Method Article
نقدم هنا بروتوكولا لعزل النوى من أدمغة نموذج الفقاريات قصير العمر Nothobranchius furzeri للتطبيقات النهائية مثل تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النواة أو مقايسة النواة الواحدة للكروماتين الذي يمكن الوصول إليه بواسطة transposase مع التسلسل (ATAC-seq).
لا تزال دراسة شيخوخة الدماغ بدقة الخلية الواحدة في أنظمة الفقاريات صعبة بسبب التكلفة والوقت والقيود التقنية. هنا ، نوضح بروتوكولا لإنشاء مكتبات تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النواة (snRNA-seq) من أدمغة الفقاريات الأفريقية الفيروزية ذات العمر القصير بشكل طبيعي Nothobranchius furzeri. يبلغ عمر سمك الكيلي الفيروزي الأفريقي 4-6 أشهر ويمكن إيواؤه بطريقة فعالة من حيث التكلفة ، وبالتالي تقليل حواجز التكلفة والوقت لدراسة شيخوخة دماغ الفقاريات. ومع ذلك ، هناك حاجة إلى بروتوكولات مصممة خصيصا لعزل النوى ذات الجودة الكافية لتجارب الخلية الواحدة في اتجاه مجرى النهر من دماغ الأسماك الصغيرة والمسنين. هنا ، نعرض بروتوكولا محسنا تجريبيا لعزل النوى عالية الجودة من دماغ سمك كيليفيش الفيروزي الأفريقي البالغ ، وهي خطوة حاسمة في توليد مكتبات أوميك أحادية النوى عالية الجودة. علاوة على ذلك ، نوضح أن خطوات تقليل تلوث الحمض النووي الريبي في الخلفية مهمة للتمييز بوضوح بين أنواع الخلايا. باختصار ، يوضح هذا البروتوكول جدوى دراسة شيخوخة الدماغ في الكائنات الحية النموذجية غير التقليدية.
يعد فهم آليات شيخوخة دماغ الفقاريات أمرا بالغ الأهمية لمعالجة الأمراض التنكسية العصبية المرتبطة بالعمر مثل مرض الزهايمر والخرف1. كيليفيش الفيروز الأفريقي (Nothobranchus furzeri) هو أقصر الفقاريات عمرا التي يمكن تربيتها في الأسر ، وبسبب عمرها القصير وضعف الإدراك المرتبط بالعمر ، فهي نموذج ممتاز لشيخوخة الدماغ2،3،4،5. في الآونة الأخيرة ، سمح ظهور تقنيات "omics" أحادية الخلية ، مثل النواة المفردة RNA-seq (snRNA-seq) ومقايسة النوى المفردة للكروماتين الذي يمكن الوصول إليه بواسطة transposase مع التسلسل (snATAC-seq) ، للباحثين باستجواب الدماغ المسن بدقة غير مسبوقة6،7،8. تعتمد هذه الطرق على عزل النوى ، نظرا لأن استعادة خلايا الدماغ مثل الخلايا العصبية غالبا ما يكون صعبا للغاية لعزل6،7،8،9،10. ومع ذلك ، تم تحسين معظم بروتوكولات عزل النوى المنشورة للكائنات النموذجية للثدييات11،12،13،14،15. وبالتالي ، نظرا لوجود حاجة غير ملباة حاليا لعزل نوى الدماغ في killifish ككائن نموذجي جديد قادم في مجال أبحاث الشيخوخة2 ، فإن الهدف من هذا البروتوكول هو إنشاء طريقة لعزل النوى عالية الجودة من أنسجة killifish المخية المجمدة.
هنا ، يتم إنشاء سير عمل مبسط وقوي يستخدم المواد المتاحة بشكل شائع لعزل النوى عالية الجودة من أدمغة killifish. تم تعديل هذا البروتوكول من بروتوكول 10x Genomics لأدمغة الفئران لاستيعاب أدمغة محتوى المايلين المنخفض لسمك الكيلي الفيروزي الأفريقي ، وهشاشة الأنسجة المجمدة ، والحاجة إلى تقليل محتوى الحطام المحيط للتطبيقات المتعلقة بالتسلسل16. في الواقع ، تؤدي البروتوكولات المحسنة سابقا لأنسجة دماغ الثدييات17,18 إلى جودة رديئة للنوى (أي الإفراط في التحلل) و / أو محتوى حطام مرتفع عند استخدامها على أدمغة أسماك الكيلي المجمدة ، مما يجعلها غير مناسبة للاستخدام مع snRNA-seq وفقا لتوصيات النوى المفردة RNA-seq باستخدام الموائع الدقيقة (الشكل التكميلي 1).
بالإضافة إلى عزل النوى ، نوضح كيفية تقييم جودة النوى والعائد عن طريق الفحص المجهري وقياس التدفق الخلوي. توفر هذه المقالة أمثلة على كل من النتائج المثلى ودون المثلى وتناقش استكشاف الأخطاء وإصلاحها. تم تصميم هذا البروتوكول وتحسينه لأدمغة سمك الكيلي المجمدة ولكن يمكن استخدامه أيضا دون تعديلات كبيرة على عينات سمك الكيلي التي تم تشريحها حديثا. تم تحسين نوى دماغ Killifish المعزولة باستخدام هذه الطريقة للاستخدام في نواة واحدة RNA-seq (snRNA-seq) كتطبيق نهائي ، ولكن يجب أيضا أن تكون قابلة للاستخدام في snATAC-seq و ATAC-seq السائبة.
تم إجراء رعاية الحيوانات والتجارب على الحيوانات وفقا لجامعة جنوب كاليفورنيا IACUC بموجب البروتوكولات المعتمدة # 21215. لأي عمل يستخدم هذا البروتوكول ، من الضروري الحصول على موافقة من IACUC للمؤسسة قبل البدء في أي عمل بحثي على الحيوانات الفقارية.
ملاحظة: يجب أن يستغرق التشغيل الكامل من خلال البروتوكول بدءا من أنسجة المخ المجمدة (بدءا من الخطوة 3) ~ 2.5 ساعة لست عينات (الشكل 1).
1. تشريح أدمغة كيليفيش
2. تحضير مخازن جديدة
3. عزل النوى
4. تقييم جودة النوى عن طريق الفحص المجهري
5. تحديد النوى المفردة والحطام ونسبة الضرب عن طريق قياس التدفق الخلوي
ملاحظة: قد تختلف المصطلحات والواجهة المحددة لبرنامج مقياس التدفق الخلوي بناء على العلامة التجارية للجهاز ، ولكن يجب تكييف هذه الخطوات بسهولة مع الأنظمة الأخرى إذا لزم الأمر.
تم تحسين بروتوكول عزل نوى دماغ killifish الموصوف هنا خصيصا ل killifish ويتم تلخيصه في الشكل 1. بالإضافة إلى استخراج النوى ، يفصل البروتوكول طرقا مختلفة لتقييم جودة وكمية النوى المعزولة. يوضح الشكل 2 أمثلة على كل من النوى السليمة (الشكل 2 أ) وغير الصحية (الشكل 2 ب) كما تم تقييمها بواسطة الفحص المجهري الضوئي. توجد نوى صحية مناسبة للتحليل النهائي (الشكل 2 أ) كنوى مفردة ذات أغشية سليمة. كما هو موضح في الشكل 2B ، فإن وضع الفشل الأكثر شيوعا لهذا البروتوكول (وبروتوكولات عزل النوى الأخرى) هو توليد نوى مفرطة ، والتي تتميز بأغشية نووية تالفة. غالبا ما يؤدي هذا إلى تكتل النوى ويمكن أن يساهم في إشارات الخلفية في التطبيقات النهائية بسبب تسرب الأحماض النووية من النوى الممزقة. إذا لوحظ تكتل مفرط ، نوصي بأن نكون أكثر لطفا أثناء خطوات الارتداد و / أو تقليل أوقات الحضانة في محلول التحلل.
يستخدم هذا البروتوكول قياس التدفق الخلوي لتحديد عدد النوى المعزولة وتحديد النسبة النسبية للنوى المتعددة في العينة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام قياس التدفق الخلوي لتقييم المحتوى النسبي للحطام الملوث ، وغالبا ما تتمزق شظايا النوى وغيرها من الحطام الخلوي الذي يمكن أن يؤثر بشكل ضار على مقايسات المصب في عينة النوى. يمكن رؤية بيانات التدفق التمثيلي في الشكل 3. سينتج إجراء عزل النوى عالي الجودة: 1) جزء صغير من الحطام ، و 2) جزء كبير من النوى المفردة مقابل النوى المتعددة (> 80٪ من جزء النوى). يسمح استخدام تلطيخ PI ، الذي يلطخ الأحماض النووية ، بفصل النوى المفردة عن الحطام ومضاعفة النوى. الشكل 3 أ هو مثال على التحضير الملوث بالحطام ، في حين أن الشكل 3 ب هو مثال على تجربة عالية الجودة.
الشكل 1: سير عمل عزل نوى دماغ Killifish. سير العمل التجريبي لعزل النوى عن أدمغة killifish المجمدة أو الطازجة. بمجرد عزلها وتقييمها ، يمكن استخدام النوى في العديد من تحليلات "omics" النهائية. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: تقييم جودة النوى عن طريق الفحص المجهري. تم خلط النوى بنسبة 1: 1 في محلول بنسبة 0.4٪ من Trypan Blue وتم تصورها على مجهر Echo Revolve بواسطة تصوير برايتفيلد بمعدل 60x. (أ) مثال على نواة عالية الجودة. النواة موجودة كمفردة والغشاء النووي سليم. ب: مثال على النوى ذات النوعية الرديئة. تضررت الأغشية النووية ، وتتجمع النوى في دوبل ، ويرجع ذلك على الأرجح إلى تسرب الحمض النووي اللزج ، والذي يمكن رؤيته يتسرب من أعلى النواة العلوية. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: تقدير كمية النوى وتقييم النقاء عن طريق قياس التدفق الخلوي. تم تلطيخ عينات النوى بتخفيف 1: 100 من PI وتشغيلها على مقياس التدفق الخلوي. توجد النوى في أشكال مفردة ومضاعفة في الربع الأيمن العلوي من (A ، B) مع مفردات كأدنى سحابة من الأحداث تليها ثنائيات وثلاثية وما إلى ذلك بترتيب تصاعدي. يتميز الحطام بالأحداث في الربعين في أقصى اليسار. (أ) مثال على إعداد نوى منخفضة الجودة ، حيث تم حذف خطوة إزالة الحطام ويشكل الحطام >40٪ من الأحداث. (ب) مثال على عينة نوى عالية الجودة، مع خطوة إزالة الحطام المضمنة. في هذا المثال، يشكل الحطام <10٪ من جميع الأحداث المسجلة بواسطة مقياس التدفق الخلوي. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
نوع العينة (2 أدمغة) | متوسط العائد (4 تحضيرات مستقلة) |
أدمغة الذكور لمدة 5 أسابيع | 3.59 ± 1.76 س 105 |
أدمغة الذكور لمدة 10 أسابيع | 6.41 ± 1.33 س 105 |
أدمغة الذكور لمدة 15 أسبوعا | 14.59 ± 2.05 س 105 |
أدمغة الإناث لمدة 5 أسابيع | 2.54 ± 0.75 س 105 |
أدمغة الإناث لمدة 10 أسابيع | 4.66 ± 1.29 س 105 |
أدمغة الإناث لمدة 15 أسبوعا | 7.95 ± 3.51 س 105 |
الجدول 1: متوسط الغلة المتوقعة من دماغين من سمك الكيلي الفيروزي الأفريقي عبر الجنس والعمر. متوسط الغلة معبرا عنه ب 105 نوى ± خطأ معياري للمتوسط على أربعة مستحضرات نوى مستقلة في كل فئة.
الشكل التكميلي 1: مقارنة جودة عزل النوى باستخدام البروتوكولات القياسية وبروتوكولنا الأمثل على أدمغة أسماك الكيلي المجمدة. (أ) تقييم جودة النوى بالفحص المجهري. تم خلط النوى بنسبة 1: 1 في محلول بنسبة 0.4٪ من Trypan Blue وتم تصورها على المجهر بواسطة تصوير برايت فيلد عند 60x. (ب) قياس كمية حمل النوى والحطام عن طريق قياس التدفق الخلوي. تم تلطيخ عينات النوى بتخفيف 1: 100 من PI وتشغيلها على مقياس التدفق الخلوي. (ج) ملخص مقاييس تقييم الجودة عن طريق الفحص المجهري وقياس التدفق الخلوي مع البروتوكولات المعيارية المختلفة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
الشكل التكميلي 2: تمثيل تخطيطي لخطوات إزالة الحطام. (أ) مخطط إزالة الحطام بطبقات الطرد المركزي المسبق. (ب) مخطط إزالة المواد الطافية بعد الطرد المركزي. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
يمكن استخدام البروتوكول المقدم هنا لتوليد نوى عالية الجودة من أدمغة killifish. كان لا بد من تصميم هذا البروتوكول خصيصا لدماغ killifish حيث أدت بروتوكولات عزل نوى الدماغ النموذجية القائمة على الثدييات المطبقة على أدمغة killifish باستمرار إلى ضعف جودة النوى في أيدينا. نشك في أن هذا يرجع إلى انخفاض محتوى المايلين النسبي في دماغ killifish مقارنة بنظرائهم في الثدييات ، والتي من شأنها أن تتحلل وتتجمع استجابة للظروف القاسية المطلوبة لتحلل خلايا دماغ الثدييات. هذا البروتوكول هو تقدم في مجالات الشيخوخة و killifish لأنه يسهل استكشاف شيخوخة الدماغ على مستوى الخلية الواحدة في نموذج فعال من حيث التكلفة والوقت لشيخوخة دماغ الفقاريات.
هذا البروتوكول قوي للعينات الطازجة أو المجمدة ، على الرغم من أنه يجب على المرء أن يأخذ في الاعتبار التطبيقات النهائية عند استخدام الأنسجة الطازجة أو المجمدة. غالبا ما تكون الأنسجة المجمدة مريحة حيث يمكن جمعها وتخزينها لعدة أشهر أثناء جمع العينات. يمكن استخدام هذه العينات بأمان لتطبيقات مثل snRNA-seq. ومع ذلك ، قد تؤدي عينات التجميد إلى تعطيل البنية النووية وبالتالي القدرة على قياس مشهد الكروماتين بدقة بواسطة ATAC-seq21. وبالتالي ، بالنسبة للتطبيقات النهائية مثل ATAC-seq السائبة أو snATAC-seq ، يوصى باستخدام أدمغة تشريح طازجة بدلا من العقول المجمدة. بالإضافة إلى ذلك ، نظرا لأنه يمكن إجراء جميع الخطوات بعد تجانس الدماغ بالتوازي ، فإن هذا البروتوكول قابل لتشغيل عينات متعددة في إطار زمني معقول ، وبالتالي الحد من تدهور الحمض النووي الريبي الناجم عن الحضانة المطولة على الجليد.
علاوة على ذلك ، من الضروري تحضير مخازن مؤقتة طازجة (في غضون ساعات) من إجراء استخراج النوى. وجدنا أنه يجب إضافة المنظفات وكذلك BSA إلى المخازن المؤقتة مباشرة قبل بدء البروتوكول. يمكن صنع المخازن المؤقتة التي تحتوي على أملاح فقط (PBS ، NaCl ، إلخ) كمركزات ، وتعقيمها بالمرشح (0.22 ميكرومتر) ، وتخزينها إلى أجل غير مسمى في درجة حرارة الغرفة. يمكن تحضير محاليل مخزون BSA وتعقيمها وتخزينها عند 4 درجات مئوية في غضون أيام من استخراج النوى (إذا تم تحضيرها من مسحوق) ولكن يجب دائما إضافتها إلى المخازن المؤقتة المستخدمة في هذا البروتوكول مباشرة قبل إجراء البروتوكول. ومع ذلك ، نوصي بإعداد حلول BSA في يوم البروتوكول. في حالة استخدام حلول BSA مسبقة الصنع من طرف ثالث ، ينصح باستخدام زجاجات جديدة غير مفتوحة. يؤدي استخدام BSA الطازج بشكل عام إلى انخفاض محتوى الحطام في تحضيرات النوى.
سواء تم استخدام العينات الطازجة أو المجمدة كمدخلات ، فمن المهم تقييم جودة النوى بعد عزل النوى. على الرغم من أن هذا البروتوكول مصمم خصيصا لتجنب الإفراط في التحلل ، إلا أن هذا هو السبب الأكثر شيوعا لفقدان جودة النوى. قد ينتج التحلل المفرط عن قضاء الكثير من الوقت في المخزن المؤقت للتحلل ، أو التعامل القاسي المفرط مع النوى مثل السحب المفرط بطرف ماصة التجويف القياسي ، أو مقدار مفرط من الوقت المستغرق بين عزل النوى والتطبيقات النهائية (>1 ساعة). غالبا ما تكون النوى المفرطة في التلف في الأطراف النووية ، والتي تسرب الحمض النووي وتسبب التكتل (الشكل 2 ب). سيؤدي ذلك إلى زيادة عدد المضاعفات والمساهمة في الأحماض النووية الخلفية التي ستتداخل مع التطبيقات النهائية ، وخاصة snRNA-seq. يمكن تقييم كلتا الصفتين عن طريق الفحص المجهري بعد عزل النوى. إذا لوحظ تكتل نووي مفرط ، نوصي بمحاولة تقصير حضانة خطوة التحلل لتقليل فرصة الإفراط في التحلل. كطريقة بديلة لزيادة مفردات النوى ، يمكن استخدام فرز الخلايا بمساعدة التألق (FACS) لإثراء المفردات في اتجاه مجرى هذا البروتوكول. ومع ذلك ، نلاحظ أنه عند العمل مع نوى هشة بالفعل من الأنسجة المجمدة ، قد يؤدي إجهاد القص الذي يحدث أثناء الفرز إلى زيادة التمزق النووي وبالتالي زيادة الحمض النووي الريبي / الحمض النووي المحيط. بالإضافة إلى ذلك ، نلاحظ أن الوقت اللازم لتشغيل فرز عائد FACS للنوى عند معالجة عينات متعددة سيتطلب بقاء جميع عينات النوى على الجليد لساعات ، بينما يتم فرز العينات الأخرى. وبالتالي ، فإن زيادة أوقات الانتظار عند معالجة عينات متعددة بالتوازي مع نهج نظام مراقبة الأصول الميدانية يمكن أن تؤدي أيضا إلى انخفاض جودة النوى بشكل عام وزيادة خطر تدهور الحمض النووي الريبي. ومن ثم، إذا كان نظام مراقبة الأصول الميدانية مرغوبا فيه بالنسبة لانخفاض معدل الازدواج، فإننا نوصي بفحص محتوى الحطام مرة أخرى بعد فرز الغلة وأن تؤخذ في الاعتبار إمكانية انخفاض جودة الحمض النووي الريبي بالنسبة لتطبيقات الحمض النووي الريبي أحادي الخلية كتحذير محتمل.
يعد التقدير الدقيق لعدد النوى ونسبة المفردة أمرا ضروريا لجميع تطبيقات "omics" النهائية تقريبا وهو ذو أهمية قصوى. نظرا للقدرة على بوابة النوى وعدها بسهولة حسب الحجم ، فإن قياس التدفق الخلوي هو الطريقة الأكثر دقة لحساب النوى التي قمنا بتقييمها. بدلا من ذلك ، يمكن للمرء تحديد النوى باستخدام عدادات الخلايا مثل عداد الخلايا الآلي Countess 2 FL من Invitrogen أو عداد الخلايا الآلي DeNovix CellDrop. تجدر الإشارة إلى أن عداد الخلايا الآلي Countess 2 FL من Invitrogen ، وإلى حد أقل بكثير DeNovix ، يميلان إلى المبالغة في تقدير عدد النوى عن طريق حساب الحطام كنوى ، مما يعني أن بوابة الحجم اليدوية قد تكون مطلوبة. علاوة على ذلك ، يسمح مقياس التدفق الخلوي للمرء بتقييم نقاء النوى بسهولة. يمكن للمرء أن يميز النسبة النسبية للنوى المفردة مقابل النوى المتعددة بطريقة كمية يصعب إجراؤها بواسطة الفحص المجهري. وهذا أمر حيوي بالنسبة ل snRNA-seq و snATAC-seq ، لأن هذين البروتوكولين سيعانيان من فائض في العينات المتعددة ، والتي يجب استبعادها من التحليلات النهائية. بالإضافة إلى المضاعفات ، يمكن قياس النسبة النسبية ل "الحطام" (النوى المجزأة ، الحطام الخلوي) عن طريق قياس التدفق الخلوي ويجب أن تكون منخفضة نسبيا ، لأن هذه المادة غالبا ما تحتوي على أحماض نووية ملوثة يمكن أن تسهم في إشارة خلفية وبيانات "omics" أحادية النواة الفاسدة.
كما هو الحال مع بروتوكولات عزل النوى الموصوفة سابقا ، قد لا يتم تلخيص نسب أنواع الخلايا في الأنسجة الأصلية بأمانة في إعداد النوى19 ، وبالتالي يجب تفسيرها بحذر. تجدر الإشارة ، مثل جميع teleosts ، يحتوي سمك كيليفيش الفيروزي الأفريقي على كريات الدم الحمراء ذات النواة ، والتي من المتوقع أيضا أن يتم تمثيلها في إعداد النوى. يمكن تحديد هذه النوى في مجموعات بيانات snRNA-seq و snATAC-seq من خلال التعبير العالي / إمكانية الوصول إلى جينات الهيموجلوبين ويمكن استبعادها حسابيا إذا رغبت في ذلك.
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
تم إنشاء بعض اللوحات باستخدام BioRender.com. تم دعم هذا العمل في مختبرنا من خلال منحة تدريب ما بعد الدكتوراه NIA T32 AG052374 إلى BT ، ومنحة من مؤسسة Simons كجزء من تعاون Simons من أجل اللدونة في دماغ الشيخوخة ، ومنحة تجريبية من مؤسسة Navigage ، وجائزة عائلة Hanson-Thorell إلى B.A.B.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.4% Trypan Blue solution | Gibco | 15250061 | |
10x PBS | Bioland | PBS01-03 | |
15 mL Conicle Centrifuge Tube | VWR | 89039-664 | |
2 mL Tissue Grinder | Kimble | 885300-0002 | Dounce Homogenizer |
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube | Falcon | 352054 | |
5M Sodium Chloride, Molecular Biology Grade | Promega | V4221 | |
autoMACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | This corresponds to 1x PBS pH 7.2, 2 mM EDTA (used for flow cytometry) |
Debris Removal Solution | Miltenyi Biotec | 130-109-398 | |
DNA LoBInd Tube | Eppendorf | 22431021 | |
Echo Revolve microscope (fitted with 60x objective) | Echo | NA | No catalog number; Used to visually inspect nuclei. |
Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes, 5 mL | Falcon | 352052 | FACS tube |
FLOWMI Cell Strainers, 40 μM | SP Bel-Art | 136800040 | Referred to as on-tip filters in Protocol |
Hydrochloric Acid | Sigma-Aldrich | 258146-500 mL | Used to lower TRIS pH from 8.0 to 7.4 |
Leica EZ4 dissecting scope | Leica | NA | No catalog number |
MACS BSA stock solution | Miltenyi Biotec | 130091376 | |
MACS SmartStrainers (70 μM) | Miltenyi Biotec | 130-110-916 | |
MACSQuant Analyzer 10 Flow Cytometer | Miltenyi Biotec | NA | No catalog number |
Magnesium Chloride, Hexahydrate, Molecular Biology Grade (Powder) | Millipore | 442611 | |
Megafuge 16R Centrifuge | ThermoScientific | 75003629 | |
Micro Cover Glass | VWR | 48393081 | |
Micro Slides Superfrost Plus | VWR | 48311-703 | |
Nonidet P-40 Substitute | Roche | (Roche) 11332473001/ Catalog: 983739 P Code: -102368106 (Sigma Aldrich) | |
NP-40 Surfact-Amps Detergent Solution | ThermoFisher | 85124 | |
Nuclease-Free HyPure Molecular Biology Grade Water | HyClone | SH30538.02 | |
NxGen RNase Inhibitor (50,000 U) | Lucigen | 30281-2 | |
Propidium Iodide solution | MBL | FP00010020 | |
PureBlu DAPI Nuclear Staining Dye | Biorad | 1351303 | |
TipOne RPT Pipette Tips (Ultra low retention, filtered) in 10 µL, 20 µL, 200 µL, and 1000 µL sizes | USA Scientific | #1181-3810; #1180-1810; #1180-8810; #1182-1830 | |
Tricaine-S (MS 222) | Syndel | Tricaine10G | Syndel is an FDA-approved provider for pharmaceutical grade Tricaine |
TRIS, 1 M, pH 8.0 | VWR | E199-500 mL | |
Wide Bore Pipet Tips | Axygen | T-1005-WB-C |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved