إعداد الحمض النووي الفيروسي من Nucleocapsids

نحن تصف عملية عزل الحمض النووي عالية النقاء هربس nucleocapsid من الخلايا المصابة. القبض على الحمض النووي النهائي من الحل هو تركيز عالية ونقاء ، مما يجعله مثاليا للالتسلسل عالية الإنتاجية ، وارتفاع الإخلاص تفاعلات PCR ، وtransfections لإنتاج recombinants الفيروسية الجديدة.

الفيروسات هي طفيليات تلزم الخلوية ، وبالتالي فإن دراسة عينات من الحمض النووي الفيروسي يتطلب عزل المواد بعيدا عن الملوثات الخلية المضيفة والحمض النووي. تطبيقات المصب عدة تتطلب كميات كبيرة من الحمض النووي الفيروسي النقي ، والتي يتم توفيرها من قبل هذا البروتوكول. وتشمل هذه التطبيقات تسلسل الجينوم الفيروسي ، حيث إزالة الحمض النووي المضيف أمر حاسم لتحسين بيانات الناتج عن تسلسل الفيروسي ، وإنتاج سلالات جديدة المؤتلف الفيروسية ، حيث شارك في ^1،2 ترنسفكأيشن تنقيته من الحمض النووي الفيروسي البلازميد ويسهل إعادة التركيب الخطي. ^{، 3}

هذا الإجراء يستخدم مزيجا من عمليات الاستخراج وكثافة المستندة الطرد المركزي لعزل الحمض النووي المنقى خطية هربس nucleocapsid من الخلايا المصابة. ^4،5 الخطوات الأولية تهدف إلى تنقية عزل الفيروسية capsids المنقى ، والتي تحتوي على الحمض النووي الفيروسي حماية خلال عمليات الاستخراج والخطوات الطرد المركزي التي تعمل على إزالة البروتينات والحمض النووي الخلوي. تحلل من النشرات nucleocapsids ثم الحمض النووي الفيروسي ، واثنين النهائي الفينول كلوروفورم خطوات إزالة البروتينات المتبقية. القبض على الحمض النووي النهائي من الحل يتركز عالية ونقية ، مع _260/280 OD 1.90 متوسط. اعتمادا على كمية من الخلايا المصابة المستخدمة ، غلة مجموعة الحمض النووي الفيروسي 150-800 ميكروغرام أو أكثر. نقاء من هذا الحمض النووي يجعلها مستقرة خلال التخزين الطويل الأجل في 4C. وبالتالي هذا الحمض النووي مناسبة بشكل مثالي لسرعة عالية التسلسل عالية الدقة تفاعلات PCR ، وtransfections.

قبل بداية البروتوكول ، فمن المهم أن نعرف أن متوسط ​​عدد الخلايا في الطبق (على سبيل المثال ما معدله 8 × 10 خلايا PK - 15 ⁶ متكدسة في صحن 15 سم) لاستخدامها ، وعيار من المخزون الفيروسي ( مثال 1 × 10 ⁸ البلاك تشكيل وحدات لكل مل). هذه ضرورية لحساب تعدد المناسب للعدوى (وزارة الداخلية) للبروتوكول. ⁶ وعلى سبيل المثال ، لتصيب طبق واحد من 15 سم PK - 15 مع الخلايا الفيروسية الأسهم في أعلاه ، في وزارة الداخلية من 5 ، يمكنك استخدام ميكرولتر من 400 الأسهم الفيروسية وتمييع مع 3.6 مل من المتوسط ​​(إجمالي حجم تلقيح لمدة 4 مل صفيحة 15 سم).

يمكن إعداد التحضيرات متعددة الحمض النووي الفيروسي في نفس الوقت. ويقتصر عدد التحضيرات في وقت واحد فقط من قبل عدد من الأنابيب التي عقدها الدوار نابذة فائقة السرعة (واحدة لكل فيروس ، انظر الخطوة 3.9 أدناه). نحن هنا وصف الإجراء كما لو يجري لأحد الفيروسات.

1. اليوم الأول : العدوى الفيروسية وإعداد المخازن

1. إعداد أطباق 10/05 (15 سم القطر) من خلايا الأنسجة للعدوى ، مثل خلايا PK - 15 لفيروس داء الكلب الكاذب (PRV) أو خلايا فيرو لفيروس الهربس البسيط (HSV).
2. عندما الخلايا هي 95 -- 100 ٪ متموجة ، تصيب منهم في (وزارة الداخلية) من 5-10. للقيام بذلك ، تطعيم كل لوحة باستخدام مخزون الفيروس في الحجم الكلي لل4 مل لكل لوحة ، ثم احتضان لوحات لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية. لوحات الروك بلطف كل 15 دقيقة للتأكد من أن الخلية لا يزال أحادي الطبقة المغلفة بالكامل لقيحة الفيروس. وفي الوقت نفسه ، على المديين المتوسط ​​الدافئة للخطوة التالية.
3. بعد ساعة واحدة من العدوى ، ونضح من اللقاح الفيروسي لوحات ، إضافة 15 مل من المتوسط ​​الدافئ ، واحتضان ل20/12 في 37 ساعة في حاضنة ترطيب درجة مئوية.
4. إعداد مخازن LCM (انظر الجدول رقم 1) والصخور بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية لخلط دقيق. تحضير لإعادة تعليق TNE من الحمض النووي الفيروسي (انظر الجدول 2).

2. اليوم الثاني ، المرحلة 1 : تحلل الخلايا وتنبيذ فائق

1. تأكيد بصريا أن العدوى من الخلايا تسبب تأثير الاعتلال الخلوي موحدة (CPE). سماح العدوى إلى التقدم حتى جميع الخلايا واعتقلت ، ولكن لم ترفع قبالة لوحة.
2. كشط الخلايا المصابة في المتوسط ​​، والجمع بين الخلايا والمتوسطة في أنابيب مخروطية 50 مل. عدد من الأنابيب المخروطية اللازمة لهذه الخطوة ستعتمد على عدد من الأطباق المستخدمة للعدوى في الخطوة 1.2 أعلاه ، يمكن استخدام مثل أنبوب واحد مل 50 المخروطية لتكوير كحد أقصى من 3 أطباق من المتوسط ​​15 مل كل الاختياري : شطف لوحات مع 10 مل من برنامج تلفزيوني وتتحد مع الخلايا والمتوسطة.
3. خلايا جهاز الطرد المركزي والمتوسطة لمدة 10 دقيقة في 2000 قوة centifugal النسبية (RCF) في درجة حرارة الغرفة ، ثم طاف ونضح resuspend كل بيليه في 10 مل من برنامج تلفزيوني. إذا كان نشر بيليه من عدوى فيروسية في أنابيب مخروطية متعددة في الخطوة 2.2 ، يمكن معاد في أنبوب واحد هذه المخروطية في هذه الخطوة. كرر الطرد المركزي والتطلع الاختياري : قد تكون مخزنة في هذا بيليه -20 درجة مئوية وبروتوكول تابع في وقت لاحق.

3. اليوم الثاني ، المرحلة 2 : تنبيذ فائق

الحفاظ على بيليه الخلية ومخازن LCM على الجليد كلما كان ذلك ممكنا خلال الخطوات التالية.

1. إضافة إلى β - المركابتويثانول الجلسرين ٪ 0 -- LCM العازلة. تبدأ تبريد نابذة فائقة السرعة (على الخطوة 3.9 أدناه) عن طريق تحديد أن تصل إلى 4 درجة مئوية ، وتحول على فراغ.
2. Resuspend الكرية خلية في 5 مل من الجلسرين ٪ 0 -- LCM العازلة حتى أنه لم يعد clumpy. إذا لزم الأمر ، دوامة أنبوب لتفريق أي خلية غير منحل بيليه.
3. استخراج بإضافة 1.5 مل فريون (1،1،2 ثلاثي كلورو - 1 - ،2،2 trifluoroethane) وvortexing بقوة. أجهزة الطرد المركزي على الفور لمدة 10 دقيقة على 2000 إطار التعاون الإقليمي في درجة حرارة 4 درجة مئوية جمع الطبقة العليا مع طرف ماصة واسعة تحمل (تجنب واجهة) ونقل إلى أنبوب الاختياري الجديد : إذا كان بيليه هو الصلبة هلامي ، يمكنك بسرعة صب الطبقة العليا في أنبوب جديد.
4. كرر استخراج غاز الفريون وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى.
5. جمع الطبقة العليا (~ 5 مل) ونقل إلى أنبوب polyallomer نابذة فائقة السرعة الجديدة. إضافة β - المركابتويثانول إلى الجلسرين المتبقيين -- مخازن LCM.
6. إعداد التدرج في أنبوب الطرد المركزي التي polyallomer تحتها استخراج غاز الفريون (الطبقة العليا) مع 3 مل من الجلسرين 5 ٪ -- LCM (وسط طبقة) ، وتحتها ثم مرة أخرى مع 2.5 مل من الجلسرين 45 ٪ -- LCM (الطبقة السفلي). استخدام ماصة رقيقة لتجنب تجاوز محتويات الأنبوب.
7. إذا لزم الأمر ، يعد أنبوب يعادل رصيد باستخدام نفس النسب من مخازن LCM.
8. أنابيب نقل في دلاء نابذة فائقة السرعة. التوازن داخل الدلاء ل0.1 غرام من بعضها البعض ، عن طريق إضافة المزيد من الجلسرين بلطف 0 ٪ -- LCM العازلة إلى الطبقة العليا (~ 5-10 ميكروليتر في وقت واحد).
9. نابذة فائقة السرعة باستخدام الباردة مع الدوار دلو أفقي أو يتأرجح ، وتدور في عينات متوازنة لمدة 1 ساعة في إطار التعاون الإقليمي 77000 (25000 دورة في الدقيقة على سبيل المثال عن الدوار SW41Ti) عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.
10. خلال تنبيذ فائق ، وجعل على ربط الحمض النووي لالتقاط الزجاج العائم على الايثانول خطوة هطول الأمطار (4.6 أدناه). كلا طرفي عقد من الماصة باستور الزجاج وتعليق القسم الأوسط أكثر من اللهب. عند قسم من الزجاج المصهور تقريبا ، وبرفق لتمتد على الزجاج ، وثنيه برفق لإنشاء ربط بإحكام الزاوية (<90 درجة) ، وسحب بحدة ليغلق نهاية المطاف. إذا غيض من ربط الزجاج مفتوح ، عقد أكثر من طرف اللهب بحيث يذوب الزجاج بما فيه الكفاية لإغلاقه.
11. بعد تنبيذ فائق ، سترى رقيقة شفافة مع بيليه بقعة داكنة في الوسط. نضح بعناية السائل من أنبوب ، بما في ذلك المرق على طول الجانبين ، ولكن تجنب بيليه في الجزء السفلي من الأنبوب.
12. إضافة 0.5 مل TNE في درجة حرارة الغرفة.
13. بيليه ترك الجلوس لمدة لا تقل عن 10 دقيقة للسماح للترطيب بيليه. Optional : بيليه وربما أيضا في resuspend TNE بين عشية وضحاها ، إذا كان يحتفظ بها في 4 درجات مئوية.

4. اليوم الثالث : الأمطار "الشبح" DNA

1. تفريق بيليه بواسطة pipetting مع طرف ماصة العيار الصغير (على سبيل المثال تلميح ماصة P200). لا تقلق بشأن القص في هذه الخطوة ، لأنه لا تزال تحتوي على الحمض النووي الفيروسي في capsids في هذه النقطة. إضافة الكواشف التالية إلى الأنبوب الذي يحتوي على بيليه الفيروسية في درجة حرارة الغرفة ، لتدمير capsids :
   • 4.25 مل TNE
   • 0.25 مل SDS 10 ٪
   • 2 ملغ بروتين K
   صخرة بلطف لمزج هذه الكواشف. يجب أن يكون هناك زيادة طفيفة في اللزوجة.

حذار من القص من هنا فصاعدا ، مثل استخدام واسع يحمل ماصات ولا دوامة المواد الفيروسية

2. استخراج البروتينات الفيروسية وذلك بإضافة 5 مل من الفينول كلوروفورم ، والبدء فورا في قلب vortexing أو للحفاظ على مستحلب. المزيج لمدة 10 ثانية ، ثم الطرد المركزي المستحلب لمدة 5 دقائق على 2000 إطار التعاون الإقليمي في درجة حرارة الغرفة. جمع الطبقة العليا مع طرف ماصة واسعة تتحمل ، وتجنب واجهة ، ونقل إلى أنبوب جديد الاختياري : استخدام قفل المرحلة هلام (PLG) الأنابيب في هذه الخطوة لتجنب التلوث من واجهة.
3. كرر استخراج الفينول كلوروفورم ، وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى.
4. بعد استخراج الفينول كلوروفورم الثانية ، جمع الطبقة العليا في أنبوب 30 مل Corex الزجاج والبرد في الأنبوب -20 درجة مئوية لمدة 10-15 دقيقة ، مع الحرص على أن لا تجميد.
5. إضافة 10 مل من الايثانول الجليد الباردة ، وغطاء للأنبوب (على سبيل المثال عن طريق تمتد قطعة من M Parafilm فوق الجزء العلوي) ، وعكس لخلط فورا. يراقب عن الحمض النووي "شبح" لتظهر ، والتي تتكون من ترسيب لزج رقيقة. عكس الأنبوب بلطف لمزج وتسبب المزيد من الحمض النووي لزجة تترسب إلى المجموعة معا.
6. استخدام الزجاج هوك لالتقاط شبح الحمض النووي (ق). لطخة بعناية الحمض النووي لإزالة السائل الزائد ، ثم ضع هوك (نصيحة لأسفل) في أنبوب 1.5 مل ، والسماح ليجف. إضافة ،25-،5 مل من TE بحل شبح الحمض النووي. تسمح إعادة تعليق من الحمض النووي والمضي قدما على الأقل ساعة واحدة. الحمض النووي مخزن في 4 درجات مئوية. اختياري : لتعظيم العائد الحمض النووي ، وكسر الزجاج ورطتها في أنبوب مل 1.5 ، بحيث يمكن إعادة تعليق قبالة شظايا الزجاج يستمر مع مرور الوقت.

5. ممثل النتائج

مع وزارة الداخلية عالية بما فيه الكفاية ، وينبغي أن الخلايا CPE تحقيق كامل في غضون 18 ساعة بعد الإصابة ~ (HPI) لسلالات PRV من النوع البري ، و~ 24 HPI للسلالات البرية HSV - 1 - نوع (الشكل 1). بمجرد أن يتم حصاد الخلايا المصابة بيليه ، لا يمكن للبروتوكول الخطوات المتبقية تكون كاملة في يوم واحد أو طويلة امتدت على مدى يومين (الشكل 2).

عند إعداد السنانير الزجاج لالتقاط شبح الحمض النووي ، فمن المهم لجعل زاوية ربط يكون أقل من 90 درجة ، بحيث انه في وقت لاحق يمكن أن تندرج في قاعدة أنبوب مل 1.5 (الشكل 3). ختم هذا غيض من الخطاف يمنع فقدان الحمض النووي داخل الماصة.

الحمض النووي شكل أشباح خلال هطول الأمطار والخطوة سوف تظهر المواضيع ، أبيض لزج (الشكل 4). هذه الكلية والعصا مع بعضها البعض و / أو ربط الزجاجية المستخدمة لالتقاط الحمض النووي. بالتالي يمكن استخدام الزجاج ربط نفسه لجمع ما يصل مواضيع متعددة من الحمض النووي من ضمن الحل هطول الأمطار.

الجدول 1. وصفات لإعداد مخازن LCM

الجدول 2. إعداد TNE (كلوريد الصوديوم 0.1 م و 50 ملي تريس ، ودرجة الحموضة 7.5 و 10 ملي EDTA)

الجدول 3. إعداد برنامج تلفزيوني (2.7 ملي بوكل ؛ 1.5 ملم KH ₂ ص ₄ ؛ 137 مم كلوريد الصوديوم ؛ 8.1 ملي نا ₂ هبو ₍₄₎ ؛ الرقم الهيدروجيني 7.0)

الشكل 1. PK15 الخلايا (A) قبل الإصابة ، (B) في منتصف الطريق من خلال العدوى ، و (C) في تأثير الاعتلال الخلوي (CPE) ، وبعد تعدد عالية من العدوى.

الشكل 2. نظرة عامة للبروتوكول.

الشكل 3. خطاطيف تستخدم نماذج تمثيلية ثلاثة من الزجاج لجمع أشباح الحمض النووي الفيروسي.

الشكل 4. سبيل المثال الممثل عن "الأشباح" بشكل جيد وفيرة الحمض النووي.

وقد وضعت أصلا أجزاء من هذا البروتوكول لعزل الحمض النووي الفيروسي في BSL4 الظروف ، لكنه يتكيف بشكل جيد على قدم المساواة لغير BSL شروطه. ⁴ ونحن عادة ما تستخدم هذا البروتوكول لعزل الحمض النووي من PRV ألفا herpesviruses وHSV - 1 ، التي الجينوم الحمض النووي المغلقة في قفيصة البروتينية ومحاطة المغلف الدهون. ^7،8 ومع ذلك فمن المرجح للتكيف مباشرة إلى غيره من فيروسات الحمض النووي كبيرة ، بما في ذلك بيتا وغاما وherpesviruses الفيروسات الغدية. ويشيع استخدام قلع مماثلة للفيروسات RNA وكذلك ⁹

متانة هذه النتائج إعداد الحمض النووي المحتمل من أساليب متعددة لتنقية المضمنة. تفسد الأولية المستخرجة الأغشية الدهنية الفريون ، وفصل مكونات الخلية ، وإطلاق سراح أيضا المغلف الدهون والبروتينات التي تحيط غلاف الخارجي capsids هربس. ويعقب ذلك من خلال تنبيذ فائق ، حيث nucleocapsids الثقيلة بيليه الفيروسية من خلال التدرج وسائد اثنين ، فصل عليها بشكل فعال من أهم المكونات الخلوية الأخرى. وهذه capsids معلق ، ويتم تحرير بواسطة الحمض النووي الفيروسي nucleocapsid تمزيق capsids مع K بروتين ومواد التنظيف. اثنين من الفينول كلوروفورم - قلع إزالة المكونات جيدا nucleocapsid وأي البروتينات الخلوية المتبقية. أخيرا ، وتساقط الأمطار من الحمض النووي الفيروسي الجينوم كبيرة في حل يقلل المرحل من أملاح أو ملوثات الجسيمات.

هذا الإجراء لعزل الحمض النووي الفيروسي nucleocapsid يوفر وفيرة ، والمواد عالية النقاء للتطبيقات المصب. مزيج من استخراج متعددة وخطوات الطرد المركزي يميز هذا البروتوكول من أبسط واحد البروتوكولات استخراج الحطام التي تترك أكثر الخلوية أو منتجات البروتين المتدهورة مع DNA ^10. يمكن أن تقلل من الملوثات البروتين الاستقرار تخزين الحمض النووي الفيروسي ، وتقليل كفاءة ترنسفكأيشن في الخلايا. الملوثات تؤثر سلبا على الحمض النووي الخلوي تفاعلات PCR والبروتوكولات التسلسل عالية الإنتاجية. ¹ الحمض النووي العائد من هذا البروتوكول هو أيضا عالية ، مما يجعلها مناسبة جدا لتقييد تعدد الأشكال جزء طول (RFLP) تحليل وجنوب النشاف. ^5،11 واحد يوفر ما يكفي من إعداد nucleocapsid المادية لجميع هذه التحليلات.

كمية من الخلايا المستخدمة لعدوى الآثار العائد في نهاية المطاف من الحمض النووي الفيروسي. لسلالات PRV مع معدل النمو من النوع البري ، ومدخلات من الأطباق 50-10 من الخلايا PK - 15 (واحد قطره 15 سم طبق يحمل ما يقرب من 8 × 10 ⁶ خلايا) غلة عادة 250-500 ميكروغرام من الحمض النووي الفيروسي. لالمسوخ الفيروسية مع انخفاض العائد virions المعدية ، ينبغي تحجيمها وفقا لإدخال المواد التصاعدي. وسوف يتضاعف عدد المدخلات من الأطباق تقريبا ضعف المحصول ، ويمكن معالجته مع نفس الكميات من الكواشف الموصوفة هنا. لزيادة المدخلات وراء هذه النقطة ، فإننا نوصي فصل المواد مدخلات تيارين معالجة موازية (مثل خلايا الكريات اثنين وأنابيب استخراج اثنين) من خلال الخطوة 3.13. ويمكن الجمع بين اثنين من الكريات تنبيذ فائق السلالة الفيروسية نفسها في أنبوب واحد في هذه الخطوة إعادة تعليق. إذا فشل في تشكيل الحمض النووي شبح نظيفة في نهاية الإجراء ، والنهج المشاكل الرئيسي هو زيادة كمية مدخلات من الخلايا ، والتي سوف تزيد من الحمض النووي وتحسين العائد على هطول الأمطار.

يمكن أن تتسبب ظروف أخرى تؤثر أيضا على نجاح تشكيل أشباح. على سبيل المثال ، فمن المهم أن وقت الحصاد من الإصابات في نقطة عند nucleocapsids الفيروسية وفيرة ، ولكنها في الغالب داخل الخلايا أو الخلية المرتبطة. ولن Virions المفرج عنهم إلى وسيلة يمكن التقاطها بواسطة هذا الإجراء ، وبالتالي حصد الخلايا في وقت متأخر جدا في العدوى (على سبيل المثال عندما تقدمت CPE إلى النقطة حيث الخلايا تنفصل عن الطبق) سوف يقلل احتمال العائد DNA وتشكيل أشباح. من المهم أيضا أن يحل تماما تحصد بيليه في الخلية العازلة LCM (الخطوة 3.2) للاستفادة الكاملة من الخطوة التالية الاستخراج ، وهذا يتطلب إعادة تعليق المزيد من الوقت والرعاية إذا كان قد تم تجميد بيليه خلية في الخطوة السابقة. تفاصيل إجرائية طفيفة تؤثر على الحمض النووي العائد كذلك. بينما يمكن أن تتم الخطوات 3 و 4 من دون استخدام حلول تبريد وحفظ جميع أنابيب على الجليد ، ونسبة نجاح الظلال الحمض النووي هو أعلى من ذلك بكثير عندما يتم الاحتفاظ الكواشف الباردة. وبالمثل ، فإن استقرار المركابتويثانول - β الانخفاضات في حل بمرور الوقت ، وبالتالي فإنه إضافة إلى حلول LCM مباشرة قبل استخدام يحسن قدرتها الحد ، وتحسين وزيادة الاضطراب البروتين وتكوين الحمض النووي العائد أشباح. وسوف نحرص على الاهتمام بهذه التفاصيل تحسين مخرجات ذات جودة عالية الحمض النووي الفيروسي.

لأن الحمض النووي الفيروسي غير لزج ، يمكن أن يكون حل ينتج عنه غير المتجانسة. السماح لمزيد من الوقت لإعادة تعليق من ورطتها الزجاج يزيد من غلة الحمض النووي مفيدة وتحسن التجانس الحل. معيار القياس الطيفييمكن استخدامها لquantitate العائد الحمض النووي والنقاء. fluorimetry الحمض النووي ينص على تدابير أكثر دقة من العائد الحمض النووي (على سبيل المثال Invitrogen PicoGreen dsDNA صمة عار).

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

الكتاب نقدر مساهمات سميث جريج ، بوميرانز ليزا ، ليمان مات ، إلدريدج مارليس ، Halina Goraczniak Staniszewska ، وأعضاء في مختبر Enquist هذا البروتوكول صقل.