تحليلات ترانسكريبتوميك خلية واحدة من خلايا الغدد الصماء البنكرياس الماوس

يصف لنا طريقة لعزل خلايا الغدد الصماء من البنكرياس الأجنة والأطفال حديثي الولادة وبعد الولادة، تليها تسلسل الحمض النووي الريبي خلية واحدة. يسمح هذا الأسلوب بتحليل التنمية النسب الغدد الصماء في البنكرياس، خلية ديناميات عدم التجانس وترانسكريبتوميك.

خلايا الغدد الصماء البنكرياس، التي تتجمع في الجزر الصغيرة، تنظيم استقرار الجلوكوز في الدم والايض الطاقة. تختلف أنواع الخلايا متميزة في الجزر الصغيرة، بما في ذلك إفراز الأنسولين خلايا بيتا، من أجداد الغدد الصماء شيوعاً أثناء المرحلة الجنينية. توسيع عن طريق انتشار الخلايا غير ناضجة من خلايا الغدد الصماء وتنضج خلال فترة إنمائية طويلة بعد الولادة. ومع ذلك، أن الآليات الكامنة وراء هذه العمليات غير محددة بوضوح. خلية واحدة-تسلسل الحمض النووي الريبي نهجاً واعداً لتوصيف السكان خلية متميزة وتتبع الخلية النسب تمايز المسارات. هنا، يمكننا وصف أسلوب للجيش الملكي النيبالي-تسلسل خلية واحدة من الخلايا β البنكرياس معزولة في البنكرياس الأجنة والأطفال حديثي الولادة وبعد الولادة.

البنكرياس جهاز الأيض حيوي في الثدييات. يتكون البنكرياس من المقصورات، وافرازات الغدد الصماء. خلايا الغدد الصماء البنكرياس، بما في ذلك خلايا بيتا المنتجة للأنسولين وإنتاج الجلوكاجون خلايا α، المجموعة معا في جزر لانجرهانز وكورديناتيلي تنظيم التوازن الجلوكوز الجهازية. ويؤدي الخلل في خلايا الغدد الصماء مرض البول السكري، الذي أصبح مشكلة صحية عامة رئيسية في جميع أنحاء العالم.

يتم اشتقاق خلايا الغدد الصماء في البنكرياس من Ngn3⁺ فروعه خلال embryogenesis¹. في وقت لاحق، خلال فترة ما حول الولادة، تتكاثر خلايا الغدد الصماء بشكل غير ناضجة الجزر الصغيرة. هذه الخلايا غير ناضجة مواصلة تطوير وتدريجيا تصبح جزيرات الناضجة، التي تصبح الغني vascularized لتنظيم التوازن الجلوكوز في الدم في البالغين².

على الرغم من أن قد حددت مجموعة من العوامل النسخي التي تنظم تمايز الخلايا β، مسار نضج الدقيق لخلايا بيتا لا يزال غير واضح. وعلاوة على ذلك، عملية نضج خلية بيتا ينطوي أيضا على تنظيم توسيع الخلية رقم^3،4 وتوليد التغايرية الخلوية^5،6. ومع ذلك، لم تدرس جيدا الآليات التنظيمية لهذه العمليات.

خلية واحدة-تسلسل الحمض النووي الريبي هو نهج قوية يمكن الشخصية الفئات السكانية الفرعية الخلية وتتبع الخلية النسب المسارات الإنمائية⁷. الاستفادة من هذه التكنولوجيا، مفتاح يمكن فك شفرتها الأحداث التي تحدث أثناء تطوير جزيرة البنكرياس في خلية واحدة مستوى⁸. بين البروتوكولات تسلسل الحمض النووي الريبي خلية واحدة، يسمح الذكية-seq2 جيل كامل طول كدنا مع تحسين حساسية ودقة، واستخدام الكواشف القياسية في انخفاض تكلفة⁹. ذكية-seq2 يستغرق يومين تقريبا لبناء مكتبة كدنا للتسلسل¹⁰.

هنا، نحن نقترح أسلوب لعزل الخلايا β المسمى الأسفار من البنكرياس للجنين للكبار Ins1-RFP الفئران المعدلة وراثيا¹¹، استخدام خلية تنشيط fluorescence الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية)، ويحلل أداء ترانسكريبتوميك في مستوى خلية واحدة، باستخدام التكنولوجيا الذكية-seq2 (الشكل 1). ويمكن تمديد هذا البروتوكول لتحليل ترانسكريبتوميس لجميع أنواع خلايا الغدد الصماء في البنكرياس في الدول العادية والمرضية والشيخوخة.

عليها جميع الأساليب الموصوفة هنا "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) من جامعة بكين.

1-البنكرياس العزلة

1. للأجنة E17.5 (17.5 يوما الجنينية):
   1. ويقدر اليوم الجنينية 0.5 استناداً إلى النقطة الزمنية عندما يظهر المكونات المهبلية.
   2. التضحية الفئران الحوامل بالإدارة₂ CO. رش الفراء البطن مع الكحول 70%.
   3. جعل شق على شكل V مع مقص من توسيع المنطقة التناسلية للاضلاع. سيتم فتح هذه العملية تماما في تجويف البطن.
   4. تشريح الرحم خارج تجويف البطن ووضعه في صحن 10 سم يحتوي على برنامج تلفزيوني الباردة.
   5. تشريح الأجنة من الرحم مع الملقط رقيقة ذات الرؤوس تحت ستيريوميكروسكوبي، إزالة الأنسجة الأخرى، مثل المشيمة والحبل السري. ضع جميع الأجنة في صحن 10 سم يحتوي على برنامج تلفزيوني الباردة.
   6. المسيل للدموع فتح تجويف البطن للأجنة وحفر النسيج الحشوي مع ملاقط الكوع. نقل النسيج الحشوي في صحن أسود أسفل 6 سم يحتوي على برنامج تلفزيوني الباردة.
   7. يقع في أعلى اليسار جزء من البطن البنكرياس وتعلق على المعدة والطحال والعفج (الخط المنقط صفراء في الشكل 2 أ)¹². فصل في البنكرياس من النسيج الحشوي استخدام الملقط وتجميع أنسجة البنكرياس في قنينة 20 مل يحتوي على 5 مل من محلول كولاجيناز الباردة 0.5 ملغ/مل: كولاجيناز 0.5 ملغ/مل ف في عزلة المخزن المؤقت (حبس تحتوي على 10 مم حبيس، 1 مم مجكل₂ ، 5 ملم الجلوكوز، ودرجة الحموضة 7.4).
2. للفئران P0-P15 (0-15 يوما بعد الولادة):
   1. التضحية وإصلاح الماوس بالتقيد بأطرافه إلى قطعة من حامي benchtop مع الشريط. رش الفراء البطن مع الكحول 70%.
   2. فتح تجويف البطن تماما كما هو موضح في الخطوة 1-1-3. سحب الأمعاء وعلى الجانب الأيسر للماوس. سوف يعرض هذا الإجراء الفصوص الإثني عشر والمعدة والطحال البنكرياس. تشريح جميع الفصوص البنكرياس (الشكل 2)¹² وتجميع أنسجة البنكرياس في قنينة 20 مل يحتوي على 5 مل من محلول كولاجيناز الباردة 0.5 ملغ/مل بعناية.
3. للفئران p18 وبطاقات مجانية-P60 (18-60 يوما بعد الولادة):
   1. إعداد الحل كولاجيناز. الحفاظ على الجليد حتى جاهزة للاستخدام.
   2. التضحية بالماوس وفتح التجويف البطني كما ذكر أعلاه (الخطوة 1.1.2 و 1.1.3).
      ملاحظة: لا تؤذي الكبد، وسوف تقلل ضغط التدفق في القناة الصفراوية أي جرح في الكبد وتقليل كفاءة التروية الخطوة التالية.
   3. قم بإزالة في الرهابه. سحب الأمعاء وعلى الجانب الأيمن من الماوس، ودفع الفصوص اليسار واليمين الآنسي الكبد لكل جانب لفضح (السهم الأبيض في الشكل 2) المرارة والقناة الصفراوية المشتركة.
   4. المشبك العفج مع زوج من المشابك السفن الصغيرة في الموضع العلوي والسفلي، المرافقة الموقع حيث يدخل القناة الصفراوية في العفج (الشكل 2D).
      ملاحظة: لا المشبك الفصوص المعدة أو الطحال البنكرياس. وسوف لا تدفق الحل كولاجيناز في الفص المعدة والطحال البنكرياس في الخطوة التالية إذا فرضت.
   5. ملء المحاقن مع 5 مل من محلول كولاجيناز الباردة 0.5 ملغ/مل وإدراج إبرة ز 30 في المرارة. بدقة وسلاسة، التلاعب بالإبرة عبر القناة الصفراوية المشتركة.
   6. نتخلل البنكرياس عن طريق حقن 1 – 5 مل من محلول كولاجيناز الباردة 0.5 ملغ/مل، تبعاً لحجم الماوس. ينبغي أن يكون الحقن البطيء والمستمر للحيلولة دون الانزلاق خارج مجرى الهواء الإبرة والحيلولة دون انفجار تحت ارتفاع ضغط السائل الأمعاء. اكتمال الحقن عند البنكرياس موسعة بشكل كامل.
   7. تشريح البنكرياس (الخط المنقط صفراء في 2D الشكل) خارج تجويف البطن باستخدام الملقط فورا بعد التروية. وضع الأنسجة في قنينة 20 مل يحتوي على 5 مل من محلول كولاجيناز الباردة 0.5 ملغ/مل. في حالة التعامل مع الماوس واحد أو أكثر في وقت واحد، نتخلل الفئران واحداً تلو الآخر وتجمع الأنسجة إلى حل كولاجيناز الباردة في قنينة 20 مل حتى قد تم تشريح الفئران جميع.

2-كولاجيناز الهضم وعزله جزيرة ليلى

1. مكان القنينة 20 مل يحتوي على أنسجة البنكرياس في حمام مائي 37 درجة مئوية واحتضان لمدة 3 دقيقة حجته درجة الحرارة.
2. بلطف يهز الأنبوب لآخر 3 إلى 5 دقائق. إذا هو تضخم أنسجة البنكرياس تماما، وسوف تنأى تدريجيا إلى قطع صغيرة من الأنسجة حتى أنه ينتشر أخيرا شكل موحد. ويختلف وقت الهضم اعتماداً على حجم البنكرياس وكفاءة التروية.
3. تصفية المنتج هضمها من خلال مصفاة نايلون 0.25 مم في أنبوب 50 مل أجهزة الطرد مركزي جديدة. شاملة يغسل مصفاة استخدام 20 مل حقنه تحتوي على برنامج تلفزيوني المثلج.
4. للبنكرياس E17.5-P15، قم بالتخطي إلى الخطوة 3.1.
5. للبنكرياس p18 وبطاقات مجانية-P60، الطرد المركزي في 200 x ز لمدة 1 دقيقة وتجاهل المادة طافية. تعليق إعادة الأنسجة مع برنامج تلفزيوني الباردة.
6. صب 5 مل تعليق الأنسجة في طبق السفلي أسود 6 سم. جزيرات البنكرياس هياكل بيضاء صغيرة، والتعاقد، درب التبانة والأنسجة أسينار بيضاء فضفاضة وشفافة. اختيار الجزر الصغيرة مع 200 ميكروليتر ماصة وتحويلها إلى 1.5 مل أنبوب يحتوي على كمية صغيرة من برنامج تلفزيوني الباردة.

3-التربسين هضم أنسجة البنكرياس أو الجزر الصغيرة

1. الطرد المركزي الأنبوب الذي يحتوي على أنسجة البنكرياس أو الجزر الصغيرة في 200 x ز لمدة 1 دقيقة في 4 درجات مئوية وتجاهل المادة طافية بدون إزعاج بيليه.
2. تعليق إعادة بيليه مع 0.25% التربسين-يدتا واحتضان في حمام مائي 37 درجة مئوية. بعد 4 دقائق من الحضانة، نضح بلطف وأحيانا (ماصة) لمدة 1 دقيقة باستخدام 200 ميكروليتر النصائح.
   ملاحظة: للبنكرياس E17.5-P3، أضف 1 مل التربسين-يدتا. للبنكرياس P4-P15، أضف 3 مل التربسين-يدتا. للجزر الصغيرة 100-300، أضف 1 مل التربسين-يدتا. ضبط حجم الصوت يدتا التربسين وفقا لكمية الأنسجة.
3. وقف الهضم عن طريق إضافة حجم x 0.4 من مصل البقر الجنين الباردة (FBS)، ومزيج من دوامة لطيف.
4. أجهزة الطرد المركزي في 250 x ز لمدة 3 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية دون إزعاج بيليه.
5. تعليق إعادة الخلايا مع 200 ميكروليتر الباردة نظام مراقبة الأصول الميدانية المخزن المؤقت (حبس يحتوي على 1% FBS، درجة الحموضة 7.4). نقل الخلايا إلى أنبوب 5 مل نظام مراقبة الأصول الميدانية.
6. بسرعة تدور أنبوب نظام مراقبة الأصول الميدانية للسماح بتعليق خلية لتمرير من خلال عامل التصفية لإزالة الحطام الأنسجة الكبيرة عسر الهضم. تعليق خلية مفردة في الأنبوب جاهز الآن لنظام مراقبة الأصول الميدانية الفرز.

4-خلية واحدة تحلل

1. إعداد المخزن المؤقت لتحلل الخلية.
   ملاحظة: إجراء جميع التجارب تحت غطاء تعقيم الأشعة فوق البنفسجية مع الاندفاق الصفحي. ينبغي أن تكون جميع الأنابيب ولوحات ونصائح ماصة رناسي-الدناز مجاناً. إزالة التلوث من هود والماصات مع رناسي الحل بعيداً قبل الاستخدام.
   1. ذوبان الجليد الكواشف على الجليد: دنتب (10 ملم)، اليغو-dT التمهيدي (10 ميكرومترات)، واركك الأسهم الحل (01:20).
   2. تمييع اركك إلى 1:5 × 10⁵ مع المياه خالية من نوكلاس.
   3. حساب حجم المخزن المؤقت لتحلل الخلية المطلوبة. إضافة 0.1 ميكروليتر من رناسي المانع (يو 40/ميكروليتر)، ميكروليتر 1.9 من 0.2 في المائة (المجلد/المجلد) X-100 تريتون، 1 ميكروليتر دنتب وميكروليتر 1 من التمهيدي اليغو-dT ميكروليتر 0.05 من اركك المخفف لوحدة تخزين نهائي من ميكروليتر 4.05 لكل خلية.
   4. قاسمة المخزن المؤقت تحلل الخلية في أنابيب PCR 8-شريطية رقيقة الجدار 0.2 مل أو لوحات 96-جيدا. الطرد المركزي في أنابيب أو لوحات لمدة 30 ثانية في 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: الطرد المركزي أنابيب PCR 8-شريطية رقيقة الجدار 0.2 مل في 7500 x ز ولوحات 96-جيدا في 800 x ز في الخطوات التالية.
2. انتقاء خلية واحدة وتحلل.
   1. يدوياً اختيار نظام مراقبة الأصول الميدانية فرز الخلايا Ins1-طلب تقديم العروض⁺ واحدة في المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية في أنابيب PCR 8-قطاع استخدام من 30-40 ميكرون ماصة شعرية، أو مباشرة فرز الخلايا المفردة Ins1-طلب تقديم العروض⁺ إلى لوحات 96-جيدا. وحدة التخزين التي تحتوي على خلية واحدة يعتبر أقل من 0.3 ميكروليتر.
      ملاحظة: استخدام مبعثر الأمام مقابل الطول (منتدى التعاون الأمني-H) إلى الأمام مبعثر منطقة استراتيجية التمييز يبنوا النابضة (منتدى التعاون الأمني-أ)، مقابل منتدى التعاون الأمني-ح الجانب المجال مبعثر (SSC-أ) للحطام والأسفار النابضة لفرز الخلايا (الشكل 3A-3C) Ins1-طلب تقديم العروض⁺ . لتحديد أسلوب الانتقاء، فرز الخلايا الهدف في أنبوب 1.5 مل تحتوي على 300 ميكروليتر نظام مراقبة الأصول الميدانية العازلة. التركيز النهائي المناسب 5-10 خلية/ميكروليتر. ضبط حجم المخزن المؤقت وفقا لذلك. لطريقة جمع صفيحة، فرز خلية واحدة في كل بئر من صفيحة 96-جيدا عقب المختصر للصك. ^{7 , 13}
   2. دوامة الأنابيب أو لوحات الخلايا والإفراج عن الجيش الملكي النيبالي. الطرد المركزي في أنابيب أو لوحات لمدة 30 ثانية في 4 درجات مئوية وعلى الفور مكان لهم على الجليد.
      ملاحظة: يمكن تخزين الخلايا في-80 درجة مئوية لمدة أسبوع واحد.

5-خلية واحدة كدنا التضخيم

1. عكس النسخ (RT).
   1. ذوبان الجليد الكواشف RT (الجدول 1) على الجليد.
   2. احتضان هذه العينات في 72 درجة مئوية لمدة 3 دقائق وفورا على أنابيب أو لوحات على الجليد على الأقل 1 دقيقة بإيجاز الطرد المركزي أنابيب أو لوحات لمدة 30 ثانية في 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: استخدم cycler حرارية مع غطاء 105 مئوية ساخنة لجميع إينكوبيشنز.
   3. إعداد مزيج RT لجميع ردود الفعل، كما هو موضح في الجدول 1.
   4. الاستغناء عن 5.7 ميكروليتر من مزيج RT لكل عينة إحضار وحدة التخزين لما مجموعة 10 ميكروليتر. بلطف دوامة المزيج والطرد المركزي لمدة 30 ثانية في 4 درجات مئوية.
   5. وضع العينات في cycler حرارية وبدء برنامج RT على النحو التالي: 42 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة، 10 دورات (50 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة، 42 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة)، 70 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة وعقد في 4 درجات مئوية.
2. بكر قبل التضخيم.
   1. ذوبان الجليد الكواشف بكر (الجدول 2) على الجليد.
   2. إعداد مزيج PCR لجميع ردود الفعل، كما هو موضح في الجدول 2.
   3. الاستغناء عن 15 ميكروليتر من مزيج PCR لكل عينة، والذي يحتوي على ردود الفعل الأولى-حبلا. بلطف دوامة المزيج والطرد المركزي لمدة 30 ثانية في 4 درجات مئوية.
   4. وضع العينات في cycler حرارية والبدء في البرنامج التالي PCR: 98 درجة مئوية لمدة 3 دقائق، دورات 18 (98 درجة مئوية 20 s، 67 درجة مئوية لمدة 15 ق، 72 درجة مئوية لمدة 6 دقائق)، 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق وعقد في 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: يمكن تخزين المنتج بكر عند 4 درجة مئوية لمدة أقل من أسبوع واحد أو في-20 درجة مئوية/-80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
3. تنقية PCR.
   1. إضافة 25 ميكروليتر من إعادة تعليق الخرز تنقية الحمض الخلوي الصبغي (س 1) لكل عينة من الخطوة السابقة ومزيج جيد من دوامة. ثم، بسرعة تدور أنبوب أو لوحات في درجة حرارة الغرفة جمع السائل ولكن تجنب تسوية الخرز.
      ملاحظة: حجته الخرز تنقية الحمض النووي لدرجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة ودوامه جيدا قبل الاستخدام.
   2. احتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
   3. مكان الأنبوب أو لوحة في المناسبة المغنطيسي الوقوف حتى الحل الواضح، ثم بعناية إزالة وتجاهل المادة طافية.
   4. إضافة 200 ميكروليتر من الإيثانول 80% طازجة لغسل الخرز بينما في موقف المغناطيسية، واحتضان لمدة 30 ثانية، ثم بعناية إزالة وتجاهل الحل الإيثانول.
      ملاحظة: الحل الإيثانول 80% (المجلد/المجلد) ينبغي أن يكون طازج في كل مرة.
   5. كرر الخطوة 5.3.4 لإجمالي يغسل اثنين.
   6. بعناية إزالة وتجاهل الباقي الحل الإيثانول والهواء الجاف الخرز بينما الأنبوب أو لوحة على الوقوف المغناطيسية.
      ملاحظة: تجنب الإفراط في تجفيف الخرز لضمان الكفاءة القصوى شطف.
   7. إضافة ميكروليتر 11 من المياه خالية من نوكلاس الوت الهدف الحمض النووي من الخرز ومزيج جيد من دوامة. ثم سرعان ما تدور أنبوب أو لوحة ووضعه في موقف مغناطيسي حتى الحل الواضح. نقل 10 ميكروليتر من العينة إلى أنبوب بكر جديدة.
      ملاحظة: في حالة وجود dimers بعد جولة واحدة من تنقية، استناداً إلى الكشف عن توزيع حجم كدنا، تنقية مرة أخرى لإزالة dimers تماما. يمكن أن تؤثر dimers حساب العائد كدنا إذا سمح لهم بالبقاء في العينة.
4. فحص الجودة من كدنا.
   1. اختيار العينات للكشف عن العائد الإجمالي كدنا استخدام fluorometer عشوائياً.
   2. تقييم مستويات التعبير الجيني علامة طريق PCR الوقت الحقيقي (qPCR) (4E الشكل). إزالة 1 ميكروليتر من العينة تمييع 40 مرة، وأداء قبكر باستخدام لوحة 384-جيدا. إعداد مزيج قبكر كما هو موضح في الجدول 3. شروط ركوب: 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، دورات 45 (95 درجة مئوية لمدة 10 s، 60 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، 72 درجة مئوية لمدة 15 s).
   3. اختيار العينات للكشف عن حجم التوزيع باستخدام أداة التفريد شعرية موازية عشوائياً.

6-كدنا بناء المكتبة

1. تاجمينتيشن رد فعل ترانسبوساسي Tn5.
   1. كشف كدنا عائد إجمالي الخلايا qPCR مختارة من الخطوة 5.4.2 استخدام فلوروميتير. استخدام 2 نانوغرام من كدنا كمادة البدء.
   2. ذوبان الجليد الكواشف رد فعل تاجمينتيشن (الجدول 4) على الجليد.
   3. إعداد رد فعل تاجمينتيشن في أنبوب بكر 8-شريطية رقيقة جدار 0.2 مل، كما هو موضح في الجدول 4، ومزيج دقيق من دوامة. ثم، تدور بسرعة إلى أسفل الحل في درجة حرارة الغرفة.
   4. احتضان هذه العينات في 55 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، وعقد في 4 درجات مئوية.
   5. فورا إضافة 2 ميكروليتر من 5 x الملخص لكل عينة تحتوي على تاجمينتيد الحمض النووي لوقف رد الفعل. مزيج دقيق من دوامة، ومن ثم تدور بسرعة إلى أسفل الحل في درجة حرارة الغرفة.
   6. احتضان هذا الخليط لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ينبغي معالجة الحمض النووي لتخصيب اليورانيوم نهائياً PCR فورا.
2. التضخيم من محول متصلة الأجزاء.
   1. ذوبان الجليد الكواشف بكر (الجدول 5) على الجليد.
   2. إعداد مزيج PCR تخصيب اليورانيوم، كما هو موضح في الجدول 5، ومزيج دقيق من دوامة. ثم، تدور بسرعة إلى أسفل الحل في درجة حرارة الغرفة.
   3. أداء بكر باستخدام البرنامج التالي: 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، 98 درجة مئوية لمدة 30 s، 8 دورات (98 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، 60 درجة مئوية لمدة 30 s، 72 درجة مئوية لمدة 3 دقائق)، 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق وعقد في 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: عدد الدورات يعتمد على مقدار الحمض النووي مكتبة المتوقعة.
3. تنقية PCR مع حجم التحديد.
   1. إضافة 14 ميكروليتر من إعادة تعليق الخرز تنقية الحمض النووي (0.7 x) لكل عينة من الخطوة السابقة ومزيج جيد من دوامة. ثم، بسرعة تدور الأنبوب في درجة حرارة الغرفة جمع السائل ولكن تجنب تسوية الخرز.
      ملاحظة: حجته الخرز تنقية الحمض النووي لدرجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة ودوامه جيدا قبل الاستخدام.
   2. احتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
   3. وضع الأنبوب على موقفا مغناطيسي مناسب حتى يتم الحل واضح، بعناية نقل المادة طافية على شريط أنبوب جديد وتجاهل الشريط الأنبوبة السابقة.
   4. إضافة 3 ميكروليتر من إعادة تعليق الخرز تنقية الحمض النووي (0.15 x) لكل عينة في أنبوب شريطية ومزيج جيد من دوامة. ثم، بسرعة تدور الأنبوب في درجة حرارة الغرفة.
   5. احتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
   6. مكان الأنبوب أو لوحة في المناسبة المغنطيسي الوقوف حتى الحل الواضح، ثم بعناية إزالة وتجاهل المادة طافية.
   7. إضافة 200 ميكروليتر من الإيثانول 80% طازجة لغسل الخرز بينما في موقف المغناطيسية، واحتضان لمدة 30 ثانية، ثم بعناية إزالة وتجاهل الحل الإيثانول.
      ملاحظة: الحل الإيثانول 80% (المجلد/المجلد) ينبغي أن يكون طازج في كل مرة.
   8. كرر الخطوة 6.3.7 لإجمالي يغسل اثنين.
   9. بعناية إزالة وتجاهل الباقي الحل الإيثانول والهواء الجاف الخرز بينما الأنبوب أو لوحة على الوقوف المغناطيسية.
      ملاحظة: تجنب الإفراط في تجفيف الخرز لضمان الكفاءة القصوى شطف.
   10. إضافة ميكروليتر 11 من المياه خالية من نوكلاس الوت الهدف الحمض النووي من الخرز ومزيج جيد من دوامة. ثم سرعان ما تدور أنبوب أو لوحة ووضعه في موقف مغناطيسي حتى الحل الواضح. نقل 10 ميكروليتر من العينة إلى خط أنبوب جديد.
4. فحص الجودة من مكتبة كدنا النهائي.
   1. قياس تركيز كل مكتبة باستخدام فلوروميتير والتحقق من توزيع حجم استخدام أداة التفريد شعرية موازية.
      ملاحظة: العائد الحمض النووي عادة ما بين 15-25 نانوغرام لكل مكتبة. الشظايا التي تتراوح بين 250 شركة بريتيش بتروليوم إلى 450 يحتفل بي بي. إذا ظلت dimers بعد تنقية، كما أكدته الاختيار توزيع حجم، تنقية مع 1 × الخرز تنقية الحمض النووي مرة أخرى.
5. تجميع مكتبة
   1. استناداً إلى حجم جزء التقريبي، تجمع كميات متساوية من الحمض النووي من كل عينة، ضمان أن أيا منها لا تحتوي على تركيبات نفس محولات N6XX و N8XX.

7. تسلسل الحمض النووي

1. موضوع المكتبات المراقب إلى 51 بي بي واحد في نهاية التسلسل باستخدام نظام تسلسل الفائق. إجراء تسلسل يتبع البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة. عمق التسلسل كل خلية يقرأ حوالي 1 مليون في المتوسط⁸، مالا يقل عن 0.5 مليون يقرأ كل خلية¹⁴.

8. التحليلات المعلوماتية الحيوية

1. تقييم نوعية التسلسل والمحاذاة.
   1. تقييم جودة ما يلي التسلسل باستخدام فاستقك (v0.11.3)¹⁵ مع المعلمات التالية: "فاستقك-input_fastq output_dir-o استخراج".
   2. دمج الجينوم الماوس مع تسلسل اركك باستخدام الأمر "القط mm10.fa ERCC.fa > mm10_ERCC.fa".
   3. بناء bowtie2 (v2.2.5)¹⁶ مؤشر مع المعلمات التالية: "بناء bowtie2 mm10_ERCC.fa mm10_ERCC".
   4. محاذاة إلى ما يلي: استخدام tophat2 (v2.1.0)¹⁷ مع المعلمات التالية: "tophat2-س output_dir ز-gene.gtf-الترنسكربيتوم-مؤشر trans_index mm10_ERCC input_fastq".
2. قياس مستويات التعبير الجيني.
   1. يقرأ عدد معين لكل الجينات باستخدام هتسيق (v 0.6.0)¹⁸ مع المعلمات التالية: '' هتسيق-العد-أم-نقاط البيع-اللغات الرسمية لا gene.gtf accepted_hits.bam-30 > read_count.txt ''.
   2. تطبيع مستويات التعبير الجيني للنصوص كل مليون (TPM)¹⁹.
3. مراقبة الجودة للخلايا.
   1. استبعاد الخلايا التي تحتوي على أقل من 0.5 مليون القراءات المعينة أو 4,000 أقل من الجينات (TPM > 1).
      ملاحظة: يعتمد معيار الاستبعاد على أنواع الخلايا وعمق التسلسل.
   2. الاحتفاظ بالخلايا معربا عن علامات الغدد الصماء (مثلاً، Ins1 للخلايا β، فريق التنسيق العالمي للخلايا α)، واستبعاد الخلايا معربا عن علامات غير الصماء (مثلاً، Spi1 للكريات البيضاء).
4. تحليل العنصر الرئيسي (PCA)
   1. تحديد الجينات اختلافاً كبيرا حسب اركك سبايك الإضافية، كما هو موضح سابقا²⁰.
   2. إجراء التحكيم باستخدام الدالة "التحكيم" في آر حزمة²¹من فاكتومينير (v1.31.4)، مع log2(TPM + 0.1) من جينات اختلافاً كبيرا.
   3. وضع تصور لنتائج محكمة التحكيم الدائمة مع ggplot2 (v2.0.0)²².
5. هرمي التكتل.
   1. تحديد الجينات مع أحمال المكون الرئيسي (PC) أعلى باستخدام الدالة "ديمديسك" فاكتومينير (v1.31.4)²¹.
   2. القيام بتجميع التسلسل الهرمي باستخدام الدالة "heatmap.2" في جبلوتس (v3.0.1) R حزمة²³، مع log2 (TPM + 1) القيم النسبية لأجهزة الكمبيوتر عالية تحميل الجينات.

تم تشريح البنكرياس من الفئران الأجنة والأطفال حديثي الولادة وبعد الولادة (الشكل 2A و 2 باء). يعتمد تأثير الجهاز الهضمي للفئران الأقدم من يوم الولادة 18، على درجة التروية؛ ولذلك، الحقن هو أهم خطوة لعزله جزيرة ليلى (الشكل 2--2E و الجدول 6). تم حقن قدر كولاجيناز قدر الإمكان لملء البنكرياس أثناء هذه الخطوة. ويرد تماما تضخم البنكرياس في 2D الشكل. إذا نضح ليست ناجحة (الشكل 2E)، ولكن العينة الثمينة، يمكن أن تمزق البنكرياس إلى قطع صغيرة الهضم كافية في وقت لاحق.

بعد نضح، كان يهضم أنسجة البنكرياس إلى قطع صغيرة لإطلاق سراح الجزيرات (الشكل 2 واو). لتقصير وقت الفرز نظام مراقبة الأصول الميدانية، ونحن أثري خلايا الغدد الصماء الانتقاء في الجزر الصغيرة في وقت مبكر. حجم الجزر الصغيرة تختلف حسب عمر الماوس وكثافة الهضم. في بعض الأحيان، الجزر ليست جولة في الشكل. وينبغي اختيار الجزر حسب اللون والدولة المدمجة (الشكل 2 و الجدول 6). إذا كان الضغط الماوس المعدلة وراثيا جين مراسل، مثل التجارة والنقل أو طلب تقديم العروض لخلايا الغدد الصماء، يمكن أيضا انتقاء الجزيرات تحت مجهر الأسفار.

تم تنقية الخلايا Ins1-طلب تقديم العروض⁺ بنظام مراقبة الأصول الميدانية الفرز (الشكل 3 ألف-3 ج) ومن ثم اختار الخلايا المفردة باستخدام ماصة شعرية لخلية واحدة الجيش الملكي النيبالي-seq (3D الشكل). كدنا تضخيم بنجاح يجب أن يكون طول كامل أكثر من 500 شركة بريتيش بتروليوم، وإثراء من كيلو بايت 1.5 إلى 2 كيلو بايت. وعلاوة على ذلك، عادة ما يكون هناك إثراء bp 500-600 كدنا لوحظت في الخلايا Ins1-طلب تقديم العروض⁺ ، والتي قد تمثل النصوص الأنسولين (الشكل 4 أ). ومع ذلك، كانت هناك بعض الحالات الشاذة الملاحظة¹⁰ (الجدول 6). على سبيل المثال، بالقرب من الشظايا كدنا 100 شركة بريتيش بتروليوم هي مبلمر (الشكل 4 باء)، التي عادة ما يسببها الإشعال المفرطة، التي يجب إزالتها عن طريق تكرار الخطوة تنقية الحمض النووي. قد تؤثر على وجود مبلمر حسابات كدنا مجموع الغلات، التي يتم استخدامها لبناء مكتبة التالية. شظايا كدنا بين 100 شركة بريتيش بتروليوم و 500 bp عادة تمثل المتدهورة كدنا (الشكل 4)، الذي يحدث بسبب مشاكل الوضع أو المتفاعلة خلية سيئة، مثل التلوث رناسي. تحت هذا الشرط، ينبغي أن نحدد سبب تدهور الحمض النووي واستبعاد الاضطرابات. على سبيل المثال، لضمان وضع الخلية جيدة، يجب أن يهضم الأنسجة ويجب فرز الخلايا بسرعة ولطف، وينبغي إجراء عمليات بحذر لتجنب أي نوع من الملوثات.

بعد تنقية المكتبات كدنا للتسلسل، حصلنا على شظايا كدنا ذات الأحجام المختلفة باتباع الإرشادات لإضافة نسب مختلفة من الخرز تنقية الحمض النووي للعينة. على سبيل المثال، يمكننا الحصول على كدنا تتراوح بين 250 شركة بريتيش بتروليوم bp بإضافة x 0.7 و 0.15 × الخرز تنقية الحمض النووي للأولى والثانية 450 طلقة لتنقية، على التوالي (الشكل 4). هذه الخطوة بمعدل نجاح مرتفع. ومع ذلك، إذا كان هناك أجزاء من ما يقرب من 100 شركة بريتيش بتروليوم، يقترح لتنقية المكتبات مرة أخرى مع 1 × الخرز تنقية الحمض النووي لإزالة dimers (الجدول 6). Dimers أونريموفيد سوف تحرف الكمي الحمض النووي وسوف تؤثر العينة تجميع النتائج، مما يؤدي إلى الحصول على البيانات غير متكافئ من كل عينة.

قمنا بتحليل البيانات التسلسل مع نهج المعلوماتية الحيوية (الشكل 5A). ينبغي أن يكون عشرات نوعية التسلسل أكبر من 30 خلال تسلسل نوعية التقييم (الشكل 5 (ب)). من المتوقع بعد المحاذاة، 80-90% القراءات ليتم تعيينها إلى الجينوم مرجع. للحصول على خلايا ذات جودة عالية لتحليلات المصب، نحن استبعاد الخلايا التي تحتوي على أقل من 0.5 مليون القراءات المعينة أو مع 4,000 أقل من اكتشاف الجينات (الشكل 5 و 5 د). بعد محكمة التحكيم الدائمة والمجموعات الهرمية، تتميز مجموعات مختلفة من الخلايا، وتحديد الجينات التي تم الإعراب عنها تقوم في مجموعات مختلفة⁸.

رقم 1: نظرة عامة التخطيطي للجيش الملكي النيبالي-seq خلية واحدة من خلايا الغدد الصماء البنكرياس الماوس. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

رقم 2: تشريح البنكرياس ونضح والانتقاء ايميا. (أ) تشريح أنسجة البنكرياس الجنينية (السفلي) من جنين E17.5 (العليا). خط منقط الأصفر فىالوقت أنسجة البنكرياس. شريط المقياس = 1,000 ميكرومتر. (ب) تشريح أنسجة البنكرياس بعد الولادة (يمين) من ماوس P10 (إلى اليسار). شريط المقياس = 1,000 ميكرومتر. (ج-د) أنسجة البنكرياس بالماوس P60 قبل (ج) وبعد نضح (د). خط منقط الأصفر فىالوقت أنسجة البنكرياس. ويشير السهم الأبيض إلى المرارة. (ﻫ) أنسجة البنكرياس جزئيا perfused ماوس P60. يشير السهم الأحمر إلى منطقة بيرفوسيد البنكرياس. الأسهم الزرقاء تشير إلى مجالات perfused ضعف البنكرياس. الأنسجة (F) البنكرياس قبل (العليا) وبعد الهضم كولاجيناز (السفلي). (ز) أسهم أشر إلى الجزر الصغيرة التي تم إصدارها من أنسجة البنكرياس كولاجيناز هضمها. شريط المقياس = 200 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 3: اختيار الخلايا التي تحتوي 30 – 40 ميكرومتر ماصة شعرية تحت مجهر يدوياً. (أ-ج) تدريجيا نظام مراقبة الأصول الميدانية النابضة لفرز الخلايا Ins1-طلب تقديم العروض⁺ . (د) مشرق الدوائر تشير إلى الخلايا والانبوب ماصة شعرية. اختر الخلايا مع أفضل مورفولوجيا (سهم) وتجاهل الخلايا متفاوت المسافات (رأس السهم). شريط المقياس = 200 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 4: نوعية الكشف عن توزيع حجم كدنا ومكتبة للخلايا Ins1-طلب تقديم العروض⁺ بصك التفريد شعرية موازية. (أ) الممثل نتيجة كدنا تضخيم مسبقاً بنجاح. عادة، يجب أن يكون التشكيل الجانبي كدنا أعلاه 500 bp مع ذروة kb ~1.5–2. (ب) ممثل نتيجة كدنا تضخيم مسبقاً مع ذروة ديمر التمهيدي. ذروة ديمر التمهيدي هو ما يقرب من 100 هناك (ج) صورة كدنا تضخيم مسبقاً مع شظايا بين 100 شركة بريتيش بتروليوم و 500 bp يشير إلى إمكانية تدهور كدنا. (د) توزيع حجم كدنا مكتبة تتراوح ما بين 250 bp ويلي بي بي 450 تنقية الخطوات المشار إليها في هذا البروتوكول. (ﻫ) التعبير مستويات Ins2 في مكتبات كدنا قبكر (يسار) والنسبية تسلسل البيانات (يمين). إكساكسيس تمثل عينات خلية مفردة 8 متميزة. ويمثل المحور الصادي (يسار) ΔCt طبيعية بالنسبة إلى جابده (Ct_جابده-Ct_Ins2 + 6) والمحور الصادي (يمين) يمثل مستوى التعبير تم تسويتها من Ins2 بالنسبة إلى جابده (سجل₂(TPM _Ins2 /TPM_جابده)). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الرقم 5: التحليلات المعلوماتية الحيوية من البيانات في خلية واحدة الترنسكربيتوم. (أ) خط أنابيب من التحليلات المعلوماتية. (ب) تسلسل درجات الجودة عبر جميع القواعد لما يلي. (ج) توزيع عدد مرات القراءة المعينة. (د) توزيع عدد الجينات المكتشفة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الجدول 1: كاشف RT خلط المكونات في رد فعل ميليلتر 5.7 لكل عينة.

الجدول 2: PCR قبل التضخيم كاشف مزيج المكونات في رد فعل ميليلتر 25 لكل عينة

الجدول 3: كاشف قبكر خلط المكونات في رد فعل ميليلتر 10 باستخدام لوحة 384-جيدا قياسية.

الجدول 4: كاشف تاجمينتيشن خلط المكونات في رد فعل ميليلتر 8 لكل عينة.

الجدول 5: الإثراء PCR كاشف مزيج المكونات في رد فعل 20 ميليلتر لكل عينة.

الجدول 6: استكشاف الأخطاء وإصلاحها.

وفي هذا البروتوكول، أثبتنا طريقة فعالة وسهلة الاستخدام لدراسة ملامح التعبير خلية واحدة من الخلايا β البنكرياس. يمكن استخدام هذا الأسلوب لعزل خلايا الغدد الصماء من البنكرياس الأجنة والأطفال حديثي الولادة وبعد الولادة والقيام بالتحاليل ترانسكريبتوميك خلية واحدة.

أن الخطوة الأكثر أهمية هو عزل خلايا بيتا واحد في حالة جيدة. البنكرياس تماما perfused الاستجابة على نحو أفضل الهضم اللاحقة. سيؤدي إلى عدم كفاية التروية، الذي يحدث عادة في البنكرياس الظهرية، في جزيرة صغيرة منخفضة عائد. بعد نضح، وقت الهضم وتهز كثافة تتطلب اهتماما خاصا. الهضم المفرط، والناجمة عن أوقات حضانة طويلة وقوية تهتز، يمكن كسر الجزيرات أربا. الهضم غير كافية سوف منفصلة تماما في الجزر الصغيرة من الأنسجة المجاورة. بعد هضم البنكرياس، كانت تنقية الجزيرات بالانتقاء اليد بدلاً من الكثافة المتدرجة الطرد المركزي. على الرغم من أن الكثافة المتدرجة الطرد المركزي يمكن أن تثري الجزر الصغيرة، يتم تجاهل العديد من الجزر الصغيرة أو الجزر الصغيرة المرتبطة بالانسجة أسينار عن طريق الخطأ. في محاولة لتجنب التقاط acinar الأنسجة، والتي يمكن أن تسبب التربسين عدم كفاءة الهضم وتقليل نقاء الخلايا β.

Replicates البيولوجي المستقلة ضرورية للتمييز بين الآثار البيولوجية تقلب ودفعه واحدة. إذا يتطابق البيولوجية اثنين بنمط مماثل في محكمة التحكيم الدائمة وتشمل مجموعات فرعية مماثلة في تجميع النتائج، هذه العينات قد تكشف عن التنوع البيولوجي موثوق بها. خلاف ذلك، replicates البيولوجية الإضافية المطلوبة لتأكيد النتائج. لجهاز التمثيل الغذائي مثل البنكرياس، قد تمثل الدولة الخلية المرتبطة ب الإيقاعية على مدار الساعة²⁴ الاختلافات دفعة. لحل هذه المشكلة، نوصي بجمع عينات من جميع في نفس الوقت من اليوم.

الحد من هذا النهج هو الإنتاجية منخفضة لأن لدينا لبناء مكتبة لكل خلية. سبب الإشعال الإفراط في رد الفعل، وينبغي تنقية كدنا قبل وبعد بناء مكتبة عموما مرتين لإزالة تماما مبلمر. هذه العمليات التي تستغرق وقتاً طويلاً. في الآونة الأخيرة، أبلغ بروتوكول معدل²⁵ التي يمكن أن تحل هذه المشكلة إلى حد ما. في هذا البروتوكول، تسميات الرمز الشريطي خلية على حدة الشظايا التي كدنا خلال الخطوة النسخ العكسي. ولذلك، كدنا كل خلية يمكن تجميعها معا وثم يتم تنقيتها، متبوعاً ببناء المكتبة. هذا التعديل يزيد بشكل ملحوظ إنتاجية بناء المكتبة. ومع ذلك، هذا الأسلوب تم التعديل هو أقل حساسية ويكشف عددا أقل من الجينات في الخلية. وبالإضافة إلى ذلك، هذا الأسلوب هو 3 ' عد الأسلوب مع انخفاض التغطية القراءة. ولذلك، seq2 الذكية لا يزال الأسلوب الأكثر ملاءمة لتطوير البنكرياس.

إعداد البنكرياس من الأنواع الأخرى قد تكون مختلفة. للبنكرياس البشرية، يمكن الجزر الصغيرة المعزولة بعد^26،البروتوكولات السابقة²⁷. ثم يمكن فصلها إلى خلايا مفردة²⁸ الجزر المنعزلة وإجراء تحليلات خلية واحدة باستخدام هذا الأسلوب. يمكن تطبيق هذه الطريقة على نطاق واسع لأبحاث التنمية البنكرياس الثدييات والأمراض وتجديدها.

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

ونحن نشكر المركز الوطني للعلوم البروتين وبكين (جامعة بكين) ومركز بكين تسينغهوا "منصة الحوسبة علوم الحياة". هذا العمل كان تدعمها وزارة العلوم والتكنولوجيا في الصين (2015CB942800) والوطنية العلوم الطبيعية مؤسسة في الصين (31521004 و 31471358 و 31522036)، وتمويل من مركز بكين تسينغهوا لعلوم الحياة إلى جيم-R.X.