JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يفصل هذا البروتوكول طريقة محسنة لتوليف غلة عالية من البروتينات المؤتلفة من نظام ترجمة النسخ الخالي من الخلايا العقدية الفنزويلية (TX-TL).

Abstract

العقديات spp. هي مصدر رئيسي للمضادات الحيوية السريرية والمواد الكيميائية الصناعية. العقديات الفنزويلية ATCC 10712 هي سلالة سريعة النمو ومنتج طبيعي للكلورامفينيكول والجادوميسين والبيكروميسين ، مما يجعلها مرشحا جذابا كهيكل بيولوجي تركيبي من الجيل التالي. لذلك ، فإن الأدوات الوراثية التي تسرع تطوير S. venezuelae ATCC 10712 ، بالإضافة إلى نماذج Streptomyces spp. الأخرى ، مرغوبة للغاية لهندسة المنتجات الطبيعية واكتشافها. تحقيقا لهذه الغاية ، يتم توفير نظام S . venezuelae ATCC 10712 الخالي من الخلايا في هذا البروتوكول لتمكين التعبير غير المتجانس عالي الإنتاجية لجينات G + C العالية (٪). هذا البروتوكول مناسب لتفاعلات الدفعات الصغيرة (10-100 ميكرولتر) إما في شكل لوحة 96 بئر أو 384 بئر ، في حين أن التفاعلات قابلة للتطوير. النظام الخالي من الخلايا قوي ويمكنه تحقيق غلة عالية (~ 5-10 μ M) لمجموعة من البروتينات المؤتلفة في الحد الأدنى من الإعداد. يتضمن هذا العمل أيضا مجموعة أدوات بلازميد واسعة للقياس في الوقت الفعلي للحمض النووي الريبوزي المرسال وتخليق البروتين ، بالإضافة إلى تلطيخ التألق في الجل للبروتينات الموسومة. يمكن أيضا دمج هذا البروتوكول مع سير عمل توصيف التعبير الجيني عالي الإنتاجية أو دراسة مسارات الإنزيم من جينات G + C العالية (٪) الموجودة في جينومات الأكتينوميسيت.

Introduction

توفر أنظمة النسخ والترجمة الخالية من الخلايا (TX-TL) منصة نموذجية مثالية للبيولوجيا التركيبية لتنفيذ دورات التصميم والبناء والاختبار والتعلم السريعة، وهي الإطار الهندسي المفاهيمي للبيولوجيا التركيبية1. وبالإضافة إلى ذلك، هناك اهتمام متزايد بأنظمة TX-TL لإنتاج البروتين المؤتلف عالي القيمة في بيئة التفاعل المفتوح2، على سبيل المثال، لدمج الأحماض الأمينية غير القياسية في مترافقات الأجسام المضادة والأدوية3. على وجه التحديد ، يتطلب TX-TL مستخلصا خلويا أو بلازميد أو حمض نووي خطي ، ومحلول طاقة لتحفيز تخليق البروتين على دفعة واحدة أو تفاعلات شبه مستمرة. في حين أن الإشريكية القولونية TX-TL هي النظام المهيمن الخالي من الخلايا ، فقد جذب عدد من أنظمة TX-TL الناشئة غير النموذجية الانتباه إلى تطبيقات مختلفة4,5,6,7,8. تشمل المزايا الرئيسية ل TX-TL قابلية التوسع المرنة (مقياس نانولتر إلى لتر) 9,10 ، وقابلية إعادة إنتاج قوية ، وسير عمل تلقائي8,11,12. وعلى وجه الخصوص، تسمح أتمتة TX-TL بالتوصيف المتسارع للأجزاء الوراثية والعناصر التنظيمية8،12،13.

من حيث إعداد التفاعل ، يتطلب TX-TL مصادر طاقة أولية وثانوية ، بالإضافة إلى الأحماض الأمينية والعوامل المساعدة والمواد المضافة وتسلسل الحمض النووي النموذجي. توفر ثلاثي فوسفات النيوكليوتيدات (NTPs) مصدر الطاقة الأساسي لدفع الحمض النووي الريبي المرسال الأولي (ATP و GTP و CTP و UTP) وتخليق البروتين (ATP و GTP فقط). لزيادة غلة TX-TL ، يتم تجديد NTPs من خلال هدم مصدر طاقة ثانوي ، مثل maltose14 و maltodextrin15 و glucose14 و 3-phosphoglycerate (3-PGA)16 و phosphoenolpyruvate17 و L-glutamate18. هذا النشاط الأيضي المتأصل متعدد الاستخدامات بشكل مدهش ، ولكنه لم يدرس بشكل جيد ، خاصة في أنظمة TX-TL الناشئة. لكل مصدر طاقة خصائص ومزايا متميزة من حيث إنتاجية ATP والاستقرار الكيميائي والتكلفة ، وهو اعتبار مهم لتفاعلات TX-TL الموسعة. وحتى الآن، وصلت البروتوكولات الحالية للإشريكية القولونية TX-TL إلى 4.0 ملغم/مل (~ 157 ميكرومتر) لنموذج بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP)، باستخدام مزيج من 3-PGA (30 ملليمتر)، والمالتوديكسترين (60 ملليمتر)، والريبوز D (30 ملليمتر) كمصدر ثانوي للطاقة19.

في الآونة الأخيرة ، كان هناك اهتمام متزايد بدراسة مسارات التخليق الحيوي للمستقلب الثانوي في أنظمة TX-TL20،21،22. على وجه التحديد ، تعد الأكتينوباكتيريا مصدرا رئيسيا للمستقلبات الثانوية ، بما في ذلك المضادات الحيوية والمواد الكيميائية الزراعية23,24. يتم إثراء جينوماتها بما يسمى مجموعات الجينات الاصطناعية الحيوية (BGCs) ، والتي تشفر المسارات الأنزيمية للتخليق الحيوي المستقلب الثانوي. لدراسة الأجزاء الوراثية للبكتيريا الأكتينوباكتيريا ومسارات التخليق الحيوي ، تم مؤخرا تطوير مجموعة من أنظمة TX-TL القائمة على العقديات 5،6،25،26. من المحتمل أن تكون أنظمة Streptomyces TX-TL المتخصصة هذه مفيدة للأسباب التالية: [1] توفير بيئة قابلة للطي للبروتين الأصلي للإنزيمات من Streptomyces spp.26 ؛ [2] الوصول إلى تجمع tRNA الأمثل للتعبير الجيني G + C (٪) العالي ؛ [3] الأيض الأولي النشط، الذي يحتمل اختطافه لتوريد سلائف التخليق الأحيائي؛ و [4] توفير الإنزيمات أو السلائف أو العوامل المساعدة من التمثيل الغذائي الثانوي الموجود في مستخلص الخلايا الأصلي. ومن ثم، فقد تم مؤخرا إنشاء مجموعة أدوات S.venezuelae TX-TL عالية الإنتاجية لتسخير هذه القدرات الفريدة5.

Streptomyces venezuelae هو مضيف ناشئ للبيولوجيا التركيبية مع تاريخ غني في التكنولوجيا الحيوية الصناعية5،27،28،29 وكنظام نموذجي لدراسة انقسام الخلايا والتنظيم الجيني في Actinobacteria30،31،32. تحتوي سلالة النوع الرئيسي ، S. venezuelae ATCC 10712 ، على جينوم كبير نسبيا يبلغ 8.22 ميجا بايت مع محتوى G + C بنسبة 72.5٪ (٪) (رقم الانضمام: CP029197) ، والذي يشفر تسلسل ترميز 7377 ، و 21 rRNAs ، و 67 tRNAs ، و 30 مجموعة جينية اصطناعية حيوية27. في البيولوجيا التركيبية ، S. venezuelae ATCC 10712 هو هيكل جذاب للتعبير غير المتجانس عن مسارات التخليق الحيوي. على عكس معظم بقع العقديات الأخرى ، فإنه يوفر العديد من المزايا الرئيسية ، بما في ذلك وقت المضاعفة السريع (~ 40 دقيقة) ، ومجموعة واسعة من الأدوات الوراثية والتجريبية5,28 ، ونقص التكتل الفطري ، والجراثيم في الوسائط السائلة28,33. وقد أظهرت العديد من الدراسات أيضا استخدام S. venezuelae للإنتاج غير المتجانس لمجموعة متنوعة من المستقلبات الثانوية ، بما في ذلك polyketides والببتيدات الريبوسومية وغير الريبوسومية 34،35،36،37،38. هذه الميزات مجتمعة تجعل هذه السلالة مضيف ميكروبي جذاب للبيولوجيا التركيبية وتطبيقات الهندسة الأيضية. في حين أن S. venezuelae ليس نموذج Streptomyces المهيمن للتعبير الجيني غير المتجانس ، مع مزيد من التطورات ، إلا أنه مستعد للاستخدام على نطاق أوسع في اكتشاف المنتجات الطبيعية.

تقدم هذه المخطوطة بروتوكولا مفصلا (الشكل 1) لنظام S. venezuelae TX-TL عالي الإنتاجية، والذي تم تحديثه من البروتوكول الأصلي المنشور سابقا26. في هذا العمل ، تم تحسين محلول الطاقة وظروف التفاعل لزيادة إنتاجية البروتين حتى 260 ميكروغرام / مل لبروتين مراسل mScarlet-I في تفاعل دفعة 4 ساعات ، 10 ميكرولتر ، باستخدام بلازميد قياسي ، pTU1-A-SP44-mScarlet-I. تم تصميم هذا البلازميد خصيصا لتمكين طرق مختلفة للكشف عن تعبير البروتين. كما تم تبسيط البروتوكول ، في حين تم تحسين نظام الطاقة لتقليل تعقيد وتكلفة إعداد تفاعلات خالية من الخلايا دون المساس بالعائد. جنبا إلى جنب مع نظام TX-TL الأمثل ، تم تطوير مكتبة من الأجزاء الوراثية لضبط التعبير الجيني الدقيق وكأدوات فلورسنت لمراقبة TX-TL في الوقت الفعلي ، وبالتالي إنشاء منصة متعددة الاستخدامات للنماذج الأولية للتعبير الجيني ومسارات التخليق الحيوي للمنتجات الطبيعية من Streptomyces spp. و Actinobacteria ذات الصلة.

في هذا العمل، يمكن استخدام البلازميد القياسي الموصى به (pTU1-A-SP44-mScarlet-I) لإنشاء سير عمل S. venezuelae TX-TL في مختبر جديد وهو متاح على AddGene (انظر الجدول التكميلي S1). يوفر pTU1-A-SP44-mScarlet-I للمستخدم المرونة اللازمة لدراسة إطارات القراءة المفتوحة الأخرى (ORFs). تم تحسين mScarlet-I ORF من الكودون للتعبير الجيني S. venezuelae. مروج SP44 هو مروج تأسيسي قوي نشط للغاية في كل من الإشريكية القولونية والستربتومايسيس spp.39. يحتوي البلازميد على موقعين فريدين لإنزيم التقييد (NdeI ، BamHI) للسماح بالاستنساخ الفرعي ل ORFs الجديدة في الإطار مع علامة FLAG-TERMINAL مشتركة ونظام علامة رابط الفلوريسين الزرنيخي (FlAsH). بدلا من ذلك ، يمكن إزالة كلتا العلامتين بإدراج كودون توقف بعد استنساخ جين جديد. مع هذا المتجه الأساسي ، تم إثبات التعبير عالي الغلة لمجموعة من البروتينات ، وهي البروتينات من مسار التخليق الحيوي لأوكسي تتراسيكلين ومركب الببتيد غير الريبوسومي غير المميز (NRPS) من العقدية ريموسوس (الشكل 2). من حيث الكشف عن الحمض النووي الريبوزي المرسال ، يحتوي البلازميد القياسي pTU1-A-SP44-mScarlet-I على أبتامر dBroccoli (في المنطقة 3'-untranslated) للكشف باستخدام مسبار 3,5-difluoro-4-hydroxybenzylidene imidazolinone (DFHBI). لزيادة المرونة، تم أيضا توفير مجموعة أدوات من أجزاء MoClo المتوافقة مع EcoFlex40 على AddGene، بما في ذلك متجه مكوك العقديات المتوافق مع EcoFlex (pSF1C-A-RFP/pSF2C-A-RFP) ومجموعة من البلازميدات المتغيرة pTU1-A-SP44 التي تعبر عن بروتين الفلور الأخضر الفائق (sfGFP) و mScarlet-I و mVenus-I و β-glucuronidase (GUS). على وجه الخصوص ، يشتق بلازميد pSF1C-A من pAV-gapdh28 ويتم علاجه من مواقع BsaI / BsmBI لتجميع MoClo. pSF1C-A-RFP/pSF2C-A-RFP يعادل pTU1-A-RFP/pTU2-A-RFP من EcoFlex40 ولكنه يحتوي على وظائف إضافية للاقتران وتكامل الكروموسومات في العقديات spp. باستخدام نظام phiC31 integrase28.

تتضمن المرحلة الأولى من البروتوكول نمو S. venezuelae ATCC 10712 أو سلالة وثيقة الصلة ، وحصاد الخلايا في المرحلة الأسية المتوسطة ، وخطوات غسل الخلايا ، والتوازن في المخازن المؤقتة S30A و S30B. تتطلب هذه المرحلة ثلاثة أيام ، ويمكن استخدام وقت نمو الخلايا لإعداد المكونات المتبقية كما هو موضح أدناه. ثم يتم تحليل الخلايا المحصودة عن طريق الصوتنة ، وتوضيحها ، وتخضع لتفاعل الجريان السطحي. في هذه المرحلة النهائية من التحضير ، يمكن تحضير مستخلصات الخلايا للتخزين على المدى الطويل عند -80 درجة مئوية لتقليل فقدان النشاط. لتجميع تفاعلات TX-TL باستخدام هذا البروتوكول ، يتم تقديم Streptomyces Master Mix (SMM) ، مع خيار تنسيق الحد الأدنى من حلول الطاقة (MES) الذي يعطي عوائد مماثلة. علاوة على ذلك ، يوصى بربط ثقافة جديدة من S. venezuelae ATCC 10712 من مخزون الجلسرين -80 درجة مئوية على صفيحة أجار GYM واحتضانها عند 28 درجة مئوية لمدة 48-72 ساعة على الأقل حتى تكون المستعمرات المفردة مرئية. يجب استخدام الثقافات الطازجة فقط للخطوات التالية.

Protocol

ملاحظة: انظر الجدول 1 والجدول 2 للحصول على وصفات لصفيحة GYM المتوسطة والأجار ومخازن الغسيل S30A و S30B.

1. إعداد الحلول والتوجيه العام

  1. احتفظ بجميع المحاليل والخلايا (ما بعد النمو) ومستخلصات الخلايا على الجليد بعد التحضير ، ما لم يتم ذكر استثناء.
  2. قم بتخزين المخزونات ل 1 M Mg-glutamate ، 4 M K-glutamate ، 40٪ (w / v) PEG 6000 ، 1 جم / مل من حمض البولي فينيل سلفونيك في درجة حرارة الغرفة ، وجميع المخزونات الأخرى عند -80 درجة مئوية. تقليل عدد دورات التجميد والذوبان لتجنب التحلل الكيميائي.
  3. لإعداد مخزونات حلول الطاقة (انظر الجدول 3) مثل 3-PGA (يتطلب تعديل الأس الهيدروجيني)، اتبع الإرشادات الواردة في بروتوكول E. coli TX-TL41.
    ملاحظة: جميع المكونات قابلة للذوبان بالكامل في ddH2O ويتم تخزينها كمركبات في الفريزر -80 درجة مئوية.
  4. إذابة الجليد عن المخزونات الفردية أو محاليل الطاقة (الموضحة لاحقا) على الجليد. تسخين مخزون الأحماض الأمينية عند 42 درجة مئوية مع دوامة لمدة ~ 15-30 دقيقة لذوبان جميع الأحماض الأمينية.
  5. نظرا لأن بعض الأحماض الأمينية (L-Cys و L-Tyr و L-Leu) تترسب على الجليد ، مع تقليل وقت الراحة ، اترك هذا المحلول في درجة حرارة الغرفة واستخدم دوامة للذوبان.
  6. أضف الكميات المحسوبة (الجدول 3) من محاليل المخزون والماء واخلطها جيدا باستخدام دوامة.
  7. Aliquot محلول الطاقة كما 20-100 ميكرولتر aliquots لكل أنبوب، أو حسب الرغبة، على الجليد وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى مزيد من الاستخدام.

2. إعداد خلايا S. venezuelae ATCC 10712

  1. اليوم 1 - إعداد وسائل الإعلام / المخزن المؤقت وما قبل الثقافة بين عشية وضحاها
    1. قم بإعداد 1 لتر من وسط سائل GYM المعقم في قارورة محيرة سعة 2 لتر ، كما هو موضح في الجدول 1. انظر جدول المواد للاطلاع على مصادر المعدات/المواد الكيميائية/الكواشف.
    2. تحضير 1 × 50 مل من وسط سائل GYM معقم في قارورة Erlenmeyer سعة 250 مل ، كما هو موضح في الجدول 1.
    3. قم بإعداد 100 مل من 1 M HEPES-KOH الرقم الهيدروجيني 7.5 ، 100 مل من 1 M MgCl2 ، و 500 مل من 4 م حلول NH4Cl لصنع 1 لتر من S30A و 1 لتر من مخازن الغسيل S30B. انظر الجدول 2 للاطلاع على الوصفات.
    4. إعداد ما قبل الثقافة بين عشية وضحاها. قم بتسخين 50 مل من الوسط السائل GYM المعقم مسبقا في قارورة Erlenmeyer سعة 250 مل إلى 28 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    5. قم بتلقيح مستعمرة واحدة من S. venezuelae ATCC 10712 (أو سلالة ذات صلة) من صفيحة أجار GYM إلى 50 مل من الوسط السائل GYM المحتضن مسبقا واحتضانه عند 28 درجة مئوية ، 200 دورة في الدقيقة لمدة 16 ساعة (بين عشية وضحاها قبل الثقافة).
  2. اليوم 2- إعداد ما قبل الثقافة النهارية وثقافة النمو الرئيسية.
    1. قم بتسخين 50 مل من الوسط السائل GYM المعقم مسبقا في قارورة Erlenmeyer سعة 250 مل عند 28 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    2. انقل 1 مل من الثقافة المسبقة الليلية إلى 50 مل من وسط سائل GYM قبل التسخين واحتضانه عند 28 درجة مئوية ، 200 دورة في الدقيقة لمدة 8 ساعات (قبل الزراعة أثناء النهار).
    3. بعد فترة النمو هذه ، تحقق من OD600 في مقياس الطيف الضوئي باستخدام تخفيف 1:10 مع وسط GYM معقم في كوفيت بلاستيكي 1 مل (طول مسار 1 سم).
      ملاحظة: يجب أن يكون OD600 قد وصل إلى 3-4 على الأقل. إذا كان هناك نمو ضعيف ، فمن المستحسن تكرار الخطوات 2.2.1-2.2.2.
    4. الاستزراع الفرعي 0.25 مل من الاستزراع المسبق النهاري إلى 1 لتر من وسط الصالة الرياضية السائل في قوارير محيرة سعة 2 لتر.
    5. يرج طوال الليل على حرارة 28 درجة مئوية، 200 دورة في الدقيقة لمدة 14 ساعة.
  3. اليوم 3-خلايا الحصاد
    1. بعد فترة الحضانة السابقة (14 ساعة) ، سجل OD600 للثقافة الرئيسية. تمييع الثقافة بين عشية وضحاها 1:10 مع وسط GYM الطازج لقياس OD600 .
      ملاحظة: كان من المفترض أن يصل OD600 إلى 3.0-4.0 في هذه المرحلة.
    2. إذا OD600<3.0 ، قم بزيادة سرعة الاهتزاز إلى 250-300 دورة في الدقيقة وتنمو حتى يتم الوصول إلى OD600 من 3.0. تنمو لمدة لا تزيد عن 2 ساعة إضافية (16 ساعة في المجموع).
    3. إذا OD600>3.0 ، انقل الثقافات إلى حاويات الطرد المركزي والتبريد بسرعة على الثلج الرطب لمدة 30 دقيقة.
    4. أثناء انتظار أن تبرد مزرعة الخلايا على الجليد ، قم بإعداد 4 مل من المخازن المؤقتة الطازجة 1 M dithiothreitol (DTT) و S30A و S30B ، كما هو موضح في الجدول 1 ، واحتفظ بها على الجليد. انظر جدول المواد للحصول على مصدر كيميائي / كاشف.
    5. قم بوزن أنبوب طرد مركزي فارغ سعة 50 مل مسبقا وقم بتبريده مسبقا عند -20 درجة مئوية.
    6. أضف 2 مل من 1 M DTT إلى 1 لتر من المخزن المؤقت S30A على الثلج واخلطه جيدا.
      ملاحظة: أضف DTT إلى المخازن المؤقتة للغسيل S30A وS30B فقط قبل استخدامها.
    7. خلايا الطرد المركزي عند 6000 × جم ، 4 درجات مئوية ، 10 دقائق ، وتخلص بعناية من المادة الفائقة في حركة سريعة وواحدة.
      ملاحظة: إذا كانت الكريات مضطربة، فقم بزيادة الاحتفاظ بالخلايا إلى أقصى حد باستخدام وسط GYM المتبقي واستمر في البروتوكول.
    8. أضف 500 مل من المخزن المؤقت S30A وأعد تعليق الخلايا عن طريق هز زجاجات الطرد المركزي بقوة حتى يتم تشتيت كتل الخلايا بشكل متجانس.
    9. قم بطرد الخلايا بسرعة 6000 × جم و 4 درجات مئوية و 6 دقائق وتخلص بعناية من المادة الفائقة.
      ملاحظة: على الرغم من أن حبيبات الخلايا ستكون أكثر صلابة في هذه المرحلة، إلا أن بعض الخلايا ستبقى معلقة (انظر الشكل 1). تعامل كما هو موضح في 2.3.7 واحتفظ بأكبر عدد ممكن من الخلايا.
    10. كرر الخطوات من 2.3.8 إلى 2.3.9.
    11. أضف 2 مل من 1 M DTT إلى 1 لتر من المخزن المؤقت S30B على الثلج واخلطه جيدا. أضف 500 مل من المخزن المؤقت S30B إلى الخلايا. كرر الخطوة 2.3.9.
    12. أعد تعليق حبيبات الخلايا في 10 مل من المخزن المؤقت S30B ونقلها إلى أنبوب الطرد المركزي 50 مل المبرد مسبقا والمبرد مسبقا. إذا لزم الأمر ، انقل الخلايا المتبقية باستخدام 5-10 مل إضافية من المخزن المؤقت S30B. املأ إلى 50 مل باستخدام S30B.
    13. خلايا الطرد المركزي عند 6000 × جم ، 4 درجات مئوية ، 10 دقائق ، وتخلص بعناية من المادة الفائقة.
    14. كرر الخطوة 2.3.13.
    15. اشفط بعناية ماصة S30B المتبقية باستخدام ماصة 100-200 ميكرولتر.
    16. وزن بيليه الخلايا الرطبة.
      ملاحظة: وزن حبيبات الخلايا الرطبة النموذجي ل 1 لتر من ثقافة GYM بين عشية وضحاها (OD600 = 3.0) هو ~ 4.5 جم.
    17. لكل 1 غرام من الخلايا الرطبة، أضف 0.9 مل من المخزن المؤقت S30B. أعد تعليق الخلايا باستخدام إما ماصة باستور أو دوامة.
    18. جهاز طرد مركزي لفترة وجيزة (~ 10 ثانية) يصل إلى 500 × جم لترسيب الخلايا.
      ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا عند هذه النقطة، ويمكن تجميد الخلايا إما على النيتروجين السائل أو الثلج الجاف وتخزينها عند -80 درجة مئوية، من أجل السلامة، ارتد معدات الحماية الشخصية المناسبة (PPE) عند التعامل مع النيتروجين السائل، بما في ذلك دروع الوجه والقفازات.

3. تحلل الخلايا عن طريق الصوتنة للحصول على مستخلص الخلية الخام

ملاحظة: في هذه المرحلة، يمكن للمستخدم اختيار تعطيل الخلايا عن طريق الصوتنة إما في كسور 1 مل (الخيار 1) أو كتعليق خلية أكبر (5 مل) في أنبوب 50 مل (الخيار 2). تم تفصيل كلا الخيارين أدناه لضمان قابلية التكاثر ، حيث يمكن أن يتغير الحجم النهائي لتعليق الخلية بسبب فقدان الخلايا أثناء خطوات الحصاد والغسيل السابقة. يجب على مستخدم جديد محاولة الخيار 2.1 أولا لإنشاء البروتوكول.

  1. تحلل الخلية عن طريق صوتنة في كسور 1 مل
    1. باستخدام طرف ماصة 1 مل (قطع نهاية الطرف لزيادة حجم التجويف) ، انقل 1 مل من تعليق الخلية إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 2 مل.
      ملاحظة: إذا تم تجميد الخلايا، فقم بإذابة أنبوب 50 مل الذي يحتوي على الكريات في الماء الفاتر بسرعة قبل تحلل الخلايا. انقل الأنبوب إلى الثلج الرطب بمجرد أن تبدأ الكريات في إذابة الجليد ، وبرد لمدة 10 دقائق.
    2. ضع كل أنبوب طرد مركزي صغير في كوب من الماء المثلج ، باستخدام رف أنبوب بلاستيكي لتثبيت الأنبوب للصوتنة.
      ملاحظة: نظرا لحساسية مستخلص الخلية لارتفاع درجة الحرارة ، من الأهمية بمكان التأكد من أن الأنابيب لا تسخن لمنع هطول الأمطار البروتينية وتقليل النشاط الأنزيمي.
    3. استخدم مسبار صوتي بطرف قطره 3 مم وقم بتنظيفه باستخدام 70٪ (v / v) من الإيثانول والماء المقطر المزدوج (ddH2O). اخفض طرف الصوت في تعليق الخلية حتى يكون ~ 1 سم تحت سطح السائل.
    4. أدخل الإعدادات التالية في الصوتنة: تردد 20 كيلو هرتز ، سعة 65٪ ، نبضة 10 ثانية في الوقت المحدد ، نبضات 10 ثانية وقت إيقاف التشغيل ، 1 دقيقة إجمالي وقت الصوتنة.
    5. قم بتشغيل بروتوكول الصوتنة. حرك الأنبوب لأعلى / لأسفل وجانبيا خلال أول دورتين للراحة لضمان صوتنة الخلايا بالتساوي. سجل مدخلات الطاقة.
      ملاحظة: للسلامة، ارتد واقيا مناسبا للسمع أثناء الصوتنة. سوف تنخفض اللزوجة مع تعطل الخلايا ، ويجب أن تتحول حبيبات الخلايا الرطبة الكريمية الشاحبة إلى سائل بني متجانس. مدخلات الطاقة الموصى بها هي 240 J لكل مل من الخلايا الرطبة. إذا تم تحلل الخلايا جزئيا فقط ، فسيظل التعليق يظهر بلون كريمي مع كتل لزجة من الخلايا ، خاصة على جانبي الأنبوب.
    6. عكس الأنبوب 2-3 مرات وكرر صوتنة لدورة واحدة أو دورتين إضافيتين 10 ثانية ، والاختلاط بشكل متكرر حتى تتعطل الخلايا بالكامل.
  2. تحلل الخلية عن طريق صوتنة تعليق الخلية 5 مل
    1. إذا تم تجميد الخلايا ، فقم بإذابة أنبوب 50 مل الذي يحتوي على الكريات في الماء الفاتر بسرعة مع الاهتزاز قبل تحلل الخلايا. انقل الأنبوب إلى الثلج الرطب بمجرد أن تبدأ الكريات في إذابة الجليد ، وبرد لمدة 10 دقائق.
    2. قم بتدوير الأنبوب لفترة وجيزة عند 500 × g لترسيب الخلايا.
    3. ضع الأنبوب سعة 50 مل في كوب من الماء المثلج للصوتنة.
      ملاحظة: نظرا لحساسية مستخلص الخلية لارتفاع درجة الحرارة ، من الأهمية بمكان التأكد من أن الأنابيب لا تسخن لمنع هطول الأمطار البروتينية وتقليل النشاط الأنزيمي.
    4. استخدم مسبار صوتي بطرف قطره 6 مم وقم بتنظيفه باستخدام 70٪ (v / v) من الإيثانول و ddH2O (انظر المخطط المرئي للمسبار 6 مم في الشكل 1). اخفض طرف الصوتة في تعليق الخلية (~ 5 مل) حتى يصبح ~ 1 سم تحت سطح السائل.
    5. أدخل الإعدادات التالية في الصوتنة: تردد 20 كيلو هرتز ، سعة 65٪ ، نبضة 10 ثانية في الوقت المحدد ، نبضات 10 ثانية وقت إيقاف التشغيل ، 1 دقيقة إجمالي وقت الصوتنة لكل مل من الخلايا الرطبة (5 دقائق في المجموع).
    6. قم بتشغيل بروتوكول الصوتنة. حرك الأنبوب لأعلى / لأسفل وجانبيا خلال أول دورتين للراحة لضمان صوتنة الخلايا بالتساوي.
      ملاحظة: للسلامة، ارتد واقيا مناسبا للسمع أثناء الصوتنة. سوف تنخفض اللزوجة مع تعطل الخلايا ، ويجب أن تتحول حبيبات الخلايا الرطبة الكريمية الشاحبة إلى سائل بني متجانس. سجل مدخلات الطاقة. يوصى بإدخال الطاقة الأمثل من 240 J لكل مل من الخلايا الرطبة (~ 1200 J في المجموع من 5 دقائق صوتنة).
    7. إذا بقيت بعض الخلايا سليمة، اتبع الإرشادات الواردة في الخطوة 3.1.5.
    8. نقل مستخلصات الخلية إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيق 2 مل.

4. توضيح مستخلص الخلية ورد فعل الجريان السطحي

  1. جهاز طرد مركزي للخلايا المحللة عند 16000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية لإزالة حطام الخلية. انقل المادة الفائقة إلى أنابيب أجهزة طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 مل كأجهزة إرسال مركزية سعة 1 مل.
  2. قم بإجراء تفاعل الجريان السطحي لمستخلصات الخلايا. احتضن الأنابيب سعة 1.5 مل التي تحتوي على مستخلصات الخلايا عند 30 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة على كتلة حرارية أو حاضنة دون اهتزاز.
  3. جهاز الطرد المركزي تستخرج الخلية عند 16000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. قم بتجميع الغواصات الفائقة في أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل. اخلط المادة الفائقة عن طريق قلب الأنبوب خمس مرات حتى يصبح متجانسا ، ثم احتفظ به على الجليد. عكس بلطف لتجنب تشكيل فقاعات الهواء.
  4. تمييع 10 ميكرولتر من مستخلص الخلية 100 ضعف باستخدام المخزن المؤقت S30B وقياس تركيز البروتين الكلي باستخدام فحص برادفورد مع ثلاث تكرارات تقنية (انظر المادة التكميلية S2 للحصول على إرشادات فحص برادفورد).
  5. إذا كان تركيز البروتين 20-25 ملغم / مل ، فانقل مستخلصات الخلايا على شكل أليكوت 100 ميكرولتر إلى أنابيب جديدة 1.5 مل ، وتجميد الفلاش في النيتروجين السائل ، وتخزينها عند -80 درجة مئوية.
    ملاحظة: للسلامة، ارتد معدات الوقاية الشخصية المناسبة عند التعامل مع النيتروجين السائل، بما في ذلك دروع الوجه والقفازات.
  6. إذا كان تركيز البروتين <20 ملغم/مل، كرر خطوات إعداد المستخلص الخام لضمان أن تكون مستخلص الخلايا عالي الجودة وغلة TX-TL قابلة للمقارنة مع العمل المنشور سابقا5.

5. إعداد قالب الحمض النووي البلازميد

  1. قم بتنقية بلازميد pTU1-A-SP44-mScarlet-I (أصل pUC19) من سلالة بلازميد E. coli المحولة حديثا (DH10β ، JM109) المزروعة في 50 مل من ثقافة LB (مع 100 mg / mL carbenicillin) باستخدام مجموعة تنقية الحمض النووي البلازميد المناسبة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
  2. قم بإزالة البلازميد في 2 × 300 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز واجمع بين الكسور.
  3. أضف 0.1 مجلدات (66 ميكرولتر) من خلات الصوديوم 3 M (الرقم الهيدروجيني 5.2).
  4. أضف 0.7 وحدة تخزين (462 ميكرولتر) من الأيزوبروبانول.
  5. احتضان الحمض النووي عند -20 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  6. جهاز طرد مركزي عند 16000 × جم لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية وتخلص من المادة الفائقة.
  7. أضف 2 مل من 70٪ (v / v) من الإيثانول إلى حبيبات الحمض النووي.
  8. عكس الأنبوب 3-4 مرات لإعادة تعليق حبيبات الحمض النووي البلازميد.
  9. جهاز طرد مركزي عند 16000 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية وتخلص من المادة الفائقة.
  10. كرر الخطوات من 5.7 إلى 5.9 وقم بإزالة كافة السوائل المرئية.
  11. جفف حبيبات الحمض النووي بالهواء لمدة 10-30 دقيقة أو جففها لمدة 5 دقائق باستخدام جهاز طرد مركزي فراغي.
  12. أعد تعليق الكريات المجففة مع 600 ميكرولتر من ddH2O الخالي من النواة.
  13. قياس تركيز الحمض النووي ونقائه باستخدام مقياس الطيف الضوئي.
  14. تحضير 50-100 ميكرولتر aliquots وتخزينها في -20 درجة مئوية.
    ملاحظة: يوصى بتركيز عال للحمض النووي في حدود 500-1000 نانوغرام/ميكرولتر بسبب قيود الحجم الضيقة للتفاعلات الخالية من الخلايا. تمييع مخزون الحمض النووي البلازميد إلى 80 نانومتر ؛ 168 نانوغرام / ميكرولتر pTU1-A-SP44-mScarlet-I بلازميد يعادل 80 نانومتر.

6. تحضير محلول الستربتومايسيس ماستر ميكس (SMM)

  1. محلول الأحماض الأمينية
    1. استخدم مجموعة أخذ عينات الأحماض الأمينية لتجنب الأخطاء اليدوية وتقليل وقت التحضير، باتباع تعليمات الشركة المصنعة المقدمة عبر الإنترنت.
    2. تمييع محلول مخزون الأحماض الأمينية 20x باستخدام ddH2O إلى تركيز نهائي قدره 6 mM (5 mM L-Leu).
    3. مزيد من التخفيف إلى 2.4 mM (2 mM L-Leu) داخل محلول SMM 2.4x (انظر الجدول 3).
      ملاحظة: التركيز النهائي في تفاعل TX-TL هو 1 mM 19x الأحماض الأمينية و 0.83 mM L-Leu.
  2. حلول الطاقة والمواد المضافة
    1. قم بإعداد المكونات الأخرى في محلول SMM 2.4x باتباع الوصفة الموضحة في الجدول 3.
    2. بدلا من ذلك ، قم بإعداد محلول الحد الأدنى للطاقة 2.4x (MES) ، باتباع الوصفة الموضحة في الجدول 3.

7. إعداد رد فعل S. venezuelae TX-TL قياسي

  1. قم بإذابة مستخلص الخلية ومحلول SMM (أو MES) والحمض النووي البلازميد على الجليد. قم بتبريد طبق 384 بئرا مسبقا عند -20 درجة مئوية.
  2. إعداد تفاعلات TX-TL حيث يكون 25٪ من الحجم هو الحمض النووي البلازميد ، و 33.33٪ هو مستخلص الخلية ، و 41.67٪ هو محلول SMM ؛ احتفظ بها على الجليد لتجنب التحيز في وقت البدء.
    ملاحظة: تم توفير قالب TX-TL قياسي (الجدول 4) لحساب حجم الكواشف اللازمة استنادا إلى عدد التفاعلات. الحجم القياسي لتفاعل 33 ميكرولتر هو كما يلي: 11 ميكرولتر من مستخلص الخلية ، و 13.75 ميكرولتر من SMM ، و 8.25 ميكرولتر من الحمض النووي البلازميد.
  3. قم بتدوير الخليط بلطف لمدة ~ 5 ثوان عند إعداد منخفض السرعة لضمان أن يكون المحلول متجانسا. تجنب الرغوة / تكوين الفقاعات.
  4. انقل 10 ميكرولتر من الحصص إلى ثلاثة آبار من صفيحة 384 بئرا كثلاثي تقني دون إدخال فقاعات الهواء. أغلق اللوحة بغطاء شفاف وقم بالدوران بسرعة 400 × جم لمدة 5 ثوان.
  5. احتضن التفاعل عند 28 درجة مئوية إما في حاضنة (لقراءات نقطة النهاية) أو قارئ لوحة دون اهتزاز.
    ملاحظة: تتطلب التفاعلات عادة 3-4 ساعات للوصول إلى الاكتمال. انظر المواد التكميلية S2 للحصول على إرشادات حول قارئ الألواح والقياسات القياسية mScarlet-I.

النتائج

يتم توفير هذا البروتوكول التفصيلي كمثال لمساعدة المستخدم على إنشاء نظام Streptomyces TX-TL استنادا إلى سلالة نموذج S. venezuelae ATCC 10712 (الشكل 1). قد يسعى المستخدم إلى دراسة سلالات العقديات الأخرى. ومع ذلك ، فإن مراحل النمو / الحصاد للسلالات الأخرى ذات أوقات المضاعفة الأطول أو تفضيلات النمو المتميزة ستحتاج إلى تحسين مخصص لتحقيق نتائج الذروة. بالنسبة للنتيجة التمثيلية ، تم تحسين بروتين الفلورسنت mScarlet-I من البلازميد القياسي pTU1-A-SP44-mScarlet-I (الشكل 2 والشكل 3) لتوفير تعبير عالي الإنتاجية في S. venezuelae TX-TL مع مجموعة من طرق الكشف (SDS-PAGE ، التألق). بالإضافة إلى ذلك ، تم تعديل هذا البلازميد القياسي لإثبات تخليق مجموعة من إنزيمات المستقلب الثانوية من S. rimosus (الشكل 2)5. وأخيرا، يظهر سير العمل المحتمل للتركيب الحيوي للمنتجات الطبيعية الموسعة كمخطط لاستخدام مسار نموذجي من المراحل المبكرة من التخليق الحيوي للهيم. من المحتمل أن يكون سير العمل قابلا للتكيف مع مسارات التخليق الحيوي المستقلب الثانوية الأخرى. كمبدأ توجيهي ، يجب أن يوفر هذا البروتوكول عائدا لا يقل عن 2.8 ميكرومتر ل sfGFP و 3.5 ميكرومتر ل mScarlet-I / mVenus من تعبير البلازميدات المقدم على AddGene. تسمح هذه الأرقام بتباين الدفعات النموذجي (حتى 28٪) الذي لوحظ في البيانات السابقة5 ، على الرغم من أن الغلة أكبر من 10 ميكرومتر mScarlet-I قد تم تحقيقها مع الدفعات المثلى (بيانات غير منشورة).

قياس S. venezuelae TX-TL لجين mScarlet-I باستخدام خمس طرق متميزة
يظهر التعبير عن البلازميد القياسي pTU1-A-SP44-mScarlet-I ، مع قياس تعبير mScarlet-I باستخدام خمس طرق مختلفة: 1. قياس التألق في الوقت الفعلي للحمض النووي الريبي المرسال باستخدام dBroccoli aptamer ، 2. قياس التألق في الوقت الفعلي لبروتين mScarlet-I غير الناضج باستخدام نظام علامة FlAsH ، 3. قياس التألق في الوقت الفعلي لبروتين mScarlet-I الناضج ، 4. تلطيخ التألق في الجل ل mScarlet-I باستخدام علامة FlAsH ، و 5. تلطيخ أزرق كوماسي لإجمالي البروتينات الخالية من الخلايا. بالنسبة لهذه البيانات ، تم إعداد التفاعلات في أنابيب أجهزة الطرد المركزي الدقيقة سعة 2 مل كتفاعلات 33 ميكرولتر (لعينات نقطة النهاية) أو كثلاثي تقني 10 ميكرولتر في لوحات 384 بئرا في قارئ الصفائح. تم تنقية بروتين mScarlet-I ثلاثي العلامات (N-terminal His6 و C-terminal Flag و C-terminal FlAsH) بشكل منفصل لإنشاء معيار معايرة للقياسات ، باستخدام بلازميد pET15b-mScarlet-I ، والذي تم وصفه بشكل أكبر في المواد التكميلية S2. وترد بيانات هذه التجارب في الشكل 3. مزيد من التفاصيل عن طريقة تلطيخ التألق في الجل متوفرة في المواد التكميلية S3.

س. فنزويلا TX-TL من التخليق الحيوي للهيم في مرحلة مبكرة
ليكون بمثابة مسار اصطناعي حيوي طبيعي للمنتج النموذجي ، تم إجراء التخليق الحيوي "وعاء واحد" ل uroporphyrinogen III (uro'gen III) باستخدام بلازميد التعبير pTU1-A-SP44-hemC-hemD / cysGA-hemB 5. تم اختيار هذا المسار الاصطناعي الحيوي النموذجي لأن uro'gen III حساس للغاية للأكسجين ويتأكسد بسرعة (فقدان ستة إلكترونات) إلى uroporphyrin III ، والذي يعرض تألقا أحمر قويا. وهذا يتيح سهولة اكتشاف التفاعل في الوقت الحقيقي باستخدام قياسات التألق و / أو HPLC-MS (الشكل 4) ، كما هو موضح سابقا5. بالإضافة إلى ذلك ، تمت دراسة هذه التفاعلات باستخدام إما طريقة دفعية أو شبه مستمرة. التفاعل شبه المستمر هو استراتيجية ، والتي تستخدم جهاز غسيل الكلى الدقيق42,43 الذي يوفر طاقة إضافية (NTPs ، مصدر الطاقة الثانوي) والأحماض الأمينية لإطالة وقت التفاعل وزيادة غلة تخليق البروتين. هنا ، يتم استخدام الطريقة شبه المستمرة لتوسيع نطاق تفاعل نموذج الهيم وفصل بروتينات TX-TL عن منتج التفاعل لتسهيل التنقية والتحليل بواسطة HPLC-MS. ويمكن الاطلاع على مزيد من التفاصيل عن الأساليب في المواد التكميلية S4 أو للاطلاع على البيانات، انظر العمل السابق5. كما تم وصف التفاعلات شبه المستمرة الخالية من الخلايا في العمل السابق42,43. من المحتمل أن يكون مثال سير العمل التخطيطي الموضح هنا (الشكل 4) قابلا للتكيف مع مسارات التخليق الحيوي للمنتجات الطبيعية الأخرى.

figure-results-4466
الشكل 1: نظرة عامة على بروتوكول Streptomyces venezuelae TX-TL. ويرد موجز للبروتوكول، بما في ذلك إطار زمني موصى به مدته ثلاثة أيام. يتم تقسيم البروتوكول إلى مراحل متميزة من نمو الخلايا ، وحصاد الخلايا ، وغسل الخلايا ، وتحلل الخلايا عن طريق الصوتنة ، والتوضيح ، وتفاعل الجريان السطحي ، وإعداد المزيج الرئيسي (SMM) ، وإعداد الحمض النووي البلازميد ، وتجميع تفاعل TX-TL. يتم وصف البروتوكول الكامل بالتفصيل داخل النص ، إلى جانب الإرشادات والنصائح العملية. الاختصارات: SMM = Streptomyces Master Mix; TX-TL = النسخ والترجمة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-5332
الشكل 2: تخليق البروتين عالي الغلة من جينات G + C عالية (٪) (أ) تخليق بروتينات الفلورسنت sfGFP و mVenus-I و mScarlet-I. (ب) تخليق إنزيمات التخليق الأحيائي من العقدية الريموسوس. اختصار: EV = متجه فارغ; NRPS = تركيب الببتيد غير الريبوسومي. تم تعديل الرقم من 5. يرجى الاطلاع على البروتوكول والملفات التكميلية لإعداد التفاعل والمنهجية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-6062
الشكل 3: قياس TX-TL بخمس طرق باستخدام بلازميد pTU1-A-SP44-mScarlet-I. (أ) تصميم البلازميد بما في ذلك السمات التالية: SP44 هو مروج تأسيسي قوي نشط في العقديات spp. و E. coli؛ pET-RBS مشتق من بلازميدات التعبير pET وهو نشط للغاية في كل من Streptomyces spp. و E. coli5,40 ؛ جين mScarlet-I المحسن للعقديات الكودونية ، والذي يشفر مشتق بروتين الفلورسنت الأحمر44 ؛ C-terminal FLAG-tag لتنقية كروماتوغرافيا التقارب أو الكشف عن النشاف الغربي ؛ علامة FlAsH الطرفية C لوضع العلامات الفلورية لتلطيخ الجل أو القياس في الوقت الفعلي لتخليق البروتين الوليد ؛ dBroccoli aptamer لقياس الحمض النووي الريبوزي المرسال في الوقت الحقيقي باستخدام مسبار DFHBI ؛ Bba_B0015 منهي النسخ ، والتي هي ذات كفاءة عالية في S. venezuelae ATCC 107125 ؛ علامة مقاومة الأمبيسلين و pUC19 أصل النسخ المتماثل. (ب) تعبير الحمض النووي الريبوزي المرسال في الوقت الحقيقي، المكتشف باستخدام أبتامر dBroccoli ومسبار DFHBI (الإثارة 483-14 نانومتر، الانبعاث 530-30 نانومتر). (ج) الكشف عن تخليق البروتين الوليد في الوقت الحقيقي باستخدام مسبار الفلورسنت FlAsH-EDT2 (الإثارة 500-10 نانومتر ، الانبعاثات 535-10 نانومتر). (د) قياس التألق في الوقت الحقيقي لتوليف mScarlet-I (الإثارة 565-10 نانومتر ، الانبعاث 600-10 نانومتر). (ه) تلطيخ في الجل باستخدام مسبار الفلورسنت FlAsH-EDT2. (و) تلطيخ الكوماسي الأزرق لمجموع بروتينات TX-TL مع معيار His6-mScarlet-I المنقى للمقارنة. تم تشغيل التفاعلات في ظل الظروف الموضحة في البروتوكول مع 40 نانومتر من قالب الحمض النووي البلازميد. يتم تمثيل جميع بيانات التألق على أنها RFU ، ويتم تمثيل أشرطة الخطأ (الانحراف المعياري لثلاث تكرارات تقنية) داخل منطقة مظللة رمادية. الاختصارات: TX-TL = النسخ والترجمة; FlAsH = fluorescein hairpin. DFHBI = 3,5-ثنائي فلورو-4-هيدروكسي بنزيليدين إيميدازولينون; RFU = وحدات التألق النسبية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-8426
الشكل 4: سير العمل التخطيطي للتفاعل شبه المستمر S. venezuelae TX-TL. مثال على سير العمل للمنتج الطبيعي TX-TL ، باستخدام أوبرون التخليق الحيوي للهيم في المرحلة المبكرة والتحليل النهائي بواسطة HPLC-MS. يتم تفصيل ردود الفعل والتحليل في المواد التكميلية. تم تعديل الرقم من 5. الاختصارات: SMM = Streptomyces Master Mix; TX-TL = النسخ والترجمة; ALA = 5-حمض أمينوليفولينيك. SPE = استخراج الطور الصلب ؛ ESI-MS = قياس الطيف الكتلي لتأين رذاذ الإلكترون ؛ HPLC-MS = كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء - قياس الطيف الكتلي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الجدول 1: وصفة لوسط نمو البكتيريا GYM ولوحة أجار GYM. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 2: الكواشف لإعداد مخازن الغسيل S30A و S30B. تم اقتباس هذه المعلومات من Kieser et al. 45 الاختصار: DTT = ديثيوثريتول. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 3: وصفة لصنع حلول S. venezuelae MES و SMM. الاختصارات: MES = الحد الأدنى من حل الطاقة; SMM = ستربتومايسيس ماستر ميكس; NTP = ثلاثي فوسفات النيوكليوسيد. PEG 6000 = البولي ايثيلين جلايكول 6000 ; 3-PGA = 3-فوسفوغليسيرات. G6P = الجلوكوز 6-الفوسفات; PVSA = حمض البولي فينيل سلفونيك. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 4: وصفة لتفاعل S. venezuelae TX-TL. الاختصارات: MES = الحد الأدنى من حل الطاقة; SMM = ستربتومايسيس ماستر ميكس; TX-TL = النسخ والترجمة. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول التكميلي S1: البلازميدات لسير عمل S. venezuelae TX-TL. الاختصار: TX-TL = النسخ والترجمة. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

المواد التكميلية S2: إعداد معيار المعايرة mScarlet-I وقياسات قارئ اللوحة. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

المواد التكميلية S3: طرق FlAsH-tag. اختصار: FlAsH = fluorescein hairpin. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

المواد التكميلية S4: تفاعل شبه مستمر ، تنقية ، و HPLC-MS. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

Discussion

في هذه المخطوطة، تم وصف بروتوكول S. venezuelae TX-TL عالي الإنتاجية بخطوات مفصلة يسهل إجراؤها لكل من المستخدمين ذوي الخبرة والجدد لأنظمة TX-TL. تمت إزالة العديد من الميزات من بروتوكولات Streptomyces45 و E. coli TX-TL41 الحالية لإنشاء بروتوكول الحد الأدنى ، ولكنه عالي الإنتاجية ل S. venezuelae TX-TL5,26. سير العمل الموصى به هنا هو التأكد من أن S. venezuelae ينمو بسرعة في الوسط الغني المختار ، ليكون قادرا على تطعيم الثقافة النهائية في المساء. هذا يسمح بحصاد الخلايا في ذروة النمو في صباح اليوم التالي ويسمح للمستخدم بحصاد وإعداد مستخلص الخلية النشط في نفس اليوم. من خلال اتباع هذا البروتوكول المبسط ، من المتوقع أن يتمكن باحث واحد من إكمال البروتوكول بسهولة في إطار مدته ثلاثة أيام. كما تم توفير مجموعة أدوات بلازميد تكميلية لنظام S. venezuelae TX-TL ، بما في ذلك نظام بلازميد تعبير قوي (pTU1-A-SP44-mScarlet-I) ، والذي يوفر وظائف واسعة لتحليل mRNA / البروتين. يتم تشغيل هذا البلازميد القياسي بواسطة مروج SP44 التأسيسي النشط للغاية في مجموعة من Streptomyces spp. وفي الإشريكية القولونية39. لإثبات الإمكانات الأولية لمجموعة أدوات S. venezuelae TX-TL ، تظهر النتائج التمثيلية التوليف عالي الغلة لمجموعة من البروتينات الفلورية ، وإنزيمات المستقلب الثانوية ، والتخليق الحيوي لمسار منتج طبيعي نموذجي (من التخليق الحيوي للهيم).

بشكل عام ، يحتوي البروتوكول على وصف مفصل لنظام S. venezuelae TX-TL ، بالإضافة إلى نصائح عملية لإعداد المكونات الأساسية الثلاثة لتفاعل TX-TL: (1) مستخلص الخلية ، (2) محلول Streptomyces Master Mix (SMM) ، و (3) الحمض النووي البلازميد. لا يتطلب هذا البروتوكول معدات متخصصة ولا يتطلب سوى مهارات روتينية في علم الأحياء الدقيقة والكيمياء الحيوية. وبالتالي ، فإنه في متناول معظم المختبرات. البروتوكول مناسب للتفاعلات الصغيرة الحجم (10-100 ميكرولتر) والتفاعلات على نطاق أوسع (~ 2.5 مل) ، على الرغم من أن بعض التحسين في حجم / تهوية التفاعل قد يؤثر على إنتاجية البروتين. حجم التفاعل الموصى به هو 33 ميكرولتر في أنبوب 2 مل أو 10 ميكرولتر في صفيحة 384 بئر. يستغرق مستخلص الخام خمسة أيام للتحضير من قبل شخص واحد بدءا من مخزون الجلسرين. ينتج كل لتر (لتر) من الثقافة ما لا يقل عن 5 مل من مستخلص الخلايا (أي ما يعادل ~ 1500 × 10 ميكرولتر من تفاعلات TX-TL) - وهذا تقدير متحفظ ويمثل فقدان العينة أثناء خطوات الغسيل وتوضيح مستخلص الخلية. كل مرحلة من مراحل البروتوكول مستقلة ويمكن تحسينها من قبل المستخدم لتلبية احتياجاته. أحد القيود الرئيسية لجميع الأنظمة الخالية من الخلايا هو تباين الدفعات46,47. تتضمن العوامل العامة خطأ السحب وتجربة المستخدم واختلاف دفعات الوسائط واختلافات المعدات. نحن نقدم على وجه التحديد مزيجا رئيسيا لتقليل خطأ السحب وتقديم تعليمات مفصلة تغطي استخدام الوسائط والمعدات. حتى الآن ، البروتوكول قابل للتكرار من قبل مجموعة من المستخدمين في خمس مجموعات بحثية على الأقل في المملكة المتحدة. ومع ذلك ، فمن غير المعروف ما هو الدور الذي يساهم فيه التباين البيولوجي في تقلب الدفعات الخالية من الخلايا. إلى جانب الاختلافات العالمية في تنظيم التعبير الجيني ، تم الإبلاغ عن لدونة الجينوم في Streptomyces spp. على نطاق واسع وهي مساهم محتمل48. للتحقيق في اختلاف الدفعات ، يوصى بزراعة ما يصل إلى أربع ثقافات منفصلة 1 لتر مشتقة من أربع مستعمرات مفردة تزرع بين عشية وضحاها. في السابق ، لوحظ تباين يصل إلى 28٪ (من حيث الانحراف المعياري) بين أربع دفعات بيولوجية (4 لتر لكل دفعة مقدمة ~ 20 مل من مستخلص الخلية)5. واستنادا إلى هذه البيانات، فإن الحد الأدنى المعقول لهدف المستخدم الجديد هو 2.8 ميكرومتر ل sfGFP و 3.5 ميكرومتر mScarlet-I/mVenus-I باستخدام البلازميدات المتوفرة على AddGene- هذه الأهداف أقل بنسبة 30٪ من المتوسط الملاحظ في البيانات السابقة. إذا كنت ترغب في تحليل HPLC-MS النهائي ، فيمكن إزالة PEG 6000 من الخلطات الرئيسية ، على الرغم من أنه يمكن توقع انخفاض في إجمالي عائد TX-TL بنسبة تصل إلى 50٪.

من حيث إمكانات الأنظمة المتخصصة الخالية من الخلايا العقدية5,6 ، هناك رغبة متزايدة في تطوير أدوات مختبرية رطبة جديدة لتطبيقات التنقيب البيولوجي مثل المنتجات الطبيعية. جنس العقديات غارق في تاريخ اكتشاف المنتجات الطبيعية، بما في ذلك المضادات الحيوية ومبيدات الأعشاب والأدوية الصيدلانية49. وقد كشفت المعرفة المتزايدة المكتسبة من مشاريع تسلسل الجينوم الكامل وأحدث أدوات المعلوماتية الحيوية50،51،52 عن مستوى غير مسبوق من المنتجات الطبيعية المشفرة بواسطة BGCs داخل الجينومات الميكروبية53. وسيتطلب إطلاق العنان لهذه المعلومات الجينية - التي من المتوقع أن تحتوي على أدوية / مواد كيميائية وإنزيمات جديدة مفيدة للتكنولوجيا الحيوية - تطوير استراتيجيات جديدة للبيولوجيا التركيبية، بما في ذلك أنظمة تعبير جديدة ومجموعة من أدوات الهندسة الأيضية54. تعد أنظمة TX-TL المتخصصة القائمة على العقديات مفيدة لدراسة الجينات والعناصر التنظيمية من الأكتينوباكتيريا والجينومات ذات الصلة للأسباب التالية: [1] توافر بيئة قابلة للطي للبروتين الأصلي26 ، [2] الوصول إلى تجمع tRNA الأمثل للتعبير الجيني G + C (٪) العالي ، و [3] التمثيل الغذائي الأولي النشط للإمداد المحتمل للسلائف الاصطناعية الحيوية. بالإضافة إلى ذلك، تتمثل إحدى المزايا الرئيسية للأنظمة الخالية من الخلايا في التوصيف عالي الإنتاجية للأجزاء الوراثية والتعبير الجيني، باستخدام تسلسل الجيل التالي13 وروبوتات مناولة السوائل الصوتية8،11،12. باختصار ، توفر مجموعة أدوات S. venezuelae TX-TL5 أداة تكميلية في مجال البيولوجيا التركيبية للمنتجات الطبيعية. ستدعم مجموعة أدوات S. venezuelae TX-TL مواصلة تطوير S. venezuelae كنظام نموذجي وتوفر طريقة لهندسة أجزاء / أدوات البيولوجيا التركيبية الجديدة واستكشاف مسارات وإنزيمات التخليق الحيوي للمستقلب الثانوي.

Disclosures

ويعلن صاحبا البلاغ أنهما لا يملكان مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgements

يود المؤلفون أن يعترفوا بالدعم البحثي التالي: EPSRC [EP/K038648/1] ل SJM كPSR مع PSF. قامت Wellcome Trust برعاية زمالة ISSF ل SJM مع PSF في إمبريال كوليدج لندن. منحة الجمعية الملكية البحثية [RGS\R1\191186]; جائزة Wellcome Trust SEED [217528/Z/19/Z] ل SJM في جامعة كينت؛ ومنحة الدكتوراه من صندوق أبحاث التحديات العالمية (GCRF) ل KC في جامعة كينت.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
2.5 L UltraYield FlaskThomson931136-B
3-PGA (>93%)SigmaP8877
384 Well Black/Clear Bottom PlateThermoFisher10692202
Ammonium chloride (98%)Fluorochem44722
ATP, CTP, UTP, GTP (100 mM solution, >99%)ThermoFisherR0481
Carbenicillin (contact supplier for purity)MelfordC46000-25.0
D-(+)-glucose (contact supplier for purity)MelfordG32040
DFHBI (≥98% - HPLC)SigmaSML1627
DTT (contact supplier for purity)MelfordMB1015
FlAsH-EDT2 (contact supplier for purity)Santa Cruz Biotechsc-363644
Glucose-6-phosphate (>98%)SigmaG7879
HEPES Free Acid (contact supplier for purity)MelfordB2001
L-glutamic acid hemimagnesium salt tetrahydrate (>98%)Sigma49605
Magnesium chloride (98%)Fluorochem494356
Malt extractSigma70167-500G
PEG-6000Sigma807491
Pierce 96-well Microdialysis Plate, 10K MWCOThermoFisher88260
Poly(vinyl sulfate) potassium saltSigma271969
Potassium glutamate (>99%)SigmaG1149
RTS amino acid sampler5 Prime2401530
Sodium chloride (99%)Fluorochem94554
Supelclean LC-18 SPE C-18 SPE column (1 g)Sigma505471
Yeast ExtractMelfordY1333
Equipment
PlatereaderBMGOmega

References

  1. Carbonell, P., et al. An automated Design-Build-Test-Learn pipeline for enhanced microbial production of fine chemicals. Communications Biology. 1, 66 (2018).
  2. Gregorio, N. E., Levine, M. Z., Oza, J. P. A user's guide to cell-free protein synthesis. Methods Protocols. 2 (1), 24 (2019).
  3. Zimmerman, E. S., et al. Production of site-specific antibody-drug conjugates using optimized non-natural amino acids in a cell-free expression system. Bioconjugate Chemistry. 25 (2), 351-361 (2014).
  4. Wiegand, D. J., Lee, H. H., Ostrov, N., Church, G. M. Cell-free protein expression using the rapidly growing bacterium Vibrio natriegens. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (145), e59495 (2019).
  5. Moore, S. J., et al. A Streptomyces venezuelae cell-free toolkit for synthetic biology. ACS Synthetic Biology. 10 (2), 402-411 (2021).
  6. Xu, H., Liu, W. -. Q., Li, J. Translation related factors improve the productivity of a Streptomyces-based cell-free protein synthesis system. ACS Synthetic Biology. 9 (5), 1221-1224 (2020).
  7. Yim, S. S., et al. Multiplex transcriptional characterizations across diverse bacterial species using cell-free systems. Molecular Systems Biology. 15 (8), 8875 (2019).
  8. Moore, S. J., et al. Rapid acquisition and model-based analysis of cell-free transcription-translation reactions from nonmodel bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (19), 4340-4349 (2018).
  9. Zawada, J. F., et al. Microscale to manufacturing scale-up of cell-free cytokine production--a new approach for shortening protein production development timelines. Biotechnology and Bioengineering. 108 (7), 1570-1578 (2011).
  10. Geertz, M., Shore, D., Maerkl, S. J. Massively parallel measurements of molecular interaction kinetics on a microfluidic platform. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (41), 16540-16545 (2012).
  11. McManus, J. B., Emanuel, P. A., Murray, R. M., Lux, M. W. A method for cost-effective and rapid characterization of engineered T7-based transcription factors by cell-free protein synthesis reveals insights into the regulation of T7 RNA polymerase-driven expression. Archives of Biochemistry and Biophysics. 674, 108045 (2019).
  12. McManus, J. B., et al. A method for cost-effective and rapid characterization of genetic parts. bioRxiv. , (2021).
  13. Park, J., Yim, S. S., Wang, H. H. High-throughput transcriptional characterization of regulatory sequences from bacterial Biosynthetic Gene Clusters. ACS Synthetic Biology. , (2021).
  14. Caschera, F., Noireaux, V. Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system. Biochimie. 99, 162-168 (2014).
  15. Caschera, F., Noireaux, V. A cost-effective polyphosphate-based metabolism fuels an all E. coli cell-free expression system. Metabolic Engineering. 27, 29-37 (2015).
  16. Shin, J., Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. coli RNA polymerase and sigma factor 70. Journal of Biological Engineering. 4, 8 (2010).
  17. Karim, A. S., Heggestad, J. T., Crowe, S. A., Jewett, M. C. Controlling cell-free metabolism through physiochemical perturbations. Metabolic Engineering. 45, 86-94 (2018).
  18. Cai, Q., et al. A simplified and robust protocol for immunoglobulin expression in Escherichia coli cell-free protein synthesis systems. Biotechnology Progress. 31 (3), 823-831 (2015).
  19. Garenne, D., Thompson, S., Brisson, A., Khakimzhan, A., Noireaux, V. The all-E. coli TXTL toolbox 3.0: New capabilities of a cell-free synthetic biology platform. Synthetic Biology. , (2021).
  20. Goering, A. W., et al. In vitro reconstruction of nonribosomal peptide biosynthesis directly from DNA using cell-free protein synthesis. ACS Synthetic Biology. 6 (1), 39-44 (2017).
  21. Khatri, Y., et al. Multicomponent microscale biosynthesis of unnatural cyanobacterial indole alkaloids. ACS Synthetic Biology. 9 (6), 1349-1360 (2020).
  22. Zhuang, L., et al. Total in vitro biosynthesis of the nonribosomal macrolactone peptide valinomycin. Metabolic Engineering. 60, 37-44 (2020).
  23. Hoskisson, P. A., Seipke, R. F. Cryptic or silent? The known unknowns, unknown knowns, and unknown unknowns of secondary metabolism. mBio. 11 (5), 02642 (2020).
  24. Bentley, S. D., et al. Complete genome sequence of the model actinomycete Streptomyces coelicolor A3(2). Nature. 417 (6885), 141-147 (2002).
  25. Li, J., Wang, H., Kwon, Y. -. C., Jewett, M. C. Establishing a high yielding Streptomyces-based cell-free protein synthesis system. Biotechnology and Bioengineering. 114 (6), 1343-1353 (2017).
  26. Moore, S. J., Lai, H. -. E., Needham, H., Polizzi, K. M., Freemont, P. S. Streptomyces venezuelae TX-TL - a next generation cell-free synthetic biology tool. Biotechnology Journal. 12 (4), (2017).
  27. Kim, W., et al. Comparative genomics determines strain-dependent secondary metabolite production in Streptomyces venezuelae strains. Biomolecules. 10 (6), 864 (2020).
  28. Phelan, R. M., et al. Development of next generation synthetic biology tools for use in Streptomyces venezuelae. ACS Synthetic Biology. 6 (1), 159-166 (2017).
  29. Song, J. Y., et al. Complete genome sequence of Streptomyces venezuelae ATCC 15439, a promising cell factory for production of secondary metabolites. Journal of Biotechnology. 219, 57-58 (2016).
  30. Bush, M. J., Bibb, M. J., Chandra, G., Findlay, K. C., Buttner, M. J. Genes required for aerial growth, cell division, and chromosome segregation are targets of WhiA before sporulation in Streptomyces venezuelae. mBio. 4 (5), 00684 (2013).
  31. Schumacher, M. A., et al. The crystal structure of the RsbN-σBldN complex from Streptomyces venezuelae defines a new structural class of anti-σ factor. Nucleic Acids Research. 46 (14), 7405-7417 (2018).
  32. Ramos-León, F., et al. A conserved cell division protein directly regulates FtsZ dynamics in filamentous and unicellular actinobacteria. Elife. 10, 63387 (2021).
  33. Bush, M. J., Tschowri, N., Schlimpert, S., Flärdh, K., Buttner, M. J. c-di-GMP signalling and the regulation of developmental transitions in Streptomycetes. Nature Reviews. Microbiology. 13 (12), 749-760 (2015).
  34. Ehrlich, J., Gottlieb, D., Burkholder, P. R., Anderson, L. E., Pridham, T. G. Streptomyces venezuelae, n. sp., the source of chloromycetin. Journal of Bacteriology. 56 (4), 467-477 (1948).
  35. Inahashi, Y., et al. Watasemycin biosynthesis in Streptomyces venezuelae: thiazoline C-methylation by a type B radical-SAM methylase homologue. Chemical Science. 8 (4), 2823-2831 (2017).
  36. Jakeman, D. L., et al. Antimicrobial activities of jadomycin B and structurally related analogues. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (3), 1245-1247 (2009).
  37. Kodani, S., Sato, K., Hemmi, H., Ohnish-Kameyama, M. Isolation and structural determination of a new hydrophobic peptide venepeptide from Streptomyces venezuelae. Journal of Antibiotics. 67 (12), 839-842 (2014).
  38. Akey, D. L., et al. Structural basis for macrolactonization by the pikromycin thioesterase. Nature Chemical Biology. 2 (10), 537-542 (2006).
  39. Bai, C., et al. Exploiting a precise design of universal synthetic modular regulatory elements to unlock the microbial natural products in Streptomyces. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (39), 12181-12186 (2015).
  40. Moore, S. J., et al. EcoFlex: A multifunctional MoClo kit for E. coli synthetic biology. ACS Synthetic Biology. 5 (10), 1059-1069 (2016).
  41. Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (79), e50762 (2013).
  42. Kim, D. M., Choi, C. Y. A semicontinuous prokaryotic coupled transcription/translation system using a dialysis membrane. Biotechnology Progress. 12 (5), 645-649 (1996).
  43. Liu, Y., Fritz, B. R., Anderson, M. J., Schoborg, J. A., Jewett, M. C. Characterizing and alleviating substrate limitations for improved in vitro ribosome construction. ACS Synthetic Biology. 4 (4), 454-462 (2015).
  44. Bindels, D. S., et al. mScarlet: a bright monomeric red fluorescent protein for cellular imaging. Nature Methods. 14, 53-56 (2017).
  45. Hopword, D. A., Kieser, T., Bibb, M. J., Buttner, M. J., Chater, K. Practical Streptomyces genetics. John Innes Foundation. , (2000).
  46. Hunter, D. J. B., Bhumkar, A., Giles, N., Sierecki, E., Gambin, Y. Unexpected instabilities explain batch-to-batch variability in cell-free protein expression systems. Biotechnology and Bioengineering. 115 (8), 1904-1914 (2018).
  47. Dopp, J. L., Jo, Y. R., Reuel, N. F. Methods to reduce variability in E. coli-based cell-free protein expression experiments. Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 204-211 (2019).
  48. Hoff, G., Bertrand, C., Piotrowski, E., Thibessard, A., Leblond, P. Genome plasticity is governed by double strand break DNA repair in Streptomyces. Scientific Reports. 8, 5272 (2018).
  49. Bibb, M. J. Regulation of secondary metabolism in streptomycetes. Current Opinion in Microbiology. 8 (2), 208-215 (2005).
  50. Weber, T., et al. antiSMASH 3.0-a comprehensive resource for the genome mining of biosynthetic gene clusters. Nucleic Acids Research. 43 (1), 237-243 (2015).
  51. Navarro-Muñoz, J. C., et al. A computational framework to explore large-scale biosynthetic diversity. Nature Chemical Biology. 16, 60-68 (2020).
  52. Alanjary, M., et al. The Antibiotic Resistant Target Seeker (ARTS), an exploration engine for antibiotic cluster prioritization and novel drug target discovery. Nucleic Acids Research. 45 (1), 42-48 (2017).
  53. Medema, M. H., Fischbach, M. A. Computational approaches to natural product discovery. Nature Chemical Biology. 11 (9), 639-648 (2015).
  54. Whitford, C. M., Cruz-Morales, P., Keasling, J. D., Weber, T. The Design-Build-Test-Learn cycle for metabolic engineering of Streptomycetes. Essays in Biochemistry. , (2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

175

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved