使用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳人的MxA多亚基蛋白复合物的表征

This article describes a simple and rapid protocol to evaluate the oligomeric state of the dynamin-like GTPase MxA protein from lysates of human cells using a combination of non-denaturing PAGE with western blot analysis.

The formation of oligomeric complexes is a crucial prerequisite for the proper structure and function of many proteins. The interferon-induced antiviral effector protein MxA exerts a broad antiviral activity against many viruses. MxA is a dynamin-like GTPase and has the capacity to form oligomeric structures of higher order. However, whether oligomerization of MxA is required for its antiviral activity is an issue of debate. We describe here a simple protocol to assess the oligomeric state of endogenously or ectopically expressed MxA in the cytoplasmic fraction of human cell lines by non-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) in combination with Western blot analysis. A critical step of the protocol is the choice of detergents to prevent aggregation and/or precipitation of proteins particularly associated with cellular membranes such as MxA, without interfering with its enzymatic activity. Another crucial aspect of the protocol is the irreversible protection of the free thiol groups of cysteine residues by iodoacetamide to prevent artificial interactions of the protein. This protocol is suitable for a simple assessment of the oligomeric state of MxA and furthermore allows a direct correlation of the antiviral activity of MxA interface mutants with their respective oligomeric states.

蛋白质的四级结构起着许多细胞过程至关重要的作用。信号通路，基因表达，和酶的激活/停用所有依赖蛋白复合物^1-4的正确组装。这个过程也被称为均聚物或杂低聚是由于不可逆的共价的或可逆的静电和疏水蛋白 - 蛋白相互作用。低聚不仅多样化的不同的细胞过程，而不增加基因组的大小，而且还提供了策略蛋白质来构建稳定的复合物是对变性和降解⁵更耐。在低聚缺陷对蛋白质的功能产生影响，并可能导致疾病的发展。例如，酶苯丙氨酸羟化酶形成四聚体复合物。蛋白质复合物内的一些突变可以削弱四聚体的形成，并导致该疾病苯丙酮尿症^6。

人MxA蛋白是干扰素（IFN）诱导的抗病毒效应蛋白施加对抗各种RNA的一个广泛的抗病毒活性以及DNA病毒^7。它属于dynamin上样大GTP酶超家族，并具有在体外形成^8个大寡聚结构的能力。齐聚已建议，以保护从MxA蛋白快速降解^9,10。尽管许多研究小组加紧努力，作用的分子机制在很大程度上仍然难以捉摸和的MxA为它的抗病毒功能齐聚国家的作用正在辩论^9,11,12。在这方面，高和同事提出，其中的MxA通过在大环状寡聚结构¹¹的形式的病毒核蛋白相互作用而发挥其抗病毒活性的模型。然而，最近，我们证明了MxA蛋白二聚体具有抗病毒活性，流感病毒¹²的核蛋白进行交互。乙ASED上的MxA的晶体结构，高和同事鉴定在这对于其在体外低聚和其抗病毒功能^11,13临界界面区域几个氨基酸残基。因此，为了阐明它的MxA的寡聚状态发挥抗病毒活性，我们试图建立一个简单的协议，以快速地确定在人类细胞中表达以及内源的MxAIFNα刺激之后表达的MxA界面突变体的oligmeric状态。

虽然有通常用于研究蛋白质之间的相互作用，如分割绿色荧光蛋白的许多技术（分割-GFP）互补实验^14，表面等离子体共振¹⁵和荧光共振能量转移^{（FRET）16，}它们不提供寡聚蛋白复合物的精确化学计量的信息。此特定方面的调查，技术如多角度光散射^（MALS）17和分析超速离心¹⁸是非常有用的。通常，使用这些方法分析的蛋白质是纯化的蛋白质。低聚方法还可能依赖于其他细胞因子。如果这些因素都是未知的，所述分析是比较困难的。此外，一些蛋白质难以在大肠杆菌表达大肠杆菌和净化。因此，这些方法都没有来分析在蜂窝环境蛋白低聚的最佳选择。此外，这些技术需要昂贵的仪器这是不容易获得的。

非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE），大小排阻层析或化学交联，随后通过常规的十二烷基硫酸钠（SDS）-PAGE是用于从细胞裂解物^2,19,20形成低聚物的特征的有用工具。这些方法不需要专门的设备，并且可以是容易的performed在标准实验室。我们最初评价为不变地导致非特异性聚集和MxA蛋白的沉淀的各种化学交联的协议。因此，我们接下来要测试的非变性PAGE协议。非变性PAGE中排除使用SDS，和蛋白质的迁移取决于其天然电荷。蓝变性PAGE使用考马斯亮蓝G250加载蛋白质具有整体负电荷，类似于SDS，但不使蛋白质变性^21。不幸的是，考马斯在高盐和通常包括在裂解缓冲液的二价阳离子（ 如 Mg ^2+离子 ）的存在下艳蓝沉淀。根据所使用的缓冲液中，可能难以分析未经可能对所述寡聚蛋白复合物的作用的步骤进一步优化的样本。

在这里，我们提出了基于以前出版的方法²²来确定齐聚一个简单的协议使用非变性PAGE蜂窝裂解物衍生的人MxA蛋白。

注意:此协议是基于以前出版的非变性PAGE协议^12。在该研究中，MxA蛋白的寡聚状态使用或Vero细胞过表达的MxA或IFN-α刺激的A549细胞表达内源性的MxA进行了评估。下面描述的协议可以用来分析除了的MxA任何蛋白质的寡聚状态。然而，可能需要进一步优化。

1.细胞裂解物的制备非变性PAGE

注意:为了分析在任一的Vero或A549细胞的人MxA蛋白的寡聚状态，收获1.0×10 ^6个细胞。取决于细胞类型或分析蛋白质的丰度，细胞数应调整。同样重要的是要尽快光敏碘乙酰胺加入保护裂解缓冲液从曝光。

1. 每孔种0.3×10 ^6个 A549或Vero细胞中6良好的菜肴。保持在每孔2mL的生长培养基中的细胞（ 见表1）。过夜孵育细胞在细胞培养孵育箱（37℃，5％CO _2）。
2. 收获洗涤的细胞用1ml磷酸盐缓冲盐水（PBS），并通过加入0.5ml 0.25％的胰蛋白酶 - 乙二胺四乙酸（EDTA），在室温下大约5分钟，1倍溶液分离。
3. 一旦细胞从培养皿分离，将0.5ml生长培养基中并通过上下抽吸小心混合。
4. 传送每个细胞以及成1个2毫升管，并用台式离心机（5000 xg离心，4℃，5分钟）沉淀它们。
5. 小心取出吹打上清，而不会干扰细胞沉淀。
6. 通过仔细吹打细胞悬液上下洗涤细胞用1ml冰冷的PBS。
7. 沉淀细胞在台式离心机（5000 xg离心，4℃，5分钟）。
8. 仔细吹打无线除去上清液thout分离细胞沉淀。
9. 悬浮细胞在200μl冰冷的裂解缓冲液（ 见表1）通过上下吹打和置于冰上。
10. 随即，用锡纸孵育冰30分钟覆盖管保护裂解液由轻。
    注:在冰上孵育30分钟后，它不再是必须保护溶解物从曝光中，由于游离硫醇基团的保护是不可逆的。
11. 通过离心在预冷的台式离心机（13,000 xg离心，4℃，20分钟）除去细胞碎片。
12. 在期间离心步骤冷室于4℃20分钟平衡在透析缓冲液（ 见表1）的透析列。使用列与切断10,000的分子量。
    1. 附加列一个浮动浮标，并把它们放入装有透析缓冲液的烧杯中。以确保温和搅拌，使用磁力搅拌器。不要触摸膜。
       注:Dialys被列能够购买或者根据由菲亚拉和同事¹⁹中描述的协议由1.5毫升管制备。
13. 从透析缓冲和浮子浮标删除的列。转移清除裂解物到准备透析柱通过移液而不触及该膜。附加列一个浮动浮标，并把它们放回装满透析缓冲液中。
14. 在4℃下透析含有冰冷透析缓冲液（ 表1）为至少4小时（或优选过夜）的烧杯中的溶胞产物，同时用磁力搅拌器小心搅拌。使用至少百毫升透析缓冲液200微升溶胞产物。
15. 的透析样品转移到1.5ml试管。在台式离心机（13,000 xg离心，4℃，20分钟）除去通过离心沉淀。为了防止寡聚蛋白复合物继续透析后，立即协议（第2节）的解离。不冻结准备裂解液。

2.电泳

与一些修改²²之前的描述进行电泳:注意。在下面描述的协议中，使用预制梯度凝胶（4-15％梯度）。或者，该凝胶可以在实验室制备。它排除任何变性剂如SDS防止寡聚蛋白复合物的离解是非常重要的。电泳时间为人类MxA蛋白的不同寡聚状态进行了优化。然而，它可根据低聚复合物的大小以及是应该可以实现分析复杂的分离范围为其它蛋白质而异。因此，电泳的最佳时间应根据经验确定。对于待分析的低聚物的最佳分辨率的电流不超过25毫安。

1. 装配在凝胶室中的非变性PAGE凝胶上。填写ŧ他内部和外部腔室预冷运转缓冲液（ 表1）。
2. 在每凝胶25毫安为在冷室于4℃15分钟运行前预冷运转缓冲凝胶。
3. 混合15微升如上制备的裂解物的4倍样品缓冲液5微升（ 表1）。不要煮沸的样本。
4. 装载样品15微升，并在凝胶上选择的天然蛋白质的标准。在寒冷的房间在4℃运行在25毫安凝胶4小时。
   注:对于半定量分析，蛋白质定量协议（ 例如 Bradford蛋白测定^23）可以确保等量每个泳道的总蛋白加载执行。

3.免疫印迹

注意:下面描述的是一个湿印迹系统的协议。任何印迹膜都可以使用。激活聚偏二氟乙烯（PVDF）膜在100％甲醇平衡之前在印迹的buf外汇储备。在半干印迹技术可以替代地使用，但已经为大型寡聚物进行优化。

1. 拆开凝胶小心地转移到SDS缓冲液（ 表1）。
2. 孵育在室温下10分钟，同时轻轻地摇动。
3. 准备2海绵，4-纤维素滤纸片及每凝胶印迹膜。浸泡其中在印迹缓冲液（ 表1）。
4. 组装夹心如下（底部到顶部）:1海绵，2-纤维素滤纸片材，膜，凝胶，2-纤维素滤纸片，1海绵。
5. 把三明治切成印迹坦克。确保该膜面对正极而凝胶面向负极。
6. 填充预冷印迹缓冲器中的印迹罐。
7. 在90毫安吸干过夜4°C的最佳蛋白转移的结果。
8. 拆开夹层，并在Ponc孵育膜显现蛋白质标准淡溶液，在室温下5分钟。
9. 退色通过仔细洗去丽春红用去离子水，直到你可以清楚的看到蛋白质标准的带膜。
10. 用标记笔的标准蛋白的条带。
    注:残余丽春S能与免疫干扰。为了避免这种情况，该膜可以进一步孵育在0.1M的NaOH脱色1分钟和随后的洗涤，用去离子水。
11. 方框与封闭缓冲液的膜（ 见表1），在室温下至少1小时或过夜，在4℃。
12. 通过使用针对该蛋白的抗体进行分析免疫染色可视化的目的蛋白（多个）。
    注:在封闭缓冲液（ 表1）1000:人MxA蛋白用特异于人MX1的兔多克隆抗体可视稀释1。抗体溶液在4℃温育过夜。可替代地，单克隆一个NTI-MxA蛋白抗体（克隆143）可用于（数据未示出^）24。

使用非变性PAGE，我们分析了人野生型MxA蛋白，二聚体界面突变体的MxA（R640A）和MxA蛋白（L617D），以及从细胞裂解物¹²单体界面突变体的MxA（M527D）的寡聚状态。细胞在含有1％辛基苯氧基（NP-40）和碘乙酰胺，以确保蛋白质溶解和游离的巯基的保护缓冲液中裂解（参见图1）。如前所述，盐和小代谢物通过透析¹⁹除去。蛋白分离是通过非变性PAGE进行。促进有效免疫印迹，将凝胶在SDS缓冲液印迹之前温育。所述的MxA蛋白通过使用针对的MxA一兔多克隆抗体的免疫染色可视化。工作流在图2中说明。

从IFN-α比较内源性人MxA蛋白的寡聚状态 ;刺激的A549细胞中，我们转染Vero细胞（缺乏内源性的MxA）用重组野生型，单体和二聚体的MxA变体。这些重组野生型相比，未染色天然蛋白质标记（ 图3A）时单体和二聚体的MxA变形成稳定的四聚体，分别单体和二聚体，。因此，我们使用这些重组蛋白，以评估从IFN-α衍生内源人MxA蛋白的寡聚状态刺激的A549细胞。 图3B表明的MxA在IFN-α刺激的A549细胞裂解物的大小对应于一个四聚体。

两者合计，我们描述了一种方法，以确定从细胞裂解物的人MxA蛋白的寡聚状态。我们的非变性PAGE方法还可以用于评估其他寡聚蛋白复合物的寡聚状态。

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图1:碘乙酰胺的结构与反应方案碘乙酰胺不可逆通过形成硫醚键保护的游离半胱氨酸硫醇基团。从与半胱氨酸的硫原子碘的亲核取代这种稳定的修改结果。 请点击此处查看该图的放大版本。

图 2: 流程非变性PAGE的图细胞裂解物的非变性PAGE方法的一个系统的表示。在细胞裂解，洗涤剂溶解的蛋白质和硫醇基被碘乙酰胺保护，以防止蛋白聚集。透析除去小的代谢物和盐，可以与非变性PAGE干扰 19。复杂的分离非变性条件下进行。低聚复合物的检测是由Western印迹随后染色来实现的。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3:使用非变性PAGE和Western印迹人MxA蛋白的寡聚状态的测定 （A）重组的MxA变异体在Vero细胞异位表达。野生型的MxA（四）接口突变的MxA的（R640A）的复合物，MxA蛋白（L617D）（二聚体）和MxA蛋白（M527D）迁移在其预期的分子量，确认其寡聚状态。 （B）中的A549细胞用每ml的IFN-α1000 IU刺激诱导的MxA表达。内源性的MxA SHOWS对应于四聚体形式带。 请点击此处查看该图的放大版本。

表 1: 非变性PAGE需要缓冲食谱。

在这里，我们描述一个简单的方法，它允许通过非变性PAGE，随后通过Western印迹分析在哺乳动物细胞中表达的蛋白质的寡聚状态的快速测定。这种方法的主要优点是，一个给定的蛋白的寡聚状态可以从没有事先的蛋白质纯化全细胞裂解物来确定。这可能是对于低聚或发挥它们的相关联功能的辅助因子蛋白重要。此外，该蛋白仍然在其天然状态，如果进一步从凝胶中提取，酶活性或其它蛋白质的功能可以被确定和相关的寡聚状态。

该协议的一个重要方面是洗涤剂样品制备过程中的选择。这是特别重要的用于与细胞膜相关的蛋白质。 MxA蛋白似乎与滑面内质网²⁵的膜进行相关的主要。对于细胞裂解的非离子型洗涤剂NP40是最佳的，防止MxA蛋白的沉淀。缓冲液交换和去除的透析的裂解物的低分子量杂质之后如先前¹⁹描述的0.1％3的存在下- [（3-胆酰胺丙基）二甲氨基]需要-1-丙烷（CHAPS）中，以防止凝胶中的MxA的沉淀电泳。此外，CHAPS不与MxA蛋白的酶活性干扰与在大肠杆菌中表达的纯化的重组MxA蛋白测定大肠杆菌 ^12。它是该洗涤剂不变性蛋白质或裂解过程中破坏蛋白质 - 蛋白质相互作用的重要性。非变性去污剂，例如NP40，Octoxinol 9，毛地黄皂苷和CHAPS适于溶解。洗涤剂及其浓度的选择应根据经验确定。洗涤剂也可能影响，例如对某些检测洗涤剂必须是下游实验除去其与CHAPS通过透析容易实现，但不与Octoxinol 9 ^26。

由于所描述的方法分析来自细胞裂解物的非变性条件下的蛋白质中，所需的蛋白质没有事先纯化。这是一个优点，因为重组蛋白的纯化有时需要缓冲的优化通过加入高盐和其它添加剂，以防止蛋白质从聚集或沉淀。然而，这些添加剂和高盐浓度可能具有对可能不一定像其自然状态的蛋白质的低聚合产生影响。尤其是在人的MxA蛋白的情况下，盐浓度和核苷酸的存在下发挥更高的低聚状态²⁷的形成至关重要的作用。在细胞裂解物，蛋白质更容易稳定，因为蜂窝稳定因素仍然存在。因此它可以分析公关多种细胞生理条件下otein络合物（ 例如生理食盐浓度和pH值）。对于其他蛋白质形成的低聚物，例如用于结构相关MXB或dynamin上⁸该协议也应适用。

协议的另一个重要方面是游离的巯基的保护，以防止溶解（ 图1）中的细胞质蛋白的人工二硫桥的形成。最初的实验表明，加入1,4-二硫苏糖醇（DTT）或β-巯基乙醇的是不足以防止样品制备过程中的人工二硫键的形成。既还原剂保护的硫醇基团可逆的形成二硫键。这种可逆的保护可能不足以永久保护所有硫醇基团。在MxA蛋白的情况下，这将导致该蛋白质的不可逆的聚集。然而，加入碘乙酰胺的那irrevers从用DTT处理过的溶胞产物相比的MxA时ibly保护半胱氨酸大大降低了MxA蛋白的聚集。此外，从MxA蛋白表达的哺乳动物细胞制备的裂解物的碘乙酰胺处理对免疫沉淀的MxA的GTP酶的活性没有影响的游离硫醇基团（数据未示出）。

在低聚物原聚体的数目的精确测定其他关键的考虑是聚丙烯酰胺浓度范围的选择，以及蛋白质分子量参考。的聚丙烯酰胺浓度的范围应首先建立允许在低聚物的预期分子量条带的最大分离。非变性PAGE不含任何SDS。缺乏SDS，电荷，分子量和蛋白质的形状决定了它的电泳迁移率。因此，该蛋白质分子量标记物的选择是至关重要的。理想的情况下，分子量参考将芳与已知的低聚状态感兴趣的蛋白质的ecombinant纯化形式。由于这不是总是可用的，应该使用非变性或天然蛋白质标记。自MxA蛋白已被证明与其它细胞蛋白如UAP56或Thogotovirus病毒核蛋白相关联，拉克罗斯病毒或流感病毒^12,28-30，我们还通过使用特异性抗体是否UAP56或甲型流感核蛋白将共同分离的免疫染色测试与在非变性的PA凝胶的MxA。然而，我们发现的MxA异低聚物形成的证据。这可能是由于这样的事实的MxA-UAP56和MxA蛋白-核蛋白相互作用是低亲和力^12,24的。此外，MxA蛋白与UAP56或病毒核蛋白相关联的分数可能是非常低的，因此难于用这种方法来检测。

此外，考虑到在蛋白质的pKa要分析是很重要的。在所描述的非代纳uring PAGE协议，该蛋白通过电泳在pH 8.3分离。大部分蛋白质在该pH带负电荷。然而，基本的蛋白质表现出在pH 8.3的正净电荷，因此将运行到相反的方向。因此，重要的是，对于基本蛋白质的分析来调整运行缓冲液的pH，以确保整体负电荷的蛋白质。

两者合计我们在这里提出了在哺乳动物细胞中表达的蛋白质的寡聚状态的快速评估的协议，而不需要事先纯化。

The authors have nothing to disclose.

This work was funded by a Grant from the Swiss National Science foundation (Grant nr. 31003A_143834) to JP.