli, U. K. The anchor-away technique: rapid, conditional establishment of yeast mutant phenotypes. Molecular Cell. 31 (6), 925-932 (2008).
  25. Neymotin, B., Athanasiadou, R., Gresham, D. Determination of in vivo RNA kinetics using RATE-seq. RNA. 20 (10), 1645-1652 (2014).
  26. Shetty, A., et al. Spt5 Plays Vital Roles in the Control of Sense and Antisense Transcription Elongation. Molecular Cell. 66 (1), 77-88 (2017).
  27. Xu, Y., et al. Architecture of the RNA polymerase II-Paf1C-TFIIS transcription elongation complex. Nature Communications. 8, 15741(2017).
  28. Adelman, K., Lis, J. T. Promoter-proximal pausing of RNA polymerase II: emerging roles in metazoans. Nature Reviews. Genetics. 13 (10), 720-731 (2012).
  29. Nojima, T., Gomes, T., Carmo-Fonseca, M., Proudfoot, N. J. Mammalian NET-seq analysis defines nascent RNA profiles and associated RNA processing genome-wide. Nature Protocols. 11 (3), 413-428 (2016).
  30. Storvall, H., Ramskold, D., Sandberg, R. Efficient and comprehensive representation of uniqueness for next-generation sequencing by minimum unique length analyses. PloS One. 8 (1), 53822(2013).
  31. Tani, H., et al. Identification of hundreds of novel UPF1 target transcripts by direct determination of whole transcriptome stability. RNA Biology. 9 (11), 1370-1379 (2012).
  32. Tani, H., et al. Genome-wide determination of RNA stability reveals hundreds of short-lived noncoding transcripts in mammals. Genome Research. 22 (5), 947-956 (2012).
  33. Jao, C. Y., Salic, A. Exploring RNA transcription and turnover in vivo. by using click chemistry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15779-15784 (2008).
  34. Palozola, K. C., et al. Mitotic transcription and waves of gene reactivation during mitotic exit. Science. 358 (6359), 119-122 (2017).
  35. Ardehali, M. B., et al. Polycomb Repressive Complex 2 Methylates Elongin A to Regulate Transcription. Molecular Cell. 68 (5), 872-884 (2017).
  36. Schulz, D., et al. Transcriptome surveillance by selective termination of noncoding RNA synthesis. Cell. 155 (5), 1075-1087 (2013).
  37. Barrass, J. D., et al. Transcriptome-wide RNA processing kinetics revealed using extremely short 4tU labeling. Genome Biology. 16, 282(2015).
  38. Duffy, E. E., et al. Tracking Distinct RNA Populations Using Efficient and Reversible Covalent Chemistry. Molecular Cell. 59 (5), 858-866 (2015).
  39. Rutkowski, A. J., Dolken, L. High-Resolution Gene Expression Profiling of RNA Synthesis, Processing, and Decay by Metabolic Labeling of Newly Transcribed RNA Using 4-Thiouridine. Methods in Molecular Biology. 1507, 129-140 (2017).
  40. Darzacq, X., et al. In vivo dynamics of RNA polymerase II transcription. Nature Structural & Molecular Biology. 14 (9), 796-806 (2007).
  41. Fuchs, G., et al. Simultaneous measurement of genome-wide transcription elongation speeds and rates of RNA polymerase II transition into active elongation with 4sUDRB-seq. Nature Protocols. 10 (4), 605-618 (2015).
  42. Singh, J., Padgett, R. A. Rates of in situ transcription and splicing in large human genes. Nature Structural & Molecular Biology. 16 (11), 1128-1133 (2009).
  43. Schwalb, B., et al. TT-seq maps the human transient transcriptome. Science. 352 (6290), 1225-1228 (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

140 4

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved