تطوير وبناء الجرذ نموذج ألفا synuclein لمرض باركنسون عن طريق حقن المجسم من النواقل الفيروسية المؤتلف المرتبطة الغدة

This manuscript describes how viral vector-mediated local gene delivery provides an attractive way to express transgenes in the central nervous system. The protocol outlines all crucial steps to perform a viral vector injection in the substantia nigra of the rat to develop a viral vector-based animal model for Parkinson's disease.

من أجل دراسة المسارات الجزيئية من مرض باركنسون (PD) ووضع استراتيجيات علاجية جديدة والمحققين العلمي تعتمد على النماذج الحيوانية. وقد أدى تحديد الجينات المرتبطة PD إلى تطوير نماذج PD الوراثية. الأكثر المعدلة وراثيا نماذج الماوس α-SYN تتطور تدريجيا α-SYN علم الأمراض ولكن تفشل في عرض واضحة فقدان الخلية الدوبامين والعجز السلوكية التي تعتمد على الدوبامين. تم التغلب على هذه العقبة الاستهداف المباشر من المادة السوداء مع النواقل الفيروسية overexpressing الجينات المرتبطة PD. توصيل الجينات المحلي باستخدام ناقلات فيروسية يوفر وسيلة جذابة للتعبير عن الجينات المحورة في الجهاز العصبي المركزي. يمكن استهداف مناطق محددة في الدماغ (مثل المادة السوداء)، والتعبير يمكن أن يتسبب في الإعداد الكبار ومستويات التعبير العالية يمكن أن يتحقق. وعلاوة على ذلك، نظم ناقلات مختلفة على أساس مختلف الفيروسات يمكن استخدامها. يحدد البروتوكول كل خطوات حاسمة لأداء ناقل فيروسيالحقن في المادة السوداء من الفئران لتطوير ألفا synuclein نموذج حيواني ناقلات القائم على الفيروسي لمرض الشلل الرعاش.

لدراسة الفيزيولوجيا المرضية لPD ووضع استراتيجيات علاجية جديدة، هناك حاجة ملحة لنماذج حيوانية تشبه عن كثب أمراض الأعصاب، علم وظائف الأعضاء والحركية أعراض PD البشري. ارتفاع القيمة التنبؤية، وأفضل ونحن يمكن أن تترجم علاجات جديدة من النماذج الحيوانية للمرضى.

أدى اكتشاف ألفا synuclein (α-SYN) كأول جين بارك في عام 1997 لتطوير النماذج الأولى PD الوراثية. وقد تم إنشاء العديد من الفئران المعدلة وراثيا overexpressing البشري من النوع البري (WT) أو متحولة (A30P، A53T) α-SYN على مدى العقد الماضي. وقد أثبتت مستويات overexpression α-SYN أن تكون حاسمة في تطور علم الأمراض. أيضا سلالة الماوس، وجود أو عدم وجود الذاتية α-SYN وما إذا كان يتم التعبير عن كامل طول أو شكل اقتطاع، يلعب دور (استعراض مفصل من قبل ماجن وChesselet ^1). overexpression من كلا WT والعديد من المسوخ السريرية البشرية و# 945؛ -SYN في الفئران المعدلة وراثيا يؤدي الى تراكم المرضي للα-SYN واختلال الوظائف العصبية ^2-6. ولكن، حتى الآن فشلت معظم المعدلة وراثيا نماذج الماوس α-SYN لعرضه واضحة فقدان الخلية الدوبامين والعجز السلوكية التي تعتمد على الدوبامين.

تم التغلب على هذه العقبة الاستهداف المباشر من المادة السوداء (SN) مع النواقل الفيروسية overexpressing ألفا-SYN. وتستمد ناقلات فيروسية من الفيروسات التي يمكن بسهولة تصيب الخلايا، وإدخال مادة وراثية في الجينات التي تستضيفهم وإجبار الخلية المضيفة لتكرار الجينوم الفيروسي من أجل إنتاج جزيئات الفيروس الجديدة. يمكن هندستها الفيروسات لناقلات غير تكرار الفيروسية التي تحتفظ قدرتهم على دخول الخلايا وإدخال جينات. عن طريق حذف أجزاء من الجينوم الفيروسي والاستعاضة عنها الجينات في المصالح، وتطبيق ناقلات يؤدي الى عدوى جولة واحدة دون تكرارها في الخلية المضيفة، المعين بصفة عامة "التنبيغ". ناقلات فيروسية جعلى أن تستخدم في كل overexpression وإسكات الجينات. التحوير أعرب يمكن أن يكون البروتين مراسل (على سبيل المثال الأخضر بروتين فلوري أو يراعة وسيفيراز) ^7، وهو البروتين العلاجي للتطبيقات العلاج الجيني ^8-10، ونحن سوف نركز عليها في هذه الورقة، وهو بروتين المتعلقة بالأمراض تستخدم لنمذجة المرض ^{11 -14.}

يوفر الفيروسي بوساطة ناقلات توصيل الجينات وسيلة بديلة للتعبير عن الجينات المحورة في الجهاز العصبي المركزي مع العديد من المزايا. عن طريق تسليم التحوير المحلي، مناطق محددة في الدماغ يمكن أن تكون مستهدفة. وعلاوة على ذلك، التعبير التحوير يمكن أن يتسبب خلال مرحلة البلوغ تقليل مخاطر الآليات التعويضية خلال التنمية. أيضا، نماذج يمكن إنشاؤها في أنواع وسلالات مختلفة. وأخيرا، الجينات المحورة مختلفة يمكن بسهولة مجتمعة. باستخدام ناقلات فيروسية، ومستويات التعبير عالية التحوير لا يمكن أن يتحقق، والتي قد تكون حاسمة منذ بداية ظهور أعراض المرض وشدة في كثير من الأحيان تعتمد على مستوى overexpression.

وقد تم تطوير عدة أنظمة ناقل القائمة على الفيروسات المختلفة. اختيار نظام ناقل يعتمد على حجم الجين من الفائدة، ومدة المطلوبة في التعبير الجيني، والخلايا المستهدفة، وقضايا السلامة الأحيائية. لنقل الجينات مستقرة في الدماغ، lentiviral (LV) والمؤتلف الفيروسية الغدة المرتبطة تعتبر (rAAV) ناقلات الآن أنظمة ناقلات الاختيار لأنها تؤدي إلى التعبير الجيني فعالة وطويلة الأمد في الدماغ القوارض. لاستهداف معين من الخلايا العصبية الدوبامين (DN) من SN، ناقلات rAAV وoutcompeted تدريجيا ناقلات LV بسبب التتر من أعلى وكفاءة تنبيغ DN.

وقد وضعت أفضل α-SYN نماذج القوارض أساس المتاحة حاليا من نهج موحد باستخدام الأنماط المصلية AAV أحدث (rAAV 1، 5، 6، 7، 8) والأمثل يبني ناقلات، التتر، ونقاء ^15،16. عيار ناقلات فضلا عن نقاء ناقلات يؤثر بشكل مباشرنتائج المظهرية للنموذج. التتر ناقلات المفرطة أو دفعات ناقلات النقاء كاف قد يؤدي إلى سمية غير محددة. لذلك، ناقلات المراقبة المناسبة لا غنى عنها. وقد أثبتت كبيرا للاستثمار الوقت في إنتاج ناقلات، الارتقاء، والإجراءات تنقية الفيروسية أيضا ضروري للحصول على دفعات ناقلات نوعية استنساخه وعالية.

يتم تنفيذ جميع التجارب على الحيوانات وفقا للمجتمعات الأوروبية توجيه المجلس من 24 نوفمبر 1986 (86/609 / EEC) والتي وافقت عليها لجنة أخلاقيات العلوم الحيوية في جامعة لوفان (بلجيكا).

1. المؤتلف AAV إنتاج وتنقية

ملاحظة: تم تنفيذ rAAV إنتاج النواقل وتنقية من قبل لوفين الفيروسية المتجهات الأساسية (LVVC) كما هو موضح سابقا ^(17).

1. لفترة وجيزة، transfect subconfluent منخفضة (<50) مرور ملتصقة خلايا كلوة 293T باستخدام 25kD الخطية polyethylenimine 150 نانومتر كلوريد الصوديوم الحل ترنسفكأيشن وثلاثة البلازميدات مختلفة في نسبة 1: 1: 1 في DMEM المتوسطة 2٪ مصل بقري جنيني. بعد 24 ساعة من الحضانة عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO _2، استبدل المتوسطة مع الطازجة DMEM المتوسطة 2٪ مصل بقري جنيني.
   ملاحظة: البلازميدات تشمل بنيات للالمصلي AAV7، البلازميد نقل AAV ترميز متحولة A53T البشري α-SYN تحت سيطرة CMVie تعزيز SYNAPSالمروج in1 ووpAdvDeltaF6 الفيروسة الغدانية المساعد البلازميد ^17.
2. حصاد المتوسطة 5 أيام بعد ترنسفكأيشن عابرة والتركيز باستخدام تدفق عرضية الترشيح ^17.
3. تنقية ناقلات جزيئات rAAV من المتوسط ​​المركزة باستخدام iodixanol خطوة التدرج ^17.
4. استخدام التقنيات القياسية في الوقت الحقيقي PCR للنسخة الجينوم (GC) تقرير. في هذا البروتوكول، عيار ناقلات 3.0 E11 GC / كان يستخدم مل لتطوير نموذج الفئران α-SYN القائمة على PD ^17.

2. حقن المجسم من α-SYN rAAV ناقلات في SN الفأر (الشكل 2)

1. منزل ثمانية أسابيع من العمر فئران ويستار الإناث تزن حوالي 200-250 ز تحت 12 ساعة دورة الضوء / الظلام طبيعية مع حرية الوصول إلى الغذاء مكعبات وماء الصنبور.
2. إرسال الفئران إلى داخل الصفاق (IP) التخدير التي تحتوي على خليط من الكيتامين (60 ملغ / كلغ) وmedetomidine (0.4 ملغ / كلغ). مرة واحدة يتم تخدير الفئران ولا يتفاعلعندما الضغط على الكفوف مختلفة، تدير تحت الجلد مستجيب الصغيرة في الجزء الخلفي من الفئران لمزيد من الاعتراف باستخدام implanter-مستجيب الصغيرة. تحقق إذا تم وضع باقة الصغيرة بشكل صحيح ويمكن قراءتها من قبل جهاز القراءة.
3. قص الشعر على أعلى من فروة الرأس. تطبيق مخدر موضعي على كل فروة الرأس والأذنين. أداء بقية إجراء العمليات الجراحية تحت تدفق الصفحي باستخدام تقنيات العقيم.
4. وضع الفئران في الإطار رئيس المجسم باستخدام اثنين من القضبان الأذن، والفم والأنف بار. يغطي الجسم من الفئران مع ورقة بطانية لتجنب حدوث انخفاض في درجة حرارة الجسم. تطبيق مواد التشحيم العين لمنع العينين من الجفاف.
5. تطهير فروة الرأس مع jodium 1٪ في الأيزوبروبانول 70٪، وجعل شق صغير في خط الوسط من فروة الرأس. كشط بلطف بعيدا الأغشية على الجمجمة وشطف مع المياه المالحة. السماح الجمجمة جافة لعدة دقائق. مراقبة الغرز في الجمجمة والنقاط المرجعية اثنين: Bregma وامدا.
6. لحقن ناقلات rAAV في SN، وتحديد إحداثيات نحو Bregma (الأمامي الخلفي: 5.3 مم؛ الناصف الوحشي: 2.0 ملم وظهري بطني: 7.2 مم تحسب من الجافية).
   ملاحظة: يمكن حساب الإحداثيات ثلاثية الأبعاد لكل المنطقة ذات الاهتمام باستخدام أطلس التجسيمي للدماغ الفئران، وتطبيق Bregma كنقطة مرجعية التشريحية.
7. ملء حقن مكروي حقنة 10 ميكرولتر (30 مقياس 20 ملم) مع ناقلات rAAV ووضعه في الصك التجسيمي على اتصال مع مضخة حقن مكروي الآلية. التحكم في مستوى الصوت عن طريق الإفراج عن قطرة من النواقل والقضاء في متعدد التكافؤ التنظيف المنظفات درجة الحموضة 9 (على سبيل المثال RBS).
8. فحص البصر إذا تم إصلاح الرأس مباشرة في إطار الرأس وتقييم محور بين اليسار واليمين. بعناية تحديد بصريا الأمامي الخلفي والناصفي الوحشي إحداثيات Bregma وامدا وقياس طولهم باستخدام قياس 30 ملم 20 إبرة في الذراع ظهري بطني من الإطار المجسم.
   1. السماح صباحاaximum 0.3 الفرق ملم في الطول بين Bregma وامدا. وضع الإبرة مرة أخرى على Bregma وتطبيق الأمامي الخلفي والإحداثيات الناصفي الوحشي عن طريق تحريك الأمامي الخلفي والذراع الناصف الوحشي للإطار المجسم.
9. في مكان الحقن، وقياس ارتفاع الجمجمة والتأكد من أنها لا تختلف أكثر من 0.3 ملم من ارتفاع Bregma. حفر حفرة في الجمجمة يبلغ قطرها حوالي 2 مم. قياس ارتفاع الجافية، وهذا سيكون بمثابة إشارة إلى تطبيق ظهري بطني تنسيق. وبدلا من طرح سمك ثابتة لالجمجمة (0.9 ملم).
10. اختراق الجافية باستخدام إبرة قياس 26 وامتصاص الدم بمنديل معقم. الانتظار حتى توقف عن النزيف قبل المتابعة.
11. إدراج ببطء حقن مكروي حقنة 10 ميكرولتر محملة مسبقا مع حل متجه إلى الدماغ إلى عمق محدد مسبقا (ظهري بطني تنسيق). انتظر 1 دقيقة مع الإبرة في المكان. ضخ 3 ميكرولترحل ناقلات (3.0 E11 الجينوم نسخة / مل (الجرعة ناقلات متوسطة) أو 1.0 E12 GC / مل (الجرعة ناقلات عالية) من rAAV2 / 7 α-SYN أو EGFP ناقلات السيطرة) باستخدام مضخة حقن مكروي الآلية مع إنتاجية 0.25 ميكرولتر / دقيقة.
12. بعد الحقن، والحفاظ على الإبرة في المكان لمدة 5 دقائق أخرى قبل إزالته ببطء. غرزة فروة الرأس باستخدام المغلفة مضفر البوليستر 3.0 تطهير مع 1٪ jodium في 70٪ الأيزوبروبانول وإزالة بلطف الحيوان من الصك المجسم. أولا تخفيف الأنف والفم شريط، ثم القضبان الأذن اثنين.
13. لعكس التخدير، وحقن الفئران داخل الصفاق مع 0.5 ملغ / كغ atipamezole ووضع الفئران في قفص نظيف على لوحة التدفئة من 38 درجة مئوية حتى يستيقظ. تغطية الفئران مع ورقة بطانية لمنع انخفاض في درجة حرارة الجسم.
14. توفير سهولة الوصول إلى الطعام والماء لمدة ساعة الأولى. مراقبة الفئران في الأيام القليلة الأولى. إذا لزم الأمر تطبيق التسكين.
    ملاحظة: ليست هناك حاجة لإزالة الغرز من رانه الجمجمة. بعد 1-2 أسابيع يتم إصلاح الجمجمة تماما وغرز تأتي فضفاضة.

3. تقييم rAAV2 / 7 α-SYN الفئران المحقونة عن طريق غير الغازية PET التصوير، اختبارات السلوكية وتحليل المناعى

1. لمتابعة حركية التنكس العصبي الدوبامين السوداوي المخططي غير جراحية مع مرور الوقت في الحيوانات الفردية، تحديد الدوبامين نقل (DAT) ملزمة باستخدام الحيوانات الصغيرة التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني (PET) والتتبع من DA الناقل على سبيل المثال ^[18 F] -FECT ¹⁶ .
2. لدراسة ما إذا كان مستوى التنكس العصبي الدوبامين هو كافية لإحداث العاهات الحركية في الفئران، تعرض الفئران لاختبار اسطوانة لتقييم استخدام forelimb عفوية.
   1. وضع الفئران في 20 سم واضح واسعة اسطوانة الزجاج وشريط فيديو سلوك خلال الحركات الرأسية على طول الجدار والهبوط بعد العمق. تسجيل عدد من الاتصالات التي أجراها كل forepaw ليصبح المجموع 20جهات الاتصال. للحصول على وصف مفصل للمعايير التهديف نرى Schallert وآخرون. ¹⁸ يعربون عن عدد من الاتصالات forelimb ضعف (على سبيل المثال forepaw الأيسر) كنسبة مئوية من إجمالي الاتصالات forelimb (من اليسار بالإضافة إلى forepaw الأيمن).
      ملاحظة: يجب أن الفئران السيطرة غير lesioned باستخدام كل من الكفوف على قدم المساواة يسجل نحو 50٪ في هذا الاختبار.
3. أداء المناعى (IHC) التحليل لتقييم مستوى التعبير التحوير وفقدان الخلية الدوبامين.
   1. في المراحل النهائية المختلفة، التضحية الفئران مع جرعة زائدة من الصوديوم (60 ملغ / كلغ، والملكية الفكرية) وإجراء نضح intracardial مع المياه المالحة الباردة تليها بارافورمالدهيد 4٪ في برنامج تلفزيوني ^(19). يحملق أدمغة بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية، وخفض 50 ميكرون أقسام الدماغ الاكليلية سميكة باستخدام مشراح تهتز.
   2. أداء IHC تلطيخ على أقسام التعويم الحر باستخدام أجسام مضادة ضد α-SYN وهيدروكسيلاز التيروزين لتحليل مستويات التعبير ألفا-SYN ولوفيل من التنكس العصبي ^16.

وصفت الخطة الشاملة للتجربة في الشكل 1

overexpression rAAV 2/7 بوساطة من A53T α-SYN يدفع العجز الحركي تعتمد على الدوبامين.
لدراسة ما إذا كان مستوى α-SYN overexpression غير كافية لإحداث العاهات الحركية في الفئران، ونحن تعرض الفئران لاختبار اسطوانة لتقييم استخدام forelimb العفوي (الشكل 3A). من 3 أسابيع بعد الحقن، وكان ينظر الى إعاقة حركية كبير في الفئران التي تلقت جرعة 3.0 E11 GC / مل من A53T α-SYN rAAV2 / 7 ناقلات. في 4 أسابيع بعد الحقن لوحظ وجود انخفاض بنسبة 50٪ في المقابل (يسار) استخدام forepaw عفوية، في حين أن السيطرة EGFP rAAV2 / 7 حقن الحيوانات لم تظهر أي التفاوت في استخدام forepaw (الشكل 3B). وأظهرت الفئران التي تلقت rAAV2 / 7 جرعة ناقلات أعلى A53T α-SYN لimpairm أكثر وضوحاوالأنف والحنجرة من استخدام forepaw (70٪) في 29 أيام بعد الحقن (الشكل 3C). لإثبات أن الإعاقة الحركية الملحوظ كان المعتمدة على الدوبامين، ونحن تدار جرعة واحدة من لام دوبا (6 ملغ / كغ والملكية الفكرية) للفئران حقنت بجرعة ناقلات عالية. عندما كررنا اسطوانة اختبار 45 دقيقة بعد العلاج لام دوبا، والشفاء التام من استخدام forepaw في A53T α-SYN rAAV2 / 7 حقن الحيوانات لوحظ (الشكل 3C).

PET التصوير يسمح التصوير غير الغازية α-SYN التنكس العصبي التدريجي الناجم.
لمتابعة حركية التنكس العصبي الدوبامين السوداوي المخططي غير جراحية مع مرور الوقت في الحيوانات الفردية، ونحن كميا نقل الدوبامين (DAT) ملزمة باستخدام الحيوانات الصغيرة التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني (PET) مع ^[18 F] -FECT كما جين مشع. DAT ملزمة انخفضت بشكل ملحوظ في المماثل المذنبة-putamen من A53T α-SYN rAAV2 / 7 injecالفئران تيد مرور الوقت ولكن ظلت مستقرة في الحيوان السيطرة EGFP (الشكل 4A - 4B). وأظهر تقدير حجم DAT ربط A53T α-SYN rAAV2 / 7 حقن الحيوانات معدل القصوى من انحطاط الدوبامين السوداوي المخططي بين يوم 7 و 21 بعد الحقن. بعد 32 يوما، لوحظ وجود انخفاض في DAT ربط ما يصل الى 85٪ (الشكل 4C). كما تحكم إيجابية، حقن عصبي 6-OHDA في SN يسببها فقدان 90٪ من DAT ملزمة غضون 7 أيام (الشكل 4B - 4C).

حقن المجسم من rAAV2 / 7 A53T α-SYN في SN من الفئران يدفع سودائي موت الخلية الدوبامين وتشكيل غير قابلة للذوبان α-SYN المجاميع إيجابية.
لتحليل مستوى α-SYN overexpression والدوبامين فقدان الخلية ضحينا الحيوانات في نقاط زمنية مختلفة. تم تنفيذ IHC على أقسام التعويم الحر باستخدام الأجسام المضادة AGainst α-synuclein (الأرنب بولكلونل 1: 5000). وكانت هذه الأجسام المضادة يمكن الكشف عن الإنسان والفئران على حد سواء α-synuclein، ولكن المستويات الخفية من الفئران α-synuclein أقل من حدود الكشف في somata خلية سودائي، نظرا لتوطين بدورها الأساسي في الأغشية متشابك. لتقويم فقدان الخلية استخدمنا الأجسام المضادة ضد TH (الأرنب بولكلونل 1: 1000).

بعد أربعة أيام rAAV حقن ناقلات، تم الكشف α-SYN أو التعبير EGFP في SN (الشكل 5A - 5C) للفئران. الأغلبية (> 90٪) من DN تم transduced بكفاءة وتم ترجمة كل من البروتينات المعدلة وراثيا في أجسام الخلايا والمحاور. في 29 يوما وقد لوحظ حقن آخر (بي) انخفاض كبير في التعبير α-SYN في SNpc، في حين كان لا يزال اكتشافها في المناطق المحيطة SN (الشكل 5B - 5C). بعد ذلك، قمنا بتحليل مستوى فقدان الخلية سودائي. وسريع وتدريجي وفقدان ستم الكشف عن و تصل إلى 80٪ من الخلايا العصبية TH-إيجابية أكثر من 29 يوما في الفئران المحقونة مع A53T α-SYN rAAV2 / 7 (الشكل 5D - 5H). وتجدر الإشارة، overexpression من النوع البري بدلا من A53T α-SYN أسفرت عن التنكس العصبي الدوبامين مماثلة (لا تظهر البيانات). ويتوازى فقدان DN في SN من انخفاض قوي من النهايات العصبية TH-إيجابية في المخطط (STR) (الشكل 5F). استبعاد آثار ناقلات دفعة محددة، تم اختبار مختلفة α-SYN الاستعدادات ناقلات في SN مع نتائج مماثلة. وقد لوحظ عدم إجراء أي تخفيض في TH تلطيخ في SN أو STR من EGFP rAAV2 / 7 حقن الحيوانات التحكم (الشكل 5E-5H). بجانب التنكس العصبي الدوبامين، وجود α-synucleinopathy هو السمة المميزة الثانية الهامة من PD. وعلى الرغم من مسار وقت قصير من نموذجنا (أربعة أسابيع)، لاحظنا كل من المجاميع هيولي-SYN-إيجابية α في SN وneurites التي التصنع في STR (الشكل 5I أونج>). مناعية اليوبيكويتين هو سمة مميزة من ليوي الجسم أمراض في الدماغ البشري ^20-22. لاحظنا شارك في توطين α-SYN واليوبيكويتين في 29 يوما بي في جزء (± 20٪) من α-SYN معربا عن الخلايا العصبية سودائي (الشكل 5J). تم تقييم طبيعة ييفي من المجاميع α-SYN التي كتبها Thioflavin S (ثيو S) تلطيخ ^23. ثيو S تم الكشف عن خلايا إيجابية في SN من 17 يوما فصاعدا (الشكل 5J).

الشكل 1: حقن المجسم من rAAV2 / 7 النتائج ناقلات α-SYN في التنكس العصبي التدريجي حقن المجسم من rAAV2 / 7 ناقلات α-SYN في SN من الفئران يدفع التنكس العصبي الدوبامين قياسها عن طريق تحليل السلوك (اسطوانة اختبار)، PET غير الغازية التصوير والتحليل IHC.د / 53670 / 53670fig1large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: حقن المجسم من الترميز rAAV2 / 7 ناقلات α-SYN في SN من الفئران. (A، B، E) الغرز في الجمجمة على الجمجمة الفئران، وتحديد النقاط المرجعية اثنين: Bregma وامدا. (ج) وأطلس التجسيمي للدماغ الفئران تقديم منطقة الحقن وهي SN. (D) ويستار الفئران وضعه في إطار رأس المجسم باستخدام اثنين من القضبان الأذن، والفم والأنف بار. (F) إبرة قياس 30 مليئة متجه يتم وضعها في موقف للالمادة السوداء. وحفر (G) وكلها صغيرة في موقع الحقن ويتم وضع إبرة في الموقف. (H) بعد حقن فروة الرأس هي الأمراض المنقولة جنسياtched وتطهيرها. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3): rAAV overexpression 2/7 بوساطة من A53T α-SYN يدفع العجز الحركي تعتمد على الدوبامين (A، B) اختبار اسطوانة في نقاط زمنية مختلفة بعد حقن rAAV2 / 7 A53T α-SYN. (يعني ± التنمية المستدامة، * ف <0.05 مقابل 17 يوما، # ف <ضوابط 0.05 EGFP بواسطة أنوفا وتوكي اللاحق اختبار، ن = 5). (ج) اختبار اسطوانة في نقاط زمنية مختلفة بعد حقن rAAV2 / 7 A53T α-SYN (جرعة ناقلات عالية). (متوسط ​​± التنمية المستدامة، * ف <0.05 4 أيام مقابل 29 يوما قبل ANOVA وتوكي اللاحق اختبار، ن = 5). تم إجراء اختبار مع أو بدون إدارة يفودوبا (L-دوبا). (يعني ± التنمية المستدامة، * ص <0.05 غير المعاملة مقابل الحيوانات المعالجة بواسطة أنوفا وتوكي اللاحق اختبار، ن = 5). نقلا عن بيولوجيا الأعصاب من الشيخوخة، المجلد. 36 فان دير بيرين وآخرون، طولية متابعة وتوصيف نموذج الفئران قوي لمرض باركنسون بناء على overexpression من ألفا-synuclein مع ناقلات الغدة المرتبطة الفيروسية، 1543-1558، (2015)، بإذن من السيفير. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 4: التصوير غير الغازية من A53T α-SYN موت الخلية الدوبامين التي يسببها استخدام DAT PET التصوير (A - B) سلسلة من شرائح أفقية والاكليلية تصور متوسط ​​الجسم المخطط DAT ملزم من (A) rAAV2 / 7 A53T α-SYN حقن الحيوانات في مختلفانقطة تي الوقت بعد الحقن (ن = 7) و (ب) rAAV2 حقن / 7 EGFP (ن = 1) معاملة أو 6-OHDA الحيوانات التحكم (ن = 1) بعد 79 يوما الحقن. وتشير لون القضبان إمكانات ملزمة لDAT. (C) الكمي لDAT ربط rAAV2 / 7 A53T α-SYN، حقن rAAV2 / 7 EGFP و 6-OHDA الحيوانات قياس في نقاط زمنية مختلفة (البيانات تمثل يعني ± SD). نقلا عن بيولوجيا الأعصاب من الشيخوخة، المجلد. 36 فان دير بيرين وآخرون، طولية متابعة وتوصيف نموذج الفئران قوي لمرض باركنسون بناء على overexpression من ألفا-synuclein مع ناقلات الغدة المرتبطة الفيروسية، 1543-1558، (2015)، بإذن من السيفير. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (5): rAAV 2/7 بوساطة overexpression من A53T α-SYN الحث موت الخلايا الدوبامين وتشكيل غير قابلة للذوبان α-SYN المجاميع إيجابية. (A - B) IHC تلطيخ يدل α-SYN overexpression 4 أيام و 29 يوما بعد rAAV بوساطة نقل في الفئران SN. وتبين إدراج تكبير من المنطقة المحددة. مقياس شريط = 400 ميكرون (نظرة عامة الصورة إلى اليسار)، 70 ميكرون و 200 ميكرون (إدراج الحق). (C) IHC تلطيخ يتظاهرون EGFP overexpression 4 أيام و 29 يوما بعد rAAV بوساطة نقل في SN الفئران. شريط مقياس = 400 ميكرون. (D - G) IHC تلطيخ لTH في SN وSTR في نقاط زمنية مختلفة بعد حقن (D، F) rAAV2 / 7 α-SYN أو 29 يوما بعد حقن (E، G) rAAV2 / 7 EGFP في SN . مقياس شريط أ، ج = 400 ميكرون، ب، د = 1000 ميكرون. (H) الكمي Stereological من خدرإيه من الخلايا العصبية TH-إيجابية في SN مع مرور الوقت بعد الحقن rAAV2 / 7 A53T α-SYN أو rAAV2 / 7 مكافحة ناقلات EGFP (متوسط ​​± التنمية المستدامة، * ف <0.05 مقابل 8 أيام، # ف <0.05 مقابل الضوابط EGFP بواسطة أنوفا و توكي اختبار خاص آخر، ن = 5). (I) IHC تلطيخ يتظاهرون ألفا-SYN علم الأمراض، بما في ذلك الركام هيولي في SN والتصنع وneurites التي انتفاخ في STR، بعد intranigral حقن rAAV2 / 7 A53T α-SYN. (J) صور متحد البؤر التمثيلية للimmunostainings ضعف فلوري لα-SYN (الخضراء) واليوبيكويتين (الحمراء) تظهر زيادة في المشاركة في توطين على مر الزمن (السهام). مقياس شريط ج = 50 ميكرون. Thioflavin S تلطيخ SN 29 أيام بعد الحقن من rAAV2 / 7 A53T α-SYN. شريط النطاق D = 30 ميكرون. نقلا عن بيولوجيا الأعصاب من الشيخوخة، المجلد. 36 فان دير بيرين وآخرون، طولية متابعة وتوصيف نموذج الفئران قوي لمرض باركنسون بناء على overexpression من ألفا-synuclein مع إعلانإينو المصاحب ناقلات فيروسية، 1543-1558، (2015)، بإذن من السيفير. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

هناك العديد من الخطوات الحاسمة في البروتوكول. عيار ناقلات فضلا عن نقاء ناقلات يؤثر بشكل مباشر على نتائج المظهرية للنموذج. التتر ناقلات المفرطة أو دفعات ناقلات النقاء كاف قد يؤدي إلى سمية غير محددة. ولذلك، فإن استخدام دفعات ناقلات جودة عالية وناقلات الرقابة المناسبة أمر لا غنى عنه. وعلاوة على ذلك، وتحديد المواقع بدقة من رأس فأر في إطار التجسيمي وتحديد دقيق لإحداثيات ضروري في استهداف المادة السوداء. بعد حفر ثقب في الجمجمة في موقع الحقن، فمن المهم لادخال الإبرة مباشرة الى الدماغ الفئران دون لمس أي الهوامش. يجب إزالة الإبرة ببطء بعد حقن ناقلات فيروسية، لمنع تسرب النواقل. وأخيرا، وبعد خياطة، يجب تطهير فروة الرأس مع 1٪ jodium في 70٪ الأيزوبروبانول لتجنب العض من غرز من قبل الحيوانات الأخرى. الكواشف مطهر أخرى بدلا من ذلكممكن استخدامه.

ويمكن أيضا أن الأسلوب هو موضح أن تستخدم لتطوير rAAV2 / 7 α-SYN نموذج الفئران استنادا لمرض الشلل الرعاش ^(24). في الفئران نحن حقن حجم ناقلات rAAV 2 ميكرولتر في SN. بالمقارنة مع الفئران، الفئران DN يبدو إلى حد ما أقل حساسية لألفا SYN overexpression، مما أدى إلى تأخير مظاهر التنكس العصبي. وعلاوة على ذلك، مناطق أخرى في الدماغ (مثل المخطط، الحصين، القشرة، الخ) يمكن أن تكون مستهدفة. إحداثيات لمناطق الدماغ المختلفة يمكن العثور عليها في الأطلس التجسيمي. ويمكن أن يتم تعظيم الاستفادة من الإحداثيات التي كتبها الحبر الصيني أو باستخدام ناقلات فيروسية ترميز الجين مراسل (على سبيل المثال EGFP). أنظمة نواقل مختلفة (rAAV، والوقف، وغيرها) يمكن أن تستخدم اعتمادا على التطبيق.

هذه التقنية لديها الحد أن كل حيوان له ليتم حقنه بشكل فردي. ولذلك ينبغي شخص مدرب أداء الحقن من أجل الحد الأدنىالاختلافات imize بين الحيوانات المختلفة. الحد الآخر هو أن هذه الطريقة تستغرق وقتا طويلا (عندما أعدم من قبل شخص مدرب ويستغرق حوالي 45 دقيقة لكل حيوان). فقط ثمانية إلى عشرة حيوانات يمكن حقنها في يوم واحد.

الفيروسي بوساطة ناقلات توصيل الجينات يسمح لاستهداف معين من مناطق الدماغ. باستخدام ناقلات فيروسية، ومستويات التعبير عالية التحوير لا يمكن أن يتحقق، وهو أمر حاسم منذ بداية ظهور أعراض المرض وشدة يعتمد على مستوى التعبير α-SYN. أيضا، يمكن تطبيق جرعات مختلفة الأمر الذي سيؤدي في نموذج حيواني عرض حركية أبطأ أو أسرع من التنكس العصبي. وأخيرا، هذه التقنية يمكن استخدامها لإنشاء النماذج في مختلف أنواع الحيوانات والسلالات باستخدام نفس إعداد النواقل.

هذا الإجراء يمكن استخدامها لتوفير ناقلات فيروسية وكذلك السموم (مثل 6-OHDA) في مناطق مختلفة من التحوير brain.The المشفرة بواسطة ناقلات يمكن أن يكون البروتين مراسل وص العلاجيةrotein لتطبيقات العلاج الجيني ^8-10 أو بروتين الأمراض ذات الصلة المستخدمة لنمذجة مرض ^11-14. هذه التقنية يمكن استخدامها لتطوير نماذج حيوانية جديدة والتي تسمح للما قبل السريرية لاختبار المخدرات ويمكن أن تكون مفيدة في دراسة الآلية الجزيئية لمرض الشلل الرعاش، وكذلك العديد من الاضطرابات العصبية الأخرى.

الكتاب تعلن أنه لا يوجد نزاع قائم أو محتمل في المصالح.

الكتاب أشكر يوريس فان Asselberghs وآن فان Santvoort للحصول على المساعدة الفنية الممتازة. وقد تم تمويل البحث من قبل IWT-VLAANDEREN (IWT الثانوي المهني / 80020)، وFWO VLAANDEREN (G.0768.10)، من خلال برنامج EC-FP6 "ديمي" (LSHB-CT-2005-512146)، ومشروع MEFOPA FP7 RTD (الصحة -2٬009-241٬791)، وبرنامج FP7 "INMiND" (الصحة-F2-2011-278850)، جامعة الكويت لوفين (قوات الاحتلال الإسرائيلي-KP / 07/001، OT / 08 / 052A، IMIR PF / 10/017)، و مؤسسة MJFox (التحقق من صحة هدف عام 2010). A. فان دير بيرين وجيم Casteels هي زملاء ما بعد الدكتوراه من صندوق الفلمنكية البحث العلمي. ك فان Laere هو زميل السريرية كبار من صندوق الفلمنكية البحث العلمي.