مسح بروتوكولات المجهر الإلكتروني الماسح (SEM) لإشكالية النبات، طلائعيات بيضية، وعينات الفطرية

Problems in the processing of biological samples for scanning electron microscopy observation include cell collapse, treatment of samples from wet microenvironments and cell destruction. Low-cost and relatively rapid protocols suited for preparing challenging samples such as floral meristems, oomycete cysts, and fungi (Agaricales) are compiled and detailed here.

وتشمل المشاكل المشتركة في تجهيز العينات البيولوجية لالملاحظات مع المجهر الإلكتروني الماسح (SEM) انهيار الخلية، ومعالجة عينات من microenvironments الرطب وتدمير الخلايا. باستخدام الأنسجة الشباب الأزهار، الخراجات طلائعيات بيضية، وجراثيم الفطريات (غاريقونيات) كأمثلة، بروتوكولات محددة لمعالجة عينات الحساسة موصوفة هنا أن التغلب على بعض التحديات الرئيسية في معالجة عينة لالتقاط الصور تحت SEM.

الخلايا الإنشائية نباتية ثابتة مع القوات المسلحة الأنغولية (-الفورمالين الخل من الكحول) ومعالجتها مع نقطة مجفف الحرجة (CPD) لم يظهر انهارت الجدران الخلوية أو أجهزة مشوهة. هذه النتائج هي حاسمة لإعادة إعمار تنمية الأزهار. إجراءات مماثلة على أساس وثيقة البرنامج القطري لعينات من microenvironments الرطبة، مثل الخراجات طلائعيات بيضية الثابتة غلوتارالدهيد، هو الأمثل لاختبار النمو المتفاوت للخصائص التشخيصية (على سبيل المثال، العمود الفقري الكيس) على أنواع مختلفة من سوbstrates. وتجنب تدمير خلايا ممرضة تعلق على جراثيم الفطريات بعد الإماهة، والجفاف، ومعاملة CPD، خطوة مهمة لمزيد من الدراسات الفنية لهذه الخلايا.

البروتوكولات بالتفصيل هنا تمثل منخفضة التكلفة وبدائل سريعة لاقتناء صور ذات نوعية جيدة لإعادة بناء عمليات النمو ودراسة الخصائص التشخيصية.

في علم الأحياء، وقد تم تمديد استخدام المجهر الإلكتروني الماسح (SEM) للدراسات التطور الهيكلي، مورفولوجيا المقارن، تطوير الجهاز، وتوصيف السكان أو الأنواع ^1. مع عرض ثنائي الأبعاد للهياكل مجهرية، مجالات مثل micromorphology والنظاميات استفادت من التقدم تقنية ووزارة شؤون المرأة منذ النصف الثاني من القرن ^التاسع 20. على سبيل المثال، فإن إدخال منهجية تفل طلاء في 1970s الملاحظات الممكنة من المواد الحساسة مثل قمم تبادل لاطلاق النار والزهور تعزيز التصوير من الأنسجة غير موصل ^{2 و 3.} يستخدم SEM الالكترونات طرد من سطح العينة لإنتاج التضاريس في بيئة عالية فراغ ^4.

وتركز الدراسات التي تنطوي على ووزارة شؤون المرأة في كل من الاستدلال من الشخصيات الهيكلية وإعادة بناء growtعمليات ح. وقد تم اكتشاف الشخصيات الهيكلية الجديدة ذات الصلة لتصنيف والنظاميات من مجموعة واسعة من الكائنات الحية من الملاحظات ووزارة شؤون المرأة. على سبيل المثال، والصفات النباتية المستخدمة لتشخيص أنواع أو تصنيفات supraspecific، مثل حفر vestured من الخشب ⁵ _{والتنوع} وصمة عار ^6، الرحيقية والأزهار التشكل ^{7 و 8} و تفاصيل شعري الشكل ^9، وحبوب اللقاح ^{10، 11،} لا يمكن تصور بشكل صحيح من دون ووزارة شؤون المرأة. وقد تحققت الملاحظات ناجحة مع SEM التقليدية أيضا لفترة طويلة الكائنات الثابتة الفورمالين ¹² و معشبة النباتات. نماذج ^13.

من ناحية أخرى، ودراسات إعادة بناء عمليات النمو باستخدام SEM تشمل مجموعة واسعة من المواضيع، مثل تطوير الجهاز ^14، infections الناجم عن البكتيريا ^15، مصنع الجذر علم وظائف الأعضاء ¹⁶ وآليات مرفق الطفيلي المضيف ^{17 و 18} و آثار المخدرات على الطفيليات ^19، mycoparasitism وتضاد ^{20 و 21} و تشوه نمو ^22، والتنمية المقارنة من الأفراد البرية ومتحولة ^23، ودورة حياة كاملة ^24. على الرغم من أن المجاهر المسح البيئي الإلكترون (ESEM) ²⁵ قد يكون من المزايا الهامة لمراقبة العينات البيولوجية الرطب في عمليات النمو والمواد الحساسة ربما لا يزال خطر حتى في حالة انخفاض فراغ من ESEM)، وتحتاج إلى معالجتها على نحو كاف لتجنب فقدان الملاحظة المورفولوجية للقيمة.

في هذه الورقة، ومراجعة بروتوكولات محددة لمراقبة SEM من ثلاث فرقيتم تقديم أنواع erent العينات: الخلايا الإنشائية الأزهار، الفطريات البيضية (الرمية)، والمواد الفطرية. هذه البروتوكولات ترجمة تجربة دراساتنا السابقة استنادا ^{SEM-26، 27، 28، 29، 30، 31، 32، 33،} حيث تم العثور على صعوبات محددة والحلول البديلة. في حالة محطة التنموية المقارن والدراسات الهيكلية، بدأ استخدام SEM في 1970s ^{34 و 35،} ومنذ ذلك الحين، اكتشف الباحثون أن بعض ميزات الزهور هي أكثر عطوب مما كان يعتقد سابقا ^36. إعادة الإعمار للتنمية الأزهار ينطوي على الاستيلاء على جميع مراحل بين الخلايا الإنشائية الأزهار الشباب وanthesis. للوصول إلى هذا الهدف، فمن ESSEntial إلى أن تضاريس العينة وسلامة جدار الخلية وعدم المساس بعد تثبيت والجفاف لاحق. الخلايا الإنشائية الأزهار الشباب معرضة بشكل خاص لانهيار جدار الخلية (أرقام 1A، 1B). وبالمثل، الهياكل الحساسة مثل الرحيق، بتلات، الوصمات ومباغات تتطلب بروتوكولات فعالة وغير ضارة. يلخص هذا الاستعراض بروتوكول الأمثل للحفاظ على الأنسجة الشباب وحساسة سليمة للتصوير ووزارة شؤون المرأة.

في حالة الفطريات البيضية (Stramenopiles) وهي إحدى المجموعات الأكثر تنوعا وانتشارا من الطفيليات، مع المضيفين تتراوح بين الميكروبات والنباتات لاللافقاريات والفقاريات ³⁷ - هناك جراثيم التي تنمو وتتطور في بيئة رطبة. وتمثل هذه الحالة تحديا للمراقبة ووزارة شؤون المرأة لأن الجراثيم تحتاج الركيزة المناسبة ليست مناسبة للبروتوكولات ووزارة شؤون المرأة القياسية. بين الفطريات البيضية، نوعا من الرمية ذات أهمية خاصة لأنها كاليفورنيان تسبب تخفيضات حادة في aquacultures ومصائد الأسماك، وأعداد البرمائيات ^38. خصائص Micromorphological، مثل العمود الفقري مدمن مخدرات الخراجات، وقد وجد أن تكون مفيدة لتحديد الأنواع من الرمية، وهو أمر أساسي لوضع ضوابط العدوى والعلاجات المحتملة ^39. هنا، هناك بروتوكول تجريبي لمقارنة أنماط نمو العمود الفقري من الخراجات على ركائز المختلفة والتعامل مع عينة لإعداد حاسم مجفف نقطة (CPD) والملاحظة ووزارة شؤون المرأة لاحقة.

وفي حالة ثالثة، وهناك نتائج مثيرة للاهتمام التي ظهرت بعد عملية تفتيش للأبواغ الفطريات Phellorinia herculanea و. و النجمية. نوفا (غاريقونيات) ^31. جنبا إلى جنب مع الجراثيم، تم تحديد مجموعة من الخلايا الحضانة غير متوقعة تحت SEM. مع البروتوكولات التقليدية السابقة، والمواد غير المعالجة، وجاء الخلايا الممرضة أوور انهارت تماما (الشكل 1C). مزيد من استنتاجات حول معينة الأنسجة المرتبطة الجراثيم ويمكن إجراء مع تعديلات بسيطة ولكنها حاسمة لنهج قياسية الموصوفة هنا (1D الشكل).

في هذا الاستعراض، وهناك بروتوكولات وإجراءات تفصيلية SEM التي يمكن استخدامها للتعامل مع مختلف المشاكل المرتبطة الملاحظة ووزارة شؤون المرأة في كاسيات البذور، الفطريات البيضية، وغاريقونيات، مثل انهيار الخلايا وتقلص الأنسجة بارضي والنمو غير الأمثل في العمود الفقري الكيس، وتدمير الأنسجة سريعة الزوال، على التوالي.

الشكل 1: مقارنة بين عينات علاجها بدون (أ، ج) ومع (ب، د) البروتوكول FAA الإيثانول-CPD. (أ - ب) براعم الزهور من Anacyclus المقرعية، منتصف التنمية. برعم تعامل مع رباعي أكسيد الأوزميوم ^{46 <}/ sup> في (أ) و برعم تعامل مع بروتوكول FAA-CPD (ب). (ج - د) ممرضة الخلايا مع أبواغ Phellorinia herculanea و. النجمية. المجففة عينات من دون أي علاج (ج) ومع بروتوكول صفها هنا لغاريقونيات (د). الجراثيم في البرتقال. المقاييس: (أ ب) 100 ميكرون، (CD) 50 ميكرون. تم التقاط الصور بواسطة Y. رويز-ليون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ملاحظة: يتضمن هذا البروتوكول ستة أقسام رئيسية، ثلاثة المكرسة للكائنات محددة (الأقسام 1-3)، وثلاث واصفا إجراءات مشتركة بين جميع (4-6). النجمة (*) تشير إلى الخطوات تعديلها من قبل المجربون.

1. دراسات الدول النامية وتشكلت بالكامل هياكل النبات

1. جمع والتثبيت
   1. إذا تم جمع المواد النباتية في مكان اللواتي لا يحصلن على خزانة الدخان، وإدخال وتزج المواد في 70٪ من الإيثانول في أنابيب الطرد المركزي. من الناحية المثالية، تزج المواد بعد 48 ساعة في القوات المسلحة الأنغولية (الخطوات 1.1.1-1.1.3) لتجنب الجفاف المفرط في الإيثانول. إذا خزانة الدخان يمكن الوصول إلى المواد النباتية، تجاهل هذه الخطوة ومتابعة مع 1.1.1.
   2. إعداد تثبيتي-الفورمالين الخليك من الكحول (FAA) في خزانة الدخان مزودة مرشح ألدهيد. إضافة 85 أجزاء من الإيثانول التشويه والتحريف 70٪، و 10 أجزاء من 60٪ محلول الفورمالديهايد، و 5 أجزاء من حامض الخليك الجليدي. إعداد FAAقبل تحديد المواد، والتخزين على المدى الطويل وليس من المستحسن ^40.
   3. تحت خزانة الدخان، صب الأسهم للقوات المسلحة الأنغولية في الفردي الفم واسعة والزجاجات البلاستيكية مانعة للتسرب. استخدام العديد من زجاجات كما أن هناك عينات متوفرة، وإنشاء بطاقات لتحديد العينة.
   4. حدد الخلايا الإنشائية الأزهار أو الخضري لإصلاح، والتأكد من أنها غير متضررة من الحشرات والفطريات، أو الظروف الجوية القاسية. قطع الفروع، وإزالة المواد غير المرغوب فيها، وإيداع عينة فورا في حل القوات المسلحة الأنغولية.
   5. بعد 72-96 ساعة، صب FAA في وعاء من البلاستيك للتخلص من المواد الكيميائية. على الفور، وغسل العينات ثلاث مرات مع الطازجة 70٪ من الإيثانول لإزالة أي FAA المتبقية. المواد الثابتة يمكن تخزينها لأجل غير مسمى في 70٪ من الإيثانول.
2. تشريح والجفاف
   1. تشريح المواد الثابتة في 70٪ من الإيثانول تحت مجهر تشريحي باستخدام الملقط غرامة فائقة، شمال شرقedles، ملقط، وفرش، والمشارط الدقيقة (يجب أن يكون الحد الأقصى لحجم الأنسجة المحيطة 1 سم ^3، أو 2 سم للمواد مسطحة). تشريح عينات في طبق بيتري مغطاة الإيثانول لمنع الأنسجة من التجفيف. استخدام طبق بتري مع قاعدة مغطاة السيليكون الأسود الجاف لرؤية أفضل الأنسجة البيضاء المتناقضة.
   2. وضع مادة تشريح في حاويات عينة للحرج مجفف نقطة (CPD، الشكل 2A). عند هذه النقطة، تزج حاويات في طبق بيتري مع 70٪ من الإيثانول، وتشمل بطاقات هوية العينة (مع ورقة وقلم رصاص). لتجفيف أكثر فعالية لمزيد من التلاعب، وتجنب خلط العينات شابة وناضجة في نفس الحاوية. *
   3. وضع أغطية على الحاويات وإيداعها في أنابيب الطرد المركزي البلاستيكية التي تحتوي على الكثير من الايثانول 70٪. تخزين الأنابيب بين عشية وضحاها إذا لم يتم معالجة المواد فورا.
   4. نقل المواد تشريح من خلال سلسلة الإيثانول التاليةالصورة في الجرار المحكم أو أنابيب الطرد المركزي: 70٪، 90٪، 100٪، و 100٪. ترك العينات في كل حل لمدة 1 ساعة على الأقل. الحفاظ على عينات بين عشية وضحاها في حل الإيثانول بنسبة 100٪.
   5. نقل الحاويات مع المواد وثيقة البرنامج القطري (القسم 4).
3. تركيب وإعداد الأنسجة النباتية لمراقبة SEM
   1. كتابة رقم تعريف العينة تحت أصحاب عينة SEM (أي بذرة الألومنيوم). تغطية الجزء العلوي من بذرة مع الشريط على الوجهين. وضع بذرة إلى حامل العينة (الشكل 2B).
   2. تحت مجهر تشريحي، فتح بعناية الحاويات التي تحمل عينات من الشباب وحساسة المجففة بالفعل في وثيقة البرنامج القطري. نضع في اعتبارنا أن بعد العلاج وثيقة البرنامج القطري، وعينات تصبح أخف وزنا وحساسة إلى الكهرباء الساكنة. إغلاق الحاويات مرة واحدة وقد تم أخذ عينات من لتجنب الغبار أو الشوائب.
   3. وضع العينات على سطح لزجة من بذرة، التخطيط للمستقبل المنشودموقف (مرة واحدة العينات تلمس السطح، فمن الصعب جدا إزالتها). لا تحاول أن تحمل تشريح الرئيسي عند هذه النقطة. فقط إزالة الأنسجة غير المرغوب فيها التي هي سهلة لالتقاط. للدراسات palynological، تشريح anthers وفتحها للكشف عن حبوب اللقاح على بذرة.
   4. عينات طويلة وضع (على سبيل المثال، 2 سم) مثل النورات في وضع أفقي. عندما يكون ذلك ممكنا، عينات توجيه من نفس هيكل القطبي، والجانب، ووجهات النظر أسفل. ترك مساحة كافية بين العينات على كعب.
   5. إذا لا يمكن معالجة عينات على الفور، والحفاظ على المحمية بين عشية وضحاها في وعاء المحكم مع هلام السيليكا لتجنب الإماهة (الشكل 2C) *. معطف العينات باستخدام المغطي تفل ونقلها إلى وزارة شؤون المرأة (أقسام 5 و 6).

الشكل 2: أدوات manipulati عينةعلى والتجهيز قبل الملاحظة ووزارة شؤون المرأة. (أ) حاوية عينة من صنع الصلب مع الجدران محاصرين لتبادل الإيثانول / CO ₂ في غرفة وثيقة البرنامج القطري. (ب) بذرة الصلب داخل حامل عينة من البلاستيك. حاوية (ج) الزجاجية المستخدمة للحفاظ على عينات حمايتها من الرطوبة والغبار. في الأساس، هناك حجرة للهلام السيليكا. (د) الحرجة نقطة الصحون. في الجبهة، وهناك (من اليسار إلى اليمين) مقياس ضغط الدم، ومفتاح الطاقة، ونظام التحكم في درجة الحرارة، وعرض درجة الحرارة. ضغط العمل المعتاد لCO ₂ -ethanol تبادل 60 البارات (800 رطل). في الجزء العلوي، وهناك أربعة صمامات (الضوابط مدخل، واستنزاف، والتهوية، والعادم) المرافقة حجرة العينة المركزية. تم التقاط الصور بواسطة Y. رويز-ليون وMA بيلو. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

1. النمو وتحديد الخراجات
   1. إعداد ببتون والجلوكوز (PG-ل) وسائل الإعلام ⁴¹ باستخدام D - (+) - الجلوكوز (6 ز) وببتون الفطريات (3 غرام) *. تضيف ما يصل الى 900 مل من ماء الصنبور وتعقيم 40 دقيقة في درجة حرارة 121 مئوية. صب 50 مل من تعقيمها قبل حل ألف (ناه ₂ ص _4، 0.13 م) و 50 مل من محلول ب (نا ₂ هبو _4، 0.13 م).
   2. من ثقافات الأسهم من سلالات طفيلي المنشأ الرمية الحفاظ على ببتون والجلوكوز وسائل الإعلام أجار (PGA، الذي يعد كما PG-لتر ولكن بإضافة 10 غراما من أجار البكتريولوجية الأوروبي إلى الجلوكوز وببتون قبل الأوتوكلاف)، وتنمو المستعمرات فطر في 0.5 مل قطرات PG-لتر لمدة 24-48 ساعة عند 20 درجة مئوية في أطباق بتري. حمل تبوغ بغسل فطر مع مياه الحنفية تعقيمها ثلاث مرات وتفرخ لهم لمدة 15 ساعة عند 20 ° C= "XREF"> ^{42، 43.}
   3. جمع الأبواغ الحيوانية السابحة الثانوية الصادرة عن pipetting بلطف على الجزء العلوي من تعليق وتجميع لهم في 1 مل أجزاء. تستنهض الهمم بقوة الأبواغ الحيوانية السابحة لمدة 30 ثانية قبل vortexing لإنتاج الأكياس الثانوية ^44.
   4. لاختبار النمو التفاضلي من العمود الفقري من الخراجات، على منفصلة أطباق بتري (P60)، وطرح 0.5 مل من تعليق الكيس الثانوي على السطوح المختلفة (على سبيل المثال، والكربون، وشبكات الذهب، والنحاس تيم، سمك السلمون والسمك النازلي المقاييس (سابقا ابيض)، وغطاء زجاجي زلات) *. احتضان الخراجات عند 20 درجة مئوية لمدة 70 دقيقة، والتي تفضل المرفق من الخراجات على السطح.
   5. إزالة السائل وإضافة 0.5 مل من 2٪ غلوتارالدهيد على كل سطح لتثبيت الخراجات. الحفاظ على العينات في درجة حرارة الغرفة تحت خزانة الدخان لمدة 1 ساعة.
   6. إزالة غلوتارالدهيد ويذوى العينة من خلال سلسلة الايثانول (30٪، 40٪، 50٪، 60٪، 70٪، 80٪ ، 90٪، 100٪، و 100٪)، مشيرا 5 مل من كل حل الإيثانول لمدة 15 دقيقة. مرة واحدة في الماضي حل الإيثانول بنسبة 100٪، وعينة يمكن تخزينها لمدة تصل الى شهر واحد في طبق بتري مختومة. في هذه المرحلة، وعينات جاهزة للالمجففة في وثيقة البرنامج القطري.
   7. نقل بعناية شبكات وجداول من طبق بيتري لحامل مناسبة لوثيقة البرنامج القطري (القسم 4). لهذه الخطوة، واستخدام حامل وثيقة البرنامج القطري الشبكة أو حامل العينة التراص، والتي تبقي عينات فصلها عن بعضها البعض. خذ الشبكات والمقاييس مع ملاقط، مع الأخذ في الاعتبار أن الخراجات يجب أن تواجه حتى على الشبكات في كل وقت. *
2. تركيب وإعداد العينات كيس للمراقبة SEM
   1. تركيب شبكات وجداول على بذرة الألومنيوم التي تم تغطيتها في وقت سابق مع وجهين الشريط الكربون وصفت تحتها.
   2. نقل العينات إلى المغطي تفل (القسم 5).
   3. مراقبة العينات تحت SEM (المادة 6).

= "jove_title"> 3. دراسة المعشبة الفطرية الجراثيم من herculanea Phellorinia تحت SEM

1. الإماهة والجفاف من الجراثيم
   1. التفاف كل عينة بعناية مع ورق الترشيح، وتشكيل المغلفات التي تحمل علامات قلم رصاص ~ 0.5-1 سم ^2، مع الحرص على عدم التضييق عليهم. ختم ورقة الترشيح مع مشابك الورق. نقل العينات معبأة في طبق بتري وتزج بهم في 10 مل من الماء لترطيب الأنسجة المحيطة الجراثيم.
   2. فورا العينات في الميكروويف (600 واط لحوالي 20 ثانية). إزالة المواد بمجرد أن يبدأ الماء بالتبخر، واتركه حتى يبرد في درجة حرارة الغرفة.
   3. تمرير عينات من خلال سلسلة الإيثانول التالية: 30٪، 50٪، 70٪، 80٪، 90٪، 95٪، 100٪، و 100٪. اعتمادا على كمية من العينات، استخدام كوب أو الطرد المركزي أنابيب لهذه الخطوة. ترك العينات لمدة 15 دقيقة في كل حل.
   4. وضع العينات في وثيقة البرنامج القطري (القسم 4).
2. التركيب و عيصلح الجراثيم للمراقبة SEM
   1. فتح المظاريف. صب جراثيم على كعب معدة مسبقا مع الشريط على الوجهين. بدلا من ذلك، جمع الجراثيم مع سطح لزجة من بذرة، مع الحرص على عدم التضييق عليهم *.
   2. إذا كانت العينات تحتوي على عدد قليل من الجراثيم، بالإضافة إلى الخطوة السابقة، وقطع قطعة صغيرة من المغلف (~ 1 مم ²⁾ ووضعه على كعب * جديد.
   3. وضع الأنسجة في المغطي تفل (القسم 5).
   4. مراقبة تحت SEM (المادة 6).

4. تجفيف المواد عن طريق نقطة مجفف الحرجة (CPD، الشكل 2D)

1. استخدام وثيقة البرنامج القطري في منطقة جيدة التهوية وتحقق من أن يتم إغلاق كافة الصمامات من الجهاز. معرفة ما اذا كان غرفة عينة فارغة ونظيفة.
2. التبديل على الجهاز والتحقق من أن اختبار نظام التحكم في درجة الحرارة يحدث تلقائيا. إذا كان لدى CPD نظام التبريد حمام خارجي، والتحقق من مستويات المياه قبل ان ينتقل طر على.
3. اتبع إرشادات الشركة المصنعة للCPD محددة تستخدم للإيثانول وثاني أكسيد الكربون ₂ التبادل. للسلامة، وحمل على هذه الخطوة تحت إشراف شخص تدرب على استخدام الجهاز. تذكر أنه يتعرض لتغيرات الضغط السريع، يمكن ان تهب بعنف.
4. إخراج العينات وتابع الخطوة 1.3 إذا كان يعمل مع الأنسجة النباتية، خطوة 2.2 إذا كان يعمل مع الفطريات البيضية الخراجات، والخطوات 3.2 إذا كان يعمل مع جراثيم الفطريات.

5. طلاء العينات مع الذهب باستخدام تفل المغطي (الشكل 3A)

1. تحقق من المغطي تفل. تحقق من أن الهدف الذهب الكاثود هو في حالة جيدة. استخدم قطعة قماش خالية من الوبر منقوع مع 90٪ من الإيثانول لتنظيف الجدران من فراغ الغرفة وغطاء غرفة إذا لزم الأمر.
2. بمناسبة حامل تفل مع الأرقام بجانب كل ثقب كعب لمزيد من التعرف على العينات تحت المجهر. بعناية، وضع بذرة محملة sampl الدراسيوفاق وتأمينها. استخدام مرحلة عينة الكواكب الدوارة لضمان طلاء موحد على عينات مع الأسطح غير المنتظمة.
3. اتبع إرشادات الشركة المصنعة لضبط إعدادات مثل المسافة العمل، عملية ضغط الغاز (على سبيل المثال، 5 × 10 ^-1 - 7 × 10 ^-1 م بار) (على سبيل المثال، 30 مم)، وهي المرة الاخرق (على سبيل المثال، 50 ق)، سمك طبقة الذهب (على سبيل المثال، 12 نانومتر) الحالي (على سبيل المثال، 15 أمبير) وامدادات التيار الكهربائي (على سبيل المثال، 600 V) ^45.
4. إزالة بذرة ونقلهم الى وزارة شؤون المرأة (المادة 6). بدلا من ذلك، وضع بذرة في حاوية مغلقة مع هلام السيليكا (الشكل 2C).

الشكل (3): تفل المغطي (أ) والمجهر الإلكتروني الماسح (ب). (أ) جبهة نظرا للفراغ الغرفة (يسار)، valv الغازه، وتوقيت، فراغ، والضوابط الحالية. (ب) الجانب الشخصي من المكونات الرئيسية SEM (من اليسار إلى اليمين): العمود فراغ مع حجرة العينة، شاشة الكمبيوتر مع الضوابط، ورصد للغرفة. تم التقاط الصور بواسطة Y. رويز-ليون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

6. مراقبة تحت مجهر المسح الإلكتروني (SEM، الشكل 3B)

1. SEM بدء
   1. اتبع إرشادات الشركة المصنعة لبدء وتعيين ووزارة شؤون المرأة، وتعديل ارتفاع عينة قطر فتحة موضوعي (على سبيل المثال، لمحطات 2 ميكرون والفطريات والفطريات البيضية 4 ميكرون)، والجهد التشغيل (على سبيل المثال، 15 كيلو فولت).
   2. التحقق من المحاذاة الصحيحة للنظام شعاع الإلكترون وتعيين محاذاة المحورية وstigmators وفقا لمصنعي المؤشرات. ضبط طنبعد انه يعمل من أجل الحصول على عمق كاف من الحقل.
2. التقاط الصور
   1. الحصول على صورة مركزة من العينة واستخدامها كنقطة انطلاق. زيادة ختام التكبير إلى مستوى الحد الأقصى وتركيز الصورة مرة أخرى. اختيار المناطق مع عدم انتظام السطح مثل الثقوب. الاستجماتيزم الصحيح وضبط التباين والسطوع الأمثل.
   2. التقاط صورة SEM مع ذات الدقة العالية. استخدام جهاز كشف مرض جنون البقر إذا أظهرت الصورة التي يتم شحن العينات. وإلا، تعيين كاشف SE. تغيير كاشفات باتباع إرشادات الشركة المصنعة.

الأزهار التنمية وتثبيت للوضع وتشكلت بالكامل هياكل النبات

باستخدام بروتوكول FAA-CPD الموصوفة هنا، الأنسجة النباتية شابة وناضجة وثابتة على النحو الأمثل والمجففة للتصوير ووزارة شؤون المرأة. عمليات مثل التنمية الأزهار يمكن بناؤها بسبب عدم تشويه التضاريس وشكل براعم من قبل خلية تقلص (أرقام 1B، 1D، 4A-و). الهياكل ذات أشكال معقدة يمكن تغطيتها بنجاح مع طبقة موحدة من مادة موصلة (المعدن من المغطي تفل)، والسماح للانتعاش من التفاصيل غير قابلة للوصول على خلاف ذلك (الأرقام 4G-I، 5E). صور ذات نوعية جيدة من العينات القادمة من microenvironments الرطب، التي كانت المفرطه مع التيار الإلكترون إذا المجففة سيئة والمغلفة، ويمكن أن يتحقق (أرقام 4F، 5A، 5B). تفاصيل مهمة مثل سطح حبوب اللقاح جدار (الشكل 5B، 5C) وأنواع مختلفة من indumenta (أرقام 5D-ز) يمكن دراستها في العمق دون جزيئات اصطناعية أو غير مرغوب فيها أو الأشكال المشوهة.

الشكل (4): في وقت مبكر (أ، ب)، منتصف (ه ج-)، والمتأخرة (فاي) تطوير الأزهار القبض تحت SEM. (أ) عذق من سيسالبينيا سبينوزا (مولينا) Kuntze مع العديد من الخلايا الإنشائية الأزهار. (ب) أعلى نظرا لعذق الشباب المغزرة violacea Aubl. (ج) برعم زهري من الكراميرية ixine Loefl. خلال التمايز وزيم. (د - ه) البراعم من الحمرية ليرة سورية. (و) منظر جانبي من زهرة الكراميرية ixine. وanthers وأسلوب تبرز. (ز - ط) هويا اللحمي (L.) ر براون. ( ز) زهرة في anthesis (الصورة الرقمية التي اتخذت مع أوليمبوس SP-590UZ 26X). (ح) أعلى نظرا الأسدية والكرابل الانقسام. (ط) منظر جانبي من زوج من الأسدية المرافقة اثنين من الكرابل. وتشير العلامات النجمية الأسدية. ز = زيم. المقاييس: (أ، ط) 1 مم، (ب، د) 400 ميكرون، (ج) 200 ميكرون، (ه) 500 ميكرون، (و، ح) 2 مم، (ز) 0.25 سم. تم التقاط الصور بواسطة MA بيلو. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5: الميكروسكوب ووزارة شؤون المرأة من مباغات وحبوب اللقاح (أ، ب)، الأسطح مفصلة (ج- ه)، وindumenta (و - ز). (أ) مباغات من Dryopteris ليرة سورية. (ب) اللقاح الويب برقوق الحلو DA ب الهبوط على وصمة العار. (ج) حبوب اللقاح من الجرة المجنح بلانكو. (د) منظر جانبي لالإزهار من أريغارون karvinskianus العاصمة. الصورة التي اتخذت الخيار BSE كاشف مع. (ه) منظر جانبي ليرة سورية البريويات Peristoma. (و) غدية وtrichomes عدم غدي على سطح مجافي المحور ورقة للنبات إكليل الجبل المخزنية L. (ز) أعلى نظرا للجداول ورقة مسطحة من أوليا europaea L. المقاييس: (أ) 400 ميكرون، (ب) 60 ميكرون، (ج) 5 ميكرون، (د) 4 مم، (ه) 600 ميكرون، (و) 200 ميكرون، (ز) 600 ميكرون. تم التقاط الصور بواسطة Y. رويز-ليون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تأثير ركائز مختلفة في العمود الفقري نمو الثانوية الخراجات الرمية طفيلي المنشأ

الصورة = "jove_content" FO: المحافظة على together.within الصفحات = "1"> وكان نمط نمو العمود الفقري مختلفة على ركائز مختلفة. على الزجاج، كانت العمود الفقري ممدود وأظهرت الحلقات على نصائح من (الجدول 1، الشكل 6A). على الكربون والذهب شبكات العمود الفقري هي أقصر، وكرة لولبية النمو بزخم اكبر في جميع أنحاء الخراجات دون تشكيل حلقات (أرقام 6B، 6D). وإن كان ذلك على شبكات النحاس، تميل العمود الفقري لحليقة بدون حلقات، بعض منهم ممدود (الشكل 6C). على قشور السمك، كانت العمود الفقري مجعد، وفيرة حول السطح وشكلت في بعض الأحيان نهايات يحلق (الشكل 6E-و).

الشكل 6: أنماط النمو التفاضلية من العمود الفقري من الرمية طفيلي المنشأ في الخراجات مغمورة في وسائل الإعلام السائلة. (أ) غلاسالصورة. (ب) الكربون. (ج) والنحاس. (د) الذهب. (ه) نازلي الحجم. (و) على نطاق وسمك السلمون. وقد وضعت العمود الفقري مستقيم على الزجاج والنحاس، في حين شكلت العمود الفقري مجعدا على مستويات الكربون، والذهب، والأسماك. نصائح مدمن مخدرات (السهام البيضاء) من العمود الفقري يمكن ملاحظتها في كل أشواك المتزايد على الزجاج وفي عدد قليل من العمود الفقري على قشور السمك. جدران الكيس هي باللون الأصفر. الحجم: 20 ميكرون. تم التقاط الصور بواسطة Y. رويز-ليون و س Rezinciuc. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: مورفولوجيا الفقري باستخدام أنواع مختلفة من الصخور.

ملاحظات غير متوقعة في Phellorinia herculanea و. النجمية

وبصرف النظر عن النتائج غير متوقعة من خيوط laticiferous على exoperidium من P. herculanea، كالونج وآخرون. ^{31 وجدوا} كروي الشكل وخلايا ممرضة ناعمة (8-13 ميكرون) مختلطة مع الجراثيم في المواد المجففة مع وثيقة البرنامج القطري بفضل خطوة الإماهة أجريت في الميكروويف. (1D الشكل). هيكل وتفاصيل جدران رانه خلايا ممرضة والجراثيم والحفاظ جيدا على الرغم من تكوين التفاضلية الخاصة بهم (أرقام 1C-د).

وفيما يتعلق البروتوكولات ووزارة شؤون المرأة القياسية، والإجراءات المعروضة هنا تشمل سريعة نسبيا، وسهلة لمتابعة، ومنهجيات منخفضة التكلفة. اعتمادا على كمية من العينات وعلى سهولة المعالجة، فإنه يأخذ 4-5 أيام للحصول على صور ذات جودة جيدة. بما في ذلك احتياطات السلامة الكافية لجنة السكان والتنمية والتشغيل ووزارة شؤون المرأة، وإجراءات سهلة في التعامل معها. ينبغي أن تؤخذ بحذر خاص مع الفورمالين وغلوتارالدهيد (انظر الخطوات 1.1.1 إلى 1.1.3 و2.1.5 من البروتوكول). هناك بعض الخطوات التي، إذا لزم الأمر، وهذه العملية يمكن أن توقف لفترة طويلة دون الإضرار عينات أو تخريب الخطوات السابقة (على سبيل المثال، على بعد خطوات 1.1.5، 1.2.3، 1.3.5 و). من حيث التكلفة، والكثير من المعدات يمكن استخدامها لعدة الاستعدادات (على سبيل المثال، حاويات CPD الألومنيوم وأصحاب كعب)، والكواشف والمواد الكيميائية غير مكلفة المتاحة من جميع الموردين التجاري.

مساوئ هذه الإجراءاتالحاجة للتخلص من النفايات الكيميائية المناسبة لالألدهيدات والإيثانول ونقص الإمدادات الأساسية والقيود المفروضة على هذه التقنية. مواد مثل القرص الذهب لالمغطى تفل واسطوانة CO ₂ لجنة السكان والتنمية يجب أن يتم التحقق في وقت مبكر. واذا كانت في الاستخدام المتواصل، والمختبر يتطلب أسهم متعددة منها، والتي ترتفع في نهاية المطاف التكاليف. لأن الباحثين الأفراد في كثير من الأحيان لا يمكن أن تبرر النفقات المستمدة من الحفاظ على هذه الأنواع من اللوازم، أو أنها ببساطة لا تحتاج إلى استخدام ووزارة شؤون المرأة باستمرار، وهذه الإجراءات تميل هذه الأيام التي يتعين القيام بها في المختبرات مع خدمات المجهر الإلكتروني الخارجية.

تقنية مراقبة ووزارة شؤون المرأة يقتصر على دراسة عالية التكبير من السطوح. إذا يجب التقيد الأنسجة الداخلية، يجب أن تقطع العينات في الطريق الصحيح لاستكشاف المظهر الخارجي للأنسجة الداخلية. لاستكشاف الجوانب الداخلية من الخلايا في أماه عاليةgnification، مطلوب المجهر الإلكتروني انتقال (تيم). الخطوات الحاسمة في البروتوكول هي تثبيت السليم والجفاف من العينات قبل العلاج وثيقة البرنامج القطري، حيث لا بد من الحفاظ على الأنسجة في مأمن من التغييرات المثيرة للصدمة واتصال مباشر مع الهواء. أيضا، إدارة واعية من مدى التغير في الضغط في حجرة العينة CPD وكمية من الطلاء المودعة على أنواع مختلفة من العينات هو المهم.

وعلى الرغم من هذه القيود والتلاعب الخاصة، ودراسة العينات البيولوجية مع SEM بعد البروتوكولات المذكورة هنا يسمح لتسوية بعض المشاكل المشتركة، مثل جدار الخلية وتشويه الجهاز (الشكلان 1 و 4 5،)، والقيود المفروضة على الملاحظة ونمو الهياكل قادمة من البيئات الرطبة والسائلة (الشكلان 5 و 6)، وتدمير الخلايا الحساسة (أرقام 1C، 1D).

وقد allowe البروتوكولات المعروضة هناد إعادة تفسير واستجواب الخصائص التصنيفية التقليدية، مثل هيكل العمود الفقري في الخراجات من الرمية ^47. نمط النمو المتفاوت للالعمود الفقري الرمية على الأسطح المختلفة يدل على تقلقل من هذه الميزة وحدودها لتشخيص الأنواع. بالإضافة إلى القبض على الخصائص ذات الصلة للدراسات تصنيفية، مراحل تطوير الجهاز، والأمراض المعدية، وظائف الأنسجة أبدا لاحظت قبل أن يتم استكشافها بفضل هذه التقنيات. الآن، ويمكن تمديد هذا البروتوكول إلى الآلاف من دراسات الحالة في انتظار أن يتم فحص ^33. وفقا لقاعدة البيانات الأدب لاستعراض الأقران المكبر، في آخر السنوات الخمس الماضية كانت هناك 7425 منشورات أوراق التعامل مع SEM التصوير النباتات (4914)، الفطريات البيضية (21) والفطريات (2490). وتشير هذه الحقيقة أن الأبحاث في الفطريات البيضية باستخدام التصوير ووزارة شؤون المرأة لا تزال نادرة جدا بالمقارنة معالنباتات والفطريات. مع ESEM، فإن الأرقام أقل من ذلك. هناك 588 المخطوطات في نفس الفترة الزمنية: 337 في النباتات، 1 في الفطريات البيضية و 250 في الفطريات.

The authors have nothing to disclose.

وقد لقي هذا المشروع بتمويل من البحث والابتكار برنامج الاتحاد الأوروبي أفق 2020 بموجب اتفاقية منحة رقم 634429. ويعكس هذا المنشور وجهات النظر فقط للمؤلف، والمفوضية الأوروبية لا يمكن أن يكون مسؤولا عن أي استخدام التي يمكن أن تكون مصنوعة من المعلومات الواردة فيه. ونحن نعترف أيضا المساهمة المالية التي قدمها ريال حديقة النباتية، CSIC. ريال عن امتنانه للاتحاد الأوروبي [إيتن-SAPRO-238550] لدعم أبحاثها في الرمية. نحن نريد أيضا أن أشكر فرانسيسكو كالونج لليرجى تقديم الصور herculanea Phellorinia وباء. بيويو لتجهيز العينات (الشكل 5). وقد تم نقل كل الصور من قبل الخدمة ووزارة شؤون المرأة في ريال حديقة النباتية، CSIC في مدريد.