وضع العلامات والتصوير من لويحات اميلويد في انسجه المخ باستخدام الكركمين البوليفينول الطبيعية

الكركمين هو فلوكوفيري مثاليه لوضع العلامات والتصوير من لويحات بروتين بيتا اميلويد في انسجه المخ نظرا لارتباطها التفضيلية إلى بروتين بيتا اميلويد ، فضلا عن أوجه التشابه الهيكلية مع غيرها من الاصباغ التقليدية الملزمة اميلويد. ويمكن استخدامه لتسميه وصوره لويحات بروتين بيتا اميلويد أكثر كفاءه وغير مكلفه من الأساليب التقليدية.

ترسب بروتين بيتا اميلويد (Aβ) في المساحات الخارجة وداخل الخلايا هي واحده من الامراض المميزة لمرض الزهايمر (AD). ولذلك ، فان الكشف عن وجود Aβ في انسجه المخ AD هو أداه قيمه لتطوير العلاجات الجديدة لمنع تطور AD. وقد استخدمت العديد من الاصباغ الكلاسيكية الملزمة اميلويد ، الفلوروكروم ، وتحقيقات التصوير ، والأجسام المضادة الخاصة Aβ للكشف عن الرسوم البيانية Aβ في انسجه المخ AD. استخدام هذه المركبات للكشف عن Aβ مكلفه وتستغرق وقتا طويلا. ومع ذلك ، بسبب نشاطها الفلورسنت مكثفه ، عاليه التقارب ، والخصوصية ل Aβ ، فضلا عن أوجه التشابه الهيكلية مع الاصباغ التقليدية الملزمة اميلويد ، الكركمين (Cur) هو مرشح واعده لوضع العلامات والتصوير من لويحات Aβ في تشريح الجثة انسجه المخ. وهو البوليفينول طبيعيه من عشبه كركم لونغا. في الدراسة الحالية, وقد استخدمت الصورة الكترونيه لتصنيف لويحات Aβ التسمية من كل من نموذج الماوس الوراثية لمرض الزهايمر العائلي 5x (5Xبدعه) ومن الانسجه البشرية الاعلانيه في غضون دقيقه. تم مقارنه القدرة علي وضع العلامات من Cur إلى الاصباغ التقليدية الملزمة اميلويد ، مثل ثيوفلافين (Thio-S) ، الكونغو الأحمر (CR) ، وفلورو-اليشم C (FJC) ، فضلا عن الأجسام المضادة الخاصة Aβ (6E10 و A11). لاحظنا ان Cur هو الطريقة الأكثر تكلفه وأسرع لتسميه وصوره لويحات Aβ بالمقارنة مع هذه الاصباغ التقليدية وقابله للمقارنة إلى الأجسام المضادة المحددة Aβ. الاضافه إلى ذلك ، يربط Cur مع معظم الأنواع Aβ ، مثل قله المواليد وألياف الليفية. ولذلك ، يمكن استخدام Cur باعتبارها الأكثر فعاليه من حيث التكلفة ، وبسيطه ، وسريعة الفلوروكروم عامل الكشف عن لويحات Aβ.

مرض الزهايمر (الإعلان) هو واحد من الاضطرابات العصبية الأكثر شيوعا المرتبطة بالسن والتقدمية واحده من الأسباب الرئيسية للوفاة في جميع انحاء العالم^1,2. ان التعلم والذاكرة وضعف الإدراك ، إلى جانب الاضطرابات النفسانية العصبية ، هي الاعراض الشائعة التي تظهر في AD³. علي الرغم من ان مسببات AD لم يتم توضيحها بالبالكامل ، تشير الادله الوراثية والبيوكيميائية والتجريبية المتاحة إلى ان الترسب التدريجي لل Aβ هو مؤشر حيوي نهائي ل AD⁴. يتراكم هذا البروتين غير المطوي في المساحات داخل الخلايا وخارجها ، ويعتقد انه متورط في فقدان التشابك ، وزيادة التهاب العصبي ، والضمور العصبي في المناطق القشرية والهيبوكامباله في الدماغ المتضررة بواسطة AD⁵. لذلك ، الكشف الكيميائي النسيجي لل Aβ في الانسجه AD هو خطوه اولي حاسمه في تطوير غير سامه ، ومكافحه اميلويد المخدرات لمنع تقدم AD.

خلال العقود القليلة الماضية ، تم استخدام العديد من الاصباغ والأجسام المضادة من قبل العديد من مختبرات البحوث لتسميه وصوره لويحات Aβ في انسجه المخ ، ولكن بعض هذه الطرق هي مضيعه للوقت والاصباغ أو الأجسام المضادة المستخدمة مكلفه ، وتتطلب العديد من الملحقات المواد الكيميائيه. ولذلك ، فان تطوير وسيله غير مكلفه للكشف عن لويحات Aβ في الدماغ AD يكون أداه جديده ترحيب. بدات العديد من المختبرات باستخدام Cur ، واعده مكافحه اميلويد الطبيعية البوليفينول ، لوضع العلامات والتصوير aβ ، فضلا عن وكيل العلاجية لل^6،7،8،9. هيدروفوبيسيتيها وطبيعتها ، وأوجه التشابه الهيكلية مع الاصباغ الكلاسيكية الملزمة اميلويد ، والنشاط الفلوري القوي ، فضلا عن تقارب قوي للربط مع Aβ يجعل من فلوكوفيري مثاليه لوضع العلامات والتصوير من لويحات Aβ في الانسجه AD¹⁰ . يتم الكشف عن الخلية مع aβ-لويحات وقله الطفرات ووجودها أيضا في المساحات داخل الخلايا^7,11,12,13. الاضافه إلى ذلك ، فقد ثبت ان الحد الأدنى من المبالغ (1 − 10 نانومتر) من Cur يمكن تسميه لويحات Aβ في 5x مرض الزهايمر العائلي (5Xبدعه) انسجه المخ⁷. علي الرغم من ان تركيز 1 نانومتر لا يوفر كثافة مضان الأمثل للعد لويحات Aβ, 10 نانومتر أو تركيز اعلي من Cur لا. ركض والزملاء¹⁴ ذكرت ان جرعات منخفضه مثل 0.2 nM من ديفلوبوبورون-ديريفاتيزيد Cur يمكن الكشف في الجسم الخارجي aβ الودائع تقريبا فضلا عن مسبار الاشعه تحت الحمراء. ما إذا كانت هذه الجرعة كافيه لتسميه لويحات Aβ في الانسجه لا يزال غير واضح. وقد استخدمت معظم الدراسات السابقة 20 − 30 دقيقه لتلطيخ لويحات Aβ باستخدام Cur ، ولكن قد يتطلب تلطيخ الأمثل وقتا اقل بكثير.

تم تصميم هذه الدراسة لاختبار الحد الأدنى من الوقت المطلوب من قبل Cur لتسميه لويحات Aβ في انسجه الدماغ AD ومقارنه حساسية لوضع العلامات والتصوير من لويحات Aβ في انسجه المخ من الفئران 5xFAD بعد تلطيخ مع Cur مع التقليدية الأخرى Aβ-الاصباغ ملزمه ، مثل ثيوفلافين (Thio-S) ، الكونغو الأحمر (CR) ، وفلورو-اليشم C (FJC). تمت مقارنه القدرة علي وضع العلامات Aβ من هذه الاصباغ الكلاسيكية الملزمة اميلويد مع تلطيخ Cur في أقسام الدماغ الاكليليه والتي تحتوي علي البارافين والتي من الفئران 5xFAD ومن العمر المتطابقة AD الإنسان والسيطرة علي انسجه المخ. وتشير النتائج إلى ان Cur تسميات Aβ لويحات بطريقه مماثله للأجسام المضادة الخاصة Aβ (6E10) وأفضل باعتدال من Thio-S ، CR ، أو FJC. الاضافه إلى ذلك ، عندما تدار الحقن داخل الصفاق من Cur إلى الفئران 5xFAD لمده 2 − 5 أيام ، عبرت حاجز الدم في الدماغ وملزمه مع لويحات Aβ⁷. ومن المثير للاهتمام, وقد استخدمت تركيزات نانومولار من Cur لتسميه وصوره لويحات aβ في 5xfad انسجه المخ^7,14. وعلاوة علي ذلك ، يمكن تصنيف لويحات Aβ المتميزة من الناحية الشكلية ، مثل النواة ، والعصب ، والمنتشرة ، واللويحات المحترقة بواسطة Cur بكفاءة أكبر من اي من الاصباغ الأخرى التقليدية الملزمة اميلويد⁷. عموما ، يمكن تطبيق Cur علي التسمية وصوره لويحات Aβ في انسجه المخ بعد الوفاة من نماذج الحيوانية AD و/أو الانسجه البشرية AD بطريقه سهله وغير مكلفه ، كبديل موثوق بها للأجسام المضادة الخاصة Aβ.

وقد تمت الموافقة علي جميع الطرق الموصوفة هنا من قبل لجنه الرعاية والاستخدام الحيوانية (ACUC) من جامعه الدولة وادي Saginaw. تم الحصول علي الانسجه البشرية من بنك الدماغ الراسخة في معهد الصحة راية الشمس في اريزونا^15,16.

1. perfusion من الحيوانية

1. اعداد المخازن المؤقتة المثبتة والتروية.
   1. اعداد 0.1 M الفوسفات الصوديوم المخزن المؤقت عن طريق أضافه 80 g من كلوريد الصوديوم (NaCl) ، 2 غرام من كلوريد البوتاسيوم (KCl) ، 21.7 g من فوسفات الهيدروجين الصوديوم (Na₂hpo₄· 7h₂س) ، 2.59 g من فوسفات ثنائي الهيدروجين البوتاسيوم (KH₂PO₄ ) ، والماء المقطر مزدوجة لجعل ما مجموعه 1 لتر.
   2. اعداد بارافورمالدهيد 4 ٪ (PFA).
      1. أضافه 40 غرام من بارافورمالدهيد إلى 1 لتر من تلفزيوني (0.1 M ، pH 7.4).
      2. يسخن محلول PFA إلى 60 − 65 درجه مئوية ويخلط باستخدام التحريك المغناطيسي.
         ملاحظه: يجب ان لا تتجاوز درجه الحرارة 65 درجه مئوية.
      3. أضافه بضع قطرات من NaOH (1 N) مع قطاره لحل PFA تماما.
      4. تصفيه الحل PFA مع المتوسطة إلى غرامه تصفيه الورق وتخزين في 4 درجه مئوية.
         ملاحظه: الحل جيد لمده شهر.
2. اجراء التخدير الحيواني والتروية.
   ملاحظه: تم شراؤها اثني عشر شهرا من العمر B6SJL التطبيق SwFlLon ، PSEN1 * M146L * L286V ، 1136799Vas/J (5 × بدعه) الفئران التحكم المتطابقة العمر (ن = 6 لكل مجموعه) من الباعة وولدت في بيت الحيوانية من جامعه وادي Saginaw الدولة. وقد تاكد التنميط الجيني من قبل التفاعل البلمره سلسله (PCR) كما هو موضح سابقا⁷. وتشمل انسجه الدماغ البشرية AD بعد الوفاة انسجه الدماغ AD وانسجه التحكم العمر المتطابقة.
   1. تخدير الحيوانية مع عامل التخدير المناسب ، مثل البنتوباربيتال الصوديوم (390 ملغ/كغ من وزن الجسم) ، أو خليط الكيتامين/اكسيليازين (تصل إلى 80 ملغم/كغ من وزن الجسم الكيتامين و 10 ملغ/كغ من وزن الجسم اكسيليازين) بواسطة حقن داخل الصفاق (27 G ابره و 1 مل حقنه). التحقق من مستوي التخدير عن طريق معسر اصبع القدم. إذا كان الحيواني لا يستجيب ، ثم انها مستعدة لجراحه التروية.
   2. مكان الحيوانية تخدير في موقف ضعيف علي صينية الجراحة ترويه واستخدام مقص القزحية الصغيرة اجراء شق في النهاية الخلفية من البطين الأيسر.
   3. ادخل ابره الانصهار 22 جرام إلى البطين الأيسر واصنع شقا صغيرا في الأذين الأيمن لأزاله السائل المنصهر من الجسم. استخدام نظام ترويه تغذيه الجاذبية للسماح للسائل الجليد الباردة ترويه (0.1 M تلفزيوني ، pH 7.4) لتدفق لمده 5 − 6 دقيقه (معدل التدفق 20 − 25 مل/دقيقه).
      ملاحظه: الكبد واضح هو مؤشر الانصهار الأمثل.
   4. التبديل صمام العازلة إلى محلول الجليد الباردة 4 ٪ بارافورمالدهيد لتحديد والسماح لها بالتدفق لمده 8 − 10 دقيقه.
      ملاحظه: الهزة متبوعه بأطراف تصلب أو تصلب هي مؤشرات للتثبيت الجيد.
   5. أزاله الدماغ من الجمجمة باستخدام مقص. باستخدام ملعقة ، وجمع الدماغ ووضعه في قارورة من 4 ٪ PFA (علي الأقل 10x حجم حجم الدماغ) وتخزين في 4 درجه مئوية حتى مزيد من الاستخدام.

2. معالجه الانسجه

1. قطع الأجزاء الباكية.
   1. نقل الدماغ إلى حلول السكروز متدرج (10 ٪ ، 20 ٪ ، و 30 ٪) وتخزين في 4 درجه مئوية لمده 24 ساعة لكل منهما ، حتى الاستخدام.
   2. باستخدام التبريد في-22 درجه مئوية ، وقطع 40 μm-المقاطع السميكة. جمع 10 − 20 المقاطع لكل بئر في 6 لوحه جيدا مليئه بالتلفزيونية والصوديوم أزيد (0.02 ٪).
2. البارافين تضمين أقسام للماوس وانسجه المخ البشرية.
   1. لأقسام البارافين ، وأزاله الهيدرات والانسجه الدماغية الثابتة بعد 24 ساعة مع الكحول متدرج (50 ٪ ، 70 ٪ ، 90 ٪) لمده 2 ساعة لكل منهما ، تليها 100 ٪ الكحول 2x لمده 1 ساعة لكل منهما) ، ومن ثم مع الزيلين 2x لمده 1 ساعة لكل منهما) في درجه حرارة الغرفة.
   2. تخترق الانسجه مع البارافين--بارافين (1:1) 2x ل 1 ح في 56 درجه مئوية في قارورة زجاجيه مخروطيه مغطاه رقائق ألومنيوم.
   3. تزج الانسجه في البارافين المذاب (56 درجه مئوية) لمده 4 − 6 ساعة.
   4. قطع 5 ميكرون-المقاطع السميكة باستخدام ميكروتومي الدوارة في درجه حرارة الغرفة ووضعها في حمام المياه الانسجه في 45 درجه مئوية.
3. التسمية النسيجية لويحات Aβ في أقسام التبريد مع Cur.
   1. شطف المقاطع من الخطوة 2-1-2 مع تلفزيوني (pH 7.4) 3x لمده 5 دقائق لكل منهما.
   2. تزج الأقسام في 70 ٪ الايثانول لمده 2 دقيقه في درجه حرارة الغرفة.
   3. تذوب الأوراق المالية Cur (1 ملم) في الميثانول وتمييع مع 70 ٪ الايثانول للحصول علي تركيز العمل النهائي من 10 μM.
   4. تزج الأقسام مع العمل الحل Cur لمده 1 − 5 دقيقه في درجه حرارة الغرفة علي شاكر في 150 rpm.
   5. تجاهل حل Cur ويغسل مع 70 ٪ الايثانول 3x لمده 2 دقيقه لكل منهما.
   6. وضع المقاطع علي بولي-L-يسين الشرائح الزجاجية المغلفة وجبل مع كوفيرسليب باستخدام وسائل الاعلام العضوية المتصاعدة ، مثل البلاستيك ديسلين ديسيلين (dpx).
   7. عرض تحت المجهر مضان باستخدام 480/550 nm الاثاره/مرشحات الانبعاثات.
4. التسمية النسيجية لويحات Aβ في الماوس جزءا لا يتجزا من البارافين وأقسام الدماغ البشري مع Cur.
   1. الأقسام الانسجه من الخطوة 4.2.2 مع الزيلين 2x لمده 5 دقائق كل في درجه حرارة الغرفة.
   2. الترطيب مع حلول الكحول متدرج (100 ٪ ، 80 ٪ ، 70 ٪ ، 50 ٪ لمده 1 دقيقه لكل منهما) ومع الماء المقطر 2x لمده 5 دقائق كل في درجه حرارة الغرفة.
   3. أقسام وصمه عار مع Cur (10 μM) لمده 10 دقيقه في درجه حرارة الغرفة في الظلام ، وتهتز في 150 لفه في الدقيقة. يغسل مع 70 ٪ ، 90 ٪ ، والكحول 100 ٪ لمده 2 دقيقه لكل منهما.
   4. واضح مع الزيلين 2x لمده 5 دقائق لكل وغطاء زلة مع dpx.
   5. تصور تحت المجهر الفلوري كما هو مذكور في الخطوة 2.3.7.
5. Colocalize Cur مع الأجسام المضادة Aβ في لويحات Aβ وقله المواليد.
   1. غسل المقاطع بالتبريد من الخطوة 2-1-2 مع تلفزيوني 3x في لوحه 12 جيدا.
   2. منع المقاطع مع 10 ٪ مصل الماعز العادي (خ ع) المذاب في الخدمات التلفزيونية مع 0.5 ٪ تريتون-X-100 في درجه حرارة الغرفة لمده 1 ساعة.
   3. تجاهل حل الحظر. احتضان الأقسام مع الأجسام المضادة الخاصة Aβ (6E10 أو A11 ، المخفف 1:200) المذاب في حل الحجب الطازجة التي تحتوي علي 10 ٪ خ ع و 0.5 ٪ تريتون-X100 بين عشيه وضحيها في 4 درجه مئوية في شاكر في 150 دوره في الدقيقة.
   4. تجاهل حل الأجسام المضادة وغسل الأقسام مع 3x تلفزيوني لمده 10 دقيقه لكل منهما.
   5. احتضان مع العلامة الأجسام المضادة الثانوية مع فلوكوفيري الأحمر (علي سبيل المثال ، اليكسا 594) لمده 1 ساعة في درجه حرارة الغرفة في الظلام.
   6. غسل مع تلفزيوني 3x لمده 10 دقيقه لكل منهما.
   7. يغسل مع 70 ٪ الكحول 1x.
   8. احتضان الأقسام مع Cur (10 μM) لمده 5 دقائق في درجه حرارة الغرفة.
   9. يغسل مع 70 ٪ الكحول 3x لمده 1 دقيقه لكل منهما.
   10. ديهيدرات مع 90 ٪ و 100 ٪ الكحول لمده دقيقه واحده لكل منهما ، واضحة مع الزيلين 2x لمده 5 دقائق لكل منهما ، وجبل علي الشرائح باستخدام dpx.
   11. تصور باستخدام المجهر مضان مع مرشحات الاثاره/الانبعاثات المناسبة للإشارات الحمراء والخضراء.
   12. للتنظير داخل الخلايا Aβ ، وصمه عار الأقسام باستخدام Aβ-الأجسام المضادة (6E10) ، restain مع Cur في درجه حرارة الغرفة في الظلام مع اهتزاز في 150 لفه في الدقيقة ، ومضاد للبقع مع اي Hoechst-33342 (1 ملغ/مل) و/أو DAPI (1ug/ml) الظلام مع اهتزاز في 150 لفه في الدقيقة. غسل مع تلفزيوني 3x.
   13. التقاط الصور باستخدام الفلاتر الحمراء والخضراء والزرقاء بهدف 100x (التكبير الإجمالي 1, 000x).
6. تسميه لويحات Aβ مع Thio-S ، CR ، و FJC.
   ملاحظه: تم الإبلاغ عن البروتوكولات المفصلة لعلامات Thio-S و CR في السابق⁷.
   1. لتلطيخ FJC ، وغسل المقاطع العائمة الحرة التي تم الحصول عليها من الخطوة 2-1-2 مع تلفزيوني 3x لمده 5 دقائق لكل منهما.
   2. وضع الأقسام في 12 لوحه بئر ووصمه عار مع FJC (0.001 ٪) لمده 10 دقيقه في الظلام في درجه حرارة الغرفة.
   3. تجاهل حل FJC ويغسل مع تلفزيوني 3x لمده 5 دقائق لكل منهما.
   4. احتضان مع كلوريد الأمونيوم (NH₄Cl ، 50 mM المذاب في الخدمات التلفزيونية العامة) لمده 10 دقيقه في درجه حرارة الغرفة.
   5. تجاهل الحل NH₄Cl وغسل مع التلفزيونية 3x لمده 5 دقائق لكل منهما.
   6. بعد الخطوات الواردة في القسم 2.4 ، ديهيدرات مع حلول الكحول متدرج ، واضحة ، جبل ، وعرض تحت المجهر مضان باستخدام 450/520 nm الاثاره/مرشحات الانبعاثات.

الكركمين تسميات اللويحات Aβ في غضون دقيقه. عندما كنا ملطخه 5xFAD الانسجه مع Cur ، وجدنا ان التسمية Cur Aβ لويحات في غضون 1 دقيقه. علي الرغم من زيادة وقت الحضانة مع Cur زيادة طفيفه كثافة مضان من لويحات Aβ ، وكان عدد لويحات Aβ لوحظ لا تختلف اختلافا كبيرا بين 1 دقيقه و 5 دقيقه تلطيخ الوقت (الشكل 1).

يمكن التسمية الآن لويحات Aβ في المعدة بالتبريد ، والماوس جزءا لا يتجزا من البارافين والانسجه البشرية الاعلانيه التي القولون مع الأجسام المضادة الخاصة Aβ في انسجه المخ الاعلانيه الماوس. عندما كنا ملطخه الملون ، والمقاطع المضمنة البارافين (الشكل 2ا) والنسيج الاعلانيه البشرية (الشكل 2ب) ، لاحظنا Cur المسمي aβ لويحات في جميع أنواع أقسام الانسجه. بالاضافه إلى ذلك ، للتاكد من ان Cur هو ملزم للويحات Aβ ، ونحن أول المسمي لويحات مع 6E10 ، تليها تلطيخ Cur. لاحظنا انه تم المشاركة تماما في المترجمة مع Aβ في نفس اللوحات التي تربط 6E10 (الشكل 2ج).

المسمية الآن اوليغمرات Aβ والمجاميع Aβ داخل الخلايا. للتحقق من ما إذا كان يمكن التسمية Cur اوليغمرات Aβ ، كانت ملطخه المقاطع الماوس 5xFAD مع الأجسام المضادة الخاصة بالقلة Aβ (A11) ، تليها تلطيخ Cur. لاحظنا انالصورةالشخصية مع A11 في لويحات aβ (الشكل 3ا). المثل, Cur أيضا القولون مع الأجسام المضادة 6E10 في المساحات داخل الخلايا (الشكل 3ب), مشيرا إلى انه يمكن تسميه aβ في الخلايا.

الآن المسمي Aβ أكثر بروزا من الاصباغ اميلويد الكلاسيكية ملزمه. تمت مقارنه aβ الوسم من قبل Cur مع الاصباغ المتاحة تجاريا الملزمة اميلويد Thio-S ، CR ، FJC. تم استخدام الأجسام المضادة الخاصة ب Aβ 6E10 كعنصر تحكم قياسي. لاحظنا ان Cur المسمي Aβ أكثر بروزا من الاصباغ التقليدية الملزمة اميلويد (الشكل 4).

المشتقات الحالية مكررا-ديميثوكسيكوركومين (bdmc) و ديميثوكسيكوركومين (DMC) ، والموجودة أيضا في استخراج الكركم ، والملصقات aβ لويحات نسبيا ل Cur في انسجه المخ 5xfad. اثنين من المكونات الرئيسية الأخرى ، مثل BDMC و DMC ، موجودة في استخراج الكركم. نحن اختبار ما إذا كانت هذه المركبات اثنين أيضا تسميه لويحات Aβ مماثله ل Cur. عندما كانت ملطخه المقاطع الدماغ 5xFAD الماوس مع هذه المشتقات ، علي حد سواء BDMC و DMC المسمي أيضا لويحات Aβ ، متوازيالصورة(الشكل 5ا). تم التحقيق في وسائل الاعلام المتصاعدة المختلفة للتحقق من التدخل مع التصوير Aβ بعد تلطيخ مع Cur. وكانت اشاره الفلورسنت سليمه في كل من الوسائط المائية والعضوية المتصاعدة ، مثل DPX (الشكل 5ب). كان تلطيخ لويحات Aβ مع Cur المناسبة بعد وضع العلامات المناعية ويليها تلطيخ مع الحل Hoechst 33342 (1 ملغ/مل) أو 4 ′ ، 6-diamidino-2-فينيلانديول (DAPI ، 1ميكروغرام/مل). وقد تم الحفاظ علي إشارات الفلورسنت المناعي وشده التلطيخ بعد تلطيخ (الشكل 5ج).

الشكل 1: تسميات الكركمين Aβ لويحات في غضون دقيقه. (ا). تم تلطيخ أقسام الدماغ من الفئران 5xFAD أو السيطرة البشرية والانسجه القشرية AD مع Cur (10 μM) لمده 1 − 5 دقيقه وعدد لويحات مرئية عدت. (ب). لم يلاحظ اي فرق في عدد من aβ-البلاك التهم بين 1 دقيقه و 5 دقيقه تلطيخ مرات. ويتم تمثيل البيانات علي انها تعني الخطا المعياري ± المتوسط (SEM). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: التنظير الحراري لل Cur مع الأجسام المضادة aβ في لويحات aβ. يمكن تسميه الصورة الكترونيه لويحات Aβ في الأجزاء المعدة بالتبريد ، البارافينجزءالا يتجزا من (A) والنسيج AD الإنسان (ب). الوسم Aβ موازيه لوضع العلامات مع الأجسام المضادة الخاصة Aβ (6E10 ، لطخه تلطيخ). (C). تم تصنيف الأقسام 5xFAD لأول مره مع الأجسام المضادة Aβ (6E10) ، تليها تلطيخ مع Cur. الأحمر = 6E10 ملزمه من قبل الأجسام المضادة الثانوية الموسومة مع ال594 فلوكوفيري اليكسا. الأخضر = Cur. Cur تماما مع Aβ في نفس لويحات التي ترتبط 6E10. الأسهم تشير إلى لويحات Aβ. شريط مقياس يشير 50 μm (التكبير الكلي = 400x) في جميع الصور الثلاث علي اليسار ، و 10 μm (التكبير الكلي = 400x). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: تسميات الكركمين aβ اوليغمرات والخلايا aβ. (ا) aβ-تم الكشف عن اوليغمير إيممونوهيستوتشيميكالي باستخدام الأجسام المضادة الخاصة Aβ (A11) ، تليها تلطيخ مع Cur. Cur تماما مع Aβ ، في نفس اوليغمير حيث يربط A11. شريط مقياس = 250 μm والتكبير الكلي = 100x. (ب) المثل ، تم الكشف عن aβ داخل الخلايا إيممونوهيستوتشيميكالي باستخدام الأجسام المضادة الخاصة Aβ (6E10) ، تليها تلطيخ مع Cur. لاحظ ان Cur تماما مع Aβ في نفس المناطق المنضمة إلى 6E10. شريط مقياس = 50 μm والتكبير الكلي = 1 ، 000x. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: مقارنه الاصباغ اميلويد مختلفه ملزمه مع Cur لتسميه لويحات Aβ. أقسام التبريد (40 μm) من قشره الفئران البالغة من العمر 12 شهرا كانت ملطخه بالجرذان ، ثيوفلافين ، الكونغو الحمراء ، فلورو-اليشم C ، ومع الأجسام المضادة 6E10. العنوان الكتروني المسمي Aβ لويحات أكثر بروزا من Thio-S ، CR ، و FJC. الأسهم تشير إلى لويحات Aβ. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

الشكل 5: المشتقات الكترونيه مكررا-ديميثوكسي الكركمين وديميثوكسي الكركمين أيضا تسميه Aβ بالمثل إلى Cur. (ا) كانت ملطخه كلا من الأجزاء المضمنة في التبريد والبارافين 5xFAD مع المشتقات الكترونيه مكررا-ديميثوكسي الكركمين وديميثوكسي الكركمين. كل من هذه المشتقات تسميه لويحات Aβ بطريقه مماثله ل Cur. (B) تم استخدام كل من وسائل الاعلام المائية والعضوية المتصاعدة (dpx) لتركيب أقسام الانسجه بعد وضع العلامات علي لويحات Aβ مع Cur. (ج) واستخدمت المقاطع المناعية لوسم aβ مع Cur. تشير الأسهم البيضاء إلى لويحات aβ ، السهم الأخضر يشير إلى المنشطة تموت (gfap) ، ويشير السهم الأصفر وصمه عار النووية (dapi). قضبان المقياس = 100 μm. الرجاء النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: مقارنه الوسم Aβ مع مختلف الاصباغ الملزمة اميلويد و⁷.

وكانت الفرضية التي لدينا ان Cur يمكن ان تستخدم كاسرع وأسهل ، والطريقة الأقل تكلفه لتسميه وصوره لويحات Aβ في انسجه الدماغ AD بعد الوفاة بالمقارنة مع غيرها من الاصباغ الكلاسيكية الملزمة اميلويد ، فضلا عن الأجسام المضادة الخاصة Aβ. وكانت أهداف هذه الدراسة لتحديد الحد الأدنى من الوقت اللازم لتسميه وصوره لويحات Aβ بواسطة Cur في انسجه الدماغ AD بعد الوفاة وتحديد ما إذا كان يمكن استخدام Cur كبديل للأجسام المضادة Aβ لتسميه لويحات Aβ. وتحقيقا لهذه الغاية ، لوحظت القدرة علي وضع العلامات الخاصة ب Cur في نقاط زمنيه مختلفه. وكان الCur قادرا علي تسميه Aβ في غضون دقيقه واحده. الاضافه إلى ذلك ، كان وضع العلامات من Aβ من قبل Cur أكبر من غيرها من الاصباغ التقليدية اميلويد ملزمه ، مثل Thio-S (0.1 ٪) ، CR (1 ٪) ، و FJC (0.001 ٪).

يعتبر Cur فريدة من نوعها ومثاليه لوسم Aβ ، لأنه يحتوي علي معظم الخصائص التي يمتلكها معظم الاصباغ التقليدية الملزمة اميلويد ، بما في ذلك الخصائص الهيكلية والفيزيائية والكيميائية والبيولوجية¹⁰. الاضافه إلى ذلك ، نظرا للقدرة علي تحمل التكاليف ، فان معظم الباحثين مهتمون باستخدام هذه البوليفينول الطبيعية. لإظهار خصوصية الربط الكتروني إلى لويحات Aβ وقله الطفرات ، استخدمنا 6E10 و A11 (Aβ-الأجسام المضادة الخاصة اوليغمير). وأظهرت الصورة الحالية الكاملة تقريبا مع جميع الأنواع المختلفة من aβ الموجودة في الانسجه ، مما يوحي بان Cur محدده للغاية ل aβ^{7،17،18،19،20}. الاضافه إلى ذلك ، Cur المسمي Aβ اوليغمرات (الشكل 3ا) والمجاميع داخل الخلايا aβ (الشكل 3ب) والقولون مع الأجسام المضادة aβ (الشكل 2ب) ، مما يوحي بان الخلية يمكن ان التسمية ليس فقط خارج الخلية Aβ لويحات ، ولكن أيضا Aβ المودعة في المساحات داخل الخلايا⁷.

خلال العقود القليلة الماضية ، تم تطوير العديد من الفلوروبيورس والأجسام المضادة لتسميه وصوره لويحات Aβ النسيجية كيميائيا. مما لا شك فيه ، ومعظمها محدده جدا للأنواع Aβ المستهدفة وللكشف عن لويحات Aβ ، ولكن هذه هي أكثر تكلفه بكثير واستخدامها هو أكثر استهلاكا للوقت من استخدام Cur. علي سبيل المثال ، قارننا لوحه Aβ ملزمه من قبل Cur ، مع غيرها من الاصباغ الملزمة اميلويد ، مثل Thio-S ، CR ، و FJC ، حيث تم استخدام الأجسام المضادة الخاصة Aβ (6E10) كعنصر تحكم مرجع. يقترح هذا نتيجات ان [كور] بطاقات [ايبت] لويحات أكثر بقوة من اي من الأخرى [فلوبهورس]. والاهم من ذلك ، بالنسبة إلى Cur ، فان بعض الفلوريد الأكثر استخداما لها عيوب واضحة من حيث وضع العلامات والتصوير Aβ. علي سبيل المثال ، Thio-S يمكن ان تنتج تشتيت ، خلفيه عاليه لأنه يربط مع اغشيه الدهون أو مركبات الدهون في الخلية²¹. المثل ، CR ، والتي تستخدم عاده لتسميه Aβ ، تنتج التفاح الأخضر الانكسار (الشكل 4) تحت المجهر المستقطب. CR لا تسميه aβ-لويحات بسهوله كما تفعل الآن أو thio-S ، وسم اقل بكثير لويحات aβ من تلك التي تم الكشف عنها بواسطة Cur^7،22،23. وذكر غوتييريز وآخرون ان FJC, التي يمكن ان تربط مع Aβ ومع الخلايا العصبية التي تدهورت, تسميات في تردد اقل من اما Cur أو Thio-S²⁴. وتشير هذه النتائج إلى ان هذه العلامات الكلاسيكية الشائعة الاستخدام لها تقارب اقل للربط بين لويحات Aβ من Cur.

الاضافه إلى ذلك ، وضع العلامات علي أنواع مختلفه من Aβ-البلاك (الاساسيه ، العصبية ، منتشر ، أحرقت الخروج) قد يكون الأمثل مع Cur ، بدلا من غيرها من الفلورولويد ملزم الفلورية ، لان Cur يمكن ان تساعد علي تصور وتمييز لويحات Aβ مختلفه شكليا ، في حين تقنيات أخرى تفشل في التمييز بين هذه الأنواع الفرعية المورفولوجية⁷. المثل ، فان استخدام الأجسام المضادة الخاصة Aβ ، والتي هي محدده جدا لأنواع مختلفه من Aβ مكلفه للغاية وتستغرق وقتا طويلا ، مع الأخذ علي الأقل 24 − 48h عبر مناعي. وعلاوة علي ذلك ، والكشف عن أنواع مختلفه من Aβ تتطلب الأجسام المضادة المختلفة ، فضلا عن العديد من المواد الكيميائية التبعي ، مما يضيف إلى حد كبير إلى التكلفة الاجماليه. ومن الواضح ان Cur هو اقل تكلفه ، وأكثر سهوله المتاحة ، وتنتج كثافة الفلوري اعلي عندما يربط إلى لويحات Aβ. علي الرغم من ان CR هو أيضا تقنيه فعاله من حيث التكلفة نسبيا لوضع العلامات والتصوير من لويحات Aβ ، يمكن الآن ربط وتسميه أكثر من الأنواع Aβ ، مثل قله الطفرات²⁵ (الشكل 3 والشكل 4) ، في حين يربط cr فقط إلى بروتوفيلس الفيفيلز²³. ولذلك ، يمكن ان يتم وضع العلامات Aβ مع Cur بشكل أكثر كفاءه وفعالية من حيث التكلفة من قبل Thio-S ، CR ، أو FJC (الجدول 1).

وباختصار ، يمكن الكشف عن الصورة الكترونيه لويحات Aβ وقله المواليد من انسجه المخ AD بشكل فعال ، بسرعة ، وغير مكلفه. الاضافه إلى ذلك ، وربط Cur إلى Aβ محدده جدا ونشاطها الفلورسنت مستقره جدا. فانه يتطلب الحد الأدنى من المبالغ (1-10 nM) لتسميه Aβ. وعلاوة علي ذلك ، Cur هو أيضا محدده جدا للأنواع Aβ مختلفه ، مثل الفيفيلز أو لويحات ، فضلا عن قله الطفرات⁷. المثل ، المشتقات الكترونيه ديميثوكسيكوركومين و بيسديميثوكسيكوركومين أيضا ميناء اميلويد خصائص ملزمه و c التسمية aβ بالمثل ل cur¹⁰ (الشكل 5ا). ولذلك ، Cur هو فلوكوفيري مثاليه لوضع العلامات والتصوير من لويحات Aβ في انسجه المخ بعد الوفاة. ويمكن استخدامه كبديل سريع وسهل للكشف عن تحميل اللويحة Aβ بعد العلاج المضاد لداء اميلويد في نماذج الحيوانية التجريبية من AD. وتؤكد النتائج التي توصلنا اليها تقارير عن التقارب العالي من Cur إلى Aβ ، مما يعزز استخدامها المحتمل لرصد Aβ-لويحات في الدماغ بعد الوفاة وفي الانسجه الحية.

للحصول علي الأمثل Cur الوسم فمن المستحسن ان لا تسميه Aβ مع Cur في الانسجه unperfused مستخدمه وتجنب تخزين الانسجه علي المدى الطويل ، كما انها يمكن ان تنتج كميه أكبر من الخلفية ، حتى عندما perfال# استخدام. للحصول علي القولون ، فمن المستحسن لإكمال مناعي أولا مع الأجسام المضادة المحددة المستخدمة قبل تلطيخ مع Cur ثم اتبع هذا مع مكافحه تلطيخ باستخدام DAPI أو Hoechst.

وتشمل التعديلات المحتملة لهذه الطريقة زيادة وقت الحضانة من Cur مع الانسجه لمده تصل إلى 30 دقيقه ، والتي لن تتداخل مع كثافة الاشاره ، علي الرغم من انها قد تزيد من الخلفية اثناء التصوير. انخفاض تركيز Cur إلى اقل من 10 μM لا تتداخل في الوسم Aβ إلى مستوي كبير. وللحد من خلفيه انسجه المخ البشرية ، يمكن تطبيق طريقه اعداد بديله. علي سبيل المثال ، يمكن معالجه أقسام الدماغ في البداية مع 0.3 ٪ (ث/ف) السودان اسود B في 70 ٪ الايثانول (v/v) لمده 10 دقيقه في درجه حرارة الغرفة. ثم يمكن ان يكون ملطخا القسم مع Cur لمده 10 دقيقه في درجه حرارة الغرفة ، وغسلها مع 3x تلفزيوني لمده 15 دقيقه ، الملطخة ، وشنت مع وسائل الاعلام انتييتلاشي¹³. ويمكن أيضا خفض سمك القسم بالتبريد إلى 20 − 25 ميكرومتر.

وتشمل المحاذير المحتملة لهذه الطريقة الربط الحالي مع Aβ الموجودة في الاوعيه الدموية ، والتي تختلف عن لويحات Aβ خارج الخلية. التالي ، ينبغي ان يكون المحقق علي بينه من المورفولوجية من لويحات Aβ وقله المواليد من Aβ في الاوعيه الدموية. يجب ان يكون المحقق علي بينه من إشارات الفلورسنت السيارات. يمكن ان ينظر إلى الخلفية الخضراء الزائدة في بعض الأحيان بعد تلطيخ الحالي ، ولكن هذا يمكن ان تخفض عن طريق خفض الوقت تلطيخ أو عن طريق خفض تركيز Cur. وأخيرا ، قد يتم تقليل اشاره القولون مع علامات أخرى بسبب العلاجات المتكررة مع وكيل المقاصة (علي سبيل المثال ، اكسيلين).

وتشمل القيود الهامه عدم القدرة علي colabel مع اي بروتين علامة باستخدام الأجسام المضادة الثانوية الموسومة بصبغه الفلورسنت الخضراء ، مثل ايزوثيسيانات الفلورسنت (FITC). هذا يستطيع لا يكون استعملت بسبب الاثاره مماثله/انبعاث من [كور]. أيضا ، في المراحل المبكرة من AD ، قد يتم تسميه كميات محدوده فقط من Aβ بواسطة Cur. وأخيرا ، هناك حاجه للقيام بعمل في بيئة مظلمة مثل اي صبغه فلورية.

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

وجاء الدعم لهذه الدراسة من معهد أعصاب الميداني في اسنسيون سانت ماري.