مقايسة HS-الآلية للتحديد الكمي لبروتينات الخلية المضيفة في صيدلية البروتين اللوني السائل أيون التنقل قطوف الطيف الكتلي

وهنا يصف لنا تحليل الكروماتوغرافي مقترنة بفصل الحراك أيون السلائف الببتيد تليها عالية الدقة (~ 30,000) مرض التصلب العصبي المتعدد-الكشف عن شظايا الببتيد للتحديد الكمي لمعايير الببتيد ارتفعت في جسم [مونوكلونل] خلاصة.

تحليل لمستوى منخفض (1-100 جزء في المليون) البروتين الشوائب (مثلاً بروتينات الخلية المضيفة (الأطراف المتعاقدة السامية)) في بيوثيرابيوتيكس البروتين مقايسة صعبة التي تحتاج إلى حساسية عالية ودينامية واسعة نطاق. عادة ما تشمل فحوصات الكمي الشامل القائم على قياس الطيف الكتلي للبروتينات هضم البروتين يتبعه رد فعل رد فعل انتقائي رصد متعددة الرصد الكمي (SRM/MRM) من الببتيدات ذات الدقة منخفضة (Rs ~ 1,000) جنبا إلى جنب باستخدام مطياف كتلة الرباعي. أحد أوجه القصور في هذا النهج هو ظاهرة التدخل لاحظ عندما ببتيد الاهتمام قد السلائف "نفس" والجماهيري يفتت (من حيث القيم m/z) الببتيدات التينج المشترك الأخرى الموجودة في العينة (ضمن إطار 1-دا). لتجنب هذه الظاهرة، فإننا نقترح نهجاً بديلاً والمطيافيه الجماعية، مقايسة الآلية انتقائية عالية (HS) الذي يجمع بين فصل الحراك أيون السلائف الببتيد مع عالية الدقة (Rs ~ 30,000) الكشف عن مرض التصلب العصبي المتعدد من الشظايا الببتيد. وبحثنا في قدرات هذا النهج لتحديد معايير الببتيد وفرة المنخفضة ارتفعت في خلاصة [مونوكلونل] جسم (ماب)، وأثبتت أن لديها حساسية والنطاق الديناميكي (على الأقل 3 أوامر من حجم) عادة ما يتحقق في المندوبية تحليل. تم الكشف عن جميع المعايير الببتيد الستة بتركيزات منخفضة تصل إلى 0.1 نانومتر (محملة على 2.1 ملم معرف عمود الكروماتوغرافي 1 فيمتومولي) وجود خلفية ببتيد وفرة عالية (2 ميكروغرام ماب هضم محملة على-عمود). عند النظر في ميغاواط من الأرانب فوسفوريلاز (97.2 كاتشين)، التي تستمد منها الببتيدات ارتفعت لوق من هذا التحليل أقل من 50 جزء من المليون. النسبي الانحرافات المعيارية (RSD) من مناطق الذروة (n = 4 replicates) كانت أقل من 15% عبر تركيز كامل نطاق التحقيق (0.1-100 نانومتر أو 1 1,000 جزء في المليون) في هذه الدراسة.

يستند التقدير الكمي للجزيئات الحيوية الكبيرة (البروتينات) في إعدادات الصناعية حاليا تحديدكم (مثلاً، الساس)، أساسا بسبب العديد من المزايا: حساسية والإنتاجية العالية وسهولة الاستخدام ومنخفضة التكلفة لكل عينة. عندما يطبق على تحليل الشوائب وفرة منخفضة البروتين (1-100 جزء من المليون من الخلية المضيفة البروتينات (الأطراف المتعاقدة السامية)) موجودة في البروتين المداواة، هذه الاختبارات البيولوجية توفر عادة التركيز الكلي المندوبية (يعبر عنها عادة في جزء في المليون أو نغ ماب المندوبية/mg)، لكنها لا يمكن تحديد وقياس الملوثات المندوبية الفردية. ووضعت مؤخرا عدة فحوصات المستندة إلى MS لتكملة الساس أو لتوفير المعلومات التي تفشل في الساس لتقديم^{1،2،3،4،،}من^{56 , 7 , 8 , 9}-بسبب تعقيد عينة واشتراط الكشف عن الببتيدات المندوبية عبر مجموعة واسعة ديناميكية في تركيز (3 على الأقل من حيث الحجم)، يكون متعدد الأبعاد الكروماتوغرافي أساليب المناقصة وجود عينة واسعة النطاق استخدمت تقليديا للمساعدة في تحديد وفرة منخفضة الأطراف المتعاقدة السامية^{1،2،3،4،5،،}من⁶⁷.

خطوة طبيعية بعد تحديد المندوبية والتحقق من الصحة يتم تتبع المندوبية (الرصد) عبر عدة دفعات من صيدلية. في هذه الحالة، قد تم أحادية البعد LC/MS الأساليب المقترحة لتحسين العينة الإجمالية^8،9. ومع ذلك، دقة وقياسات النطاق الديناميكي للمندوبية قد تتأثر في مقايسة LC/MS د 1 وجود الساحقة من الببتيدات الصيدلانية البيولوجية. مقارنة بفصل متعددة الأبعاد، يتم زيادة إمكانات إشارة تدخل^19،20،،من²¹²² في فصل الكروماتوغرافي أحادية البعد لأن الاحتمال يتم زيادة السلائف الببتيد أكثر أن يكون المشترك التينج. ومن الواضح سيكون من المفيد إدراج الوسائل متعامد للفصل سلائف الببتيد دون تمديد الوقت الفصل الكروماتوغرافي. السفر الموجه أيون التنقل (سيارتك)¹⁰ لديها القدرة على حل ازدحام مرض التصلب العصبي المتعدد الأطياف بالمللي ثانية. يمكن أن يؤديها حوالي 500 التنقل الفواصل أثناء شطف من الببتيد واحد، على افتراض عرض كامل الكروماتوغرافي ذروة من 10 s والنظر إلى أن وقت التشغيل فصل الدردشة على الصك التنقل أيون 20 مللي ثانية.

وضعت كتلة والمطيافيه فحوصات لتحديد مقدار البروتين بنجاح على مدى العقد استخدام مقبولة تماما تحديد رد الفعل (متعددة) رصد النهج (أسلوب SRM/الآلية) تنفذ جنبا إلى جنب مطيافات الشامل^{11، 12،13،،}من^{1415،16،17،،}من^{1819،20،21 ،،}من²²²³. أحد أوجه القصور في هذا التحليل الشامل والمطيافيه منخفضة الدقة هو تدخل الظاهرة^{19،20،21،22} لاحظت عند الببتيد لمصلحة له "نفس" السلائف ويفتت الببتيدات التينج المشاركة الجماعية الأخرى الموجودة في العينة (ضمن إطار 1-دا). هناك طريقتان لتحسين دقة أساليب إدارة المخاطرة الاستراتيجية/الآلية: خيار واحد ينطوي على خطوة فصل إضافي على مستوى السلائف لإزالة الأيونات السلائف التدخل، في حين أن الخيار الآخر لزيادة دقة مرض التصلب العصبي المتعدد للكشف عن السلائف/يفتت إلى تجنب تداخل إشارات مرض التصلب العصبي المتعدد. الانتقائية العالية الآلية (HS) اقتناء الموصوفة هنا يستفيد الوضع كل من هذين النهجين باقتران فصل الحراك أيون السلائف الببتيد مع عالية الدقة (Rs ~ 30,000) الكشف عن مرض التصلب العصبي المتعدد من الشظايا الببتيد. المقايسة وصف هنا تغطي على الأقل ثلاثة أوامر من حجم، وهو النطاق الديناميكي عادة لاحظت في إدارة المخاطرة الاستراتيجية/الآلية البروتيوميات تجارب^17،،من¹⁸²⁴.

الأداة المساعدة للمقايسة HS-الآلية للقياس الكمي المندوبية تجلى رصد الخطي للإشارات التي تنتجها ستة معايير الببتيد ارتفعت تركيزات مختلفة (0.1 إلى 100 نانومتر النطاق) في خلاصة [مونوكلونل] جسم.

1. إعداد الخلاصة infliximab (~ 24 ح الداخلي)

1. إعداد حلول جديدة من 50 مم بيكربونات الأمونيوم، 1% أنيونى الفاعل في 50 ملم NH₄HCO₃، 500 مم ديثيوثريتول (DTT) في 50 ملم NH₄HCO₃و 500 مم إيودواسيتاميدي (IAM) في 50 ملم NH₄HCO₃.
2. إلى 750 ميليلتر من 50 مم NH₄HCO₃، إضافة 200 ميليلتر من ماب infliximab (10 مغ/مل) و 50 ميليلتر من 1% الفاعل أنيونى الحل وتجريدها من البروتين لمدة 15 دقيقة في 60 درجة مئوية حضور الفاعل أنيونى 0.05%.
3. إضافة 40 ميليلتر من 500 مم DTT والحد من العينة لمدة 60 دقيقة عند 60 درجة مئوية حضور 20 مم DTT.
4. إضافة 20 ميليلتر من 500 مم IAM والكيلات العينة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام حضور ~ 10 مم IAM.
5. إضافة محتويات أنبوب ميكروسينتريفوجي إلى قنينة زجاجية التي تحتوي على 20 ميكروغرام من مرض التصلب العصبي المتعدد تسلسل الصف Lys ج/التربسين وهضم العينة ح 3 في 37 درجة مئوية.
6. إضافة الكوة إنزيم ثاني (20 ميكروغرام) بنقل العينة هضمها إلى آخر القنينة الزجاجية التي تحتوي على 20 ميكروغرام من مرض التصلب العصبي المتعدد تسلسل الصف Lys ج/التربسين وهضم العينة بين عشية وضحاها (12-15 ح) عند 37 درجة مئوية.
7. وبعد بروتيوليسيس بين عشية وضحاها، إضافة 5 ميليلتر من حمض الفورميك 100% (اتحاد كرة القدم) واحتضان الخلاصة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية لتتحلل الفاعل أنيونى مجا حمض.
8. تدور إلى أسفل ملخص لمدة 15 دقيقة في 4,000 س ز في أجهزة الطرد مركزي يعجل بالمكون غير قابلة للذوبان من السطح أنيونى.
9. استرداد ميليلتر ~ 1,000 الخلاصة infliximab ووضعه في قنينة LC سيارات-أخذ عينات؛ وينبغي تركيز الخلاصة ~ 2 ملغ/مل. تخزين الخلاصة في ثلاجة في-20 درجة مئوية حتى LC/MS النظام جاهز للتحليل.

2-التشويك الببتيد المعايير (~ 30 دقيقة)

1. ذوبان الجليد في ملخص infliximab بوضع العينة المجمدة في القنينة الزجاج على مقاعد البدلاء في درجة حرارة الغرفة.
2. أضف 1 مل من 0.1% فا في ح₂س لأرنب واحد فوسفوريلاز ب (PHO) خلاصة قنينة إعداد 1 ميكرومتر حلول الأسهم لجميع المعايير الببتيد ستة من PHO الواردة في القنينة (القنينة يتضمن نمول 1 من كل الببتيد).
3. إعداد تخفيف 4 × 1 مل الحل بو الأسهم للحصول على الحلول التي تحتوي على 0.1، 1 و 10 و 100 نانومتر الببتيدات، استخدام 0.1% FA كمذيب تمييع. إعداد جميع تخفيف في قنينات زجاجية (قنينات العينات السيارات LC) وإضافة 100 ميليلتر من هضم infliximab كمصفوفة الخلفية لكل قنينة. تحميل 2 ميكروغرام من هضم الخلفية في العمود مع كل حقن 10 ميليلتر. إعداد نموذج فارغ يحتوي على خلاصة infliximab المخفف (نفس 01:10 إضعاف)، مع لا الببتيدات ارتفعت.

3-الإعداد لأسلوب اكتساب البيانات LC/HDMS ^ه

ملاحظة: سير العمل يلخص الخطوات المطلوبة لإعداد احتياز HS-الآلية هو مبين في الشكل 1، وهو وصف بالتفصيل في الأقسام 3-6. الحصول على مجموعة البيانات HDMS^ه مستقلة عن البيانات مطلوب لإنشاء وقت الاحتفاظ بكل الببتيد المرصودة، الأصل m/z لايون الببتيد الأكثر وفرة في أعقاب التأين اليكتروسبراي، وتخزينه المناظرة (الصليب الاصطدامية قسم) المستمدة من فصل أيون التنقل. وباﻹضافة إلى ذلك، dataset البيانات المستقلة يوفر المعلومات حول m/z من الأيونات الجزء الأكثر وفرة ثلاثة لكل السلائف الببتيد. في الخطوة الثانية من سير العمل (CE الأمثل)، تزداد حساسية المقايسة ضبط الطاقة الاصطدام الخلية للحصول على أعلى كثافة أيون لايون كل جزء. وأخيراً، قدم محرر أسلوب HS-الآلية لكل الببتيد التي رصدت في الخطوة الأخيرة، كافة المعلمات المذكورة أعلاه.

1. القيام بتجارب LC/MS على الرباعي وقت طيران (قطوف) شامل مطياف بالإضافة إلى نظام فائقة الأداء لوني سائل باستخدام أسلوب اكتساب البيانات المستقلة (HDMS^ه).
   ملاحظة: يتم تضمين المزيد من التفاصيل فيما يتعلق بتكوين أداة في قسم المواد. هذا الصك يستخدم جهاز تنقل أيون موجه متنقل للفصل بين الببتيد السلائف¹⁰.
2. إعداد هاتين المرحلتين المحمول الذي يحتوي على 0.1% اتحاد كرة القدم في الماء (المذيب A) و 0.1% فا في الاسيتو الانيتريل (ب المذيبات).
   ملاحظة: استخدام عمود C18 مشحونة هجين سطحية (CSH) (2.1 × 150 مم، محملة بالجسيمات 1.7 ميكرون) لفصل النبذ ارتفعت "ماب".
3. في البرنامج الحصول على البيانات، انقر فوق "إنشاء/تحليل الأسلوب" واختر "إنشاء احتياز وطريقة معالجة". استعرض للوصول إلى المجلد أسلوب (دليل)، اكتب اسم الأسلوب وانقر فوق "التالي".
4. "نوع التحليل"، اختر "الببتيد خريطة (IMS)"، وفي علامة التبويب "أداة النظام"، حدد الأداة "إدارة المذيبات رباعي". تحرير إعدادات التدرج لتحقيق الانفصال الببتيد بمعدل 200 ميليلتر/دقيقة استخدام شطف تدرج من 1 إلى 40% "ب المذيبات" في 30 دقيقة ثم يغسل عمود 2-مين والموازنة 9-مين تدفق، ومع وقت تشغيل إجمالية من 50 دقيقة إدخال هذه التجريبية معلمات في محرر الأسلوب LC.
5. في علامة التبويب "أداة النظام"، حدد الأداة "إدارة نموذج". ضبط درجة حرارة العينة إلى 10 درجة مئوية، ودرجة حرارة العمود إلى 60 درجة مئوية.
6. تعمل مطياف كتلة قطوف في أيون إيجابية وضع "حساسية دليل الاستدامة الاقتصادية"، مع قوة فوم 30,000 حل نموذجي.
   ملاحظة: LC/HDMS^ه هو وضع اقتناء البيانات المستقلة (DIA) التي تعمل بسرعة جمع الأشعة مع الطاقات الاصطدام (في الخلية الاصطدام) بالتناوب بين طاقة منخفضة (6 V لمسح قناة 1 مللي ثانية) وطاقة مرتفعة (15 إلى 40 الخامس منحدر إلى إنتاج الأطياف تجزئة دون التحديد السلائف في مرض التصلب العصبي المتعدد القناة 2).
   1. أدخل المعلمات الافتراضية المتصلة بمصدر مرض التصلب العصبي المتعدد في برنامج اقتناء البيانات: من "بلادي العمل/صك النظام،" حدد علامة التبويب "فيون IMS قطوف"، وفي القائمة "أدوات"، قم بإدخال هذه المعلمات: 3.0 كيلوفولت الشعرية الجهد، درجة حرارة المصدر 100 درجة مئوية، 100 V المصدر الإزاحة، مخروط 50 لتر/ساعة تدفق الغاز، والجهد مخروط V 40. تعيين درجة الحرارة ديسولفيشن إلى 250 درجة مئوية، ومعدل تدفق غاز ديسولفيشن إلى 500 لتر/ساعة، والجهد الشعرية إشارة إلى 3.0 كيلو فولت.
   2. في البرنامج الحصول على البيانات، انقر فوق "إنشاء/تحليل الأسلوب" واختر "إنشاء احتياز وطريقة معالجة". اكتب اسم الأسلوب واستعرض للوصول إلى المجلد أسلوب (دليل) وثم انقر فوق "التالي".
   3. "نوع التحليل"، اختر "الببتيد خريطة (IMS)"، وفي علامة التبويب "أداة النظام"، حدد الأداة "فيون IMS قطوف". انقر فوق "إنهاء".
      ملاحظة: الأسلوب LC/HDMS^ه التي تم إنشاؤها حديثا يفتح تلقائياً في الشاشة "أداة تكوين أسلوب".
   4. في علامة التبويب "إعدادات"، قم بإدخال هذه المعلمات: 3.0 كيلوفولت الشعرية الجهد، درجة حرارة المصدر 100 درجة مئوية، 250 درجة مئوية ديسولفيشن درجة الحرارة، وتدفق الغاز مخروط 50 لتر/ساعة، وتدفق الغاز ديسولفيشن 500 لتر في الساعة.
   5. في إعدادات علامة التبويب "التجربة"، حدد "عالي^همن مرض التصلب العصبي المتعدد" واختر "تحليل الأسلوب وقت التشغيل." في علامة التبويب "إعدادات المسح الضوئي"، أدخل هذه المعلمات: انخفاض الكتلة، 100؛ كتلة عالية، 2,000؛ والمسح الضوئي الوقت، السيدة 400 في علامة التبويب "CE"، اكتب "6 الخامس" لوضع الطاقة المنخفضة واختر منحدر الطاقة عالية من 15 إلى 40 ف. تأكد من أن "تقليص البيانات تعطيل" التحقق.
   6. يبث حل نانوغرام/مل 50 لوسين انكيفالين (LE) الذي أعد في الاسيتو الانيتريل 50% مع 0.1% اتحاد كرة القدم بمعدل تدفق 10 ميليلتر/دقيقة لمعايرة الكتلة قفل أثناء الحصول على البيانات.
      ملاحظة: يتم الحصول على بيانات الكتلة قفل كل 5 دقائق باستخدام بنفس معدل الحصول على نفس النطاق الشامل.
7. تحليل العينة 10-شمال البحر الأبيض المتوسط، وارتفعت بو باستخدام مقايسة LC/HDMS^ه الموصوفة أعلاه بالحقن ميليلتر 10 من العينة (المبلغ حملت على العمود فمول 100 لكل الببتيد القياسية).

4-إعداد أسلوب Tof-الآلية للاصطدام الأمثل الطاقة (CE)

1. من dataset LC/HDMS^ه ، الحصول على الوقت الاستبقاء والسلائف ويفتت أيون m/z لكل الببتيد بو. تحتفظ m/z ورسوم الدولة الأكثر وفرة أيون السلائف والثلاثة المقابلة الأكثر وفرة تجزئة الأيونات.
   ملاحظة: يرد مثال من أطياف الطاقة المنخفضة والعالية الطاقة المسجلة عادة بمقايسة LC/HDMS^ه في الشكل 2.
2. استخدام أمثلية الطاقة (CE) الاصطدام في تجربة إدارة المخاطرة الاستراتيجية/الآلية للحصول على أفضل إشارة لكل الببتيد²³.
   1. في البرنامج الحصول على البيانات، انقر فوق "إنشاء/تحليل الأسلوب" واختر "إنشاء احتياز وطريقة معالجة". استعرض للوصول إلى المجلد أسلوب (دليل)، اكتب اسم الأسلوب وانقر فوق "التالي".
   2. من أجل "نوع التحليل"، اختر "كوانتيفي." اختيار "الإنزيم Quantify 2D Tof الكروماتوغرافي" وانقر فوق "التالي". في علامة التبويب "أداة النظام"، حدد "قطوف IMS فيون" وانقر فوق "إنهاء".
      ملاحظة: الأسلوب Tof-الآلية التي تم إنشاؤها حديثا يفتح تلقائياً في الشاشة "أداة تكوين أسلوب".
   3. في علامة التبويب "إعدادات"، قم بإدخال هذه المعلمات: 3.0 كيلوفولت الشعرية الجهد، درجة حرارة المصدر 100 درجة مئوية، 250 درجة مئوية ديسولفيشن درجة الحرارة، وتدفق الغاز مخروط 50 لتر/ساعة، وتدفق الغاز ديسولفيشن 500 لتر في الساعة.
   4. في إعدادات علامة التبويب "التجربة"، حدد "جدول الدالة" واختر "واحد أو أكثر مرض التصلب العصبي المتعدد، MSMS أو الآلية المهام." باستخدام الأسهم المنسدلة، قم بإعداد دالة "Tof-الآلية" لكل الببتيد بإدخال ثلاثة "التحولات" (مجموعات من السلائف الأكثر وفرة وثلاثة من أيونات الجزء الأكثر وفرة لها).
      ملاحظة: في وضع Tof-الآلية، يتحقق حساسية أعلى باستخدام نهج الآلية مقرره.
   5. في محرر الدالة "Tof-الآلية"، اختر الاحتفاظ بالوقت نافذة واحدة لكل الببتيد (على الأقل 1 دقيقة طويلة)، رتبت وفقا للترتيب شطف الببتيد. في محرر "Tof-الآلية" وظيفة، إدراج السلائف الببتيد m/z والمنتج m/z؛ حدد إطار العزلة رباعية "منخفضة" (الإطار 4-دا) للسلائف الببتيد؛ حدد وقت المسح الضوئي ثابتة من 100 مللي ثانية؛ واختيار اثنا عشر قيم الطاقة الاصطدام المختلفة في نطاق الخامس 14-36، على النحو التالي: 14 و 16، 18، 20، 22، 24، 26، 28، 30، 32، 34، و 36، كما هو موضح في المثال من الشكل 3.
      ملاحظة: مع الأسلوب Tof-الآلية الموصوفة أعلاه، يتم تجميع البيانات على الأقل 10 نقاط لكل ذروة الكروماتوغرافي لكل انتقال في كل م المحدد. لتقليل حجم ملف البيانات، حدد الخيار "واسعة" (دا 6 نافذة) للإشارة لايون يفتت. أمثلة للقيم الأمثل CE مبينة في الجدول 2.
   6. تحليل العينة 10-شمال البحر الأبيض المتوسط، وارتفعت بو باستخدام مقايسة Tof-الآلية المذكورة أعلاه بالحقن ميليلتر 10 من العينة (المبلغ حملت على العمود فمول 100 لكل الببتيد القياسية).

5-إعداد أسلوب الحصول على النظام المنسق-الآلية النهائية للتقدير الكمي الببتيد استخدام أيون التنقل الفصل سلائف الببتيد

1. في القائمة "التحقيق" في البرنامج الحصول على البيانات، عرض كل آثار الكروماتوغرافي 11 التي تم إنشاؤها لكل م لكل الببتيد ودمج قمم باستخدام الزر "إدراج" من شريط الأدوات "تجهيز خيارات والعمليات"؛ سوف تبين منطقة الذروة أعلى م أفضل لكل انتقال.
2. مقارنة أفضل المناطق الذروة لأجزاء 3 من كل الببتيد بصريا والاحتفاظ فقط أفضل "الانتقال" (يفتت أيون التي تنتج الإشارات الأكثر كثافة)؛ يعرض الجدول 2 أفضل "التحولات" التي تم الحصول عليها من الببتيدات بو أربعة.
3. إعداد أسلوب HS-الآلية التي تحتوي على أيون بلغة واحدة فقط كل الببتيد. استخدام القيم احتجاز ثاني أكسيد الكربون لكل السلائف الببتيد من dataset LC/HDMS^ه .
   1. تعديل أسلوب Tof-الآلية التي تم إنشاؤها في المقطع السابق (القسم 4) بتحديد الدالة "HS-الآلية" بدلاً من الدالة "Tof-الآلية".
   2. في محرر "النظام المنسق-الآلية" وظيفة، أدخل المعلمات التالية ذات الصلة بالسلائف: m/z، القرار الرباعي: منخفضة (دا 4)، اتهام الدولة وقيمة تخزينه السلائف والسلائف قرار احتجاز ثاني أكسيد الكربون: منخفضة. لايون المنتج، أدخل m/z، الطاقة الاصطدام الأمثل، واختيار وقت المسح الضوئي من 0.4 s وحدد إعداد "واسعاً" (دا 6) لتضمين كافة النظائر المشعة. ويرد مثال على أسلوب الحصول على النظام المنسق-الآلية النهائية لجميع الببتيدات أربعة في الشكل 4.
4. تحليل جميع العينات باستخدام الأسلوب HS-الآلية، بدءاً بهضم ماب فارغة (غير ارتفعت عينة)، تليها 4 حقن نسخ متماثل (10 ميليلتر في كل) التركيزات التالية: 0.1، 1 و 10 و 100 نانومتر بو الببتيدات.

6-إنشاء أسلوب المعالجة لتحليل بيانات النظام المنسق-الآلية

1. إنشاء أسلوب معالجة لتحليل بيانات النظام المنسق-الآلية.
   1. في تحليل الأسلوب إنشاء لطريقة الحصول على البيانات "HS-الآلية"، انقر فوق علامة التبويب "الغرض" واختر "إدارة المكونات."
   2. من القائمة المنسدلة تحت "نوع التجربة"، حدد الخيار "MS/MS HS/النظام المنسق-الآلية".
   3. انقر فوق "إنشاء/الجديدة دخول" وإدخال المعلمات التالية في محرر أسلوب المعالجة: الببتيد الاحتفاظ بالوقت (RT)، الدولة مقابل السلائف والسلائف m/z والسلائف الانجراف الوقت (DT). لايون يفتت، أدخل حالته m/z والمسؤول وتحديد التتبع "شيك" كطريقة الاستخراج.
   4. في علامة التبويب "الغرض" من أسلوب الحصول على نفس "HS-الآلية"، انقر فوق "الافتراضي بمبالغ" وأدخل التركيزات التالية: 0.1، 1 و 10 و 100 نانومتر بو الببتيدات.
   5. أدخل المعلمات التالية في "إعدادات المعالجة/استخراج": التسامح الشامل الافتراضية، 10 أجزاء من المليون (بالنسبة m/z لكل جزء أيونات) والافتراضي الانجراف الوقت، 5%؛ ويرد مثال على أسلوب المعالجة الببتيد بو في الشكل 5.
   6. لنوع المعايرة، واختر تركيب المنحنى الخطي مع 1/X² الترجيح.
2. معالجة البيانات HS-الآلية لإدماج جميع تشروماتوجرامس وبناء منحنيات المعايرة كل الببتيد PHO.

تسلسل الفردية ب فوسفوريلاز ستة الببتيد المعايير الواردة في خليط الببتيد بو ترد في الجدول 1، جنبا إلى جنب مع مرات الاحتفاظ بهم وسلائفها الأكثر وفرة في HDMS^ه التجربة. الخطوة الأولى في تطوير المقايسة إليه الرصد والإبلاغ (HS) الانتقائية العالية هو الحصول على مجموعة البيانات HDMS^ه إنشاء أوقات شطف كل الببتيد بو، جنبا إلى جنب مع معظم المقابلة لها السلائف وفيرة والأجزاء الثلاثة الأكثر وفرة. يعرض الرقم 2 أطياف HDMS^ه المكتسبة لواحد من الببتيدات بو (بيب 6) ارتفعت في الخلاصة infliximab. بعد إنشاء أفضل 3 "التحولات" (مجموعات من الجماهير السلائف ويفتت) لكل الببتيد، يتم إجراء تجربة Tof-الآلية لإيجاد الطاقة الاصطدام الأمثل تحقيق أقصى قدر من الإشارات التي تم إنشاؤها لكل الببتيد. ويرد في الجدول 2 نتائج التجربة الأمثل CE. والرزن HS-الآلية النهائية (انظر الشكل 4) يحتفظ فقط أفضل "انتقالية" لكل الببتيد ويستخدم لتحليل جميع العينات التي ارتفعت. وترد أمثلة على تشروماتوجرامس HS-الآلية التي تم إنشاؤها ل 4 بو الببتيدات عبر جميع التركيزات التي حققت في الشكل 7. أربعة منحنيات المعايرة من الحصول على كل يلي الببتيد يتم عرض دمج على قمم HS-الآلية التي سلط عليها الضوء في الشكل 7 في الشكل 8. وباﻹضافة إلى ذلك، يلخص ذروة المجال النسبي الانحراف المعياري، المحسوبة على أساس حقن نسخ متماثل 4، 4 الجداول المبينة في الجدول 3.

الجدول 1. بو الببتيد المعايير الواردة في "الكتلة الإعدادية" خليط ارتفعت في الخلاصة infliximab. يتم عرض الأوقات الاحتفاظ الببتيد وسلائفها الأكثر وفرة (الضوء بخط غامق) في تنسيق جدولي.

الجدول 2. نتائج تجربة الأمثل Tof-الآلية: يتم الإشارة إلى ثلاثة أجزاء الأكثر وفرة من كل الببتيد بو كمياً في هذه الدراسة، جنبا إلى جنب مع الطاقة الاصطدام الأمثل المقابلة.

الجدول 3. الجدول الذي يحتوي على مجالات ذروة تشروماتوجرامس HS-الآلية سجلت 4 بو الببتيدات (بيب 2، 4، 5 و 6) لكل حقن LC/MS (16 LC/MS يدير وتركيزات 4 اختبار).
الانحراف المعياري النسبي كان أفضل من 15% لجميع الببتيدات على نطاق التركيز الكامل على التحقيق.

رقم 1. رسم تخطيطي لسير العمل يلخص الخطوات الثلاثة اللازمة لإعداد أسلوب اكتساب HS-الآلية- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الرقم 2. على سبيل المثال البيانات هدمسي:
(أ) الطاقة المنخفضة الطيف عرض أيون السلائف بيب 6. (ب) طيف تجزئة الطاقة العالية من الببتيد نفسه، عرض أعلى 3 الأكثر وفرة يفتت الأيونات (دائري) المحددة لتحسين الطاقة الاصطدام Tof-الآلية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 3. المعلمات المستخدمة لإعداد أمثلية Tof-الآلية التجربة.
لكل مرحلة انتقالية، تم اختبار الطاقات الاصطدام الإحدى عشرة (في النطاق من 16 إلى 36 الخامس). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 4. مثال لطريقة HS-الآلية النهائية.
معلمات متعددة مطلوبة من أجل كل "الانتقال" بما في ذلك السلائف الببتيد m/z، وحالته التهمة وأيون التنقل الانجراف الوقت، m/z أيون الجزء الأكثر وفرة والطاقة الاصطدام المثلى والوقت اكتساب مرض التصلب العصبي المتعدد. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 5. الإعدادات المستخدمة من قبل طريقة المعالجة لتحليل بيانات النظام المنسق-الآلية.
كل الببتيد ترصدها واحدة "الانتقالية" المذكورة من هضميد السلائف m/z واتهام الدولة ويتوقع الاحتفاظ بالوقت، جنبا إلى جنب مع m/z الجزء الأكثر وفرة وحالته التهمة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 6. الرسم التخطيطي للتنقل أيون والمطياف الشامل.
في وضع اقتناء HS-الآلية، يتم فصل سلائف الببتيد الذي هو يجري تحديده كمياً من السلائف الأخرى الببتيد التينج المشترك (التدخل) في الخلية التنقل أيون، معزول بواسطة الرباعي، ومجزأة وطاقة اصطدام ثابت في خلية الاصطدام. الإشارات التي تنتجها الأيونات يفتت الببتيد تتعزز عن طريق ضبط وتيرة دافع، والتقدير الكمي الببتيد تتم باستخدام العالية--مرض التصلب العصبي المتعدد-القرار (> 30,000) الإشارات التي تنتجها أيون الجزء الأكثر كثافة من كل الببتيد. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 7. تشروماتوجرامس HS-الآلية المسجلة الببتيدات بو 4 4 تركيزات مختلفة تمتد 3 أوامر من حجم (0، 1، 1 و 10 و 100 nM).
(A) تشروماتوجرامس بيب 2، 4 (ب) بيب تشروماتوجرامس، تشروماتوجرامس (ج) بيب 5، وتشروماتوجرامس 6 (د) بيب. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الرقم 8. منحنيات المعايرة الببتيدات بو 4 عبر 4 تركيزات مختلفة (0.1، 1 و 10 و 100 nM).
عرض الجداول تحت كل منحنى الذروة فرادى المناطق (قيم Y) المسجلة لكل الحقن، بينما يظهر العمود الثاني من الجدول كل انحراف النسبة المئوية من الرد الخطي المتوقعة. (A) المعايرة بيب 2، 4 (ب) بيب المعايرة والمعايرة (ج) بيب 5 والمعايرة 6 (د) بيب. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

عالية الدقة (Rs > 20,000) تستخدم الطيف الكتلي بشكل روتيني لتوصيف الهيكلية للبروتينات العلاجية على مجموعة متنوعة من المنصات الصك. على النقيض من ذلك، تحديد مقدار البروتين المستندة إلى MS عادة يؤديها SRM/إليه الرصد والإبلاغ على دقة منخفضة (Rs ~ 1,000) جنبا إلى جنب الرباعي الشامل مطيافات استخدام التوقيع الببتيدات الناتجة عن الانقسام الانزيمية للبروتينات^{11،12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23}-كما لا يمكن حل فصل الكروماتوغرافي أحادية البعد الكامل خلائط الببتيد المعقدة التي تنتجها الهضم الأنزيمي، شطف المشارك الببتيد أمر شائع، وحتى في حالة خلاصة البروتين وحيد. يمكن أن تتأثر للنبذ البروتين معقدة جداً (مثلاً، للتحديد الكمي للتجهيز 1-100 من الأطراف المتعاقدة السامية حضور خلفية الببتيد الغنية التي تنتجها البروتينات العلاجية)، وحساسية، ودقة أو الخطي SRM/إليه الرصد والإبلاغ بالانزيم التدخل.

وقد فحوصات SRM/الآلية الانتقائية الأحادي البعد، والاعتماد فقط على الجمع بين الجماهير السلائف/بلغة "فريدة من نوعها". ولهذا السبب، تفشل هذه الاختبارات في الحالات عند تغيير الخلفية الببتيد بشكل غير متوقع (مثلاً للعينات الصيدلانية البيولوجية الحصول عليها من إجراءات تنقية مختلفة). للتغلب على هذه القيود، فإننا نقترح هنا مقايسة (HS) الآلية انتقائية عالية نفذت في أيون تمكين التنقل الرباعي عالية الدقة وقت طيران (قطوف) هجين شامل مطياف (للرسم التخطيطي الصك، انظر الشكل 6).

الصك يفصل على سلائف ببتيد الفائدة من السلائف الأخرى الببتيد التينج المشترك (التدخل) في الخلية التنقل أيون ويعزل المغلف كامل النظائر من السلائف في الرباعي وشظايا أنه مع م ثابتة في خلية الاصطدام. كما تم تعزيز الإشارات التي تنتجها، بلغة الببتيد الأكثر وفرة بضبط تردد دافع (تعزيز الهدف)، الذي يدفع بشكل انتقائي المناطق ذات الاهتمام الجماهيري في الأنبوب الرحلة، بدلاً من أيونات كافة، كما هو الحال مع فحص كامل. الببتيد الكمي تتم باستخدام إشارات عالية--مرض التصلب العصبي المتعدد-القرار (Rs ~ 30,000) التي تنتجها هذه الشظايا أيون. مقارنة مع فحوصات SRM/إليه الرصد والإبلاغ، والمقايسة HS-الآلية يقدم اثنين من مستويات إضافية من الانتقائية: واحدة يتم توفيرها من قبل فصل أيون السلائف-مستوى التنقل، في حين تقدم الثاني بالقرار الجماعي المتزايد من محلل TOF. النتائج الناجمة عن هذه التحسينات الانتقائية مرئية في تشروماتوجرامس HS-الآلية المعروضة في الشكل 7، وخالية من التدخلات عبر ثلاثة أوامر من حجم.

خلافا لفحوصات SRM/إليه الرصد والإبلاغ، وهناك العديد من المعلمات التي يمكن تعديلها لتحسين فحوصات HS-الآلية: الإطار RT حول السلائف الببتيد (عادة تعيين في 0.2 دقيقة)، نافذة العزلة الرباعي (دا 4)، الإطار الزمني الانجراف المحيطة السلائف (± FWHM الذروة السلائف من موبيلوجرام أيون المقابلة)، وحل مرض التصلب العصبي المتعدد أيون يفتت (20,000-40,000). فحوصات HS-الآلية حساسة جداً: أدنى مبلغ الكشف لكل الببتيدات بو 1 فيمتومولي في عمود (أو 0.1 نانومتر من حيث تركيز الببتيد). عند النظر في الببتيد ميغاواط (انظر الجدول 1 لدقة موس)، تم الكشف عن المبلغ في العمود أمر pg 1-2، بينما يتم تحميل العمود بمبلغ أعلى بكثير (2 ميكروغرام) من الببتيدات الخلفية من هضم الإنسان والمحيط الحيوي.

بالنظر في الوزن الجزيئي للبروتين بو كامل طول (97.2 كاتشين) التي تستمد منها الببتيدات ارتفعت، التحليل قادراً على الكشف عن 50 جزءا من المليون شوائب البروتين حضور أيونات الخلفية وفرة عالية. الحدود الدنيا للكشف عن (5-10 جزء في المليون) قابلة للوزن الجزيئي أقل الأطراف المتعاقدة السامية (كاتشين 10-20). ويغطي المقايسة ثلاثة أوامر من حجم (كما هو موضح في المنحنيات المعايرة من الشكل 8)، مما يعني أنه يمكن قياس الأطراف المتعاقدة السامية في النطاق 1 1,000 جزء في المليون. أيضا، إمكانية تكرار نتائج لفحوصات HS-الآلية، يتضح في الجدول 3، تطابق جيد جداً مع إمكانية تكرار نتائج لفحوصات SRM/الآلية جزيء صغير، مع ذروة منطقة رسدس أفضل من 15%.

نحن استكشاف قدرات التحليل رواية للتحديد الكمي لمعايير الببتيد ارتفعت في خلاصة [مونوكلونل] جسم (ماب) وقد أظهرت حساسية والأداة المساعدة لتغطية النطاق الديناميكي الواسع (على الأقل ثلاثة أوامر من حجم) عادة واجه في تحليل المندوبية. تم الكشف عن جميع المعايير الببتيد الستة بتركيزات منخفضة تصل إلى 0.1 نانومتر (محملة على 2.1 ملم معرف عمود الكروماتوغرافي 1 فيمتومولي) وجود خلفية ببتيد وفرة عالية (2 ميكروغرام ماب هضم محملة على-عمود). من خلال دمج نظام إدارة الموارد البشرية المستهدفة وفصل أيون التنقل السلائف، مقايسة HS-الآلية إمكانات كبيرة لكي تصبح مقايسة رصد السريع، الفائق لمتعددة الأطراف المتعاقدة السامية عبر عدة دفعات من صيدلية.

جميع المؤلفين هم موظفون في شركة المياه، وهو منتج للعديد من الكواشف والأدوات المستخدمة في هذه المقالة.

الكتاب يود أن يشكر مالين ليزلي وتوني كاتلين من شركة المياه لإعداد الرقم 6 المخطوطة.