تسخير قوة شحنات الحمض النووي الريبي الصغير في حويصلات صغيرة خارج الخلية يتم إطلاقها من أقسام الدماغ البشري المجمدة حديثا

هنا ، نضع بروتوكولا باستخدام كميات قليلة من أقسام أنسجة المخ المجمدة حديثا وطريقة طرد مركزي عالية السرعة يمكن الوصول إليها إلى جانب كروماتوغرافيا استبعاد الحجم للحصول على حويصلات صغيرة خارج الخلية كمصادر للمؤشرات الحيوية microRNA (miRNA) للاضطرابات العصبية.

تعتبر الحويصلات الصغيرة خارج الخلية (sEVs) وسطاء حاسمين للاتصال بين الخلية والخلية ، حيث تنقل شحنات متنوعة مثل البروتينات والدهون والأحماض النووية (microRNA و mRNA و DNA). تتمتع شحنة microRNA sEV بفائدة محتملة كمؤشر حيوي قوي غير جراحي للأمراض نظرا لقدرة sEV على اجتياز الحواجز البيولوجية (على سبيل المثال ، الحاجز الدموي الدماغي) ويمكن الوصول إليها من خلال سوائل الجسم المختلفة. على الرغم من العديد من الدراسات حول المؤشرات الحيوية sEV في سوائل الجسم ، إلا أن تحديد الأنسجة أو المجموعات السكانية الفرعية الخاصة بالخلايا sEV لا يزال يمثل تحديا ، خاصة من الدماغ. تعالج دراستنا هذا التحدي من خلال تكييف الأساليب الحالية لعزل المركبات الكهربائية الصغيرة من كميات قليلة من أقسام الدماغ البشري المجمدة باستخدام كروماتوغرافيا استبعاد الحجم (SEC).

بعد الموافقة الأخلاقية ، تم تقطيع ما يقرب من 250 ميكروغرام من أنسجة المخ البشرية المجمدة حديثا (التي تم الحصول عليها من بنك مانشستر للدماغ [المملكة المتحدة]) من 3 أنسجة مانحة واحتضانها في محلول الكولاجيناز من النوع 3 / Hibernate-E ، مع التحريك الوسيط ، متبوعا بخطوات الطرد المركزي والترشيح التسلسلي. بعد ذلك ، تم عزل sEVs باستخدام طريقة SEC وتميزت باتباع إرشادات MISEV. قبل عزل الحمض النووي الريبي من داخل هذه sEVs ، تمت معالجة المحلول باستخدام Proteinase-K و RNase-A لإزالة أي RNA خارج الخلية غير sEV. تم فحص كمية وجودة الحمض النووي الريبي ومعالجتها بشكل أكبر لتجارب تسلسل qPCR والحمض النووي الريبي الصغير.

تم تأكيد وجود sEVs من خلال تحليل تتبع الجسيمات النانوية الفلورية (fNTA) واللطخة الغربية لعلامات السطح (CD9 ، CD63 ، CD81). تم تأكيد توزيع الحجم (50-200 نانومتر) بواسطة NTA والفحص المجهري الإلكتروني. تراوح تركيز الحمض النووي الريبي الإجمالي داخل sEVs المحللة من 3-9 نانوغرام / ميكرولتر وتم استخدامه للقياس الكمي بنجاح بواسطة qPCR للميكرو RNAs المرشحة المختارة. قدم تسلسل الحمض النووي الريبي الصغير على MiSeq بيانات عالية الجودة (Q >32) مع 1.4-5 مليون قراءة لكل عينة.

تتيح هذه الطريقة عزلا وتوصيفا فعالا للمركبات الكهربائية من الحد الأدنى من أحجام أنسجة المخ ، مما يسهل أبحاث المؤشرات الحيوية غير الغازية ويبشر بدراسات المؤشرات الحيوية العادلة للمرض ، وتقديم رؤى حول الأمراض التنكسية العصبية والاضطرابات الأخرى المحتملة.

الحويصلات خارج الخلية (EVs) هي واحدة من اللاعبين الرئيسيين في الاتصال بين الخلايا في جميع الكائنات متعددة الخلايا¹. EVs عبارة عن جزيئات غشائية ثنائية الطبقة دهنية مشتقة من الخلايا يمكن أن تسهل نقل مجموعة متنوعة من أحمال البضائع ، مثل البروتينات والدهون والأحماض النووية ، إلى الخلايا المتلقية. يمكن أن يكون للمركبات الكهربائية نطاق حجم واسع يتراوح من 30 نانومتر إلى 1 ميكرومتر<. لذلك ، فقد تورطوا في انتشار وتفاقم الأمراض التنكسية العصبية وحالات أخرى مثل مرض الزهايمر (AD) والخرف الجبهي الصدغي (FTD) ومرض باركنسون (PD) والسرطانات^2،3. علاوة على ذلك ، نظرا لأنه يمكن العثور على المركبات الكهربائية المركبة في مجموعة من السوائل الحيوية مثل الدم والسائل النخاعي (CSF) واللعاب وحتى البول ، فإن استخدامها المفيد يمكن أن يمتد إلى مجال المؤشرات الحيوية والتشخيصات غير الغازية. على سبيل المثال ، قد تشير أبحاث AD إلى استخدام نسب البروتين الممرض للسوائل الحيوية ، مثل tau / Aβ ، أو حتى Aβ₄₂ / Aβ₄₀⁴.

إحدى الشحنات المعروفة من sEVs هي microRNA (miRNA) ، وهي مجموعة من جزيئات الحمض النووي الريبي الصغيرة غير المشفرة التي يبلغ طولها حوالي 22 نيوكليوتيد والتي ترتبط بمناطق 3'-UTR من mRNA وعادة ما تنظم سلبا تعبير البروتين. تشارك miRNAs في العديد من الأدوار الخلوية ، كما أنها متورطة في التسبب في الأمراض المختلفة ، بما في ذلك السرطانات والأمراض التنكسية العصبية. أجرى Cheng et al. تحليل تسلسل عالي الإنتاجية لتوقيعات تعبير sEV miRNA المشتقة من المصل من مرضى AD⁵. بمجرد أن يقترن بسجلات التصوير العصبي وعوامل الخطر المعروفة للعمر والجنس وعرض أليل APOE ε4 ، وجد أن النتائج تتنبأ بمرض الزهايمر بحساسية 87٪ وخصوصية 77٪. علاوة على ذلك ، حددت الأبحاث اثنين من miRNAs السائل الدماغي النخاعي (miR-151a-3p ، let-7f-5p) و 3 miRNAs منخفضة التنظيم (miR-27a-3p ، miR-125a-5p و miR-423-5p) التي يمكن أن تشخص المرحلة المبكرة من PD⁶. مع الأمراض المرضية ، قد تسبق الحالة المرضية بعض الأعراض المميزة للأمراض ، بينما في التنكس العصبي ، يحدث تراكم السمات المميزة المرضية في وقت أبكر بكثير من التدهور المعرفي.

من المحتمل أن تكون MicroRNAs مؤشرا حيويا أكثر فعالية من البروتينات ، نظرا لوظائفها المتنوعة ، وتنظيمها اللاجيني عالي الترتيب. باستخدام أنسجة المخ ، يمكن للباحثين تحديد توقيعات miRNA محددة مشتقة من الدماغ (BDsEV) للأمراض وأنواعها الفرعية. على سبيل المثال ، يمكن أن تقدم sevs ذات العلامات العصبية والدبقية شحنة miRNA مختلفة ، ويمكن أن يؤدي التحليل إلى طرق أكثر دقة للكشف عن المرض. علاوة على ذلك ، يقترح أن تلعب BDsEVs دورا كبيرا في الانتشار عبر المشابك للبروتينات المسببة للأعصاب⁷. اقترحت التقارير السابقة الترسيب المناعي وتدرج الكثافة (تدرج السكروز) الطرد المركزي الفائق للحصول على مركبات كهربائية من أنسجة المخ المجمدة^{حديثا 8،9}. ومع ذلك ، تتطلب هذه الأساليب بنية تحتية محددة مع طرق الطرد المركزي الفائق والتنقية النهائية للحصول على عينات sEV عالية^{الجودة 10}. واقترحت التقارير الأحدث عدة تعديلات وتحسينات على النهج^11،12،13; ومع ذلك ، على الرغم من ذلك ، لا يزال عزل ودراسة الحمض النووي الريبي الميكرو المشتق من sEV من الأنسجة البشرية غير مطبق على نطاق واسع. يهدف النهج الموصوف في هذا البروتوكول إلى توفير بروتوكول مكرر خطوة بخطوة لدراسة sev المشتقة من الدماغ لتعزيز إمكانية الوصول إلى هذه التقنية. أنشأنا بروتوكولا باستخدام كميات قليلة من أنسجة المخ ، حيث عزلنا المركبات الكهربائية النقية باستخدام كروماتوغرافيا استبعاد الحجم وعرضنا بيانات تسلسل عالية الجودة من الجيل التالي من شحنة الحمض النووي الريبي الصغير لهذه المركبات الكهربائية.

تمت الموافقة على العمل أخلاقيا من قبل بنك مانشستر للدماغ (مرجع REC 09 / H0906/52) ومن قبل لجنة الأخلاقيات في جامعة سالفورد (معرف التطبيق: 3408).

1. انهيار المصفوفة داخل الخلايا باستخدام الكولاجيناز على أقسام أنسجة المخ المجمدة

1. قم بتقطيع 250 مجم من أنسجة المخ المجمدة إلى شرائح رفيعة (شظايا بسمك حوالي 0.4 مم) باستخدام مشرط معقم على طبق بارد وأضف 2 مل من محلول الكولاجيناز من النوع الثالث / السبات 75 U / m.
2. احتضان كل عينة في حمام مائي عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. عند نقطة 5 دقائق ، اقلب كل عينة مرتين للخلط ؛ عند نقطة 10 دقائق، قم بعمل ماصة كل عينة ثلاث مرات برفق باستخدام شريط بلاستيكي قابل للتصرف سعة 10 مل.
3. ضع كل عينة على الثلج وأضف 1x كوكتيل مثبط البروتياز و 1x مثبط الفوسفاتيز. هذا يوقف تفاعل الإنزيم وهو نقطة نهاية الهضم باستخدام الكولاجيناز من النوع الثالث.
4. جهاز الطرد المركزي لكل عينة من أنسجة المخ عند 300× جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. اجمع كل مادة طافية وأجهزة طرد مركزي أخرى عند 2000 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
5. اجمع كل مادة طافية مرة أخرى وقم بالتصفية من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر. جهاز طرد مركزي كل مرشح عند 10 000 × جم لمدة 48 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
6. اجمع المادة الطافية وأضف المخزن المؤقت لهطول الأمطار بنسبة 2: 1 لكل عينة. احتضان طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
7. جهاز الطرد المركزي لكل عينة عند 10 000 × غرام لمدة 96 دقيقة عند 4 درجات مئوية وإعادة تعليق الحبيبات في 100 ميكرولتر من PBS الخالي من الحويصلة خارج الخلية (EV).

2. إعداد أعمدة الكروماتوغرافيا لاستبعاد الحجم

1. قبل الاستخدام ، قم بموازنة عمود SEC المعد مسبقا في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 15 دقيقة.
   ملاحظة: يجب إزالة الغطاء السفلي قبل الغطاء اللولبي.
2. بعد التوازن ، قم بإزالة المخزن المؤقت للمادة الحافظة من أعلى العمود واغسل العمود مرتين باستخدام 250 ميكرولتر من PBS الخالي من EV. يتم ترك كل غسل PBS لدخول العمود من خلال الجاذبية.

3. عزل الحويصلات الصغيرة خارج الخلية باستخدام كروماتوغرافيا استبعاد الحجم

1. أضف الحبيبات المعلقة إلى الجزء العلوي من عمود SEC وقم بالطرد المركزي للعمود عند 50 × جم لمدة 30 ثانية. تجاهل التدفق.
2. أضف 180 ميكرولتر من PBS الخالي من EV إلى الجزء العلوي من عمود SEC وقم بالطرد المركزي للعمود عند 50 × جم لمدة دقيقة واحدة ، مما يسمح للمركبات الكهربائية القصيرة المشتقة من الدماغ بالخروج من العمود.
   ملاحظة: يتم تلخيص جزء البروتوكول المفصل أعلاه في الشكل 1.

4. تأكيد علامات الحويصلة الصغيرة خارج الخلية عن طريق النشاف الغربي

1. لتحليل sEVs قبل تحليل اللطخة الغربية (لضمان تحليل جميع شحنات الأغشية والعصارة الخلوية) ، قم بتخفيف عينة sEV المعزولة 1: 1 في المخزن المؤقت للتحلل والاستخراج (1x مثبط البروتياز و 1x مثبط الفوسفاتيز).
2. حرك العينة على حرارة 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة.
3. عينة أجهزة الطرد المركزي عند 14 000 × جم لمدة 15 دقيقة.
4. اجمع المادة الطافية للبروتين وقم بقياس تركيزات البروتين باستخدام مجموعة فحص البروتين.
5. امزج العينات مع 4x Laemmli Buffer وقم بتحميل 20 ميكروغرام من البروتين في كل بئر مقابل سلم بروتين ملطخ مسبقا.
6. بمجرد حلها ، انقل البروتينات إلى غشاء النيتروسليلوز 0.45 ميكرومتر. بعد النقل ، قم بسد الغشاء لمدة 2 ساعة في 5٪ BSA.
7. احتضان الأغشية بالأجسام المضادة الأولية (الجدول 1) بين عشية وضحاها.
8. اغسل الغشاء ثلاث مرات باستخدام محلول غسيل (1٪ Tween20 في PBS) وصمة عار باستخدام جسم مضاد ثانوي مضاد للفأر. بعد ذلك ، اغسل ثلاث مرات باستخدام مخزن غسيل (1٪ Tween20 في PBS).
9. اتبع الخطوات المذكورة أعلاه في المخطوطة قبل تصوير البقع.
10. الصورة باستخدام ركيزة بيروكسيداز الفجل (HRP).

5. تأكيد الحويصلات الصغيرة خارج الخلية عن طريق تحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA)

1. قم بإجراء NTA لتحليل تركيز وحجم جميع الجسيمات في العينة. قم بذلك عن طريق تخفيف كل عينة في PBS بعامل تخفيف قدره 1: 1000.
2. حقن العينة في أداة NTA وقراءة العينة بطول موجي 550 نانومتر. في هذه المرحلة ، استخدم كمية الجسيمات لقياس كمية البروتين لكل جسيم (يتم التعبير عنها عادة في مخطط الفيمتوغرام) على النحو الموصى به في إرشادات MISEV.
3. بعد ذلك ، بالنسبة ل NTA الفلورية ، قناع الخلية المخفف البرتقالي (CMO) (يلطخ جميع الجسيمات البيولوجية داخل العينة) في PBS بعامل تخفيف قدره 1: 1000. من هذا ، قم بتخفيف صبغة CMO باستخدام عينة sEV بعامل تخفيف 1:10 - احتضان خطوة التخفيف هذه في الظلام لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
4. تمييع التخفيف الثاني من CMO باستخدام PBS بمعامل تخفيف قدره 1: 1000.
   ملاحظة: يجب أن يكون التخفيف النهائي لصبغة CMO 1: 10 000 000.
5. اقرأ CMO لكل عينة sEV بطول موجي 550 نانومتر باستخدام أداة NTA.
6. بالنسبة للأجسام المضادة الفلورية رباعي السبانين (انظر جدول المواد) ، أولا ، قم بتخفيف كل جسم مضاد في PBS بعامل تخفيف 1:10. من هذا ، قم بتخفيف كل صبغة باستخدام عينة sEV بعامل تخفيف 1:10 - احتضان خطوة التخفيف في الظلام لمدة ساعتين عند 4 درجات مئوية.
7. قم بتخفيف الأجسام المضادة الثانية باستخدام PBS بعامل تخفيف 1: 1000.
   ملاحظة: يجب أن يكون التخفيف النهائي لكل جسم مضاد رباعي السبانين 1: 100 000.
8. اقرأ قراءات الأجسام المضادة الفلورية لعينة sEV بطول موجي 550 نانومتر باستخدام أداة NTA.

6. تأكيد الحويصلات الصغيرة خارج الخلية عن طريق المجهر الإلكتروني للإرسال (TEM)

ملاحظة: تم تنفيذ هذا البروتوكول من قبل مرفق الفحص المجهري الطبي الحيوي في جامعة ليفربول.

1. أولا ، قم بإصلاح عينات sEV باستخدام الجلوتارالديهايد والبقع باستخدام أسيتات اليورانيل.
2. من خلال سلسلة متدرجة من الكحوليات ، قم بتجفيف العينة الجاهزة ل TEM.
3. عينات الصور باستخدام مجهر إلكتروني ناقل الإرسال المناسب.

7. علاج البروتيناز K و RNase A

1. إلى 50 ميكرولتر من الدماغ المعزول مشتق EVs ، أضف 1 ميكرولتر من 20 ميكروغرام / ميكرولتر بروتيناز K واحتضنه عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
2. أوقف كل تفاعل عن طريق إضافة كوكتيل مثبط البروتيناز 1x واحتضانه على الثلج لمدة 10 دقائق.
3. بعد الحضانة ، أضف 1 ميكرولتر من 10 ميكروغرام / ميكرولتر RNase A إلى كل عينة واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
   ملاحظة: انتقل على الفور إلى القسم 8.

8. عزل الحمض النووي الريبي الكلي عن الحويصلات الصغيرة خارج الخلية

1. لعزل الحمض النووي الريبي الكلي ، أضف 700 ميكرولتر من كاشف تحلل استعادة الحمض النووي الريبي عالي الجودة إلى 50 ميكرولتر من عينة EV المشتقة من الدماغ (BDsEV). حرك كل عينة لمدة 1 ساعة.
2. أضف 140 ميكرولتر من الكلوروفورم ، ورج كل عينة بقوة لمدة 20 ثانية ، واتركها لتحتضن في RT لمدة 3 دقائق.
3. قم بالطرد المركزي للعينة عند 12 000 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية وجمع الطور البيني من العينة. أضف حجم 1.5x من الإيثانول بنسبة 100٪.
4. أضف 700 ميكرولتر من أعمدة عزل الحمض النووي الريبي لخليط الطور البيني / الإيثانول وأجهزة الطرد المركزي عند ≥8000 × جم لمدة 15 ثانية عند RT.
   ملاحظة: كرر هذه الخطوة باستخدام جميع عينات الطور البيني / الإيثانول.
5. أضف إلى العمود 700 ميكرولتر من محلول الغسيل وجهاز الطرد المركزي عند ≥8000 × جم لمدة 15 ثانية. تجاهل التدفق.
6. أضف 500 ميكرولتر من RPE العازلة ومرة أخرى جهاز الطرد المركزي عند ≥8000 × غرام لمدة 15 ثانية. تجاهل التدفق.
7. أضف 500 ميكرولتر من 80٪ من الإيثانول وأجهزة الطرد المركزي عند ≥8000 × جم لمدة دقيقتين. تجاهل التدفق.
8. في هذه المرحلة ، جفف غشاء العمود عن طريق الطرد المركزي للأعمدة بأقصى سرعة (>8000 × جم) لمدة 5 دقائق مع فتح الغطاء.
9. انقل العمود إلى أنبوب تجميع جديد ، وأضف 14 ميكرولتر من الماء الخالي من RNase مباشرة إلى غشاء العمود ، وجهاز الطرد المركزي عند ≥8000 × جم لمدة 1 دقيقة لتصفية إجمالي الحمض النووي الريبي من BDsEVs.
10. حدد إجمالي الحمض النووي الريبي الميكرو باستخدام العينات باستخدام مجموعة مقايسة القياس الكمي miRNA ، حيث تم قياس العينات على مقياس فلوري للقياس الكمي ، واختيار نوع مقايسة miRNA.

9. تسلسل الحمض النووي الريبي الصغير

1. بعد القياس الكمي ل miRNA داخل العينة ، قم بتجميع مكتبة (كدنا) باستخدام مجموعة إعداد مكتبة الحمض النووي الريبي الصغير.
   ملاحظة: باستخدام هذا البروتوكول ، تضمن إنشاء المكتبة أربع خطوات: ربط محول 3 بوصات ، وتنقية ، وربط محول 5 بوصات ، والنسخ العكسي - حيث يتم في النهاية تشكيل مكتبة RNA / cDNA. بعد إنشاء المكتبة ، يحدث تضخيم PCR لنقطة النهاية مع إضافة بادئات الفهرس (المستخدمة لأغراض تعدد الإرسال) ، وبعد ذلك يتم تنقية العينات.
2. لاختبار جودة الحمض النووي الريبي ، استخدم مقايسة تطبيق مراقبة الجودة التي توضح بالتفصيل حجم كل مستحضر وكثافة الذروة.
3. لاختبار تركيز الحمض النووي ، قم بقياس كمية الحمض النووي على مقياس فلوري للقياس الكمي ، واختيار نوع مقايسة dsDNA.
4. قم بإعداد العينات ل Small RNA Seq باستخدام مجموعة الكاشف ، وبعد ذلك يتم تحميل العينات في خلية التدفق.

لتأكيد وجود BDsEVs ، تم استخدام ثلاث تقنيات: النشاف الغربي ، و NTA ، و TEM (الشكل 3). تظهر نتائج اللطخة الغربية (الشكل 3 أ والملف التكميلي 1) وجود جميع العلامات الإيجابية الخمس (CD9 و CD63 و CD81 و Flot-1 و TSG101) وغياب Calnexin في sEVs (المستخدمة كعنصر تحكم سلبي) ، مما يؤكد عدم وجود تلوث بالمحتويات الخلوية. كما هو متوقع ، تظهر متجانسات الدماغ (BH) بروتينا أكثر مما لوحظ في sevs للعلامات التي تم اختبارها. أكدت صور TEM مورفولوجيا BDsEVs وحجمها النسبي داخل العينة (الشكل 3 ب) ، والذي تم تأكيده بشكل أكبر من خلال تحليل تتبع الجسيمات النانوية (الشكل 3 ج).

يوضح الشكل 3C (اللوحة العلوية) أحجام الجسيمات المعزولة التي تتراوح بين 50-200 نانومتر. من بيانات NTA ، مع أخذ نتيجة التشتت على أنها 100٪ من الجسيمات الممثلة ، يمثل CMO حوالي 52.35٪ من الجسيمات (الشكل 3C ، اللوحة السفلية) للحصول على طبقة ثنائية الدهون. من بين هذه الجسيمات الملطخة ب CMO ، احتوت 34.66٪ على CD9 ، و 15.49٪ تحتوي على CD63 ، و 12.01٪ تحتوي على CD81. ارجع إلى الملف التكميلي 2 للحصول على بيانات تحكم NTA.

تظهر بيانات القياس الكمي للحمض النووي الريبي المعزول (الجدول 2) مستويات تتراوح من 3.24-8.76 (نانوغرام / ميكرولتر) ، وهي القيم التي تم تطبيعها عند إنشاء مكتبات (كدنا). تظهر نتائج فحص TapeStation (الشكل 4) قمم رئيسية تبلغ حوالي 120-160 نقطة أساس ، مع قمم أصغر أقل من ذلك تبلغ حوالي 50 نقطة أساس وقمم أخرى أصغر أعلى من حوالي 484 نقطة أساس.

تظهر فحوصات الجودة لبيانات تسلسل الجيل التالي قراءات عالية الجودة جدا بعد تشذيب المحول (الشكل 5 أ). تظهر جميع مواضع التسلسل درجة فريد >30 ، مما يشير إلى معدلات خطأ أقل من 1 في 1000 نيوكليوتيد. يوضح الشكل 5 ب أن معظم التسلسلات تتراوح بين 21 و 22 نقطة أساس ، وهو ما يتوافق مع نطاق الحجم المتوقع للحمض النووي الريبي الصغير. من خلال مزيد من رسم الخرائط النهائية (باستخدام BowTie2) ، باستخدام الأداة الحيوية لتحليل Samtools flagstat ، من بين 1،304،100 تسلسل محاذاة ، تم تعيين 1،116 264 (85٪) إلى مناطق الحمض النووي الريبي الصغير في الجينوم البشري (بناء hg38 ؛ الجدول 3).

من إجمالي miRNAs ، تم التعبير عن 808 miRNAs من خلال جميع العينات الثلاث ، مع مشاركة 344 miRNAs بين جميع العينات الثلاث (~ 43٪) ، و 5 مشتركة بين التحكم 1 والتحكم 2 ، و 183 مشتركة بين التحكم 1 والتحكم 3 ، و 16 مشتركة بين التحكم 2 والتحكم 3 (الشكل 6). من هذه البيانات ، فإن أعلى miRNA معبر عنه عبر جميع BDsEVs الثلاثة هي has-let-7b-5p و has-miR-143-3p و has-miR-30a-5p و has-miR-221-3p و has-let7i-5p. وبالمثل ، فإن أعلى 5 miRNA أقل تعبيرا تفاضليا عبر عينات BDsEVs (القراءات >10) هي has-miR-128-2-5p و has-miR-182-5p و has-miR-193b-5p و has-miR-448 و has-miR-505-3p. يتم تقديم جميع أعداد القراءة الأولية والمعادية في الملف التكميلي 3.

الشكل 1: سير عمل معالجة الأنسجة. يوضح الشكل العملية التدريجية لعزل المركبات الكهربائية القصيرة المشتقة من الدماغ (BDsEVs) من أقسام الدماغ المجمدة حديثا باستخدام كروماتوغرافيا استبعاد الحجم. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: سير عمل عزل الحمض النووي الريبي من BDsEVs. يوضح الشكل العملية التدريجية لعزل الحمض النووي الريبي الكلي عن BDsEVs ، بما في ذلك خطوة المعالجة المسبقة لإزالة أي RNA خارج الخلية باستخدام البروتيناز K و RNase A. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 3: سير عمل توصيف BDsEV. يوضح الشكل طرقا مختلفة لتوصيف BDsEVs. (أ) اللطخة الغربية للكشف عن علامات البروتين الخاصة ب sEV. BH تجانس الدماغ. Calnexin هو عنصر تحكم سلبي في sEVs - الغياب في sEV والوجود في BH يؤكد نقاء عينة sEV. بالنسبة للعلامات الأخرى ، كما هو متوقع ، تكون كمية البروتين أعلى في BH منها في عينات sEV (20 ميكروغرام من البروتين المحملة لكل بئر). (ب) صورة المجهرية الإلكترونية التمثيلية (TEM) ل BDsEVs بمقياس 200 ميكرومتر ، مما يؤكد التشكل المتوقع بغشاء ثنائي الطبقة دهني. (ج) مخطط توزيع الحجم لتحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA) لجميع الجسيمات (اللوحة العلوية). تمثل كل نقطة بيانات التباين عبر ثلاث نسخ مكررة. النسب الطبيعية للجسيمات البيولوجية (sEVs) والنسب النسبية لعلامات سطح محددة (اللوحة السفلية) (البيانات المعروضة كمتوسط ± SEM للآبار الثلاثية (ن = 3)). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: فحص الجودة لإعداد مكتبة (كدنا). تحليل Tapestation للعينات الفردية بعد إعداد مكتبة (كدنا). تعرض القمم المعروضة في كل رسم بياني حجم كل مستحضر (المحور الأفقي ، بأساس أساس ) والشدة الخاصة بكل ذروة (المحور الرأسي ، FU). تبلغ مكتبة الحمض النووي الريبي الصغيرة المتوقعة ذروتها حوالي 120-160 نقطة أساس ، كما هو موضح في الشكل. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 5: فحص الجودة لتسلسل miRnome. (أ) مؤامرة FASTQC لجودة القراءة للعينات الفردية بعد تشذيب المحول. المحور الأفقي مخصص لموضع النيوكليوتيدات ، والمحور الرأسي لدرجات فريد. تظهر المخططات الصندوقية لكل موضع توزيع درجة Phred عبر جميع القراءات لكل موضع. تؤكد جميع التوزيعات داخل المنطقة الخضراء بيانات عالية الجودة جدا (>Q30) تنطوي على إعداد عينات عالية الجودة. (ب) يظهر توزيع طول التسلسل لكل عينة أنه بالنسبة لجميع العينات الثلاث ، كانت غالبية القراءات حوالي 21-22 نيوكليوتيد - نطاق الحجم المتوقع ل microRNA. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 6: تداخل تعبير MicroRNA عبر جميع العينات. يظهر عدد miRNAs المكتشفة من كل عينة (عدد القراءة ≥ 10) والحمض النووي الريبي الصغير المحدد المشترك في أكثر من عينة واحدة في مخطط Venn. يتم عرض جميع القراءات الأولية والمعادية في الملف التكميلي 3. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: حواتم الأجسام المضادة المستخدمة لتوصيف BDsEVs وعوامل التخفيف الخاصة بها.

الجدول 2: بيانات القياس الكمي للحمض النووي الريبي المعزول.

الجدول 3: مقدار تسلسلات miRNA المحاذاة والمعينة بنجاح.

الملف التكميلي 1: بيانات تحليل اللطخة الغربية التكميلية. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 2: بيانات التحكم التكميلية NTA. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 3: عدد القراءة الخام والطبيعي لتحليل تعبير miRNA. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 4: بيانات تركيز البروتين التكميلي. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

يوضح هذا البروتوكول المعدل والمحسن لعزل الحويصلات الصغيرة خارج الخلية المشتقة من الدماغ وحمولتها من الحمض النووي الريبي الصغير جدوى استخدام الحد الأدنى من الأنسجة دون المساس بجودة وكمية المنتجات في اتجاه مجرى النهر. في مجال اكتشاف المؤشرات الحيوية ، يمكن أن يؤدي تحديد المعرفات الجزيئية الخاصة بأنواع الخلايا والأنسجة إلى وسائل أكثر سهولة للاختبارات التشخيصية غير الغازية باستخدام سوائل الجسم. علاوة على ذلك ، يوفر النهج الموصوف هنا إطارا لتحديد مجموعات سكانية فرعية محددة من sEV داخل أنواع مختلفة من الخلايا (الخلايا العصبية مقابل الدبق) ، وأنواع الأنسجة (أنسجة الحصين مقابل أنسجة قشرة الفص الجبهي) ، والسوائل الحيوية - والتي ستوفر فهما أكبر لتوقيعات تحميل البضائع والفيزيولوجيا المرضية ومدى المرض. تم توضيح ما سبق في Vella et al. ، أنه يجب استخدام 450 مجم إلى 1 جم لعزل BDsEV ، إلى جانب الطرد المركزي الفائق المتدرج للكثافة (باستخدام سرعات تصل إلى 180,000 × جم)⁸. في هذه المنهجية ، تم عزل المركبات الكهربائية بنجاح باستخدام كميات أقل (انخفاض بنسبة >50٪) من عينات أنسجة المخ المجمدة الطازجة (250-450 مجم). يؤدي تقليل كمية أنسجة المخ المستخدمة لعزل المركبات الكهربائية إلى انخفاض التكاليف والمواد الاستهلاكية. وبالمثل، أصبح البروتوكول أكثر سهولة من خلال تطبيق SEC إلى جانب الطرد المركزي عالي السرعة (000 10 × جم) بدلا من الطرد المركزي الفائق (000 180 × جم).

باستخدام fNTA و TEM ، أثبتنا أن ملف تعريف نطاق الحجم للمركبات الكهربائية المركبة يقع ضمن نطاق الحجم المميز 30-200 نانومتر ، على النحو الموصى به في إرشادات MISEV^13،14 ، مع توفر TEM تأكيدا مورفولوجيا للمركبات الكهربائية التي تم الحصول عليها. كما هو موضح في الشكل 3C وفي الملف التكميلي 4 ، >87٪ من الجسيمات هي نطاق حجم <250 نانومتر ، وتظهر العينات ، في المتوسط ، 10.56 بروتين fg / BDsEV. تختلف أنواع معينة من الحويصلات الصغيرة خارج الخلية في الحجم والشكل ، حيث لوحظ أن مجموعات سكانية فرعية أصغر بشكل مميز ، مثل الإكسوسومات ، لها مورفولوجيا موحدة مقارنة بالحويصلات الدقيقة التي يقال إن لها بنية غير منتظمة بسبب طبيعتها في التكوين الحيوي¹⁵. بالنسبة ل fNTA ، تم إنتاج قراءة مبعثرة (520 نانومتر) لتحليل الجسيمات الإجمالية في العينات ، وتوفير تفاصيل عن ملف تعريف الحجم والتركيزات. تظهر القراءات أن أكثر من 50٪ من الجسيمات كانت بيولوجية (من خلال تلطيخ CMO) ، مع مجموعات من الجسيمات البيولوجية التي تقع ضمن نطاق حجم sevs التي تعرض علامات tetraspanin ، مع CD9 هو الأكثر انتشارا في عينات التحكم لدينا (34.66٪). بينما بالنسبة للنشاف الغربي ، قدم وجود شحنات غشاء مميزة وبروتين العصاري الخلوي دليلا على وجود sEV ، مع عدم وجود Calnexin يؤكد أن BDsEVs خالية من أي تلوث خلوي. للتأكد بشكل أكبر من أن miRNA المتاح للمعالجة النهائية كان جزءا من شحنة sEV (وليس أي RNA آخر خارج الخلية) ، قمنا بمعالجة sEVs بإنزيمات Proteinase K و RNase A قبل تعطيل أغشية sEV لتحلل أي بروتين وRNA كانا موجودين خارجيا في الفضاء خارج الخلية خارج BDsEVs¹⁶.

تم استخراج إجمالي الحمض النووي الريبي من sEVs وإعداده لتطبيقات المصب مثل qRT-PCR وتسلسل الجيل التالي (للحمض النووي الريبي الصغير). أظهرت الفحوصات القياسية باستخدام فحوصات مراقبة الجودة عينات عالية الجودة ومكتبات (كدنا) جاهزة للتسلسل. تبلغ مكتبات (كدنا) ذروتها عند حوالي 120-160 نقطة أساس ، وتعزى إلى قمم (كدنا) المشتقة من miRNA مع تسلسلات محول بأطوال متفاوتة ، مع أي قمم أصغر يحتمل أن تمثل ثنائيات المحول.

يظهر تحليل بيانات تسلسل الجيل التالي باستخدام FASTQC و CutAdapt نتائج عالية الجودة تم الحصول عليها من BDsEV miRNAs. كما هو موضح في الشكل 5 ، فإن كل موضع مقروء له درجة Q أعلى من 30 (Q30) ، مما يدل على احتمال خطأ يتراوح بين 0.001-0.0001 (1 في 1000-10,000). علاوة على ذلك ، يظهر تحليل توزيع طول التسلسل (الشكل 6) قمم سائدة تقع ضمن النطاق المميز ل miRNA (19-25 نقطة أساس) ، مما يشير إلى جودة عالية وخصوصية للبيانات التي تم الحصول عليها.

ستستفيد العديد من الدراسات المستقبلية من هذه الطريقة نظرا لتحسين إمكانية الوصول إليها ، إلى جانب توفير التكلفة والموارد من خلال تقليل ليس فقط كمية عينات الأنسجة ، ولكن أيضا توفير تكلفة الكواشف. الانخفاض (>50٪) في الكمية المطلوبة من الأنسجة يجعل هذه الطريقة أكثر أخلاقية أيضا. تماشيا مع الجهود العالمية في مجال الصحة الدقيقة ، يوفر سير العمل المحسن المفصل هنا أدوات أكثر تكلفة نسبيا للشروع في مؤشرات حيوية دقيقة خاصة بنوع الخلية عبر طرق غير جراحية (أو طفيفة التوغل) باستخدام BDsEVs وحمولتها. يمكن استخدام هذا لمجموعة واسعة من الحالات العصبية. أحد القيود المحتملة لهذه الطريقة هو أن البروتوكول سيحتاج إلى تعديل إذا أراد الباحثون استخدام نسيج آخر غير الدماغ البشري لعزل sev. على المدى الطويل ، ستجعل هذه الطريقة المحسنة اكتشاف المؤشرات الحيوية غير الغازية الخاصة بالأنسجة والتحقق من صحتها أكثر إنصافا ويمكن الوصول إليها في جميع أنحاء العالم.

لا يوجد تضارب في المصالح لأي من المؤلفين.

تم تمويل هذا العمل من خلال منحة الدكتوراه لجوزيف مورغان من جمعية الزهايمر في المملكة المتحدة (المنحة رقم 549 / SERA-52) ومن قبل صناديق استراتيجية الابتكار بجامعة سالفورد (منحة SEFA-39). تم الحصول على أنسجة المخ من بنك الدماغ في مانشستر (مرجع REC 09 / H0906/52) لشبكة أدمغة الخرف.