تشريح وثقافة ماوس الجنينية الكلى

يصف هذا البروتوكول طريقة لعزل وزراعة أساسيات ميتانيفريك من الأجنة الماوس.

الهدف من هذا البروتوكول هو لوصف طريقة لتشريح، العزلة، والثقافة من أساسيات ميتانيفريك الماوس.

خلال تطور الكلى الثدييات، واثنين من الأنسجة الاصلية، وبرعم الحالب والميزينشيم ميتانيفريك، والتواصل وتحفيز بالمثل آليات الخلوية لتشكيل في نهاية المطاف نظام جمع و نيفرونس الكلى. كما تنمو الأجنة الثدييات داخل الرحم وبالتالي لا يمكن الوصول إليها للمراقب، وقد وضعت ثقافة الجهاز. مع هذا الأسلوب، فمن الممكن لدراسة التفاعلات الظهارية اللحمة المتوسطة والسلوك الخلوي خلال أورغانوجينيسيس الكلى. وعلاوة على ذلك، يمكن التحقق من أصل الكلى الخلقية والتشوهات الجهاز البولي التناسلي. بعد تشريح دقيق، يتم نقل أساسيات ميتانيفريك على مرشح الذي يطفو على وسط الاستزراع ويمكن أن تبقى في حاضنة ثقافة الخلية لعدة أيام. ومع ذلك، يجب أن يكون على بينة من أن الشروط هيالاصطناعي ويمكن أن تؤثر على عملية التمثيل الغذائي في الأنسجة. أيضا، اختراق المواد اختبار يمكن أن تكون محدودة بسبب المصفوفة خارج الخلية والغشاء القاعدي موجودة في إكسلانت.

ميزة رئيسية واحدة من ثقافة الجهاز هو أن المجرب يمكن الحصول على إمكانية الوصول المباشر إلى الجهاز. هذه التكنولوجيا هي رخيصة وبسيطة، ويسمح لعدد كبير من التعديلات، مثل إضافة المواد النشطة بيولوجيا، ودراسة المتغيرات الجينية، وتطبيق تقنيات التصوير المتقدمة.

The mammalian kidney is derived from two primordial structures with mesodermal origin: the tubular epithelial ureteric bud and the metanephric mesenchyme. During nephrogenesis, the ureteric bud invades the metanephric mesenchyme and branches to form the collecting system. The metanephric mesenchyme gives rise to the epithelial elements of the nephrons. These processes occur in a precisely timed and spatially coordinated manner and are initiated by reciprocal inductive mechanisms. Both tissue components communicate and affect the other's cell morphogenesis.

In the 1920s, it was Boyden who performed the in vivo obstruction of the mesonephric duct in chicken, providing the first indication of inductive interactions as separated nephric blastema fail to differentiate¹. At about the same time, the first successful attempts to culture chicken nephric rudiments in a hanging drop were published. Subsequently, the organ culture was developed to study tissue interactions in mammalian organogenesis. In the 1950s, Grobstein developed a technique in which metanephric rudiments could be cultured on a filter. This technique was modified by Saxén, who placed the filter on a Trowell-type screen in a culture dish¹. Over the years, many modifications and applications for organ culture have emerged. The method described here is based on Saxén's technique but is simplified, as the filters float free on the medium and the diameter of the culture well only slightly exceeds the diameter of the filter, limiting unwanted movement of the filter.

Whole-organ culture is a classical, cheap, and simple but powerful tool to investigate cellular processes and intercellular communication during organogenesis. Organ culture allows for treatment with biological agents, such as growth factors, antibodies, antisense oligonucleotides, viruses, and peptides, as well as with pharmaceutical compounds and other chemicals. Also, gene function may be studied using explants derived from genetically modified mice or using inducible gene inactivation technology, such as the Cre-loxP system. This allows for the study of genetic mutations that cause embryonic lethality prior to the development of the kidney. Organ culture can also be combined with fluorescent tagging for gene function or lineage tracing and modern imaging techniques, which enable real-time monitoring of cell behavior².

In the specific example provided here, the effect of EphrinB2-activated Eph-receptor signaling on the branching morphology of the ureteric bud was investigated. The morphology of the EphA4/EphB2 double-knockout mice suggested several severe defects in kidney development, which were detectable as early as embryonic day 11 (E11) and involved the ureteric bud, the ureter, and the common nephric duct³. Signaling via Eph receptors requires the clustering of the ligand-receptor dimer⁴. To over-activate Eph signaling, the kidney rudiments from E11.5 mouse embryos were cultured in the presence of clustered recombinant EphrinB2-Fc. EphrinB2 is a known ligand for the EphA4 receptor, which is expressed in the ureteric bud tips³.

وتم الحفاظ على الفئران وفقا للوائح السويدية وتشريعات الاتحاد الأوروبي (2010/63 / يو). وتم تنفيذ جميع الإجراءات وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة الأخلاقيات السويدية (التصاريح C79 / 9 و C248 / 11 و C135 / 14). وقد تمت الموافقة على الإجراءات في جامعة هايدلبرغ التي تتعلق بالمواضيع الحيوانية من قبل ريجيرونسبراسيديوم كارلسروه وضباط رعاية الحيوان في جامعة هايدلبرغ.

1. إعداد الكواشف والمواد للثقافة

ملاحظة: استخدام غطاء تدفق رقائقي للحد من التلوث.

1. في يوم تشريح، قبل الكتلة البشرية فك وحدها أو المؤتلف البروتين إفرين خيالي تنصهر إلى فك البشري عن طريق مزجها مع الأجسام المضادة الماعز فك الإنسان بنسبة مولارية من 1: 5 في المالحة الفوسفات معقمة المالحة (بس). احتضان لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية ⁵ .
2. إعداد وسط الثقافة عن طريق استكمال دولبيكو في النسر المعدل المتوسطة: المغذياتالخليط F-12 (دمم / F12) مع 1٪ البنسلين / الستربتومايسين (v / v)، 1٪ الجلوتامين (الخامس / الخامس)، 1٪ الأنسولين ترانسفرين-السيلينيوم (v / v)، 50 ميكروغرام / مل الإنسان holo- ترانسفيرين، و 1.5 ميكروغرام / مل أمفوتيريسين.
   ملاحظة: 10 مل من المتوسط ​​يكفي ل 16 الأجنة.
3. إضافة محلول إفرين متجمد المؤتلف في تركيز النهائي من 20 ميكروغرام / مل إلى وسط الاستزراع. استخدام فك الإنسان المتجمعة كسيطرة.
4. إعداد لوحات الثقافة عن طريق إضافة 500 ميكرولتر من الوسط الثقافي إلى كل بئر من العقيمة، غير المطلية، مسطحة القاع البوليسترين لوحة 4 جيدا.
5. باستخدام ملقط معقم، مكان بعناية واحد مرشح غشاء البولي مع حجم المسام من 5 ميكرون لكل بئر على أعلى المتوسطة. نقل لوحة أعدت إلى حاضنة (37 درجة مئوية / 5٪ كو ₂ ). تأكد من أن المرشح يبقى جافة على السطح العلوي ويطفو.
   ملاحظة: مرشح واحد يكفي لاثنين من أنلاجين الكلى.
6. باستخدام شفرة حلاقة، وقطع ما يقرب من 30 نصائح ماصة (حجم: 100 ميكرولتر) أبروسيماتلy 1 ملم من طرف ليؤدي إلى افتتاح أوسع. ضع النصائح مرة أخرى في رف ماصة طرف.

2. تشريح رذاذ ميتانيفريك في E11.5

1. التضحية الماوس في فترة الحوامل في E11.5 عن طريق خلع عنق الرحم (أو باستخدام طريقة وافقت عليها لجنة الأخلاق المحلية).
2. إزالة الرحم والأجنة، كما وصفها براون وآخرون ⁶ . من هذه النقطة إلى الأمام، والعمل تحت المجهر تشريح.
3. باستخدام رقم 5 ملقط الساعاتي، وقطع الجنين مباشرة تحت أركان. استخدام طبق بتري جديدة لكل الجنين. إزالة الساقين والذيل من الجنين. للقيام بذلك، والاستيلاء على الأنسجة المراد إزالتها مع زوج واحد من رقم 5 ملقط الساعاتي واستخدام نصائح الزوج الثاني لخفض.
4. لإزالة كتلة الجهاز البطني، واستخدام نصائح من زوج من ملقط لفتح أفقيا جدار الجسم من الجنين في اتجاه منقاري إلى الذيلية.
   1. قطع سطحيا، موازية ل tالأبهر الظهري. استخدام الدم المملوءة وبالتالي مرئية الظهري الأبهر للتوجه. بعناية فصل الجزء البطني من جدار الجسم من الجزء الظهري باستخدام نصائح ملقط مغلقة والوجه الجنين أكثر. قطع جدار الجسم أفقيا في اتجاه منقاري إلى الذيلية واستخدام الشريان الأورطي الظهري للتوجه، كما في الجانب السابق.
5. مرة واحدة وقد تم فصل جدار الجسم البطني من الجسم الظهري، والاستيلاء عليها مع زوج واحد من ملقط وسحب بعناية لإزالته، جنبا إلى جنب مع كتلة الجهاز.
   ملاحظة: أنلاجين ميتانيفريك عادة ما تبقى تعلق على جدار الجسم الظهري. فهي بيضاوية، ~ 200 ميكرون هياكل طويلة تقع على مستوى أطرافه الخلفية.
6. عقد جدار الجسم الظهري مع زوج واحد من ملقط، مع الجانب البطني مواجهة. باستخدام زوج آخر من ملقط، والاستيلاء على الشريان الأورطي الظهري في نهاية منقاري وقشر بعناية الشريان الأورطي الظهري من جدار الجسم الظهري.
   ملاحظة: كلا الكلى ميتانيفريك البقاء عادة إرفاقإد، حتى، ال التعريف، ظهري، أورتي.
7. باستخدام زوج واحد من ملقط، وقطع روسترالي إلى أنلاجين الكلى لإزالة الشريان الأبهر. ثم، فصل بعناية اثنين من أنلاجين الكلى باستخدام نصائح ملقط.
8. تقشر بعناية الأنسجة غير المرغوب فيها من أنلاجين الكلى باستخدام نصائح ملقط. الحرص على عدم إلحاق الضرر اللحمة المتوسطة، كما يمكن أن يؤدي الضرر في ضعف النمو وإقصاء إكسلانت من مزيد من التحليل.
9. نقل أنلاجين الكلى بشكل منفصل باستخدام ماصة ميكروليتر وفتح ماصة واسعة مفتوحة في 10 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني لتصفية غشاء البولي في لوحة 4 جيدا.
   ملاحظة: بسبب التوتر السطحي، وسوف تكون مغطاة إكسلانت مع طبقة رقيقة من المتوسطة. مرشح واحد يكفي لاثنين من أنلاجين الكلى.
   1. وضع كل من أنلاجين الكلى في وسط كل نصف منها من المرشح. نقل لوحة العودة إلى الحاضنة عند 37 درجة مئوية / 5٪ كو ₂ . ترك لوحة في الحاضنة حتى رود ميتانيفريكمن الجنين المقبل على استعداد لوضعها على التصفية.
10. كرر الخطوات من 2.3-2.9.1 لكل جنين.
    ملاحظة: مع بعض الممارسة، فإن إجراء تشريح يستغرق حوالي 5 دقائق لكل جنين.
11. احتضان أنلاجين الكلى لمدة 3 أيام عند 37 درجة مئوية / 5٪ كو ₂ .

3. إعداد الكواشف للتثبيت وتلطيخ

1. لإعداد بارافورمالدهيد 4٪ (بفا) في برنامج تلفزيوني دون الكالسيوم والمغنيسيوم (ث / ت)، حل بفا في 60 درجة مئوية في برنامج تلفزيوني، واثارة باستمرار. بارد إلى درجة حرارة الغرفة واستخدام فلتر الورق لإزالة الجسيمات المتبقية. قسامة والحفاظ على 4 درجات مئوية للاستخدام الفوري أو تجميد للتخزين على المدى الطويل.
   تنبيه: بفا سامة. ارتداء معدات الوقاية الشخصية المحددة في معايير السلامة المحلية والعمل في غطاء الدخان. التخلص من النفايات وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية واستخدام حاويات النفايات المعينة.
2. لإعداد حل بيرمابيليزاتيون، تمييع تريتون X-100في برنامج تلفزيوني دون الكالسيوم والمغنيسيوم إلى 0.3٪ (الخامس / الخامس).
3. لإعداد حجب الحل، إضافة 5٪ (الخامس / الخامس) الماعز المصل و 0.1٪ تريتون X-100 إلى برنامج تلفزيوني دون الكالسيوم والمغنيسيوم. إضافة أزيد الصوديوم إلى تركيز النهائي من 0.02٪ (ث / ت). تخزين في 4 درجات مئوية.
   تنبيه: أزيد الصوديوم سامة. التعامل مع أزيد الصوديوم وفقا للسلامة المحلية وحماية البيئة اللوائح.
   ملاحظة: عند استخدام الأجسام المضادة للتلطيخ، واستخدام مصل 5٪ من الأنواع تم اشتقاق الأجسام المضادة الثانوية من لجعل حجب الحل.
4. تمييع البيروكسيديز دوليتشور بيفلوروس راصة 1: 200 في حجب الحل. تمييع Alexa488 مترافق ستريبتافيدين 1: 200 في حجب الحل.
5. (انظر جدول المواد)، إضافة 0.1 غرام من الكحول القابلة للذوبان في الماء بولي فينيل موكودزيف / مل إلى 25٪ (ث / ت) الجلسرين في 0.1 M تريس-حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 8.5) . الحرارة إلى 50 درجة مئوية تحت التحريض المستمر لمدة 1 ساعة، يبرد، وضبط درجة الحموضة إلى 8.0-8.5 باستخدام 1M هيدروكسيد الصوديوم. تجنب تركيزات أعلى هيدروكسيد الصوديوم. إضافة 100 ميكروغرام / مل N- بروبيلغالات والثيميروسال إلى تركيز النهائي من 0.02٪ (ث / ت). يحرك لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
   تنبيه: ثيميروسال سامة. التعامل معها وفقا للسلامة المحلية وحماية البيئة اللوائح.
   1. ملء المتوسطة التضمين في أنابيب 50 مل، وتوازن الدوار، وأجهزة الطرد المركزي في 3،200 x ج ودرجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة. صب حل واضح في أنابيب 15 مل وتجاهل بيليه. قسامة وتخزينها في -20 درجة مئوية لعدة أسابيع. مرة واحدة إذابة، والحفاظ على الحل في 4 درجات مئوية. الدافئة إلى ~ 30 درجة مئوية مباشرة قبل الاستخدام.
6. إعداد العديد من الشرائح الزجاجية كما المرشحات مع إكسلانتس هي التي شنت. لهذا، الغراء اثنين كوفرسليبس الصغيرة، 18 × 18 ملم، على جانبي الشريحة الزجاجية باستخدام لاصقة فورية، وترك مساحة 15 ملم ~ للمرشح بينهما.

4. التثبيت وتلطيخ

1. بعد فترة زراعة من 3أيام في المختبر (ديف)، وإزالة لوحات من الحاضنة ونضح بعناية وسط الثقافة من كل بئر باستخدام ميكروبيبيت. تأكد من عدم لمس فلتر والحفاظ على فتح طرف نحو جدار البئر.
2. إضافة 500 ميكرولتر من 4٪ بفا / برنامج تلفزيوني لكل بئر. المرشحات سوف تطفو على تثبيتي. باستخدام ميكروبيبيت، إضافة بعناية بفا تثبيتي قطرة للغمر المرشحات. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
   ملاحظة: بالنسبة لجميع الخطوات التالية، يجب الحرص على عدم غسل إإكسبلنتس من التصفية. الحفاظ على فتح طرف ماصة نحو جدار البئر.
3. إزالة بفا وشطف مرتين مع 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني، غمر مرشح. إضافة 500 ميكرولتر من حل بيرمابيليزاتيون إلى كل بئر واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
4. شطف مرتين مع 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني وإضافة 500 ميكرولتر من حجب الحل لكل بئر. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
5. استبدال الحل حظر مع250 ميكرولتر من البيروكسيديز دوليكوروس بيفلوروس راصة المخفف 1: 200 في حجب الحل واحتضان عند 4 درجات مئوية لمدة 24 ساعة.
6. إزالة الحل بلاتلوروس دوليتشوروس الجلوتين وشطف مرتين مع 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني لكل بئر.
7. إضافة 250 ميكرولتر من Alexa488 مترافق ستريبتافيدين المخفف 1: 200 في حجب الحل واحتضان في 4 درجات مئوية لمدة 24 ساعة. بدلا من ذلك، احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة.
   ملاحظة: ويتحقق أفضل نسبة إشارة إلى الضوضاء عند حضانة عند 4 درجات مئوية.
8. شطف مرتين مع 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني لكل بئر. باستخدام ملقط، ونقل المرشحات إلى الشرائح الزجاجية المعدة، مع إإكسبلانتس مواجهة. جبل مع ~ 50-100 ميكرولتر من تضمين المتوسطة. تغطية مع 60 ملم طول رقم 1.5 كوفرسليبس. السماح حل المتوسطة التضمين لتصلب لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. انتقل إلى التصوير أو تخزين الشرائح، ملفوفة في احباط، في 4 درجات مئوية حتى جاهزة للصورة.
9. صورة مع المجهر إبيفلورزنس إبيفلورزنس ^{7 <}/ سوب> مقترنة بمصباح زئبق واستخدام وحدة مرآة للإثارة الزرقاء (ممر علوي للإثارة، 460 - 495 نانو متر، ومرآة ثنائية اللون، و 505 نانو متر، وممر اجتياز للانبعاثات، و 510 - 550 نانومتر)، و 20X من العدسات، فتحة.

وقد استمدت أنلاجين الكلى ميتانيفريك من الحوامل الأسود -6 الفئران إنبريد في E11.5 وتم تربيتها. بعد 3 أيام، برعم الحالب قد تشعبت تصل إلى 5 مرات، مما أدى إلى تشعب من برعم الحالب على شكل حرف T في البداية. تم تصوير كل مستكشف، وتم تحديد أعداد القطاعات ونقاط النهاية لتحديد الأجيال المتفرعة وحساب عدد نقاط النهاية لكل فرع ( الشكل 1 ). وقد تم التوصل إلى الجيل ^الرابع في 8٪ فقط من المستكشفات المعالجة مقارنة مع 35٪ من إإكسبلنتس السيطرة ( الشكل 1 ب )، وبالتالي تم تخفيض عدد نقاط النهاية لكل فرع ونقاط النهاية لكل مم ² في إكلانتس تعامل مع EFrinB2 متجمعة.وبالإضافة إلى ذلك، كان ثلث من إكسلانتس مورفولوجيا غير عادية في نصائح برعم الحالب ( الشكل 1 ) وتشير هذه النتائج إلى أن EphrinB2 قد يكون لها تأثير مقيدعلى عملية برعم الحالب المتفرعة، على الأرجح من خلال تفعيل EphA4 و EphB2 إشارات إلى الأمام.

لتجربة ناجحة، فمن الأهمية بمكان أن لا تتضرر اللحمة المتوسطة ميتانيفريك خلال تشريح. أي إصابة من اللحمة المتوسطة يقلل من إمكانات الاستقرائي، يؤدي إلى انخفاض أو غياب برعم الحالب المتفرعة، ويمكن أن يكون مصدرا للتحيز. المثال في الشكل 2A يظهر إكسلانت حيث ميسينشيم مفقود تقريبا. لم برعم الحالب لم يتفرع خارج مرحلة T-. ويبين الشكل 2B مثال حيث أدى الضرر من اللحمة المتوسطة ميتانيفريك إلى ضعف النمو والتفرع. يجب استبعاد كلا المستكشفين من التحليل.

الشكل 1: E11.5 ميتانيفريك الكلى أنلاجين مثقف لمدة 3 ديف ومعالجتها مع متجمد متجمد EphrinB2 أو كلوستإريد الإنسان فك كسيطرة. ( A ) تم تشريح أنلاجين ميتانيفريك الكلى في E11.5، مثقف لمدة 3 ديف، وملطخة البيروكسيديز بيوتيلوروس بفلوروس أغلوتينين و Alexa488 مترافق ستريبتافيدين. تم تصوير إإكسبلنتس مع المجهر إبيفلورزنس واسعة النطاق مع ممر ممر الإثارة من 460-495 نانومتر، ومرآة ثنائي اللون من 505 نانومتر، ممر اندفاع انبعاث 510-550 نانومتر، و 20 X العدسات خطة أبوكرومات. أدى تطبيق متجمد EphrinB2 المؤتلف (clEphrinB2) في تقليل التعقيد المتفرعة وتشوه من نصائح برعم الحالب (رأس السهم). ( B ) يظهر الرسم البياني الأيسر الأجيال المتفرعة في clEphrinB2 المعالجة والتحكم إإكسبلنتس. تم التوصل إلى الجيل ^الرابع من المتفرعة في 8٪ فقط من إإكسبلنتس المعالجة، مقارنة مع 35٪ من إإكسبلنتس السيطرة. تم تخفيض عدد نقاط النهاية لكل فرع (الرسم البياني المتوسط) ونقاط النهاية لكل منطقة (الرسم البياني الأيمن) (نقاط النهاية لكل فرع نت، 2.1 ± 0.09؛ clEphrinB2، 1.7± 0.08، P = 0.007 **؛ نقاط النهاية لكل مليمتر مربع: نت، 31 ± 0.01؛ clEphrinB2، 27 ± 0.02؛ P = 0.04 *؛ ن = 23). يتم عرض البيانات على أنها متوسط ​​± سيم واستخدمت اختبار تي طالب غير مقيد. شريط مقياس = 100 ميكرون. تم تعديل هذا الرقم من بيوكيرت وآخرون. ، 2016 ³ . الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: أمثلة على اثنين من E11.5 ميتانيفريك الكلى أنلاجين التي تضررت خلال تشريح، مثقف لمدة 3 ديف، والملون مع بيوتينيلاتد دوليكوروس بيفلوروس أغلوتينين واليكسا 488 مترافق ستريبتافيدين. ( A و B ) أدى الضرر من اللحمة المتوسطة في ضعف أو غياب النمو والحالب برعم المتفرعة،عدم تأهيل المستكشفين من مزيد من التحليل. ( A ) ميتانيفريك الكلى إكسلانت بعد 3 ديف، مع غياب برعم الحالب المتفرعة. فقط أول فرع T- مرحلة مرئية. ( B ) ميتانيفريك الكلى إكسلانت بعد 3 ديف، مع الفقراء برعم الحالب المتفرعة. شريط مقياس = 60 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

وتصف هذه المخطوطة طريقة لعزل أنلاجين ميتانيفريك النامية من جنين الماوس وثقافة أساسيات الجهاز. هذا الأسلوب هو تقنية قياسية، كما وضعتها غروبستين ⁸ و ساكسن ^{9 ، 10} ، وتم تكييفها وتعديلها من قبل العديد من الآخرين ^{11 ، 12} . نجاح طريقة يعتمد أساسا على مدة تشريح، كما بقاء إكسلانت و المحتملة الاستقرائية تنخفض مع وقت تشريح لفترات طويلة. يجب أيضا أن تؤخذ الرعاية لا تتلف ميسينشيم عند تنظيف الكلى رديم من الأنسجة المحيطة بها. الضرر من اللحمة المتوسطة ميتانيفريك غالبا ما يكون السبب في ضعف النمو من إإكسبلنتس. ومع ذلك، سرعة تشريح والمهارات الحركية الدقيقة تحسن كثيرا مع الممارسة.

وعادة ما يستخدم الوسط المعرف كيميائيا في البروتوكول المقدم ليحل محليحتوي على خليط من دمم و هام F-12، مع تكملة مع الأنسولين-ترانسفيرين-السيلينيوم لدعم نمو وبقاء إإكسبلنتس. يتم تسهيل الجلوكوز وامتصاص الأحماض الأمينية، الشحوم، والنقل داخل الخلايا عن طريق الأنسولين. السيلينيوم، عامل مساعد لالبروكسيديز الجلوتاثيون، وظائف كمضاد للأكسدة. ترانسفيرين هو الناقل الحديدي ويساعد على حماية ضد الجذور الأكسجين. في ثقافة الكلى الجنينية، إضافة ترانسفيرين إلى المتوسطة يزيد من التمايز نبيب وإدماج ثيميدين بطريقة تعتمد على الجرعة، مع أقصى تأثير حوالي 50 ميكروغرام / مل ¹³ . لذلك، يتم إضافة الإنسان-هولو-ترانسفيرين بالإضافة إلى ذلك في المتوسطة، مما أدى إلى تركيز ترانسفيرين النهائي من حوالي 55 ميكروغرام / مل. العديد من البروتوكولات، التي تستخدم تكوين أقل بساطة ولكن كيميائيا أقل، مع الحد الأدنى النسر المتوسطة الأساسية النسر(ميم) أو دمم و 10٪ مصل ( أي مصل بقري جنيني، فبس) أيضا تعطي نتائج مرضية جدا ^{12 ، 13 ، 14 ، 15} . ومع ذلك، قد تحدث اختلافات بين الكثير من فبس. لتجنب مثل هذه الاختلافات واستبعاد احتمال تداخل عوامل النمو الموجودة في مصل الدم مع الإشارات إيف، تم اختيار المتوسطة خالية من المصل. قرار ما إذا كان استخدام المتوسطة خالية من مصل يعتمد على الإعداد التجريبي والسؤال العلمي. وستكون ظروف الثقافة خالية من المصل مطلوبة بشكل خاص عندما يكون الهدف النهائي هو التطبيق العلاجي. أمفوتريسين B، وكيل المضادة للفطريات المدرجة في هذا البروتوكول، يمكن حذفها. فترة زراعة في المثال المقدم كان 3 أيام، ولكن يمكن استزراع أساسيات الكلى ميتانيفريك لمدة تصل إلى 10 يوما ¹⁵ . في الثقافات التي تتجاوز 3 أيام، يجب تغيير الوسيط كل 48 ساعة. تطوير كيدنتلخص أساسيات العين في المختبر تسلسل الجسم الحي من المجاميع قبل أنبوبي، الحويصلات الكلوية، والهيئات كوما و S على شكل. بعد 3 أيام في المختبر ، وشكلت الهياكل مثل الكبيبي ^{15 ، 16} . في الثقافات الأطول، تزيد المساحة المستكشفة بسبب استمرار تشعب برعم الحالب. في حوالي 5 أيام من الثقافة، و نيفرونس فصلت إلى قطاعات البعيدة والمتوسطة، والدانية ¹⁶ .

على الرغم من السهولة النسبية وكفاءة التكلفة لهذه التقنية، والسماح لتطبيقات متعددة الاستخدامات، وينبغي أن تؤخذ بعض الاعتبارات في الاعتبار عند التخطيط للتجارب وتفسير النتائج. بسبب المصفوفة خارج الخلية والغشاء القاعدي موجودة في الأجهزة المستزرعة، وانتشار العوامل الخارجية والجسيمات محدودة ¹⁷ . وعلاوة على ذلك، فإن ظروف الثقافة الاصطناعية والتلاعب قد يسبب تغييرات في ميتابولإيسم من الأنسجة، والسلوك الخلية التي تختلف عن الوضع في الجسم الحي ^{15 ، 18} . والأكثر وضوحا، أن إإكسبلنتس تفتقر إلى إمدادات الدم، والكبيبات هي عديمة الأوعية الدموية. على الرغم من أن النيفرون تصبح مجزأة، وتقسيم وتشكيل النخاع وحلقات هنلي مفقودة ^{14 ، 19} . وبالتالي، فإن الطيف تطبيق ثقافة الكلى الجنينية يقتصر على الهياكل الأنبوبية، التشكل المتفرعة لها، والتفاعلات الوسيطة-الظهارية. وبالتالي، لا يمكن معالجة الأسئلة العلمية التي تستهدف وظائف الكلى.

التعديلات الأخيرة من طريقة الثقافة التي تزرع فيها أساسيات الكلى على الزجاج المطلي في انخفاض حجم عضوي تمكين التنمية عضوي النمط حتى تصل إلى كورتيكو النخاعي التقسيم مع حلقات ممتدة من هينلي ¹⁵ . ومن الجدير بالذكر أيضا أنه في الآونة الأخيرة، وسيلة لتخزين والحفاظ على المعيشةتم نشر الكلى الجنينية. هذه الطريقة تمكن من نقل أساسيات الكلى الجنينية في E11.5 لعدة أيام، ويسمح لهم أن تكون مثقف في وقت لاحق. ويهتم هذا بوجه خاص بالتعاون ²⁰ . طبيعة ثقافة الكلى كله رديم يسمح لمجموعة متنوعة من التكيف المنهجي، بما في ذلك تقنيات التصوير المتقدمة. لتجنب تحركات مقلقة أثناء التصوير الحي، فمن المستحسن استبدال العائمة مع فلتر ثابت، مثل أقحم ترانسويل. وقد تم توسيع التكنولوجيا المعروضة لكتل ​​الأنسجة الثقافة التي تحتوي على الجهاز البولي التناسلي كله. باستخدام هذه الثقافة الموسعة، الإدراج الحالب في المثانة يمكن التحقيق ²¹ .

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

ويشكر المؤلفان ليف أوكسبرغ وديريك آدمز على مشاركتهما بسخاء في معرفتهما، ليف أوكسبرغ على تعليقاتهما المفيدة على المخطوطة، وستيفان وولفل وأولريكي مولر على دعمهما التقني وساسكيا شميتكرت وجوليا غوبرت وساشا وير وفيولا ماير للمساعدة في مختبر. وأيد هذا العمل من قبل التنمية، شركة علماء الأحياء (ل كب).