Method Article
والهدف من هذا الفيديو هو إظهار كيفية تنفيذ استخراج الحمض النووي الآلي من (FFPE) إشارة خطوط الخلايا الثابتة الفورمالين جزءا لا يتجزأ من البارافين القياسية وقطرة الرقمية PCR (ddPCR) تحليل للكشف عن الطفرات النادرة في عملية إعداد سريرية. الكشف عن الطفرات في عينات FFPE يوضح فائدة سريرية من ddPCR في عينات FFPE.
ddPCR is a highly sensitive PCR method that utilizes a water-oil emulsion system. Using a droplet generator, an extracted nucleic acid sample is partitioned into ~20,000 nano-sized, water-in-oil droplets, and PCR amplification occurs in individual droplets. The ddPCR approach is in identifying sequence mutations, copy number alterations, and select structural rearrangements involving targeted genes. Here, we demonstrate the use of ddPCR as a powerful technique for precisely quantitating rare BRAF V600E mutations in FFPE reference standard cell lines, which is helpful in identifying individuals with cancer. In conclusion, ddPCR technique offers the potential to precisely profile the specific rare mutations in different genes in various types of FFPE samples.
تراكم الطفرات الوراثية في الجينات التنظيمية الرئيسية يغير برمجة الخلية الطبيعية مثل تكاثر الخلايا، والتمايز، والبقاء على قيد الحياة، مما يؤدي إلى السرطان 1. كيناز مسار RAS-RAF-MAP يتوسط الاستجابات الخلوية إلى إشارات النمو. يمكن أن الطفرات أنكجنيك BRAF تنجم عن طفرات في الجين سائق BRAF، والتي قد تتسبب في BRAF oncoprotein لتصبح مفرط 2. الطفرات في جين BRAF يؤدي أيضا إلى إشارات المصب فرط نشاط عن طريق منظمة مجاهدي خلق وERK 3، الذي، بدوره، يؤدي إلى نمو الخلايا المفرط والانتشار بشكل مستقل عن النمو بوساطة عامل التنظيم 4-6.
تتوفر لالتنميط تحور الحمض النووي، مثل الكمية في الوقت الحقيقي الطفرات BRAF V600E في، (FFPE) إشارة خطوط الخلايا الثابتة الفورمالين جزءا لا يتجزأ من البارافين القياسية التي ddPCR العديد من الأدوات. ddPCR هو الأسلوب القائم على PCR لتقدير المطلقتقدم دقة أعلى بالمقارنة مع التقليدية الكمي في الوقت الحقيقي PCR (QPCR) 7،8. يوفر ddPCR أيضا أعلى حل السلطة ودقة للكشف عن الطفرات النادرة في قوالب DNA، مما أبحاث السرطان أكثر إفادة والتشخيص 9. وتشمل مزايا إضافية من ddPCR على QPCR التقليدية حساسيتها تعزيز والدقة عند دراسة الأرقام نسخة قالب منخفض 10-12. هنا، يتجلى بروتوكول لاستخراج الحمض النووي من الخطوط المرجعية FFPE الخلية القياسية، تليها تحديد وجود أو عدم وجود الطفرات BRAF V600E التي كتبها ddPCR تلقائيا. وكما وصفت استخدام البرمجيات لتحليل البيانات وتمثيل رسومي للنتائج. الإجراء بأكمله هو بسيط نسبيا وتماما يعتمد على عدد من العينات المراد محة وعدد PCR وddPCR الآلات التقليدية المتاحة.
يصف بروتوكول فقا للإجراءات العادية لBR إشارة FFPE خطوط الخلايا القياسية AF V600E إيجابية (HD598، HD593، HD617، HD273 وwildtype (WT)) يتم تنفيذ في صك مؤتمتة بالكامل باستخدام بروتوكول الأنسجة نظام إعداد (TPS). وفي وقت لاحق، ويتم تحليل عينات من الحمض النووي معزولة عن وجود طفرات BRAF V600E باستخدام نظام ddPCR. يتم إجراء تحليل الطفرة المستهدفة بعد أن تم محة عن العينات وتم تحميل البيانات إلى برنامج تحليل البيانات. اعتمادا على عدد العينات / درس المجموعات، وتحليل البيانات قد تتطلب من واحد إلى عدة ساعات. العنصر التجريبي للمنهجية تتطلب دقة في التعامل مع DNA وrological الماصات وPipettors، شريط فيديو إن الرب علوم التربية شرح المزيد عن عن سياق pipetting ل"> pipetting لفي 96 لوحات جيدة، في حين أن تحليل البيانات تتم باستخدام البرمجيات.
1. استخراج الحمض النووي من خطوط الخلايا FFPE المعيار المرجعي
ملاحظة: للحصول على هذا الإجراء، تم إجراء استخراج الحمض النووي من الخطوط المرجعية FFPE الخلية القياسية (HD598، HD593، HD617، HD273 وwildtype (WT)) باستخدام FFPE DNA الأنسجة العزلة عدة كما هو موضح في البروتوكول أدناه. وقد تحقق استخراج الحمض النووي الآلي باتباع إرشادات الشركة المصنعة لمجموع عزل الحمض النووي.
1.2 بروتوكول TPS
ملاحظة: وحدات التخزين هو مبين في الجدول رقم 1 تتوافق مع الحد الأدنى اللازم لتجهيز 48 العينات، وإجراءالمعروضة في فقا للمبادئ التوجيهية TPS. قبل بدء التجربة يستقر العينات FFPE في أنبوب الإلكترونية عن طريق الطرد المركزي في 600 x ج، لتجنب فقدان العينات خلال برنامج الآلية.
2. DNA الطفرة التنميط: بروتوكول ddPCR
ملاحظة: بروتوكول لتحديد ملامح الطفرة DNA يتكون من 3 خطوات رئيسية: 1) الجيل الحبرية، 2) التضخيم PCR التقليدية، 3) القطرة القراءة و4) التنميط تحور الحمض النووي.
2.1. الجيل القطيرات
ملاحظة: ddPCR supermix هوأوصت لddPCR، وهذا المزيج يحتوي على الكواشف اللازمة لتوليد الحبرية.
2.2. استعدادا لPCR
2.3 القراءة الحبرية (حسب بروتوكول الموصى بها من المصنع)
ملاحظة: بعد PCR التضخيم من الهدف الحمض النووي في قطرات، وأداة قارئ قطرة يحلل كل قطرة فردي باستخدام نظام كشف 2 لون 13. وضعناها عادة للكشف عن FAM لد VIC fluorophores المراسل.
2.4 DNA الطفرة التنميط (حسب بروتوكول الموصى بها من المصنع)
ملاحظة: يتم حساب قطرات PCR إيجابية وسلبية PCR لتوفير quantific المطلقأوجه الهدف الطفرات BRAF V600E DNA في شكل رقمي، وذلك باستخدام برمجيات تحليل البيانات.
لتحليل ddPCR لدينا، درسنا BRAF V600E إشارة طفرة FFPE خطوط الخلايا القياسية. القارئ قطرة يتصل برنامج كمبيوتر محمول تحليل بيانات الكمبيوتر على التوالي. ويعرف كل قطرة الفردية على أساس السعة الفلورسنت على أنها إما إيجابية أو سلبية. البرامج المقدمة من قبل الشركة المصنعة يسمح أيضا قطع المعرفة من قبل المستخدم إدخالها إلى تحديد عتبة بين قطرات الإيجابية والسلبية. يتم استخدام عدد من قطرات الإيجابية والسلبية في عينة لحساب تركيز الهدف من حيث النسخ / ميكرولتر.
تم الكشف عن مضان ومعالجتها لتصبح مبعثر ثنائي الأبعاد العرض المؤامرة، تم استخدام البرامج المخصصة لرسم بوابات المناسبة لكل مجموعة نقطة النهاية قطرة، وكان يحسب عدد قطرات في كل باب. كما هو مبين في الشكل 3A، قطيرات ممثلة النقاط الزرقاء (FAM مضان إشارة) فوق خط قطع لجميع sampl الدراسيكانت العناوين (الخط الوردي) إيجابية للتحور V600E BRAF. قطرات ممثلة النقاط الزرقاء في BRAF WT (NTC، لين 2) يمكن أن تكون العينة يرجع إلى إشارة غير محددة (إيجابية كاذبة). وتم تطبيع اشارات ايجابية كاذبة (BRAF WT) مع عينات طفرة أخرى. كما هو مبين في الشكل 3B، يتم تمثيل قطرات WT BRAF التي كتبها النقاط الخضراء (VIC إشارة مضان). في كل المؤامرات، وتعتبر النقاط الرمادية في الجزء السفلي كخلفية مضان. حسبت الترددات أليل متحولة الشاملة باستخدام البيانات هو مبين في الشكل 3C، على أساس النسب المئوية النسبية للWT BRAF والقوالب BRAF V600E الكشف عنها. النتائج ddPCR حصلت تحتوي على التهم الحدث قطرة وتحسب من النوع البري وجزيء DNA متحولة التهم لV600E BRAF (50٪، 10٪، 5٪، 1٪، 0.5٪، 0.1٪ و 0.05٪) عينة محسوبة باستخدام أدناه الصيغة المذكورة أعلاه.
٪ من المسخ التردد = (المسخنسخ / (Wildtype + نسخة متحولة)) × 100
وبناء على ذلك، تم تحديد الطفرات BRAF V600E والتحقق منها مع المعيار المرجعي (BRAF WT). واستخدمت تعريف BRAF طفرة V600E الترددات أليلية من 50٪، 10٪، 5٪، 1٪، 0.5٪، 0.1٪ و 0.05٪ لاختبار الحساسية واستنساخ للنظام ddPCR. من تحليلنا مع تركيزات عينة معروفة، أكدنا أن ddPCR غير قادرة على كشف ما يصل الى 0.05٪ من BRAF V600E الطفرة. كشف كاذبة عدد متحولة إيجابي في المجلس الوطني الانتقالي أو WT ربما قد يكون بسبب التحلل التحقيق غير محددة كما ذكرت في وقت سابق 14. وقد اعتبر الكشف عن أكثر من نسختين في عينة بأنها إيجابية في ورم الأنسجة 15.
الشكل 1. تمثيل تخطيطي واصفا كاشف وتحميل عينة استعدادا لAUT omated أداة استخراج الحمض النووي ضع العينات في رفوف الناقل والاستغناء الكواشف إلى أحواض المقابلة على النحو المذكور. توظيف الآلي بروتوكول TPS التي تدعم أنواع العينة متعددة، يسلم دقيقة، ونتائج يمكن الاعتماد عليها مع أقصى قدر من الإنتاجية. إعادة طبع بإذن من سيمنز للعناية الصحية التشخيص. (من باب المجاملة سيمنز للعناية الصحية التشخيص).
الشكل 2. تمثيل تخطيطي من الأنسجة إعداد نظام سير العمل لاستخراج الحمض النووي الآلي. إجراء العزل DNA مؤتمتة بالكامل لFFPE الأنسجة أقسام بما في ذلك الخطوات السلبية مختارة من البارافين، وإزالة الحطام الأنسجة وخطوات اختيار إيجابية ملزمة وشطف ترد. إعادة طبع بإذن من سيمنز للعناية الصحية التشخيص. (من باب المجاملة سيمنز للعناية الصحية التشخيص).
الكواشف | الحجم (مل) |
تحلل العازلة | 106 مل |
غسل العازلة 1 | 101 مل |
غسل العازلة 2 | 72 مل |
غسل العازلة 3 | 106 مل |
شطف العازلة | 19 مل |
حبات مغناطيسية | 8 مل |
عازلة FFPE | 15 مل |
بروتين K | 3.3 مل |
الجدول 1. مجموع حجم الكواشف (TPS عدة) المطلوبة لاستخراج الحمض النووي مع 48 عينات.
دراجات الخطوةدرجة الحرارة | وقت | # دورات | |
تنشيط انزيم | 95 درجة مئوية | 10 دقيقة | 1 |
تمسخ | 94 درجة مئوية | 30 ثانية | 40 |
الصلب / تمديد | 60 درجة مئوية | 1 دقيقة * | |
عقد | 98 ° C | 10 دقيقة | 1 |
عقد | 4 ° C | إلى الأبد | 1 |
* ضبط إعدادات معدل الطريق المنحدر إلى 2-2،5 ° C / ثانية. استخدام غطاء ساخنة لتعيين 105 ° C وتعيين حجم العينة إلى 40 ميكرولتر |
الجدول 2. PCR التقليدية الظروف الحراري thermocycling
هنا، نسلط الضوء على تطبيق ddPCR وعزل الحمض النووي من الإشارة FFPE القياسية عينات خط الخلية لتقييم محدد تحور الجين. في هذه الدراسة، تم استخدام TPS الآلي DNA طريقة العزلة التي يمكن تكييفها بسهولة، الآلي، ويمكن أن تستوعب ما يصل إلى 48 عينات مختلفة في وقت واحد، مما يتيح للتجارب على نطاق أوسع وتقلب أقل. واحدة من القيود المفروضة على عزل الحمض النووي في العمل الحالي هو أن كل عينة FFPE هي فريدة من نوعها، وسوف تختلف بعضها البعض في الملوثات السطحية، الفلورا الميكروبية، و / أو الخلفيات الوراثية البشرية. بشكل عام، ونوعية الحمض النووي المستخرج والكمية ونجاح كله تضخيم الحمض النووي الجيني تعتمد على معايير مختلفة قبل وأثناء وبعد الاستخراج. وتشمل هذه ونوع وكمية من الأنسجة، ونوع من تثبيتي تستخدم لحفظ الأنسجة، ومدة التثبيت، عمر كتلة البارافين وظروف التخزين، فضلا عن طول الجزء DNA المراد تحليلها <سوب> 16. إزالة البارافين من الأنسجة هي الخطوة الأكثر أهمية لاستخراج ناجحة كما يؤدي البارافين غير منحل إلى سوء نوعية العينة. خلال جيل القطيرات، يجب توخي الحذر لمنع تشكيل فقاعة - وهذا هو خطوة حاسمة أخرى للكشف عن الطفرات ناجحة. النظر في عينة لعينة الاختلاف التي قد تنشأ بين السكان عينة، واستنادا إلى الدافع وراء التجربة، قد تكون هناك حاجة بعض التعديلات في الإجراء للحصول على النتيجة المرجوة.
ميزة أخرى هي أن عزل الحمض النووي وتجري ddPCR باستخدام النظم الآلية في هذا البروتوكول، وبالتالي هناك خطأ ضئيل وتدخل المستخدم المطلوب هو الحد الأدنى للغاية. عزل كامل الجينوم تضخيم DNA من جزءا لا يتجزأ من البارافين أنسجة / خاليا تم الحصول عليها عن طريق استخدام نظام TPS. واحدة من عيوب في استخدام النظام الآلي عزل الحمض النووي غير ذلك، فإنه ليست فعالة من حيث التكلفة لاستخدام عدد قليل من العينات. بدلا من هذا الظريف الآليويمكن أيضا أن يؤديها ص، وغيرها من الإجراءات المعتمدة عزل الحمض النووي لعينات محدودة
ذكرت دراسة حديثة أن استخدام قطرة PCR الرقمي (ddPCR) غير قادرة على تحديد عدد النسخ النسبي للمواضع الجيني محددة حتى في وجود من الأنسجة الطبيعية المختلطة التي تم الحصول عليها من الأنسجة FFPE. باستخدام سلسلة التخفيف السيطرة، Nadauld، L. آخرون تحديد حدود الكشف (اللد) لفحص ddPCR وذكرت تحسين حساسية على كميات ضئيلة من الحمض النووي مقارنة مع المعايير الوقت الحقيقي PCR 17. هنا، يتم استخدام خطوط الخلايا القياسية المرجعية FFPE لإثبات القدرة على الكشف عن الطفرات النظام ddPCR. أشارت النتائج إلى نظام ddPCR إمكانية كشف نادرة ترددات طفرة أليلية وصولا الى 0.05٪ الطفرة. بشكل جماعي، وهذه البيانات تشير إلى أن نظام ddPCR يمكن أيضا تحليل كمي لنسب مختلفة الأليلات الطافرة والاختلافات النسبية في متخالف عينة الورم السريريةالصورة. ويمكن تحليل عدد كبير من العينات FFPE لطفرات جينية معينة في وقت واحد وهذا هو أسلوب الأمثل للسكان الدراسات الجينية واسعة.
وأخيرا، ينبغي أن يؤخذ في الاعتبار أن الترددات طفرة الممثلة هنا هي الكمي المطلق، وينبغي ألا تعتبر القيمة النسبية لمعدل الطفرات أو تردد. توفر ddPCR قراءات الكمي المطلق للطفرة DNA الهدف. ويمكن استخدام هذه القيم للتحقق من صحة ترددات تحور العينات التي أعدت في إطار نفس الحالة، والتسلسل فوق المنطقة نفسها. ومع ذلك، هذه القيم المطلقة هي تكرار ويمكن استخدامها لمقارنة كمية التوزيع طفرة والتردد عندما يتم التحكم المعلمات المثلى. في الختام، وقد برزت في الآونة الأخيرة ddPCR كأداة قوية أن يعطي الكميات المطلقة من الأحماض النووية في عينات FFPE وخزعة، ويمكن أيضا أن duplexed مع فحوصات مرجعية لتحديد إما لاتركيزات نسخة rmalized أو عدد نسخ الحمض النووي.
ميونغ Ryuri أوه، سي يون كيم، ويونغ كيم DEUG هم موظفون من ABION CRO.
وأيد هذا البحث من قبل برنامج R & D للجمعية مؤسسة البحوث الوطنية (جبهة الخلاص الوطني)، بتمويل من وزارة العلوم وتكنولوجيا المعلومات والاتصالات والتخطيط المستقبلي (منحة رقم 2013M3C8A1075908).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Hamilton MICROLAB STARlet IVD instrument | Siemens | 10701001 | Automated DNA isolation instrument |
QX200 Droplet Generator | Bio-Rad | 772BR1119 | |
QX200 Droplet Reader | Bio-Rad | 771BR1497 | |
Conventional PCR machine capable of ramp-time adjustment | 621BR17718 | ||
PX1 PCR plate sealer | Bio-Rad | 770BR1575 | |
QuantaSoft software | Bio-Rad | ||
DNA isolation kit | |||
VERSANT Tissue Preparation Reagents Box 1 | Siemens | 10632398 | |
VERSANT Tissue Preparation Reagents Box 1 | Siemens | 10632399 | |
CO-RE tips | Siemens | ||
ddPCR mutation analysis | |||
ddPCR Supermix | Bio-Rad | BR186-3010 | 2X concentration |
DG8 cartridge | Bio-Rad | BR186-4008 | |
Droplet Generator oil | Bio-Rad | BR-186-3005 | |
Gasket | Bio-Rad | BR186-3006 | |
Droplet reader oil | Bio-Rad | BR-186-3004 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved