JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

كامل فحص السمية الخلوية الدم (التعداد الزراعي العالمي) هو فحص السمية الخلوية المتقدمة من خلال دمج الإنتاجية العالية تكنولوجيا تحديد المواقع المحمولة مع المجهري مضان ومعالجة الصور الآلي. هنا، نحن تصف كيفية التعامل مع خلايا سرطان الغدد الليمفاوية الأجسام المضادة مكافحة CD20 يمكن تحليلها في الوقت الحقيقي في الدم البشري كله لتوفير التحليل الكمي السمسة الخلوية.

Abstract

ووضعت على أساس الخلايا الحية فحص الدم الكامل السمية الخلوية (التعداد الزراعي العالمي) التي تتيح الوصول إلى المعلومات الزمنية من السمية لخلايا الكلية مع الإنتاجية العالية تكنولوجيا تحديد المواقع الخلية. ومبرمجة السكان الخلايا السرطانية المستهدفة أول من الشلل في شكل مجموعة، وصفت مع الأخضر الأصباغ الفلورية عصاري خلوي. بعد تشكيل مجموعة خلايا، يتم إضافة أدوية الأجسام المضادة في تركيبة مع الدم البشري كله. ثم يضاف يوديد propidium (PI) لتقييم موت الخلايا. ويتم تحليل مجموعة الخلايا مع نظام التصوير التلقائي. بينما الصبغة عصاري خلوي تسميات السكان الخلايا السرطانية المستهدفة، PI تصف السكان الخلايا السرطانية الميتة. وبالتالي، فإن النسبة المئوية للقتل الخلايا السرطانية المستهدفة يمكن كميا عن طريق حساب عدد الخلايا المستهدفة على قيد الحياة إلى عدد من الخلايا الميتة المستهدفة. مع هذا الأسلوب، والباحثين قادرون على الوصول تعتمد على الوقت والمعلومات السمية لخلايا تعتمد على الجرعة. بشكل ملحوظ، لا راديو الخطرةوتستخدم المواد الكيميائية. في التعداد الزراعي العالمي المعروضة هنا تم اختبارها مع سرطان الغدد الليمفاوية وسرطان الدم، وخطوط الخلايا السرطانية الصلبة. لذا، WCA يسمح للباحثين لتقييم نجاعة الأدوية في حالة شديدة الصلة خارج الحي.

Introduction

وقد أدت التطورات الحديثة في الصناعة الدوائية لزيادة الاهتمام في تحقيق هويات معينة من الأجسام المضادة الخلايا السرطانية وعلاج السرطان شخصية. ومع ذلك، واجه عدة عقبات في هذه العملية. مرخصة 5٪ فقط من العوامل التي لها نشاط مضاد للسرطان في التنمية قبل السريرية بعد تبين فعالية كافية في المرحلة II-III 1،2 الاختبار. الاستراتيجيات قبل السريرية (سواء في التجارب المختبرية والحية) غير كافية كما أظهرت العديد من الأمثلة التي المخدرات انتيتومور تتصرف بشكل مختلف في البشر والحيوانات في المختبر يرجع ذلك أساسا إلى مكوناتها الدم المختلفة 3-5.

لمعالجة ضرورة منصة فحص المخدرات انتيتومور وتوفير نقطة تفتيش قبل التجارب على الحيوانات مكلفة والتجارب السريرية، يقترح كله فحص السمية الخلوية الدم البشري (التعداد الزراعي العالمي) لتقييم فعالية الدواء المضاد للورم في بيئة أكثر البيولوجية ذات الصلة. الفحص الدم كله سمية الخلايا يمكن استخدامها لتقييم مدى استجابة الخلايا الفردية إلى الأجسام المضادة ومرشحين آخرين في المخدرات الدم البشري كله.

يتم تطوير التعداد الزراعي العالمي من خلال دمج التكنولوجيا العالية الإنتاجية تحديد المواقع المحمولة مع الإنتاجية العالية وارتفاع محتوى التصوير 6. من خلال الاستفادة من نظام التصوير الآلي، ويمكن تحديد عدد الخلايا الحية والميتة على حد سواء مع وجود درجة عالية من الدقة. يرجع ذلك إلى حقيقة أن الخلايا المستهدفة وثبتوا على نفس المستوى البؤري، التعداد الزراعي العالمي قادر على تقديم تحليل السمية الخلوية الكمي في الوقت الحقيقي دون ازالة خلايا الدم الحمراء. وعلاوة على ذلك، فإن نظام التصوير التلقائي يوفر العديد من المزايا مثل أن الخلايا المستهدفة الوحيدة التي وصلت إلى معايير محددة (على سبيل المثال، خلايا fluorescently المسمى، ومورفولوجيا الخلية) هي بوابات ومعالجتها. أيضا، فإنه يتيح إنتاج 144 لوحات في اليوم الواحد. وبالتالي، هذه القدرة الإنتاجية التصوير وتتيح تشغيل عالية ج-ontent والتجارب الإنتاجية العالية في وقت واحد. من خلال الجمع بين التعداد الزراعي العالمي ونظام التصوير الآلي، ويمكن تحقيق إنتاجية عالية السمية لخلايا التحليل الكمي في بيئة أكثر البيولوجية ذات الصلة.

Protocol

1. الهدف خلية التحضير

  1. المحافظة (خلايا سرطان الغدد الليمفاوية على سبيل المثال. راجي) الخلايا المستهدفة في وسائط النمو (1640 RPMI مستنبت، مع 10٪ الحرارة المعطل مصل بقري جنيني (FBS)، 4nM L-الجلوتامين، و 500 وحدة دولية / مل البنسلين / الستربتومايسين) عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 الحاضنة.
  2. الطرد المركزي العينة لتكوير الخلايا المستهدفة في أنبوب 15 مل. الوقت الطرد المركزي يختلف مع أنواع مختلفة من الخلايا. أجهزة الطرد المركزي لمدة 3 دقائق في 468 x ج لخلايا راجي.
  3. أولا نضح أي فقاعات تشكلت على السطح من طاف، وإزالة طاف بأكمله.
  4. إضافة 10 مل من برنامج تلفزيوني للأنبوب. إعادة تعليق الخلايا بواسطة pipetting الحل صعودا وهبوطا عدة مرات لتفريق أجمة الخلية.
  5. الطرد المركزي العينة لمدة 3 دقائق في 468 × ز.
  6. نضح أي فقاعات تشكلت على السطح من طاف، وإزالة طاف بأكمله.

2. إعداد ميكروأرس خلية

  1. يامرفق الخلية btain 96 مجموعات لوحة جيدا أو مجموعة وحيدة الخلية 8 شرائح غرفة البئر (انظر الجدول المواد / الكواشف).
  2. تطبيق 1.2 ميكرولتر من المنشط إلى كاشف الحمض النووي من عدة. تتويج القارورة، عكس ذلك، ويهز بلطف لمزج الحل.
  3. السماح للحل للرد لمدة 20 دقيقة في RT.
  4. تطبيق حل مختلطة لبيليه الخلايا المستهدفة (في أنبوب 15 مل).
  5. إضافة الأصباغ الخضراء مضان عصاري خلوي في تركيز النهائي من 500 نانومتر.
  6. احتضان الخلايا المستهدفة مع الحل المختلط والصبغة لمدة 30 دقيقة في RT على شاكر المداري.
  7. غسل الخلايا مرتين مع PBS 5 مل، و resuspend الخلايا في وسائل الإعلام 10 مل النمو.
  8. تطبيق 100 ميكرولتر من الحل من الخطوة 2.7 إلى كل بئر. حساب عدد الخلايا باستخدام عدادة الكريات. جعل متأكد من أعداد الخلايا تتراوح بين 5 × 04-01 أكتوبر × 10 6 خلايا لكل بئر.
  9. بعد 10-15 دقيقة من الحضانة على RT، وغسل بلطف مرتين مع عينات 200-300 وسائط النمو ميكرولتر لإزالة أي خلايا غير منضم.
    ملاحظة: حول 5-10 يبقى سائط النمو في كل ميكرولتر جيدا بعد الغسيل.

3. الجامع الدم فحوصات السمسة

  1. إضافة 180 ميكرولتر من الدم البشري كله إلى كل عينة بشكل جيد.
  2. الحصول مكافحة CD20 حل الأجسام المضادة في 5 ملغ / مل، وإجراء تخفيف التسلسلي لجعل 50، 20، 10، 5، 2، 1، و 0.5 ميكروغرام / مل من مكافحة CD20 حل الأجسام المضادة في 1.5 مل أنابيب. إضافة 20 ميكرولتر من كل تركيز مكافحة CD20 الأجسام المضادة لكل عينة بشكل جيد مما يجعل يثلث.
  3. إضافة يوديد propidium في تركيز النهائي من 500 نانومتر إلى كل بئر.
  4. احتضان لوحة الناتجة عند 37 درجة مئوية مع CO 2 5٪ لمدة 16 ساعة.
  5. صورة الخلايا على الشرائح أو 96 لوحات جيدة مع نظام التصوير التلقائي مع 8X التكبير.
  6. استخدام برنامج العد خلية من نظام التصوير التلقائي لقياس النتائج.
    ملاحظة: البرنامج من نظام التصوير التلقائي يوفر بسيطخطوة بخطوة عمليات العد الخلية. بروتوكول لاستخدام هذا البرنامج ويمكن الاطلاع على الموقع الالكتروني الموفر.
  7. حدد [النتائج مراجعة] من الصفحة الرئيسية للبرنامج.
  8. اختر [الملف المحفوظ لعينات].
  9. البوابة الأولى يعني FITC كثافة> 50، ثم بوابة TxRed يعني كثافة> 20.
  10. حدد [نبذة عن اللوحة].
  11. [تحديد جداول التصدير].
    ويظهر صيغة قتل الخلايا نسبة البرنامج أدناه: ملاحظة:
    قتل الخلية المستهدفة٪ = (# الخلايا الملون كلا الأخضر والأحمر / عدد الخلايا الملون الأخضر) * 100٪

النتائج

وقد تم اختيار الأجسام المضادة وخلايا سرطان الغدد الليمفاوية (خلايا راجي وMC / CAR) مكافحة CD20 كنظام نموذج للتدليل على كامل فحص السمية الخلوية الدم (التعداد الزراعي العالمي) 7،8. وكان عدد خلايا راجي نسخة عالية من CD20 على سطح الخلية، في حين أن خلايا MC / CAR انخفاض عدد نسخة من CD20 على غشاء بهم. تم صبغ الخلايا المستهدفة أولا الخضراء مع الأخضر الأصباغ مضان عصاري خلوي والمحتشدة على لوحة 96-جيدا. وقد ثبتوا 50،000 خلايا سرطان الغدد الليمفاوية هدف في كل بئر - 10،000. تمت إضافة 180 ميكرولتر من الدم الكامل رسمها حديثا البشري في كل بئر. ثم يضاف مكافحة CD20 الضد في كل بئر من 96 لوحة جيدا مع تركيزات متدرجة. بعد 16 ساعة من الحضانة عند 37 درجة مئوية، تم تقييم أعداد الخلايا كميا من خلال تصوير التلقائي من خلال تحليل عدد من خلايا الفلورية الخضراء والخلايا الحمراء الفلورسنت. منذ خلايا سرطان الغدد الليمفاوية الهدف كان كل المحتشدة على نفس المستوى البؤري، تم الكشف عن مضان من كل خلية مباشرة حتى دون ريموفينج خلايا الدم في البئر.

كما هو مبين في الشكل رقم 1، تم إجراء كشف خلايا سرطان الغدد الليمفاوية راجي المستهدفة (سواء حية وميتة). وتشير النقاط الخضراء في الشكل 1 عدد الخلايا المستهدفة المقدمة. وقد تم تحليل الخلايا الميتة (النقاط الحمراء) في الشكل رقم 1 كميا من خلال كثافة مضان أحمر لأنها كانت ملطخة أحمر فلوري مع PI. تم تحليل الأجسام المضادة سمية الخلايا من خلال نسبة الخلايا الميتة (الملون كلا الأخضر والأحمر) إلى خلايا قدمت (النقاط الخضراء). انخفض عدد النقط الحمراء الفلورسنت كما أن تركيز مكافحة CD20 الأجسام المضادة انخفضت في التركيز.

تم اختبار كل تركيز الأجسام المضادة بشكل مستقل في يثلث. لكل تركيز الأجسام المضادة، تم تصوير أكثر من 400 الخلايا المستهدفة لكل بئر لتوفير القيمة المتوسطة والانحراف المعياري للنتائج السمية الخلوية. استنادا إلى البيانات لدينا، مع 400 نقطة بيانات PEص تركيز الأجسام المضادة، حصلنا على النتائج الإحصائية مع قيمة P <0.01. تم الحصول على كفاءة الدواء تعتمد على الجرعة في الشكل 2. وقد استخدمت خلايا MC / CAR مع انخفاض عدد نسخة من المستضد CD20 كخط خلية السيطرة. تم الحصول على قيمة EC 50 0.12 ميكروغرام / مل لنتيجة التعداد الزراعي العالمي ضد خلايا سرطان الغدد الليمفاوية راجي، والذي كان في حدود مع القيمة التي تم الحصول عليها في فحوصات الأجسام المضادة سمية الخلايا العادية بما في ذلك فحص تكملة السمسة تعتمد (CDC) أو التي تعتمد على الضد السمسة الخلوية ( ADCC) فحص 9-11

figure-results-2599
الشكل 1. السمية الخلوية المعتمدة على الأجسام المضادة في الدم قياس كله. وقد وصفت الخلايا مع صبغة راجي عصاري خلوي الأخضر ثم يجمد. وأضيف أيضا PI للوصول إلى موت الخلية. تم صبغ الخلايا الميتة الحمراء من قبل بي. ويركز متفاوتةتم إضافة أيونات مكافحة CD20 الأجسام المضادة مع إضافة الدم الكامل. (أ) 2.5 ميكروغرام / مل مكافحة CD20 الأجسام المضادة بعد 16 ساعة، (ب) 1 ميكروغرام / مل مكافحة CD20 الأجسام المضادة بعد 16 ساعة، (ج) 0.5 ميكروغرام / مل مكافحة CD20 الأجسام المضادة بعد 16 ساعة، (د) 0.25 ميكروغرام / مل مكافحة CD20 الأجسام المضادة بعد 16 ساعة، (ه) 0.1 ميكروغرام / مل مكافحة CD20 الأجسام المضادة بعد 16 ساعة، (و) 0.05 ميكروغرام / مل مكافحة CD20 الأجسام المضادة بعد 16 ساعة، (ز) 2.5 ميكروغرام / مل السيطرة على الأجسام المضادة 16 بعد ساعة.

figure-results-3569
وكان الرقم 2. تعتمد على الجرعة السمية الخلوية ضد خطوط خلايا مختلفة في الدم البشري كله. راجي CD20 على خلايا سرطان الغدد الليمفاوية إيجابية، وكانت MC / CAR على خطوط خلايا CD20 السلبية. وقد أظهرت مستوى بأكملها سمية الخلايا الدموية للتركيز مختلفة من α-CD20 الأضداد (الأجسام المضادة لمكافحة CD20).

Discussion

التعداد الزراعي العالمي هو حاسم في المختبر المضادة للسرطان أداة فحص مع قرار خلية واحدة 12-16، الاستفادة بشكل مثالي بعد الهدف العروض التقليدية مثل CDC والمقايسات ADCC 9-11، وقبل الاختبارات قبل السريرية الحيوانية. حاليا، الهدف الأساسي فحوصات مثل فحص CDC أو المقايسات ADCC يتم تنفيذ كل ذلك في وسائل الإعلام مبسطة أو نظام المخزن. ومع ذلك، والمرشحين المخدرات التي تظهر في هذه الفعالية نظام المخزن مبسط ليست دائما فعالة في نظام الدم كله أكثر تعقيدا. وبالتالي، يمكن أن التعداد الزراعي العالمي لسد الفجوة بين العروض المستهدفة التقليدية والدراسات على الحيوانات مكلفة، والحد من ايجابيات كاذبة، وبالتالي منع إخفاقات يمكن تجنبها في التجارب على الحيوانات أو في التجارب السريرية البشرية. فإن التعداد الزراعي العالمي أن تكون مفيدة للباحثين يعملون على الدراسات قبل السريرية لاختبار فعالية الدواء في محتوى الدم البشري كله. عد الخلايا الميتة والحية باستخدام التدفق الخلوي يتطلب تحلل كامل للأحمر الدم مLLS من أجل الكشف عن الخلايا المستهدفة. الاستفادة من التقنية التعداد الزراعي العالمي خلال التدفق الخلوي هو أنه يمكن تحديد الخلايا المستهدفة دون تحلل خلايا الدم الحمراء. فمن الصعب ليز تماما جميع خلايا الدم الحمراء في عينة الدم، وأيضا هي lysed الخلايا المستهدفة جزئيا أثناء إجراء تحلل.

حتى فرص أكثر إثارة تنشأ إذا يمكن أن تتولد لوحات الفحص باستخدام خلايا حية الأولية التي تم الحصول عليها من المرضى الفردية، مما يمهد الطريق لعلاجات السرطان شخصية، وتقييم تجانس الخلايا ضمن الورم معينة، وتحديد الخلايا التي تقاوم معين العلاج من تعاطي المخدرات. تحريك نظام الرعاية الصحية إلى النهج الذي هو "شخصية، التنبؤية والوقائية وتركز على احتياجات المريض" هو مستقبل الطب 17،18. مبادرات عديدة داخل وزارة الصحة والخدمات البشرية، بما في ذلك ادارة الاغذية والعقاقير، ومراكز السيطرة على الأمراض، والمعاهد الوطنية للصحة، ومراكزالرعاية الصحية والخدمات الطبية، وإدارة الموارد والخدمات الصحية موجودة لدعم المبادرات الرامية إلى تعزيز الرعاية الشخصية. تحقيق الطب الشخصي يعتمد على التقنيات والمنتجات الموثوق بها التي يمكن التقاط وعقد أي الخلايا البشرية مع الحفاظ عليها في حالة البيولوجية ذات الصلة. يمكننا أن نتوقع تطبيق التعداد الزراعي العالمي لفحص المخدرات ضد الخلايا السرطانية مريض السرطان في مصفوفة من له / لها بدمه لتطبيقات الطب الشخصي.

الخطوات الحاسمة في البروتوكول هي الاستعدادات لمجموعة خلية. ويحتاج المستخدمون لإزالة كافة طاف دون فقدان الخلايا أثناء مرحلة الغسيل الخلية. بالإضافة إلى ذلك، يحتاج المستخدمون للقيام الطرد المركزي القصير إذا لا يمكن أن ينظر إليه السائل في قارورة. مرة واحدة وقد تم إعداد محلول كاشف الحمض النووي، وأنها يجب أن تستخدم مع الخلايا خلال 30 دقيقة.

كفاءة تكوين مجموعة الخلايا هي نوع من الخلايا التابعة. كانت هناك أكثر من100 أنواع من الخلايا اختبار مع هذا البروتوكول. ومع ذلك، فإنه لا يزال من الممكن أن بعض أنواع معينة من الخلايا لن تشكل مجموعة الخلايا بكفاءة. إذا لم يكن هناك أشكال مجموعة الخلايا، ويوصى على تركيز أعلى من كاشف الحمض النووي لأداء نفس البروتوكول للحصول على أفضل تشكيل مجموعة خلايا.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم المصالح المالية المتنافسة.

Acknowledgements

نشكر برنامج IMAT المعهد الوطني للسرطان من المعاهد الوطنية للصحة تمويل هذا العمل [R33 CA174616-01A1].

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Cell attachment 96 well plate kits AdherenAP9601
Suspension Single cell array 8 well chamber slideAdherenSS0801
Adherent Single cell array 8 well chamber slideAdherenSS0802
Lymphoma cell line CD20+ATCCCCL-86Raji cells
Lymphoma cell line CD20-ATCCCRL-8083MC/CAR
RPMI 1640 with L-glutamineLife Technologies11875-119
Fetal Bovine SerumThermoSH30070.01HI
Peni/StrepLife Technologies15070063
Cytosolic dyeLife TechnologiesC7025Cell Tracker Green
Rituxan (Biosimilar) Eureka Therapeutics
Human whole bloodAllcellsWB001
Propidium IodideSigmaP4170-10MG
Automatic imaging systemMolecular DevicesContact VendorCell Reporter
Cell counting programMolecular DevicesContact VendorCell Reporter

References

  1. Hutchinson, L., Kirk, R. High drug attrition rates--where are we going wrong. Nat Rev Clin Oncol. 8, 189-1890 (2011).
  2. Moreno, L., Pearson, A. D. Attrition rates be reduced in cancer drug discovery. Informa healthcare. 8, 363-368 (2013).
  3. Seok, J., et al. Inflammation and Host Response to Injury, Large Scale Collaborative Research Program. Genomic responses in mouse models poorly mimic human inflammatory diseases. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 3507-3512 (2013).
  4. Suntharalingam, G., et al. Cytokine storm in a phase 1 trial of the anti-CD28 monoclonal antibody TGN1412. N Engl J Med. 355, 1018-1028 (2006).
  5. Eastwood, D., et al. Monoclonal antibody TGN1412 trial failure explained by species differences in CD28 expression on CD4+ effector memory T-cells. Br J Pharmacol. 161, 512-526 (2010).
  6. Hsiao, S. C., Liu, H., Holstlaw, T. A., Liu, C., Francis, C. Y., Francis, M. B. Real time assays for quantifying cytotoxicity with single cell resolution. PLoS One. 8, 10-1371 (2013).
  7. Wang, S. Y., Weiner, G. Rituximab: a review of its use in non-Hodgkin’s lymphoma and chronic lymphocytic leukemia. Expert Opin Biol Ther. 8, (2008).
  8. Dalle, S., Thieblemont, C., Thomas, L., Dumontet, C. Monoclonal antibodies in clinical oncology. Anticancer Agents Med Chem. 8, 523-532 (2008).
  9. Brunner, K. T., Mauel, J., Cerottini, J. C., Chapuis, B. Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on 51-Cr-labelled allogeneic target cells in vitro; inhibition by isoantibody and by drugs. Immunology. 14, 181-196 (1968).
  10. Korzeniewski, C., Callewaert, D. M. An enzyme-release assay for natural cytotoxicity. J Immunol Methods. 64, (1983).
  11. Gerlier, D., Thomasset, N. J. Use of MTT colorimetric assay to measure cell activation. Immunol Methods. 94, 57-63 (1986).
  12. Toriello, N. M., et al. Integrated microfluidic bioprocessor for single-cell gene expression analysis. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, (2008).
  13. Douglas, E. S., Hsiao, S. C., Onoe, H., Bertozzi, C. R., Francis, M. B., Mathies, R. A. DNA-barcode directed capture and electrochemical metabolic analysis of single mammalian cells on a microelectrode array. Lab on a Chip. 9, 2010-2015 (2008).
  14. Mayr, L. M., Bojanic, D. Novel trends in high-throughput screening. Current opinion in pharmacology. 9, 580 (2009).
  15. Zanella, F., Lorens, J. B., Link, W. High content screening: seeing is believing. Trends in Biotechnology. 28, 237-245 (2010).
  16. Coelho, J., P, L., Quinn, S., Murphy, R. F. Automated image analysis for high-content screening and analysis. J Biomol Screen. 15, 726-734 (2010).
  17. Sundberg, S. A. High-throughput and ultra-high-throughput screening: solution- and cell-based approaches. Current Opinion in Biotechnology. 11, 47 (2000).
  18. Simmons, L. A. Personalized medicine is more than genomic medicine: confusion over terminology impedes progress towards personalized healthcare. PERS MED. 9, 85 (2012).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

93

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved